（动物营养与饲料科学专业论文）蚯蚓抗菌肽提取纯化及其性质研究.pdf

贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 蚯蚓抗茵肽提取纯化及性质研究 摘要 本实验以蚯蚓为原料，采用大肠杆菌诱导，通过电击的方式对抗菌肽的提取 进行了探索和研究，结果表明：直接电击提取的蚯蚓液对大肠杆菌的抑菌圈直径 1 9 7 m m ，效果最好；大肠杆菌诱导3 h 、4 h 、5 h 、6 h 的蚯蚓液对大肠杆菌的抑菌 圈直径分别为1 8 o o m m 、1 5 3 3 r a m 、1 7 3 3 r a m 、0m m ，有随诱导时间延长抑茵效果 逐渐降低的趋势；直接提取液、大肠杆菌诱导3 h 、4 h 、5 h 、6 h 的蚯蚓液对黄曲 霉的抑菌圈直径分别为1 6 o o m m 、1 4 o o m m 、1 3 o o m m 、1 2 o o m m 、1 0 o o m m ，以直 接电击提取液的抑菌效果最好，也呈随诱导时间延长抑菌效果逐渐降低的趋势： 本次提取液对大肠杆菌抑菌圈直径明显大于国内相关报道( 大肠杆菌的抑菌圈 1 9 7 r a m 1 1 o o m m 、o m m 、5 2 6 m m ) ，且发现了蚯蚓提取液对黄曲霉有明显的抑 菌作用( 国内尚无报道) ；蚯蚓提取液对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌无抑菌作用； 提取的粗液经s e p h a d e xg - 1 0 0 层析提纯后对黄曲霉的抑菌作用降低( 抑菌圈直 径1 6 m m ：1 2m m ) ；对大肠杆菌没有抑菌作用( 抑菌圈直径1 9 7 m m ：o m m ) ；将蚯 蚓提取物用s d s - p a g e 电泳测出其蛋白质分子量主要在1 4 4 - - 2 0 o k d a 范围内， 其中一条带的分子量在1 4 4 k d a 以下，说明该提取提取物为多肽。从而，认为采 用大肠杆菌诱导，通过电击的方式可以提取具有抗黄曲霉和大肠杆菌的多肽，为 利用蚯蚓提取抗菌肽粗液提供了一个成功的方法；发现了采用这种方法提取的蚯 蚓液有很好的抗黄曲霉的作用，为解决黄曲霉对饲料污染与其对畜牧业的危害问 题提供了一个新的线索；通过层析分离提纯会导致提取液抑菌效果的降低和消 失，其方法还需进一步改进。 关键词：蚯蚓；大肠杆菌诱导；黄曲霉；电击；抗菌肽 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 e x t r a c t i o np u r i f i c a t i o na n dn a t u r er e s e a r c h o fe a r t h w o r ma n t i b a c t e r i a lp e p t i d e a b s t r a c t t h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e so fp e p t i d e sf r o me a r t h w o r me o e l o m i cf l u i de x t r a c t e d w i t he l e c t r i cs h o c k sa n de c o l i i n d u c t i o n + e l e c t r i cs h o c k sw e r es t u d i e d 1 1 1 e o s e r e s u l t ss h o wt h a t ：a f t e ro h ，3 h ，4 h ，5 h ，a n d6 hi n d u c t i o n 、析me c o l i ，t h ei n h i b i t i o n d i a m e t e ro fe c o l i w e r e19 7 m m , 18 0 0 m m 、15 3 3 m m 、17 3 3 m ma n d0 m m r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t sa l s os h o w e dt h a ti n h i b i t i o nd i a m e t e rd e c l i n e dw i t ht h e i n d u c t i o nt i m e i n h i b i t i o ne f f e c to fa s p e r g i l l u sf l a v u si nd i a m e t e rw e r e16 o om n l 、 1 4 0 0 r a m 、l3 0 0 m m 、1 2 0 0 r n ma n d1 0 0 0 m r nr e s p e c t i v e l y t h eb e s tw a sd i r e c te l e c t r i c s h o c k s i n h i b i t i o nd i a m e t e ro fa s p e r g i l l u sf l a v u sa l s or e d u c e dl i n e a r l yw i l t hi n d u c t i o n t i m e 谢廿1e