（动物遗传育种与繁殖专业论文）五指山猪近交系EG细胞建系影响因素研究.pdf

中文摘要本实验以五指山小型猪( w z s p ) 近交系为实验材料，先后由1 8 头妊娠母猪采集了2 0 0 枚早期胎儿，分别从不同饲养层、条件培养基、是否添加生长因子、传代过程中所用消化液等方面对其e g 细胞的建系影响因素进行了研究；并对传代获得的e g 细胞集落进行了鉴定。( 1 ) 从2 6 2 8 d 的新鲜猪胎儿可以获得大量的猪胎儿成纤维细胞( p e f ) 经传代培养后即可纯化。实验过程中，p e f 传至1 0 代以上，可以在体外长期培养并可冷冻保存。本实验对f 5 代的p e f 进行了核型分析，结果表明其在体外培养核型正常。( 2 ) 采集2 6 5 d 的w z s p 胎儿5 3 枚，其中3 3 枚以经丝裂霉素c 处理的s t o 细胞作为饲养层；其余2 0 枚采用未经丝裂霉素c 处理的p e f 与e g 细胞共培养的方式进行培养。在使用同种培养基的条件下，比较不同饲养层对猪的e g 细胞分离培养与传代的影响。结果表明，s t o 细胞适合用作猪e g 细胞分离培养、传代的饲养层：而采用p e f 与e g 细胞共培养的方式只适于原代p g c s 的分离培养，传代后，仍需以s t o 细胞制备饲养层才能维持e g 细胞的未分化状态，p e f不能维持e g 细胞的传代培养。( 3 ) 采集2 6 5 d 的w z s p 胎儿3 5 枚，其中的1 5 枚用b r l 条件培养基进行培养：其余2 0枚以高糖d m e m + 1 5 f c s + 2 m m o b m ll - 谷氨酰胺+ o 1 m m o l m l 非必需氨基酸+ o 1 m m o | m l 巯基乙醇+ l o o i u m l 青霉素+ 1 0 0 ug m l 链霉素常规培养基进行培养，研究b r l 条件培养基对猪e g细胞培养与传代的影响。结果表明，以s t o 细胞作饲养层，使用b i l l 条件培养基与常规培养基在猪e g 细胞分离培养、传代后均可获得细胞集落，而且使用b r l 条件培养基培养产生的集落数多，细胞生长速度快。因此，b r l 条件培养基适于猪e g 细胞的培养传代。( 4 ) 采集2 6 5 d 的w z s p 胎儿7 8 枚。其中的4 3 枚用常规培养基( 培养基i ) 进行培养；剩余3 5 枚在添加l i f 、s c f 、b f g f 三种生长因子的培养基( 培养基i i ) 中进行培养。研究不添加生长因子对猪的e g 细胞分离培养与传代的影响。实验结果表明，以s t o 细胞作为饲养层，在两种培养基中都能得到可以传代的e g 细胞集落。但在培养基i 中原代e g 集落出现时间晚，生长速度较慢，传代时间间隔长，e g 细胞形态扁平：而在培养基i i 中原代e g 集落很快出现，生长速度较快，传代间隔短。两种培养条件下获得的e g 细胞都具有胚胎干细胞的形态和特征。结果提示，以s t o 细胞作为饲养层，不添加生长因子的培养基也可以维持e g 细胞的培养、传代。( 5 ) 采集2 6 5 d 的w z s p 胎儿3 4 枚，分离胎儿p g c s ，以s t o 细胞为饲养层，以常规培养基进行培养。在e g 细胞传代过程中，分别用d i s p a s e 和o 2 5 的t r y p s i n e d t a 对其进行消化传代，比较两种消化液对传代的影响。结果表明，用两种消化液消化传代都能够获得新的可传代的e g 细胞集落。因此，两种消化液均可用于e g 细胞的传代培养。( 6 ) 对培养获得的3 4 代的细胞集落进行鉴定，结果表明分离培养的e g 细胞形态多样，集落内细胞排列紧密，集落边缘清晰a k p 染色呈强阳性，s s e a 1 免疫荧光染色为阳性，o c t 4免疫荧光表达亦为阳性，体外悬浮培养可以形成简单类胚体，具有胚胎干细胞的诸多特征。关键词：猪，原始生殖细胞，胚胎生殖细胞( e g 细胞)i i ia b s t r a c tat o t a lo f2 0 0f e t u s e sw e r ec o l l e c t e df r o m1 8w u z h i s h a ni n b r e e d i n gp i g s ( w z s p ) t os t u d yt 1 ef h c t o r si n f l u e n c eo nt h ee s t a b l i s h m e n to f p o r c i n ee m b r y o n i cg e r m ( e o ) c e l l sl i n e s t h ef a c t o r si n c l u d e df e e d e rc e l l s ，c o n d i t i o nm e d i u m ( c m ) ，g r o w t hf a c t o r sa n dd i g e s t i n ge n z y m e s m o r e o v e r , e gc e l l se v a l u a t i o nw a sc a r r i e do u t ( i ) p o r c i n ee m b r y o n i cf i b r o b l a s t s ( p e f ) w e r eo b t a i n e df r o m2 6 2 8 df e t u s e so f w z s p , t h e yc o u l db ep u r i f i e db yp a s s a g i n g p e fw e r ep a s s a g e dt of l o ，i tw a ss h o w nt h a tp e fc o u l db ec u l t u r e dl o n g t e r mi nv i t r oa n dp r e s e r v e da t 1 9 6 c t h en o r m a