（动物营养与饲料科学专业论文）光合细菌的分离鉴定及营养特性研究.pdf

青岛农业人学硕士学位论文摘要 摘要 1 以类球红细菌( 1 2 1 7 4 ) g t 沼泽红假单胞菌( 1 2 1 8 0 ) 为参照，对分离的一株光合细菌从菌 落形态、个体形态，活细胞吸收光谱，部分1 6 s r r n a 的克隆测序入手，绘制了遗传发 生树，分离，鉴定了一株光合细菌c 2 。结果表明：三株光合细菌均为革兰氏阴性，三 株光合细菌在1 9 6 - - 2 4 6 n m ，2 4 6 - - 3 0 0 n m 、8 0 1 8 5 4 n m 处有相同的吸收光谱，两个标准菌 株类球红细菌( 1 2 1 7 4 ) 和沼泽红假单胞茵( 1 2 1 8 0 ) 的同源性迭9 5 6 ，类球红细菌 ( 1 2 1 7 4 ) 和分离株的同源性达9 2 5 ，沼泽红假单胞茵( 1 2 1 8 0 ) 和分离株c 2 的同源 性达9 0 o 。对系统进化树进行分析，可知分离株c 2 与类球红细菌( 1 2 1 7 4 ) 3 k 沼泽红假 单胞菌( 1 2 1 8 0 ) 的同源关系最近，经鉴定光合细菌分离株c 2 为紫色非硫科光合细茵。 2 研究了培养基及培养条件对类球红细菌( 1 2 1 7 4 ) 、沼泽红假单胞茵( 1 2 1 8 0 ) 和分离 株c 2 生长的影响。结果表明：类球红细菌( 1 2 1 7 4 ) 、沼泽红假单胞茵( 1 2 1 8 0 ) 和分 离株c 2 的最佳培养基皆为：a t y p 培养基( 海水) ，v a n n i e l 培养基( 海水) 、a t y p 培 养基( 蒸馏水) 及分离培养基( 蒸馏水) 。2 5 3 5 适合分离株c 2 生长；3 5 最适合 类球红细菌( 1 2 1 7 4 ) 和沼泽红假单胞茵( 1 2 1 8 0 ) 生长。三株光合细菌均适合于微氧 至厌氧环境生长，氮气环境不适合。不同菌株混合培养时生长效果优于单菌株培养，采 用摇床振荡培养生长皆优于静置状态培养。三菌株对光照强度有不同适应性。 3 对类球红细菌( 1 2 1 7 4 ) ，沼泽红假单胞菌( 1 2 1 8 0 ) 和光合细菌分离株c 2 的常规营 养成分、微量元素、各种氨基酸含量进行了测定。结果表明，三菌株蛋白质含量约为 6 0 ，差异不显著( p o 0 5 ) ；沼泽红假单胞茵( 1 2 1 8 0 ) 和c 2 的脂肪含量显著高于 类球红细菌( 1 2 1 7 4 ) ( p o 0 5 ) ；微量元素含量丰富，类球红细菌( 1 2 1 7 4 ) 和c 2 的f e 含量显著高于沼泽红假单胞菌( 1 2 1 8 0 ) ( p o 0 5 ) ，沼泽红假单胞菌( 1 2 1 8 0 ) 与 c 2 的z n 、m n 含量显著高于类球红细菌( 1 2 1 7 4 ) ( p 0 0 5 ) ；t h e f a t c o n t e n t o f l 2 1 8 0 a n d c 2 w a ss i g n i f i c a n t o v e r t o p1 2 1 7 4 ( p 0 0 5 ) ：t h ec r u d ea s hc o n t e n to f c 2i sm o s t , w h i c hh a dd i s t i n c ts i g n i f i c a n tc o m p a r e dw i t h1 2 1 7 4a n d 1 2 1 8 0 ( p o 0 5 ) ：i tw a s a b u n d a n c eo f t h ea c c e s s o r ye l e m e n t ，a n dt h ef ec o n t e n to f t h e1 2 1 7 4a n dc 2w a sh i g hs i g n i f i c a n tt ot h e i t 童鱼查些盔堂堕主堂堡堡苎 垒呈! ! 垦垒兰1 1 2 1 8 0 ( p 0 0 5 ) t h e z na n d m n c o n t e n t o f t h e1 2 1 8 0 a n d c 2 w a s h i g hs i g n i f i c a n t t o t h ei 2 1 7 4 ( p o 0 5 ) t h ee s s e n t i a la m i n oa c i d sc o n t e n t ( b e s i d e st r y p t o p h a n ) o f1 2 1 7 4 ，1 2 1 8 0 ，c 2o c c u p i e dt h et o t a l a m i n oa c i dc o n t e n ts e p a r a t e l y4 0 0 5 、4 2 7 1 、4 2 2 5 t h en