e o l i t h ee c o l ii n h i b i t i o nd i a m e t e rw e sl a r g e rt h a nt h er e p o r t s 饵e o l i i n h i b i t i o ne f f e c to fl9 7 m m ：1 1 0 0 m m 、0 m m 、5 2 6 m m ) ，a n df o u n dt h a tt h e a n t i m i r c o b i a lp e p t i d e sf o r me a r t h w o r mw e r ef o u n dt h a th a v ea n i t - a s p e r g i l l u sf l a v u s e f f c t s ；t h e r ew e r en oi n h i b i t o r ye f f e c to ft h ep e p t i d e so ns t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ， p s e u d o m o n a sa c r u g i n o s a a f t e rp u r i f i e d 埘t l ls e p h a d e xg - 10 0c h r o m a t o g r a p h y ，t h e a s p e r g i l l u sf l a v u si n h i b i t o r ye f f e c tw a sr e d u c i n g ，( a n t i b a c t e r i a lc i r c l ed i a m e t e ro f16 m m ： 12 r a m ) ：a n dt h e r ew e r en oi n h i b i t o r ye f f e c to ne c o l i ( a n t i b a c t e r i a lc i r c l ed i a m e t e ro f 19 7 m m ：0 m m ) 1 f 1 1 ep e p t i d e sm o l e c u l a rw e i g h tm e a s u r e db ys d s p a g ew e r e m a i n l yi nt h e1 4 4 - 2 0 0k d a , a a do n ez o n e w a sl e s st h a n1 4 4k d a s ot h a tt h eu s eo f e c o l i - - i n d u c e da n de l e c t r i cs h o c k st oe x t r a c th a sa n t i a f l a t o x i na n dt h ee e o l ip e p t i d e ， f o rt h eu s eo fe a r t h w o r m se x t r a c t i o no fc r u d ea n t i m i e r o b i a lp e p t i d e sp r o v i d e sa s u c c e s s f u lm e t h o da n df o u n dt h eu s eo ft h e s em e t h o d so fe x t r a c t i n gt h ee a r t h w o r m h a v eag o o dt h er o l eo fa f l a t o x i ni no r d e rt or e s o l v et h ea f l a t o x i nc o n t a m i n a t i o no f f e e df o rl i v e s t o c ka n di t sh a z a r d st op r o v i d ean e wt r a i lt h r o u g ht h ec h r o m a t o g r a p h y s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nw i l ll e a dt oe x t r a c ti n h i b i t o r ye f f e c to ft h ed e c r e a s ea n d d i s a p p e a r , t h en e e dt of u r t h e ri m p r o v ei t sm e t h o d s k e yw o r d s ：e a r t h w o r m s ；a n t i m i c r o b i a li n d u c t i o ne c o l i ；a s p e r g i l l u sf l a v u s ；e l e c t r i c 1 2 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 图1 图2 图3 图4 图5 图6 图7 图8 图 蚯蚓体腔液对大肠杆菌抑制效果3 6 蚯蚓体腔液对黄曲霉抑制效果。 蚯蚓体腔液对黄曲霉抑制效果3 8 蚯蚓电击提取液层析色谱图3 8 电击提取液层析后抑制黄曲霉效果3 9 蚯蚓诱导提取液层析色谱图 。