lk a r y o t y p eo fp e fw a sf o u n do u ta tf 5b yk a r y o t y p ea n a l y s i s f 2 、t 0s t u d y 也ee f f e c to ff e e d e rc e l l so np o r c i n ee gc e l l sc u l t u r e di nv i t r o ，5 3f e t u s e sw e r ec o l l e c t e df r o m2 6 5 dp r e g n a n tg i l t s 3 3o ft h e mw e r ep l a t e do ns t of e e d e rc e l l sa n d2 0w e r ec o c u l t u r e dw i mp e f w h e nu s i n gt h es a m em e d i u m p o r c i n ep g c - d e r i v e dc o l o n i e sc u l t u r e do ns t of e e d e rc e l l sc o u l dg r o ww e l l t h ec o l o n i e sc o - c u l t u r e dw i t hp e fc o u l dd e v e l o pi nf 0 ，b u tt h e yd i f f e r e n t i a t e da f t e rp a s s a g e s op e fc o u l dn o tm a i n t a i nt h eg r o w t ho fp o r c i n ee gc e l l s ，w h i l es t of e e d e rc e l l sc o u i dd o ( 3 ) t os t u d yt h ee f f e c to fc o n d i t i o nm e d i u m ( c m ) o np o r c i n ee gc e l l sc u l t u r e di nv i t r o ，3 5f e t u s e sw e r ec o l l e c t e df r o m2 6 5 dp r e g n a n tg i l t s 1 5o f t h e mw e r ec u l t u r e di nb r l - c ma n d2 0w e r ei nc o m m o nm e d i u m ( d m e m + 1 5 f c s + 2 m m o l m ll - g l u t a m i n e + o i m m o l m lm e mn o n - e s s e n t i a la m i n oa c i d s+ o 1 m m o l m lb - m e r c a p t o e t h a n o l + 1 0 0 1 u m lp e n i c i l l i n + 1 0 0pg m ls t r e p t o m y c i n ) t h er e s u l t sm a n i f e s t e dt h a tb o t hb r l - c ma n dc o m m o nm e d i u mw e r es u i t a b l ef o rp o r c i n ee gc e l l sc u l t u r i n ga n dp a s s a g i n gw h e nh a v i n gs t of e e d e rc e l l s s ob r l c mc a nb eu s e dt oc u l t u r ep o r c i n ee gc e l l s ( 4 ) t os t u d yt h ee f f e c to fg r o w t hf a c t o r so np o r c i n ee gc e l l sc u l t u r e di nv i t r o ，7 8f e t u s e sw e r ec o l l e c t e df r o m2 6 5 dp r e g n a n tg i l t s 3 5o ft h e mw e r ec u l t u r e di nm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t hl i f , s c fa n db f g f ( m e d i u m i i ) a n d4 3w e r ec u l t u r e di nc o m m o nm e d i u m ( m e d i u mi ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb o t hm e d i u mia n dm e d i u mi ic o u l db eu s e dc u l t u r i n ga n dp a s s a g i n gp o r c i n ee gc e l l sw h e nh a v i n gs t of e e d e rc e l l s ，b u tm e d i u m1 1w a sb e t t e rt h a nm e d i u mi s op o r c i n ee gc e l l sc a r la l s ob ec u l t u r e di nm e d i u mw i t h o u tg r o w t hf a c t o r s ( 5 ) t os t u d yt h ee f f e c to f d i g e s t i n ge n z y m e so np a s s a g ep o r c i n ee gc e l l s ，3 4f e t u s e sw