o n e s s e m i a la m i n oa c i d sc o n t e n to c c u p i e d t h et o t a la m i n oa c i dc o n t e n t5 9 9 5 、5 7 2 9 、5 7 7 5 t h ee s s e n t i a la m i n oa c i d sa n dt h en o n - e s s e n t i a l a m i n oa c i d sr a t i ow a s 0 6 6 8 、0 7 4 3 、0 7 31 k e yw o r d s ：p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ；r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s ；r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u t d s ；s e p a r a t i o n a n di d e n t i f i c a t i o n ；n u t r i e n tc o n s t i t u e n t i i i 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的浣明并表示谢意。如不实，本人负全部责任。 学位论文作者签名：直住手、签字同期：肋刀年z 月7 7 r 学位论文版权使用授权书 本学位论义作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，于】权保留隽1 向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学段可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或jl 描 等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学j 节论文作置签名：宦僵矛、 导师签字： 签字同期：加7 年乡月f7 r 玉达柏 签字同期：砷年月7 f 青岛农业大学硕士学位论文前言 刖看 光合细菌( p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ) 为2 0 亿年前地球上出现最古老的水圈微生物之一 【“2 1 。光合细菌以有机物为主要碳源，可利用光能进行不产氧的光合作用而生长，在自 然界碳、氮、硫等物质循环中起着重要作用。光合细菌在自然界中分布非常广泛，可以 认为凡是光能所及之处均可发现它们的踪迹，如海洋、江河、湖泊、土壤、极地或温泉 ( 甚至高达9 0 ) 、高盐水体等各种生境，在水环境中尤为丰富，在某些沟渠中甚至可高 达1 07 个m l 。在海洋砂石表面细菌种群中，仅好氧光合细菌数量即可达6 3 。它们在 水体初级生产力中占有相当的比重【n 。可见，光合细菌是一类对环境具极强适应能力的 微生物。 近年来，光合细菌在食品、医药保健、动物养殖业、微生物产氢等领域的广泛应用 成为国内外学者关注的焦点。而对其进行广泛应用的前提是如何高效培养、生产。目前， 对光合细菌培养条件的研究，国内外已有相关报道，但众说不一；实践生产中，更缺乏 完善的高效规模化生产技术。因此，光合细菌的高效规模化生产技术是目前生产上迫切 需要解决的问题。 研究表明，光合细菌菌体含有丰富的蛋白质、氨基酸、生物必需的维生索、抗病毒 活性因子、辅酶q l o 以及多种生理活性物质，能够提供生物体所必需的营养，促进动物 生长，增强抗病机能，因此在动物生产及医药保健食品方面有很高的研究价值。光合细 菌对水产动物具有明显的促生长作用，作为水产动物饲料添加剂，具有很高的饵料价值， 并且还有防控鱼虾疾病和净化养殖水质等多方面的功能。光合细菌能改善植物营养、增 加土壤肥力、抑制病原微生物的生长、改善作物品质、提高作物叶绿素和维生素c 的 含量。许多红螺菌和某些绿硫菌代谢过程中都能释放氢气，因此光合细菌在能源开发方 面具有很大的开发潜力。同时，光合细菌在废水处理和生产食用色素方面也有很好的开 发应用前景 2 1 。光合细菌种类较多，共分7 大类群，5 1 个属，1 0 0 多个品种，目前，生 产上被开发利用的种类并不多【l 】。因此，对自然界中光合细菌菌株的分离、鉴定、培养、 营养特性和利用等方面的研究日益受到国内外学者的关注，是目前研究的热点。 青岛农业大学硕士学位论文文献综述 1 光合细菌的研究历史 第一部分文献综述 有关光合细菌的研究始于十九世纪。1 8 3 6 年，e h r e n b e r g 最早记载了两种使水体变 红的微生物，并注意到此类菌的生长繁殖与光、h 2 s 的存在有关。