3 9 诱导提取液层析后抑制黄曲霉效果4 0 蚯蚓抗菌肽电泳结果4 0 8 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 表 表1 蚯蚓提取抗菌肽诱导试验方法 表21 0 分离胶配方3 3 表3 10 浓缩胶配方 3 3 表4 不同诱导时间对大肠杆菌抑菌活性的影响3 6 表5 不同诱导时间对黄曲霉抑菌活性的影响 9 3 7 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 略语与符号一览表 英文缩写英文全称中文译名 a f e e o l i s d s 而s t e m 哐d d m l s d e f e n s i n s o l i g o c h a e t a a n n e l i d a s e p h a d e xg p a g e p a 姗 a b p e a s p e r g i l l u sf l a v u s e s c h e r i c h i ac o l i d o d e c y ls o d i u ms u l f a t e t r i s ( h 【y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e n n ，n n 。- t e t r a m e t h y l e t h y l e n ed e a m i n e d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r l o o ps 乜佻t u r e d e f e n s i n s o l i g o e h a e t a a n n e l i d a s e p h a d e xg p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p e p t i d ea n t i b i o t i c s a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s a n t i b i o t i c sp e p t i d e s e a r t h w o r m 黄曲霉 大肠杆菌 十二烷基硫酸钠 三羟甲基氨基甲烷 n n ，n ，n 一四甲基乙二胺 果蝇 环状结构 防御素 寡毛纲 环节动物门 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳 肽抗生素 抗微生物肽 抗菌肽 蚯蚓 l o 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 原创性声明 本人郑重声明，所呈交的硕士学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研 究所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过程的科研成果。对本文在研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任，责任由本 人承担。 论文作者签名： 壶l 垒日期：2 q 监生堑目 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人 授权贵州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复印手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 。 论文作者签名： 主! 】皇 导师签名 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 致谢 本论文从选题、试验设计、试验开展到论文写作，都是在恩师夏先林教授及 施晓丽博士悉心指导下完成的。在三年的研究生期间，两位导师在我的学习、科 研工作和生活上给予了无微不至的关怀。两位恩师广博的学术造诣，严谨的治学 态度、无私的奉献精神和对科学的执着深深感染着我。是导师一贯的高要求、严 标准让我看到了科学的永无止境，也是从导师那里我学到了做科学研究的素养。 感谢导师对我论文工作的指导，更感谢导师给了我这些宝贵的精神财富! 我会时 刻铭记导师的教诲，并向导师表示衷心的感谢和崇高的敬意。 在实验研究和论文的撰写过程中，杨正德教授，陈胜昌老师，刘翠娥同学， 吴仙同学，郭国强同学，马明同学，高俊波同学，杜志勇同学，朱锋钊同学，付 学智同学，刘开崇同学，熊光源同学，徐娥师姐以及动物营养硕士点其他师弟妹 给予我极大帮助和支持，本人在此向他们表示衷心的感谢! 衷心感谢各位评审老师对本文认真细致的审阅，并及时针对论文不足不规范 和不足之处提出宝贵的意见，使我收益颇多。 在这里，还要感谢我的父母，他们在精神上和生活上给予了我无私的关爱和 竭尽全力的支持。在我迷茫和困惑时，是他们的鼓励和关爱使我的信念没有动摇， 保证了我的学业顺利完成。 纸短情长，不能一一表达我的感激之情，在论文答辩之季，再次对所有帮助、 关心过我的老师、同学、朋友和亲人们表示衷心的感谢1 3 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 前言 蚯蚓是以有机废物为食的腐生性动物，且食性很广，几乎所有的畜禽粪便 经发酵后均可被蚯蚓食用，易于集约化高产养殖。