e r ec o l l e c t e df r o m2 65 dp r e g n a n tg i l t s p g - c sw f f t oi s o l a t e da n dp l m e do ns t of e e d e rc e l l s o np a s s a g i n g ，t h ec o l o n i e sw e r ed i g e s t e db yd i s p a s eo ro 2 5 t r y p s i n - e d t a t h er e s u l tw a st h a tr e n a s c e n tc o l o n i e so f e gc e l l sc o u l db eo b t a i n e da n dp a s s a g e da tb o t hc a s e s i ti n d i c a t e dt h a tb o t hd i s p a s ea n do 2 5 t r y p s i n e d t ac a nb eu s e dt op a s s a g ep o r c i n ee gc e l l s ( 6 ) t h ec o l o n i e so ff 3 f 4e gc e i l sw e r ei d e n t i f i e d t h em o r p h o l o g yo fp o r c i n ep g c - d e r i v e dc o l o n i e sw a sm u l t i p l i c i t y , c e l l sw e r et i g h t l yp a c k e di nc o l o n i e sa n dc o l o n i e se d g ew a sp l a i n t h ec o l o n i e sw e r ea k p - p o s i t i v e ，r e a c t e dw i t hs s e a - 1a n t i b o d ya n dt h e i ri m m u n i t yf l u o r e s c e n c es t a i n i n go fo c t - 4w a sp o s i t i v e t h ec o l o n i e sp l a c e di ns u s p e n s i o nc u l t u r ei nm e d i u mc o n t a i n i n gc a l fs e r u mw i t h o u tg r o w t hf a c t o r sd i f f e r e n t i a t e di n t os i m p l ee m b r y o i db o d i e s ( e b s ) t h e s ec e l l sh a v em a n yc h a r a c t e r i s t i c si vo f e m b r y o n i cs t e mc e l l sa sd e s c r i b e dp r e v i o u s l y s oi t c o n f i r m e dt h a tt h e yw e r ee gc e l l sk e y w o r d s ：p o r c i n e ，p r i m o r d i a lg e r mc e l l s ( p g c s ) ，e m b r y o n i cg e r mc e l l s ( e gc e l l s )v评阅人与答辩委员会名单评阅人：崔胜教授中国农业大学生物学院动物生理田见晖副教授中国农业大学动物科技学院动物繁殖答辩委员会主席：夏国良教授中国农业大学生物学院动物生理答辩委员会成员：朱士恩教授李赞东教授陈永福教授中国农业大学动物科技学院动物繁殖中国农业大学生物学院中国农业大学生物学院生物技术生物技术林秀坤研究员中国农业科学院畜牧研究所生物化学答辩时间：2 0 0 5 年6 月2 4 日上午图表清单表1 不同饲养层条件下e g 细胞的培养情况”表2 不同培养基条件下e g 细胞的培养情况”表3 无生长因子对e g 细胞生长的影响”表4 不同消化液对e g 细胞进行传代的情况“图1 1s t o 细胞”图1 - 2 纯化后的p e f “图1 3p e f 的核型分析”图1 - 4 培养在s t o 饲养层上的e g 细胞集落( f 2 代8 d ) ”图1 5 与p e f 共培养的e g 细胞传至s t o 饲养层上形成新的集落( f l 代6 d ) “图1 - 6 与p e f 共培养的e g 细胞传代后发生分化一图2 - 1 用b i l l 条件培养基培养传代获得的e g 细胞集落( f 2 代7 d ) “图3 - 1 无生长因子培养基培养获得的e g 细胞集落( 原代7 d ) ”图3 2 添加生长因子培养基培养传代后的e g 细胞集落( f 3 代6 d ) “图4 - 1 用t r y p s i n - - e d t a 消化传代后形成的集落( f l 代4 d ) - -图4 - 2 用d i s p a s e 消化传代后产生的e g 集落( f l 代3 d ) 一图5 - 1 莲花状e g 细胞集落( f 4 代1 0 d ) “图5 2 树枝状的e g 细胞集落( f 2 代1 l d ) ”图5 - 3a k p 染色为阳性的e g 细胞集落图5 4 表达s s e a 1 阳性的e g 细胞集落”图5 - 5o c t _ 4 免疫荧光染色为阳性的集落”图5 6e g 细胞分化为上皮细胞和成纤维样细胞”v h i甜m卯儿勰强粥粥强”筘曲扣筘柏加加柏a k pb f g fb r lc mnd i ad m e md m s od p ce be gc e l l se sc e l l sf c sf g fh e fi c ml i f【e