而后e n g e l m a n n 根据 “红色细菌聚集生长在波长与细胞内色素吸收波长一致的光线下”这个事实，确定这类细 菌具有光合的能力，并正式提出“光合细菌”的概念。直到本世纪三十年代才由美国微生 物学家完成了光合作用细菌的基础研究工作。1 9 3 1 年，v a n n i e l 研究并提出了光合作用 共同反应式： c 0 2 + 2 h 2 a 盘自( c a 2 0 ) + 2 a + h 2 0 其中h 2 a 为光合作用的供氢体，植物光合作用的供氢体为h 2 0 ，所以植物的光合作 用能产生氧气；而光合细菌的供氢体是硫化物或有机物，所以其光合作用不产生氧气。 使光合细菌在光合作用过程中不放氧的现象得到了合理解释，从而为光合细菌的研究奠 定了理论基础。 近几十年国内外对光合细菌的作用机制及应用研究进展较快。2 0 世纪6 0 至8 0 年 代，日本学者小林正泰进行了光合细菌分离、培养技术的研究和在废水处理、饲料添加 剂的广泛应用，大大推动了光合细菌的研究进展 3 1 。此后研究表明，光合细菌营养价值 高、净化水质能力强，且具增强动物抗病力的功能，为此，亚洲的一些水产养殖地区和 国家，纷纷把光合细菌作为提高养殖水平的一种新的生物武器加以应用【4 】。 我国从2 0 世纪6 0 年代开始，中国科学院微生物所和植物所进行了光合细菌的基础 研究；我国8 0 年代也开始了研究应用光合细菌，但我国有关光合细菌资源的研究较少， 且都以表型特征的研究为主。1 9 8 7 年1 1 月，在中国上海成功召开了“第一届中日光合 细菌国际学术会议”，大大推动了光合细菌研究和应用的发展 4 1 。8 0 年代，上海交大等 开始进行光合细菌的应用研究。 目前，我国对于光合细菌在食品保健业、饲料业、微生物产氢等领域的应用，已经 有加大的进展。 2 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 2 光合细菌的分类及形态特征 2 1 光合细菌的分类 光合细菌类型多样，根据伯杰细菌鉴定手册( 第九版) 及常见细菌系统鉴定手 册( 第一版) 可将光合细菌分为七大类群，五十一个属【l 。 表i 光合细菌的分类 t a b l e lp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i ac l a s s i f i e d 类群名称t a x o n数量 外硫红螺菌科( 髓f d 加f o 帕删啦珊吲p 嘲 紫色非硫细菌( p u r p l en o n s u l f u rb a c t e r i a ，p n b ) 1 2 属g e n e r a 2 属g e n e r a 1 8 属g e n e r a 绿硫细菌( g r e e ns u l f u rb a c t e r i a )5 属g e n e r a 多细胞绿丝菌( 肘础缸p f f “枷砌p 胛f 0 螂g r e e nb a c t e r i a ) 4 属g e n e r a 盐杆菌( h e l i o b a e t e r i u m l 含细菌叶绿素的专性好氧菌 3 属g e n e r a 7 属g e n e r a 依据光合细菌所具有的色素体系分之，可分成绿色和紫色光合细菌两大类群，而根 据光合细菌不同的种属特性，可详细的分为以下七大类群： 色杆菌科：这是人们认识最早的一类光合细菌，其中1 2 个属中的8 个属是1 9 世纪 描述过的。细胞球形、卵形、杆状、弧形成螺旋形；二分分裂方式繁殖。运动或不运动； 有或没有气泡运动类型的细胞，具有极生鞭毛，单根或丛生。光合内膜系统与细胞质膜 相连，呈囊泡状，只有一个种t h i o c a p s ap f e n n i g i i 有管状内膜和细菌叶绿素b 。所有其 他种均含有细菌叶绿素a 和类胡萝h 素的第1 、3 、4 群。通常含有类胡萝卜素群l 菌株 的培养物呈现橘棕色到红棕色或粉色，含类胡萝卜素群3 的呈现紫红色，含胡萝h 素群 4 的菌种呈现紫罗兰色。 外硫红螺菌科：这群菌最早是由p e l s h l 9 3 7 年发现的，曾经归为着色杆菌科。细胞 螺旋形或杆形，极生鞭毛或双极生鞭毛运动，二分分裂，有或无气泡，革兰氏阴性。依 靠细菌叶绿素和类胡萝卜素作光合色素进行厌氧光合作用。利用还原性硫代物作电子供 体光下厌氧生长。硫化物被氧化成元索硫，沉积在细胞外并可进一步氧化成硫酸盐。存 在于海洋和含有硫化物及中性或高p h 值的极端盐环境中。 紫色非硫细菌：这个科的细菌利用各种有机物作为光合反应的氢供体，以此进行光 3 青岛农业大学硕士学位论文文献综述 合异养生长。因而，它们生长在含有多量有机物的水层中。不过，有一部分紫色非硫细 菌也能生长在含氧水层中以靠呼吸进行生长。因此，它们是兼性光养微生物。 