蚯蚓生活于病原菌丛生的环境 中，却极少患病，在缓慢的生物进化过程中，为适应不利的生存环境，其体内必 然有独特的抗菌与免疫系统，已经逐渐形成了防御微生物侵袭的有效机制。 抗菌肽是一类广布于动植物体的防御病原微生物入侵的活性小肽。有关抗菌 肽的研究近年来已成为一个热点。尤其无脊椎动物抗菌肽的研究是一个较新的领 域。无脊椎动物没有特异的免疫系统，因此在抵御微生物的侵袭时宿主防御体系 需要依赖先天的防御机制，抗菌肽可能存在于所有的无脊椎动物中。现在，已经 有许多抗菌肽从两栖类动物、昆虫、哺乳动物和甲壳类动物中得到分离。在鱼类 和线虫中也有一些发现。抗菌肽对昆虫及植物病原菌具有抗茵谱广，作用强，不 良反映小，安全范围大，且不产生抗药性，不污染环境的特点。因此开发蚯蚓抗 菌肽作为抗生素饲料添加剂代替品，可以有效地防止病原微生物的侵袭、减少药 物的耐药性和在人体及其动物体内无残留的问题。 蚯蚓与其它动物相比具有来源广，易于养殖，便于处理等优势，同时蚯蚓抗 菌肽主要存在于体腔液中，相对含量高。因此，利用蚯蚓抗菌成分易于诱导的特 性，进行蚯蚓抗菌成分的直接提取利用与开发新一代的抗菌药物，不仅具有合理 的可行性，而且具有广阔的前景。 1 3 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 第一部分文献综述 l 蚯蚓概述 1 1 蚯蚓养殖与常规利用 1 1 1 蚯蚓的生物学特性 蚯蚓( e a r t h w o r m ) ，学名p h e r e t y m ae a r t h w o r m , 属于环节动物门( a n n e l i d a ) 寡毛纲( 0 y g o c h a e t a ) ，俗称曲蟮，中药称地龙，其经济价值很高，种类多， 世界的蚯蚓有3 0 0 0 余种，蚯蚓是一种夜行性环节动物，喜静怕光，白天栖息在温 暖、湿润、疏松、有机质丰富的土壤中，栖息深度一般为1 0 - - 2 0 厘米，夜晚出 来活动觅食，喜食土壤中的有机质和腐烂的落叶、枯草i 蔬菜碎屑、作物秸秆和 畜粪等。 蚯蚓是变温动物，体温随外界温度的变化而变化。一般来说，蚯蚓的活动温 度在5 - - 3 0 范围内，0 一5 进入休眠状态，o c 以下死亡，最适宜温度为1 5 一2 5 ，在此温度范围内蚯蚓能最好的发育与繁殖，4 0 c 以上死亡。蚯蚓卵最 适宜的孵化温度为2 0 。c 一2 5 。蚯蚓没有特别的呼吸器官，它是利用皮肤进行呼 吸的，所以蚯蚓体必须保持湿润，一般它都在6 0 - - 7 0 左右，酸碱度p h 值为6 5 7 5 的疏松土壤中生存，条件不适时，就会爬出逃走。蚯蚓对不同的湿度条件也 有暂时的忍受能力，为了求得生存，它们有时转移到适宜的环境里去，有时通过 休眠、滞育、降低新陈代谢强度等，以减少水分消耗。 蚯蚓为雌雄同体，异体受精。交配时间约2 小时，多在晚上进行。交配后7 天左右卵即成熟，落人蚓茧中，精子也从受精囊中逸出与卵结合。每个蚓茧中多 含i - - 3 个胚胎，在1 8 - 2 5 ( 2 条件下，幼体在2 - 3 周内离开蚓茧，再经5 0 天左右的 生长过程即可达到性成熟，出现生育环。条件适宜时，蚯蚓每3 - 5 天可产卵l 粒， 并可持续7 8 个月。一般4 6 月龄性成熟，1 年可产卵3 4 次，寿命为1 3 年。 世界上最早养殖蚯蚓的国家是新西兰和美国，美国养殖蚯蚓已有七、八十年 的历史。日本在1 9 7 4 年才正式开始养蚯蚓，但仅几年时间，交易额就达2 0 亿日元， 是目前世界上最大的蚯蚓消费国之一。日本、加拿大、菲律宾、印度、新加坡等 国在研究蚯蚓和发展蚯蚓养殖生产上都做了大量工作，如菲律宾首都马尼拉就有 五万多蚯蚓养殖专业户。随着蚯蚓商品化生产的发展，世界蚯蚓贸易也不断增加， 近几年，世界年贸易额已达2 0 亿美元左右，而且每年还在以2 0 , - - 2 5 的速度递 1 4 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 增。我国7 0 年代末才开始养蚯蚓，8 0 年代在全国推广，现已得到一定发展。 1 1 - 2 蚯蚓的综合利用 蚯蚓养殖业之所以在世界范围内得到如此迅速的发展，不仅是因为蚯蚓本身 具有多方面的价值，而且是因为人们越来越认识到蚯蚓在环境保护，变废为宝， 发展生态农业中不可忽视的作用。 1 1 2 1 蚯蚓是优质动物蛋白饲料 北京市营养源研究所对干蚯蚓产品检验分析，其含脂肪5 2 5 ，粗蛋白6 1 7 3 ，每1 0 0 毫克含有1 9 种氨基酸，总重达5 8 5 6 毫克n 1 。蚯蚓所含1 1 种必需氨基酸 中，除其中4 种略低于秘鲁鱼粉外，其他各种氨基酸的含量都高于秘鲁鱼粉、饲 用酵母、豆饼和蛆粉。蚯蚓的脂肪含量也较高，含粗脂肪达8 5 ，仅次于玉米， 而高于秘鲁鱼粉、饲用酵母和豆饼。蚯蚓还含有丰富的维生素a 和b 族维生素复合 体，其中每千克蚯蚓体含维生素b ，达2 5 毫克，维生素b ：约2 3 毫克。此外，蚯蚓体 还含有多种微量元素，其中铁的含量为鱼粉的1 4 倍、豆饼的1 0 倍以上，铜的含量 比鱼粉高1 倍，锰的含量是鱼粉和豆饼的4 6 倍，锌的含量是鱼粉和豆饼的3 倍以 上，蚯蚓对磷的有效利用率高达9 0 口3 。