绿色硫细菌或绿菌科：细胞球形、卵形、直或弯曲的杆形：二分分裂或三分裂繁殖。 有一个属细胞呈单细胞丝状。高柔韧性，可滑行运动；其他属则不运动。气泡有或无。 光合色素位于细胞质膜和载色体上，载色体位于细胞质膜下并附着在质膜上。现在已知 种的培养物或细胞从颜色上可清楚的分成两群：绿色( 草绿色) 或棕色( 巧克力棕色) 。绿 色种的所有菌株都以细菌叶绿素c 或d 作为主要的色素成分，加上少量的细菌叶绿素a ， 主要的类胡萝h 素是群5 。严格厌氧，专性光养生长。能以硫化物或元素硫作电子供体 进行光自养生长。如果硫化物被氧化，将在细胞外形成硫粒大多数种可将元素硫氧化 成硫酸盐。所有的属都可能混养生长，即在硫化物和碳酸氢盐存在时光合同化一些简单 的有机物。与所有的紫色细菌不同，绿硫细菌通过还原性三羧酸循环进行c 0 2 的自养 同化。所有的种中的多数菌株都需v b 2 作生长因子。 多细胞丝状绿细菌：这类细菌1 9 7 1 年才被发现，目前已知有4 个属，其共同特点 是细胞单列排成多细胞丝状体，可滑行运动。与绿硫细菌不同，该菌群均是兼性好氧菌， 在其光养或化氧代谢中喜好利用多种有机物质。实验室培养时，还原性硫化物不是重要 的电子供体物质。除螺丝菌属无载色体而仅含有细菌叶绿素a 外，其余各属均具有载色 体，含细菌叶绿素a 、c 、d 。 盐杆菌科：该菌群发现于8 0 年代，最大的特征是产生细菌叶绿素g ，及没有分化 的光合器官，光合色素位于细胞质膜上，包括螺旋杆菌属和螺旋菌属。培养物颜色为绿 色。革兰氏染色为阴性，细胞壁非常特殊，且非常脆弱很容易裂解，因而其存活时间很 短，有证据表明其细胞壁成分更接近革兰氏阳性菌。严格厌氧专性光养异养代谢。可利 用的碳源很少，对所有种来说丙酮酸是最好的碳源，生长需要b 族维生素。 含细菌叶绿素的专性好氧菌：继s h i d a 等于1 9 8 2 年首先发现了长赤细菌，其他各 属均是9 0 年代才发现。该菌群虽然也含有细菌叶绿素a 和类胡萝卜素( r o s e b a c t e r 属的 两个种例9 b ) ，但厌氧光照条件下不生长，均是专性好氧生长。多数种属能兼性光养异 养生长，革兰氏阴性。 4 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 2 2 光合细菌的形态特征 光合细菌属革兰氏阴性菌，形态特征多样。一般为球形、卵形、杆形、弧形、螺旋 形、环形、半环形、丝形，也可随培养条件和生长阶段以及菌种不同变为链状、锯齿状、 格子状、网球状等。光合细菌细胞直径球状一般为0 3 加6 l m a ，杆状o 9 - - - 2 0 1 u n ，螺旋 状3 o 5 0 p a n 。多数光合细菌具有运动特性，有的以鞭毛运动，有的以滑行方式运动。 增殖方式主要以二分分裂方式进行，少数为出芽增殖。 光合细菌细胞内无叶绿体，也无类囊体，但具双层膜的类似叶绿体的结构，该结构 中含有类似于植物叶绿素a 的光合色素一细菌叶绿素，有的还含有大量的类胡萝b 素， 即细胞色素主要是细菌叶绿素a ，b ，c ，d ，e ，g 和类胡萝b 素等。细菌叶绿素和类胡 萝b 素的光吸收波长分别为7 1 5 1 0 5 0 n m 和4 5 0 - 一5 5 0 n m ，因而类胡萝1 - 素也是捕获光能 的主要色素，它扩大了可供光合细菌利用的光谱范围。不同种类光合细菌因其所含色素 的种类和组成的差异而显示不同的菌体颜色。 3 光合细菌的光合作用机制 光合细菌的光合作用与绿色植物和藻类的光合作用机制有所不同。大部分光合细菌 还能以厌气的硫还原菌所产生的h 2 s ，c 0 2 为营养源进行光合生长，能去除h 2 s 。光合 细菌在自然水域的厌气层和好气层都发生有光合生物参与的碳素循环，在厌气层中，光 合细菌除参与碳素循环外，同时还参与硫循环；光合细菌不仅能进行光合作用，也能进 行呼吸、发酵或脱氮1 5 1 。光合细菌生理类型的多样性使它成为细菌中最复杂的菌群之一， 在不同的自然环境下，它能表现出不同的生理生化功能，如固氮、固碳、脱氢、硫化物 氧化等，这使得光合细菌在自然界的氮、碳、硫循环中发挥着重要作用，在利用光能进 行光合反应时，因为用于还原c 0 2 的供氢体不同，其反应式可归纳为3 类： 1 ) 硫化氢为还原二氧化碳的供氢体： 2 h 2 s + c 0 2 一( c h 2 0 ) ( 菌体) + h 2 0 + 2 s ： 2 1 以有机物为供氢体： 2 h 2 a ( 有机物) + c 0 2- ( c h 2 0 ) ( 菌体) + h 2 0 叶2 a i 3 1 以硫代硫酸盐为还原二氧化碳的供氢体。 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 尽管一些光合细菌可在黑暗中异养生长，但它们的主要营养模式却是光合型的。此 类光合细菌在浅海沉积物中常见，并通过转化有毒的硫化氢形成低毒的氧化态化合物而 扮演重要的生态角色。此外，某些光合细菌在有氧环境中也能进行无氧光合，它们属于 兼性光合细菌，能够利用光作为附加能源异养生长，这些兼性光合细菌在有氧的海洋生 境中常见，约占细菌总数的6 3 1 6 ；。 原初反应是光合作用中光能转化的最重要的反应，其发生部位是光合反应中心。光 合细菌的光合反应中心含有6 个细菌叶绿素分子，这些色索分子排列为近似c 2 对称的 2 条电子传递链，其中2 个细菌叶绿素分子组成的1 个“特殊的”细菌叶绿素对构成了2 条电子传递链的交汇点，它是原初反应的电子供体，即原初电子供体( p ) ：在2 条电子 传递链的末端各有1 个脱镁细菌叶绿素分子，它们是原初反应的电子受体，即原初电子 受体( 岣；在2 条电子传递链的细菌叶绿素对和脱镁细菌叶绿素之间各有1 个“辅助”细 菌叶绿素分子( b ) ，它们是电子由原初电子供体( p ) 向原初电子受体( h ) 传递的桥梁。 4 光合细菌培养条件的研究概况 光合细菌种类多，不同的环境条件对光合细菌的生长影响程度也不同。杨官娥等在 培养液中添加槲寄生最高可使光合细菌活菌数增加达8 倍以上；而且可以使光合细菌不 经过延迟期直接进入指数期，缩短光合细菌的生长周期；且使光合细菌脱氢酶活性提高 8 4 倍【”。刘影等研究了不同浓度的三十烷醇、a 萘乙酸和赤霉素对光合细菌生长的影 响。结果表明这三种植物生长激素对光合细菌的生长均有促进作用。其中赤霉素的促生 作用最明显【8 】。操玉涛对光合细菌m 0 1 的培养条件进行了优化研究，结果表明：菌株 的生长温度为3 0 c 时，最适培养光照为3 0 0 0 i x ，最低接种浓度为6 【9 】。王笃彩通过改 变水体的盐度、温度、光照、p h 值，观察环境因子的改变及不同的抗生素对光合细菌 生长的影响。结果证明，光合细菌的活性受环境因子及抗生素的影响较大，酸性环境、 低温、过强的光照及多种常用抗生素均对光合细菌有抑制作用。光合细菌最适宜的生长 环境是：p h 值7 5 8 5 ，温度2 6 - - 3 0 ，光度5 0 0 5 0 0 0 i x ，而盐度对光合细菌的生长影 响相对较小【lo 】。操玉涛等对红假单胞菌属光合细菌m 一0 1 培养条件进行了初步探讨，结 果表明：菌株生长温度为3 0 c 时，最适培养光照度为3 0 0 0 i x i n 。吴映明等观察不同强 度( o 0 5 t 、0 0 s t 、0 2 5 t 、0 1 t ) 的磁处理水对光合细菌生长的影响结果：磁场强度为o 0 5 t 、 6 青岛农业大学硕士学位论文文献综述 o 0 8 t 、0 2 5 t 的磁处理水对光合细菌的生长有明显的抑制作用( p o 0 5 ) t 1 2 1 。钱 大益等对光合细菌的生长条件进行了较系统的研究与观察，发现温度、照度和p h 值影 响光合细菌的生长，并且三者之间又相互制约实验结果表明，温度为3 0 ，照度为 2 2 5 0 1 x ，p h 值为7 8 时光合细菌的光密度最大，生长态势最好 】。郑爱榕等利用错流 超滤技术从河流、河口、海洋水体和微藻培养液中提取胶体，研究了胶体来源和粒径对 沼泽红假单胞菌生长的影响。结果表明，在一定的胶体有机碳浓度范围，河流胶体 ( o 2 8 1 0 i _ u n o l l ) 、河口胶体( o 1 2 1 2 1 t m o l l ) 、海洋胶体( o - s 8 8 p m o l l ) 和生源胶体 ( 7 7 - 5 4 8 6 u m o l l ) 都能促进p s b 的生长，分别使其相对增长率平均提高了 4 7 3 - , - 1 9 6 2 ，3 6 一9 3 ，8 1 - - 1 0 4 和2 4 嗡9 1 。刘影三种植物生长激素对 海洋光合细菌的生长均有促进作用。其中赤霉素的促进作用最明显，其最佳质量浓度为 0 5 m g l ，经1 2 d 培养后，细菌浓度比对照样可提高1 5 3 9 。三十烷醇和a 一萘乙酸的 最佳质量浓度均是1 0 m g l ，分别可提高9 0 7 和2 0 6 1 1 5 】。熊万永等对应用于废水处 理的光合细菌的培养最适温度、光照、p h 值、溶解氧等条件进行了较系统的研究，通 过正交实验，得出光合细菌生长的最适条件为光照强度3 0 0 0 l x 、微好氧、3 0 c 、p h 7 0 t 1 6 1 。 安立超等对红色非硫光合细菌的生长规律及其影响因素进行研究，试验表明在进行污水 处理时所用的红色非硫光合细菌的最佳培养条件为接种量2 ，p n 7 8 ，光照强度为 1 5 0 0 1 x ，光照厌氧条件下培养3 5 d 【1 7 1 。黄宁宇等以光合细菌中的沼泽红假单胞菌、球 形红假单胞菌、荚膜红假单胞菌为试验对象，分别比较三株光合细菌在不同温度、盐度、 p h 生态环境下的生长差异。试验结果表明：球形红假单胞菌为广盐性菌种，荚膜红 假单胞菌适宜在高盐度水中生长，沼泽红假单胞菌则适宜在低盐度水中生长。