对蚯蚓组成的分析表明，蚯蚓是不可多 得的优质动物蛋白质饲料，它可以替代鱼粉作为禽、畜、鱼及特禽、特种水产品 的饲料添加剂。 蚯蚓粉作为一种畜禽饲料，可以很好的促进各种畜禽动物生长发育、促进产 蛋、降低饲料报酬。用蚯蚓粉代替鱼粉饲喂育肥猪日增重可提高1 3 1 ，料重比 降低0 9 1 口1 。选取添加2 的蚯蚓粉饲喂4 0 日龄体重接近的断奶新西兰白兔， 平均日增重提高1 8 ，料重比下降1 1 6 4 叫。添2 1 ：1 2 的蚯蚓粉饲喂蛋鸡，产蛋 率提高3 4 l ，耗料降低3 9 1 ，鸡蛋中胆固醇含量降低9 9 ，锌含量增加1 1 1 9 ，铁含量增加2 1 6 8 陆1 。在虹鳟稚鱼饲料中添加3 的蚯蚓粉，对其生长及存 活有明显效果。增重1 公斤鱼种，饲料成本降低0 9 7 元旧。因此，用蚯蚓作为蛋 白质饲料，具有很强的利用价值。 1 1 2 2 蚓粪是优质有机肥料 据日本食品分析中心对蚯蚓粪进行分析，在含水份3 2 5 时，全氮为1 2 1 ，含水分1 1 左右时，全氮约为3 6 。与其它有机肥料相比，蚯蚓粪干净、 卫生、无异味，呈颗粒状。特别是经过微生物发酵处理的蚯蚓粪有机肥具有合理 的团粒结构以及孔隙度，通气性好，保水力强，能够提高作物抗旱性能，改善根 贵料大学2 0 0 8 届硕士研究生学僚论文 际土壤的通气性，薹匠蚓粪保水透气缝力比一般壤高3 倍，施过蚯蚓粪的农酒土 质松软，比施用其它肥料根系发达。此外，其所含的大量有机质具有亲水性和吸 附性，使土壤的傈水保腮能力大幅度提高，对过剩的养分也能长期保存，保证作 物持续稳定地吸收肥水而健壮成长。 张余良等用蚯蚓粪与大量元素肥、微量元素的8 个不同复混组合试验表明， 蚯蚓粪与无机肥复合能够不同程度提高肥效，蚯蚓粪9 0 十无机肥1 0 效果最佳。 配合革炭会降低羝蚓粪效果，草炭含量越高效果越差，含量超过6 0 效应变负 【7 】 0 董。王。2 。3 蚯蝴具有缀高憋药用价值 蚯蚓在中医学上名叫地龙，是我国重要的中药材之一，性寒，味微咸。最早 的中药学专著神农本革经中收载的6 7 种动物药中就有蚯蚓。李时珍著本草 纲目虫部4 2 卷中用蚯蚓入药的处方有4 0 多种。中药大辞典中记载用蚯蚓配 方治疗各种疾病者达3 0 多处。目前，人参褥造丸等十余种中成药都含有不同量的 蚯蚓成分。用现代先进的科学技术对蚯蚓的药用成份进行分析，表明蚯蚓体内含 有蚯蚓素、蚯蚓解热素、蚯蚓毒素、黄嘌呤、抗组织胺、维生素b 等多种药用成 份。我国医学界通过长期临床实践证明，蚯蚓确有解热、镇静、抗惊厥、平喘、 降压等多种药理作用。 另外，蚯蚓还是人类的健康食品。国外蚯蚓食品大都以蒸、炒、炸、煎为主， 红烧蚯蚓味道鲜美，胜过海味。又辣又鲜的蚯蚓辣椒酱，能久存不变质。日本食 品工业运用现代技术研制成的蚯蚓保健食品含蛋白质5 8 5 ，脂质6 3 ，驻油 酸n 0 毫克，维生素b l1 3 毫克等。经临床服用表明可调节身体疲劳状况，面除 去血管内过多胆固醇成份，特别适于高血压患者。蚯蚓含有齐全的氨基酸，干粗 蛋自含量高达6 6 3 。我国无锡市某生物化工厂已小批量生产奶粉状的”纯地龙 粉”出阴创汇，效益良好。 1 1 2 4 蚯蚓在环保中的应用 蚯蚓可以处理生活垃圾和农业废弃物解决环境污染问题。蚯蚓以生物垃圾、 农业废弃物作为食物，先将有机废物转化为蚯蚓体和蚯蚓粪，再进一步开发利用， 交废为宝。鉴此，世晃上已有不少国家正在让蚯蚓成为有机废弃物的加工者，既 把废弃物作为”资源”来利用，又为防治污染开辟了新途径。 1 6 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 我国有着非常丰富的蚯蚓资源，但主要用于动物饲料，它的开发利用还停留 在比较初级的阶段，即将蚯蚓直接饲喂畜禽或将蚯蚓加工成蚯蚓粉进行饲喂，效 益很好。如果能将蚯蚓体内的生物活性物质( 如抗菌肽) 提取出来，应用于养殖 业或是其它行业，将会创造出更大的经济价值。 1 2 蚯蚓抗菌肽研究进展 蚯蚓是以有机废物为食的腐生性动物，且食性很广，几乎所有的畜禽粪便 经发酵后均可被蚯蚓食用，易于集约化高产养殖。蚯蚓生活于病原菌丛生的环境 中，却极少患病，在缓慢的生物进化过程中，为适应不利的生存环境，其体内必 然有独特的免疫系统。 抗菌肽( a n t i b i o t i c sp e p t i d e s ，a b p ) 又称抗微生物肽( a n t i m i c r o b i a l p e t i d e ，a m p ) 或肽抗生素( p e p t i d ea n t i b i o t i c s ) ，是一类具有广谱高效杀菌 活性的碱性多肽类物质，广泛分布于细菌、病毒和各种动植物体内，是生物天然 免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽最早是由瑞典科学家b o m a n h g ( 1 9 7 2 ) 阳1 等经注射阴沟杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的，它是一种具有抗菌活性 的多肽，最p c e c r o p i n s 。随后的研究发现抗菌肽广泛存在于昆虫、动物( 包括脊 椎动物和无脊椎动物) 、原核生物及植物体内，迄今为止已发现了2 0 0 0 多种。