沼泽红 假单胞菌生长受p h 影响较大，适宜在培养基初始p h 值较低的水中生长，随着p h 的 升高，生长速度下降；球形红假单胞菌和荚膜红假单胞菌则适宜在各种p h 水环境中生 长。三种光合细菌相对适宜在2 5 3 0 ( 2 之间生长【1 8 】。韩向红等通过三株红假单胞菌在 不同碳源、氮源、p h 值和不同温度等条件的混菌培养实验，筛选出适合其生长的最适 碳源、氮源、p h 值和培养温度试验结果表明：该混合菌株在乙醇、丙酸钠、乙酸钠等 5 种碳源中，以乙酸钠为最适碳源；在氯化铵、硫酸铵等5 种无机氮源中，以硫酸铵为 最适氮：最适p h 为8 5 ；最适培养温度为3 8 c 1 9 1 。杨莺莺等对分离鉴定的一株荚膜红 假单胞菌研究结果表明：菌株可适应的温度、盐度、p h 范围分别为2 0 , - - , 4 0 、o 4 0 0 、 7 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 6 0 - - 9 0 。最适的温度3 0 c 、盐度1 0 、p h 为7 o ；光照度5 0 0 5 0 0 0 1 x 范围内菌都可生 长，在此范围内，光照度越强，菌生长越快；p s 2 菌株可在明处进行厌气性光合生长， 在暗处进行需氧性兼性生长【2 0 】。熊万永等对光合细菌培养的最适温度、光照、p h 、溶 解氧等条件进行了较系统的研究，通过正交试验，得出光合细菌生长的最适条件为光照 度3 0 0 0 1 x 、微好氧、3 0 c 、p h 7 0 2 ”。王立超等观察了在不同温度、光照及p h 下光合 细菌的不同生长情况。发现温度、光照、p r i 之间相互制约，三者同时影响着光合细菌 的生长。试验得出光合细菌生长的最适条件是：温度1 5 2 0 ，光照为3 0 0 0 0 5 0 0 0 l x ， 培养基p h 为7 ；温度为2 5 3 0 时，光照为3 0 0 0 - - - 5 0 0 l x ，培养基p h 为7 2 2 】。 5 光合细菌的营养特性 光合细菌的菌体无毒，营养丰富，蛋白质含量约高达6 0 ，是一种优质蛋白源。还 含有多种维生素，特别是维生素b 2 、叶酸、生物素的含量是酵母的几十倍【2 3 1 。此外， 还含有许多活性物质，如辅酶q l o 、抗病毒物质及促生长因子等。这些活性物质与核酸 合成有密切关系，能参与有机体神经组织的代谢并促使血液的形成，因此作饲料添加剂 可促进家畜生长，增强抗病能力。s h i p m a n 等利用一株非硫光合细菌处理农副产品生产 单细胞蛋白，处理后的光合细菌菌体约含有6 5 0 的粗蛋白和5 1 的核酸，且氨基酸 含量可以和传统的动植物蛋白源相提并论，为工业化大生产提供了理论依据【2 4 】。邱宏端 等采用酿造酱渣培养光合细菌，3 d 后测定酱渣光合细菌饲料中粗蛋白含量为 2 1 3 - 一2 2 7 ，较原料酱渣提高3 5 以上，氨基酸总量提高2 0 左右【捌。而且用酱渣光 合细菌蛋白饲料喂养鱼苗，鱼苗成活率提高，不仅充分利用了工农业生产的废渣废水， 还开拓了新的蛋白源，为改善我国饲料严重短缺开辟了重要途径。 6 光合细菌的应用概况 6 1 光合细菌的色素应用 迄今为止，食品着色剂广泛使用焦油及人工合成色素，随着科学的发展，人们逐渐 认识到以煤焦油系列为主要成分的合成色素具有致癌性，因此天然色素的开发备受关 青岛农业大学硕士学位论文文献综述 注。各国卫生主管部门相继禁止3 6 0 多种合成色素的使用；与此同时，各国食品界正大 力进行天然色素的研究，开发了红、橙、黄、青四个颜色的天然色素。类胡萝b 素是天 然色素开发的一个主要研究方面，从其化学性质来说，类胡萝b 素可以与糖结合成糖苷， 与脂肪酸结合成酯，也可与蛋白质结合在一起，在生物体内发挥多种功能。 光合细菌富含类胡萝b 素，是天然红色素的重要来源。被认为是类胡萝b 素生产的 最佳原料，具有无毒，易提取，色彩鲜艳，有光泽，且具有防水性，成本低、产量高、 制备简便、使用安全等特点，可作为食品着色剂和添加剂，目前已经广泛用于油脂类、 豆制品、蔬果类以及饮料等的着色。蓝细菌、绿硫菌与植物产生类胡萝b 素的原理相似， 都是将八氢番茄红素转变为番茄红素，这是生物合成类胡萝b 素的个初期步骤闭。类 胡萝卜素可以隔离紫外线、防止化学致癌物诱发癌变，能清除体内超氧自由基，具有抗 衰老的功效。 牟海津等对光合细菌的培养条件进行研究后，发现适当增加菌种的接种量和光照强 度、以及微好氧培养，均会提高光合细菌的生长速度【2 7 1 。采用石油醚一甲醇抽提法对 菌体中的类胡萝b 素进行提取，对所获得的色素的部分性质进行分析，通过薄层层析发 现其中含有二种组分。该色素对酸较为稳定，对热的稳定性则较差。在室内光线条件下， 具有一定的稳定性，可以较长时间地保存，但在室外阳光立射处便会迅速分解。