从 而掀起了人们对抗菌活性肽的研究。目前，已进入临床实验阶段的抗菌肽有细菌 素、源于蛙马盖宁的m s i - 7 8 及源于猪p r o t e g r i n 的i b 一3 6 7 ，其中m s i - 7 8 已进入临床 实验嗍。 国外最早的关于蚯蚓抗菌肽的研究可以追溯到1 9 8 5 年，v a i l l i e r 等人通 过凝胶过滤，色谱聚焦、抑菌活性测定，从蚯蚓的体腔液中提取出了3 种蛋白质， 它们具有极强的抗菌作用，并且具有溶血和红细胞凝聚的活性，分子量分别为 2 0 0 0 0 ，4 0 0 0 0 、4 5 0 0 0 d a ，等电点分别为4 9 ，5 7 5 、6 0 。c h o 等采用肝素亲和 层析和h p l c 技术从蚯蚓( l u m b r i c u sr u b e l l u s ) 中分离纯化得到一种抗菌肽， 命名为l u m b r i c i n1n 们。u k e n e 等从蚯蚓的肠道中分离出两种抗菌肽，分子量分 别为1 4 7 6 6 和1 5 2 1 d a ，氨基酸序列分别为c f k d g a a d r i s h g f ，g f r d g s a d r i s h g f n 。 m i l o c h a u 等从蚯蚓体液中分离到了两种抗菌肽，分子量分别为4 0 0 0 0 和4 5 0 0 0 d a ， 且具抗菌、溶血和凝血功能的蛋白，并将其命名为f e t i d i n s n 羽。 国内关于蚯蚓生理活性肽的研究直到1 9 9 5 年才见报道；中国农业大学孙振 钧教授n 3 1 对蚯蚓抗菌肽进行了系统深入的研究，取得了重要突破，首次提出并验 1 7 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 证了蚯蚓抗病的2 个假设：( 1 ) 肽类物质可能是蚯蚓体液抗菌系统的抗菌成分； ( 2 ) 蚯蚓抗菌肽( 蛋白) 可以诱导获得并具有非专一性的免疫应答。课题组创立的 “热处理超滤法与离子交换层析相结合的蚯蚓抗菌肽制备方法”简便易行，收获 率和纯度高，已经获得国家发明专利。在国际上首次从蚯蚓体中分离得到分子量 小于1 0k d 、热稳定性强的抗菌四十肽，并相继从蚯蚓的组织匀浆液、体腔液和 体表粘液中分离纯化出另外5 种抗菌肽，证明了“肽类物质可能是蚯蚓体液抗菌 系统的抗菌成分”的假设。同时，根据该实验室已经发现的几种抗菌寡肽的结构 特点，首次提出了蚯蚓具有首次提出了蚯蚓具有a l a - m e t - v a l - s e r g i y5 - - - 7 个 氨基酸组成的抗菌寡肽族，命名为：v e r m i p e p t i d ef a m i l y 。 张希春等( 2 0 0 2 ) 经硫酸铵沉淀、超滤、阳离子交换分离和反相快速蛋白质 液相色谱( f p l c ) 分析，得到了两种新的蚯蚓抗菌肽f - i 与f - 2 ，经电喷雾离子源质 谱( e s i - m s ) 测定，其相对分子质量为5 3 5 2 7 和5 1 9 2 7 。串联质谱( m s m s ) 数据表 明 f 一1的肽序列为 a c - a l a - m e t v a l s e r s e r ，f 一2的肽序列为 a c a l 矿m e t v a l - g l v t h r 。张希春等( 2 0 0 3 ) 经硫酸铵沉淀、超滤和阳离子交换 分离，得到了一蚯蚓抗菌肽e a b p - i ，该肽的最大紫外吸收在2 7 7 1 6f i r e ，s d s - p a g e 结果表明其j i l r 2 0 x1 0 3 ，精确的分子量没有确定。刘艳琴等( 2 0 0 4 ) 经过五个步 骤，即硫酸铵沉淀，超滤，离子交换层析，葡聚糖凝胶g - 1 0 0 层析柱过滤，反向 高效色谱法，从蚯蚓( e i s e n i af o e t i d a ) 提取出一个由五个氨基酸组成的抗菌 肽o e p 3 1 2 1 ，该肽的分子量为5 1 0 8 d a ，氨基酸序列为a c s a g 。崔东波等对蚯蚓中 抗茵肽的提取发现了一种分子量为5 5 0 0 d a 的抗菌肽，该肽对多种细菌具有不同 程度的抑制。在沸水中加热一个小时，活性仍然很强，表现出很强的热稳定性。 林少琴等m 3 将蚯蚓粗提物用d e a e - s e p h a r o s e f f 层析柱分离纯化得到3 个蛋白 洗脸峰为q y i 、q y 一、q y 一，并分别对各组分行抗肿瘤研究，发现q y i 对 如腹水瘤具有明显的抑制作用，能使荷瘤小鼠生命延长率达6 5 4 。再对q y i 研究，发现其含糖量为2 ，s d s - 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s - p a g e ) 实验显示该组 分相对分子量约6 3 0 0 0 ，氨基酸组分分析含1 6 种氨基酸。 以上研究表明蚯蚓的确拥有有效的抗菌成分，经过不同方法对蚯蚓抗茵活性 成分进行提取，可以使蚯蚓产生不同的抗菌肽，这种机制是在长期的进化过程中 逐渐形成的，这对于蚯蚓抵御外来物质的侵袭起到了十分重要的作用。 1 8 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 1 3 抗菌肽类型 1 3 1 昆虫抗菌肽 自从1 9 7 2 年b o m a n 等从天蚕蛹的血淋巴分离出第一例抗菌肽以来，迄今为止， 在昆虫中发现的抗菌肽已达2 0 0 多种n 钉大多数昆虫抗菌肽是由脂肪体合成后释 放入血淋巴中，也有少数是在特定区域表达口们。昆虫还能根据不同的病原菌产生 不同的抗菌肽。 ，昆虫产生的抗菌多肽是昆虫免疫的效应物。昆虫的抗菌肽属阳离子碱性多 肽，大致可分为4 类：第1 类是天蚕素，含有3 卜3 9 个氨基酸残基，一般不含有半 胱氨酸，由鳞翅目和双翅目昆虫产生。第2 类是昆虫防御素，含有3 8 - 4 3 个氨基酸 残基，其结构与动物和某些植物的防御素相似。防御素大量存在于昆虫血淋巴液 中，至今己在双翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目和蜻蜒目中发现了3 0 多种防御素， 主要杀死革兰氏阳性菌。最近从果蝇中分离到抗菌多肽( d r o s o m v c i n ) ，有3 8 的 氨基酸序列与植物防御素相似，表明其与植物多肽的进化有一定的同源关系。第 3 类是分子量为2 - 4k d a 富含脯氨酸和精氨酸的抗菌肽，如从意大利蜜蜂中分离到 的蜜蜂肽( a p i d a e c i n 和a b a e c i n ，分子量分别为2 0 和4 o k d a ) 等，该类抗菌肽主 要抑制革兰氏阴性菌。第4 类是分子量为8 - 3 0 k d a ，富含甘氨酸的蛋白，如从麻蝇 幼虫体内分离到的麻蝇毒素i i ( s a r c o t o x i ni i ，分子量约为2 7 k d a ) ，从绿蝇幼虫、 黄粉虫幼虫虫体中分离到的双翅肽( d i p t e r i c i n ，分子量约为9 k d a ) 和鞘翅肽 ( c 0 1 e o p t e r i c i n ) 等，这些大肽之间相互关系较远，属樗蚕素( a t t a c i n ) 的超家族 成员n 7 1 。 1 3 2 两栖动物抗菌肽 两栖动物皮肤长期裸露，为抵御有害环境因子的侵袭，逐渐进化形成了一系 列保护机制。它们的皮肤分泌液中含有大量的杀菌和防御天敌的生物胺及抗菌肽 类物质，含量之高，是哺乳动物无可比拟的，被称为生物胺和抗菌肽的巨大储存 库。自1 9 6 2 年k i s s 和m i c h a l 在铃蟾皮肤分离出由2 2 个氨基酸组成的铃蟾抗菌肽 ( b o m b i n i n ) n 和从非洲蟾蜍属分离得到的滑爪蟾素( m a g a i n i n s ) j i g o 至今，人 们已从6 0 0 多种两栖动物皮肤分离出1 0 0 多种抗菌肽。例如，非洲蟾蜍属中的抗菌 肽超过十二种，研究发现它们不仅仅在皮肤的粒腺上表达而且也存在于胃黏膜和 小肠细胞嘲。有五种d e r m a s e p t i n s 抗菌肽家族存在于f r o g 忍啊o m e d u s as a u v a g i i 1 9 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 中，值得注意的是它们有很好的抗真菌活性硷。在两栖动物中，两种抗菌肽存在 增效作用，但氨基酸序列几乎无同源性。事实上，己经证明在两栖动物中没有两 种同源抗菌肽，即使在同一属也有很大的变异皿列。然而，所有的两栖动物抗菌肽 已经证明或预测是两亲性q - 螺旋结构，如滑爪蟾素( m a g a i n i n s ) 、d e r m a s e p t i n s 和b u f o r i nii ，或者是含二硫键的半胱氨酸环状结构，如r a n af r o g 属分离的 r a n a l e x i n 和b r e v i n i n s 口1 一。不同种类的蛙可以产生多种抗菌肽，并且它们既无 序列相似性又与爪蟾抗菌肽m a g a i n i n s 不同。 1 3 3 哺乳动物抗菌肽 哺乳动物抗菌肽主要存在于中性粒细胞及皮肤和黏膜上皮细胞或是蛋白质 的降解产物1 。哺乳动物抗菌肽主要分为两大类，即防御素( d e f e n s i n s ) 和 c a t h e l i c i d i n s 。防御素分为a d e f e n s i n s 和b d e f e n s i n s 两大类。两者都含有 3 个二硫键半胱氨酸和含量较高的精氨酸，但是半胱氨酸的连接部位不一样，并 且其它保守氨基酸也有差异。a d e f e n s i n s 是环状的p 发夹疏水指状物连接成的 三联体p 片层结构，主要存在潘氏细胞和粒细胞，我们假定口- d e f e n s i n s 也有相 似的结构，主要存在皮肤上皮细胞、中性粒细胞和粒细胞。b 一防御素的合成需 要细胞因子的诱导嘲】。c a t h e l i c i d i n s 是另一类存在于1 5 - - 一，1 8 k d a 前体蛋白c 末端 并具有高度保守区域( c a t h e l i n ) 的抗微生物肽汹1 ，最初是从猪白细胞分离得到 的，这类肽是以非活性的形式储藏于中性粒细胞的分泌液中。当细胞受到蛋白酶 加工刺激时释放活性c a t h e l i c i d i n s 嗍。