郝常明 等优化并确定了光合细菌培养基配方：以乳酸钠为碳源，谷氨酸钠为氮源，用酵母来替 代微量元素和生长因子1 2 8 1 。在此基础上进一步确定了最佳发酵工艺条件。崔战利等对沼 泽红假单胞菌b 9 菌株类胡萝b 的提取进行了研究，用超声波破碎菌体，类胡萝卜素获 得量较高；菌体中类胡萝卜素用丙酮提取，提取效果因菌体量、丙酮用量而变；提取液 经萃取、皂化、洗涤得到类胡萝b 素粗制品，对其分析表明b 9 菌株含有螺菌黄素系列 的类胡萝b 素1 2 9 1 。李东风，杜近义等研究了沼泽红假单胞菌类胡萝b 素的稳定性，该色 素对氧、光照、温度的作用有一定的耐受性，在微酸性至弱碱性条件下有较好的稳定性。 但当氧、光照、湿度的作用强度增加，介质和p h 值进一步改变，该色素将受到破坏， 表现为褪色或变色，吸收光谱发生改变 3 0 1 。顾新，梁新乐等对光合细菌r 1 产类胡萝b 素进行发酵条件优化，初步确定了获得类胡萝b 素较高产率的合适培养条件p ”。 为了大规模生产的需要，应当在迸一步降低培养基成本、优化工艺以提高菌体生长 量、增加类胡萝b 素产量以及色素制品的保存等方而做更深入的研究工作。 9 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 6 2 光舍细菌在保健品方面的应用 自2 0 世纪7 0 年代以来，许多国家广泛开展了光合细菌的研究开发，因其含有丰富 的营养成分和生物活性物质而被开发成多种保健食品、药品。 光合细菌能够增强动物的抗氧化能力，经动物实验表明其具有延缓衰老、免疫调节 的作用【3 2 1 。据美国商务部透露，仅1 9 9 2 年，美国保健品中约有5 5 - - 6 5 的品种加有 不同比重的光合细菌菌液。美国太空署曾拨款32 0 0 万美元，开发研制在宇宙飞船内制 造光合细菌食品的新技术，为宇航员长期滞留太空提供食品保障。其中最具代表性的当 属新奥尔良贝鲁斯潘有限公司投产的p g h 浓缩液，富含维生素、入体所需的微量元素、 氨基酸等营养成分，可调节内分泌，提高机体自身的免疫力。还有一种叫“米格申”的含 光合细菌菌液的饮料，在健全中枢神经、预防中老年痴呆方面效果显著。在日本，光合 细菌饮料也因具有延缓衰老的作用以及在防止心脏病、脑梗塞、癌症等方面的神奇功效 丽倍受青昧。日本生物化学工业公司生产的一种“紫色光合细菌保健食品”，在日本、欧 洲等国申请了专利，该保健食品采用光合细菌和乳酸菌的混合代谢产物，用于维护人体 的健康状态。 由于光合细菌菌体本身富含蛋白质( 6 0 以上) ，国内外研究者还将其用于蛋白质 的开发生产。美国能源部太阳能研究所的“在宇宙飞船中生产用于动物和人类食物的单 细胞蛋白”研究己于1 9 9 1 1 9 9 4 年申报了美国、加拿大专利。法国、意大利等国家进行 了更适合工业化大生产的中试研究。 近年来，我国也积极开展了光合细菌在保健食品方面的应用研究，1 9 9 7 年6 月， 卫生部批准了以光合细菌为主要成分的“安泰3 6 9 口服液”保健食品，具有延缓衰老、免 疫调节、血脂调节等保健功能，适宜中老年入、肿瘤患者及高血脂人群服用。研究认为， 光合细菌所含泛醌的异戊二烯侧链链长与人体细胞的一样，容易进入细胞膜，使线粒体 内的活性氧被氧化，使自由基的生成减少。自由基被称为人的衰老因子，是人体新陈代 谢的副产品，对人体内正常的生化反应具有破坏作用。中国科学院吉海平等的检测表明， 光合细菌可有效清除自由基，其清除率达9 0 以上【3 矾。 土梦亮等开发了一种经过微生物箩酵而形成的含有光合细菌菌体蛋白及其代谢分 泌物、有机硒化合物和中草药发酵物的混合物，并申请了中国专利，此光合细菌制剂能 够减少x 射线引起的白细胞减少及染色体变异，能够增加小鼠的巨噬细胞吞噬量，具 1 0 青岛农业大学硕士学位论文文献综述 有非常明显的保健治疗作用 3 4 1 。 以光合细菌为生产原料的保健品有巨大的市场潜力，但是光合细菌的种类繁多，不 可能将所有的菌株一次性研究，所以要针对每一株开发的新菌株深入研究。 6 3 光合细菌在医药方面的应用 由于光合细菌含有丰富的营养成分和生物活性物质，对人体具有保健作用，因此， 其在医药保健品方面的应用越来越受到国内外研究者的关注【3 5 1 。安徽大学荚荣等研究表 明，在光合细菌的应用研究中，将中草药木瓜、栝楼、女贞子、郁金、夏枯草等浸提液 加入培养基中进行培养，发现该中药浸提液可明显促进光合细菌的生长，并具有促进光 合细菌抑制其他杂菌生长的能力，实验证明，光合细菌和中草药的混合液的抑菌作用要 比其中任一种的单独作用大【3 6 】。 1 9 9 8 年2 月，美国基因疗法周刊以“癌症的绿色基因疗法将改善癌症的治疗方 法”为标题，报道了绿色植物和光合细菌中的绿色叶绿素i i 的衍生物应用于肿瘤的治疗 方法。该方法是将肿瘤暴露于光照下，通过光动力激活杀死癌细胞的药物活性。