科学家已经从人类睾丸嘲、扁平上皮细 胞和不同淋巴细胞中获得了c a t h e l i c i d i n s 、c a p - 1 8 和l l - 3 7 汹1 ，从绵羊获得的 s m a p 一2 9 ，从牛获得的b m a p - 2 8 、b a c - 5 和b a c 一7 都是c a t h e l i c i d i n 的衍生肽，它们 表现出不同的抗微生物活性啪瑚1 。从猪的中性粒细胞分离得到的由1 6 1 8 个氨基 酸组成的分子量为2 k d a 的内源性抗微生物肽m 1 。 1 3 4 植物抗菌肽 硫堇( t h i o n i n s ) 是第一个从植物中分离的抗菌肽嘲，它们对g + 菌、g - 菌、真 菌、酵母及哺乳动物细胞均有毒杀作用。植物抗菌肽主要存在于叶子、种子、胚 和子叶中。同昆虫一样，植物虽无特异的免疫系统，但有非特异的天然免疫系统， 抗菌肽是其中一大组分。迄今为止在植物中发现的抗菌肽分子中都富含半胱氨酸 ( c y s ) ，并且所有的半胱氨酸都形成分子内二硫键，与动物防御素相比，植物防御 贵州大学2 0 0 8 属硕士研究生学位论文 素抑杀真菌的活性较高，这从侧面表明真菌是植物界主要的病原菌朝。根据二硫 键的多少和氨基酸的保守性，又可分为硫堇、植物防御素、脂转移蛋白、橡胶蛋 白类和k n o t t i n 类抗菌肽等4 类抗菌肽分别分布于单子叶植物和双子叶植物的根、 种子、叶，种子植物的叶、块茎、花、种子及某些荚果，胚、子叶、茎、叶及十 字花科的花和果实、种子。第5 类是从玉米种子中分离到的船p l 和在i m p a t i e n s b a l s a m i n a 种子中分离到的i b - a m p s ，只含4 个半胱氨酸，能抑制真菌和革兰阳性 菌的生长，后者还是迄今在植物中发现的最短的抗菌肽1 。 1 3 5 细菌抗菌肽 抗菌肽在细菌、真菌、霉菌中均有发现。抗菌活性肽通常与由细菌和真菌产 生的抗生素肽和抗病毒肽联系在一起，包括环形肽、糖肽和脂肽，如短杆菌肽、 杆菌肽、多黏菌素肽和乳酸链球菌肽等。目前研究最多的细菌抗菌肽为乳酸菌产 生的细菌素，它能特异性杀死竞争菌而对宿主本身无害瞄1 。l a n t i b i o t i c 是革兰 氏阳性菌产生的抗菌肽，乳链菌肽是其中研究最为清楚的l a n t i b i o t i c 类抗菌 肽。革兰氏阳性菌产生的细菌素大部分是肽，多数为阳离子和两性分子，并来源 于前肽，具广谱抗菌活性，广泛用作食品保藏剂以及抗感染药。革兰氏阴性菌产 生的细菌素大部分是分子质量较大且具有功能区的蛋白质毒素，具有受体介导的 窄谱抗菌活性。 1 3 6 病毒抗菌肽 眦v l 包膜蛋白胞质尾部是最早发现的病毒抗菌肽，它们同从其他慢性病毒 穿膜蛋白得到的抗菌肽一样，都有抗菌活性和细胞毒性作用。所有的病毒抗菌肽 都富含精氨酸而不含赖氨酸。 1 4 抗菌肽的结构 研究抗菌肽结构的主要方法包括圆二色谱法、二维核磁共振谱法和脂质体 模拟实验等。按照抗菌肽的结构特征可以将其划分为以下4 类： 1 4 1a 一螺旋型抗菌肽。 此类抗菌肽的二级结构主要为一螺旋。天蚕抗菌肽( c e c r o p i n s ) 是第一个 从鳞翅目和双翅目中分离的诱导具有抗菌肽特征的线性阳离子抗菌肽1 。他们不 含半胱氨酸残基，是两个o r 螺旋结构间夹一个短的铰链啪1 ，并且c 端经常被酰胺 化，能杀死g + 菌和g 一菌。另外，蛙皮素1 在有机溶剂中也能形成两亲性的d 一螺 2 1 贵州大学2 0 0 8 届硕士研究生学位论文 旋结构。 1 4 21 3 一折叠型抗菌肽。 此类抗菌肽的主要特征是二级结构中存在反平行的8 一折叠。在鲎和猪的血 细胞中发现中国鲎肽( t a c h y p l e s i n s ) m 1 和内源性抗微生物肽( p r o t e g r i n s ) h ”都 具有二硫键稳定的b 一折迭结构。核磁共振研究表明t a c h y p l e s i n s 与从猪粒细胞 分离到的p r o t e g r i n s 都具有2 个二硫键并可形成b 一折迭和b 一转角结构，从半翅 类昆虫得到的t h a n a t i n 与t a c h y p l e s i n 的空间结构非常相似，都有一个通过二硫 键稳定的b 一折迭结构。由乳铁蛋白水解得到的2 5 个氨基酸残基的乳铁蛋白肽在 溶液中也是由一个二硫键维持的b 一折迭结构h 羽。这种类型的大部分抗菌肽中也 存在一些次要的螺旋片段。如目前研究表明中国鲎肽( t a c h y p l e s i n s ) 与壳多糖 之间具有特异结合行活性，能引起磷脂分子在细胞膜中的翻转及侧移等运动h 羽。 这说明此类抗菌肽能破坏磷脂分子的有序排列，在不形成稳定性孔洞或通道的前 提下，使多肽分子穿过脂双层。 1 4 3 伸展性螺旋结构类- 这是一类不含半胱氨酸，但富含组氨酸或脯氨酸或精氨酸或色氨酸等的抗菌 肽。由1 5 - 3 4 个氨基酸残基组成。如从人类唾液分离到富含组氨酸残基的抗乳头 状体的h i s t a t i n 1 ，富有脯氨酸的肽c a t h e l i c i d i n s 、b a c t e n e c i n s 、b a c - 5 和 b a c - 7 蜘，富有色氨酸的肽i n d o l i c i d i n s h 以及富含精氨酸残基的肽p r - 3 9 m 1 。这 些含有规则氨基酸的抗微生物肽在空间构象上不同于规则的一螺旋和b 一折叠， 而是呈伸展性螺旋构象，这可