而叶绿 素i i 的衍生物不仅能吸收可见光，还可吸收能穿透人体组织的远红外光，从而达到治疗 目的。 日本广岛大学工学部永井史朗教授领导的研究小组，根据紫色非硫光合细菌的特点， 率先开始光合细菌生产5 氨基乙酰丙酸( a l a ) 的研究，结果发现，紫色非硫光合细 菌在挥发酸培养液中，可产生高浓度a l a ( 2 7 7 9 l ) 。 我国学者刘秀艳等综合国外研究报道，认为光合细菌是一类可以大量合成a l a 并 分泌到细胞外的微生物，应用光合细菌生物合成a l a 比用化学方法合成a l a 有巨大 的优势【3 7 】。光合细菌本身也能够完全或部分对抗免疫抑制剂的免疫抑制作用，对小鼠的 免疫器官与免疫功能有一定的保护作用【3 8 】。近年来，利用光合细菌的代谢作用对中药进 行生物技术处理，又开辟一新的研究领域【3 9 1 。太原康强药业有限公司研究开发的一种以 中草药为原料，利用现代生物工程技术研制而成的富硒光合细菌制剂，能够明显提高癌 症患者的免疫功能，并且具有一定的抑瘤作用 4 0 l 。刘俊清等利用光合细菌，以还原态硒 化物发酵合成了多种生物活性的有机硒化合物，并且制成了以硒蛋白j 硒酸多糖和富硒 卟啉色素为主要成分的“康强硒”制剂，此制剂能够辅助治疗恶性肿瘤，提高患者的免疫 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 力等【4 l 4 2 1 。史国富等对康强胶囊的应用进行了详细的报道，并高度评价了其采用中药 复方与光合细菌发酵技术相结合的独特制备工艺技术，指出该技术是传统中药与现代生 物技术的结合应用，对以后的中药研究、应用、开发作出了新的贡献1 4 3 1 。刘继彪等用光 合细菌菌液发酵中药，制成了口服液、冷冻干燥产品等中药制剂，该制剂能够纠正机体 内环境微量元素平衡紊乱，促使癌细胞向正常细胞转化并最终全部恢复成正常细胞，对 恶性肿瘤治疗有较显著疗效，并申请了国家专利【4 4 1 。 6 4 光合细菌在畜牧业生产中的应用 光合细菌营养物质丰富，含有多种氨基酸，同时含有多种免疫因子和促生长因子， 如光合细菌含有3 种不同抗原( a 9 1 、a 9 2 、a 9 3 ) ，能刺激脾淋巴细胞转化功能；光合细 菌分泌多种消化酶，和动物内源酶共同促进饲料的消化和吸收，提高饲料利用率；光合 细菌合成b 族维生素和生物活性物质辅酶q l o ，促进动物生长，且能预防矿物质及维生 素缺乏引起的营养代谢病及蛋白质代谢障碍。辅酶q i o 具有增强心肌功能、抗休克、提 高免疫力、改善细胞内呼吸等多种生理功能，能够促进动物的生长，提高抗病能力。 在家禽养殖方面，饮水中添加光合细菌对提高雏鸡成活率的效果i 4 ”，还可以提高出 栏成活率闱；而以饮水方式饲喂不同日龄肉鸡，试验表明，可提高增重9 1 2 ，提高 饲料利用率7 9 1 4 7 4 8 1 ，日增重提高约2 3 8 2 6 4 1 4 9 1 。蛋鸡一般添加在日粮中，研 究发现，日粮中添加光合细菌菌液，可提高蛋重和产蛋率，降低破损率、料蛋比、死亡 掣5 0 j ，并且鸡蛋中的硒含量和s o d 酶活性大大提高，蛋品色泽鲜亮，提高了鸡蛋的营 养价值，同时改善了产蛋鸡机体的生理状况，提高了抗氧化活性，增强了防病、抗病能 力。同时，产蛋期延长1 5 ”。高登文研究报道在蛋鸡饮水中添加光合细菌，结果表明，在 蛋白度、哈夫单位和蛋壳强度方面，试验组分别为5 9 8 、7 4 2 7 和2 9 8 ，对照组分别为 5 7 3 、7 2 1 7 和3 1 3 ，试验组前2 项优于对照组，蛋壳强度略低于对照组，光合细菌不 仅能提高蛋鸡生产性能，而且能改善鸡蛋品质( 5 2 1 。 在反刍动物养殖生产上的试验表明，据报道，健康奶牛饲喂光合细菌后，平均每天 多产奶2 5 - 3 k g ，且体型匀称丰满，屠宰后肌肉鲜红、有光泽，肉质鲜嫩多汁；饲喂光 合细菌的肉牛平均同增重多0 2 k g ，净肉率提高o 7 。v a r g a 等研究表明，向发酵牛奶 中加入蓝细菌，不仅可以保护双歧杆菌及其他有机体，还增加了牛奶中氨基酸和维他命 青岛农业大学硕士学位论文 文献综述 的含量，提高了脂肪酸的组成。从现代营养学观点来看，光合细菌为生产功能性牛奶食 品开辟了崭新的途径【5 3 1 。奶牛喂养光合细菌后增产2 5 k g d ，肉牛净肉率提高o 7 例j ； 对不同生理时期的奶牛及患胃肠病奶牛的饲料中加喂光合细菌的试验，结果表明每天每 头牛加喂2 5 0 - - - 3 0 0 m l 光合细菌，7 d 后显效，平均每天每头牛多产奶3 k g ，病牛9 d 后症 状消失，恢复产奶1 5 5 】。光合细菌对促进羊生长及防病治病的效果也非常明显【圳。 特种养殖方面，光合细菌添加剂饲喂火鸡，可提高火鸡日增重和抗病力【5 7 1 ；在乌鸡 的日粮中添加光合细菌菌液，不同的阶段，添加量也要有