fn b sp b sp e fp g c sp m e fs c fs s e as t ow z s p缩略语表a l k a l i n ep h o s p h a t a s eb a s i c - f i b r o b l a s t 盯o 曲f a c t o rb u f f a l or a tl i v e rc e l l sc o n d i t i o n e dm e d i u md a y sd i f f e r e n t i a t i o ni n h i b i t o r ya c t i v i t yd u l b e c c o 3m o d i f i e de a g l em e d i u md i m e t h y l s u l f o x i d ed a y sp o s tc o i t u me m b r y o i db o d ye m b r y o n i cg e r mc e l l se m b r y o n i cs t e mc e l l se m b i y o d e r i v e ds t e mc e l l sf e t a lc a l f s e r u mf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o rh o m o l o g o u se m b r y o m cf i b r o b l a s ti n n e rc e l lm a s sl e u k e m i ai n h i b i t o r yf a c t o rm o r ee m b r y o n i cf i b r o b l a s tn e w b o mb o v i n es e r u n ld u l b e c c o sp h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n ep o r c i n ee m b r y o n i cf i b r o b l a s tp r i m o r d i a lg e r mc e l l sp r i m a r ym o u s ee m b i y o m c 舳r b l a s ts t e mc e l lf a c t o rs t a g e - s p e c i f i ee m b r y o m ca n t i g e nm o l , k s ee m b r y o n i cf i b r o b l a s tl i n e sw u z h i s h a np i gi x碱性磷酸酶碱性成纤维细胞生长因子b u f f 甜。大鼠肝细胞条件培养基猪交配后日龄分化抑制因子杜氏培养液二甲基亚砜小鼠交配后日龄类胚体胚胎生殖细胞胚胎千细胞胎牛血清成纤维细胞生长因子同源动物胎儿成纤维细胞内细胞团自血病抑制因子小鼠胚胎成纤维细胞新生牛血清杜氏磷酸缓冲液猪胎儿成纤维细胞原始生殖细胞原代小鼠胎儿成纤维细胞干细胞因子阶段特异性胚胎表面抗原小鼠胚胎成纤维细胞系五指山猪独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：到 氛时间：7 彬年7 月乡日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：导师签名右j 鼠时间：三以年7 月乡日彪磁u瞄阃：6 彬年7 玛；日中国农业科学院硕士学位论文文献综述文献综述胚胎干细胞( e m b r y o d e r i v e ds t e mc e l l s 或者e m b r y o n i cs t e r nc e l l s ，e sc e l l s ) 是由动物早期胚胎的内细胞团( i n n e rc e l lm a s s ，i c m ) 或胎儿的原始生殖细胞( p r i m o r d i a lg e r mc e l l s ，p g c s ) 经体外分离培养两获得的一声申具有发育全能性或多能性的细胞。根据其来源分为胚胎干细胞幔s 细胞) 和胚胎生殖细胞( e m b r y o n i cg e r mc e l l s ，e g 细胞) 。e s 细胞是从早期胚胎内细胞团( i c m ) 分离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞，而e g 细胞是从胎儿原始生殖细胞( p g c s ) 分离培养出来的具有发育全能性或多能性的千细胞，一般将二者统称为胚胎干细胞。一、胚胎千细胞的生物学特性1 、胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的形态特征，即胞体小、核大、胞浆少，有一至二个核仁；且具有正常的二倍体核型。2 、胚胎干细胞具有高度的发育潜能和分化潜能( 全能性或多能性) 。全能性( t o t i p o t e n c y ) 是指胚胎干细胞在解除分化抑制的条件下具有发育为包括生殖腺在内的构成机体的各种组织和细胞的潜力，即胚胎干细胞能发育成完整动物个体的能力：多能性( p l u r i p o t e n t ) 则是指胚胎干细胞具有发育为多种组织的能力，参与部分组织的形成( k e i t he ta 1 ，1 9 9 7 ) 。胚胎干细胞在体外可被诱导分化为包括内、中、外三个胚层的所有细胞；若将胚胎干细胞注射到s c i d 小鼠或同源动物体内，可分化产生出由三个胚层细胞组织构成的畸胎瘤。3 、胚胎干细胞可以在体外无限扩增。在不同的生长条件下，胚胎干细胞具有不同的功能状态。在体外适宜条件下，如在饲养层上或含有分化抑制因子的培养基中，胚胎干细胞可以稳定传代，长期培养，保持高度未分化状态和发育潜能性。这为胚胎干细胞研究和应用提供了无限的细胞来源( o s h e a 1 9 9 9 ) 。4 、胚胎干细胞具有生殖系嵌台能力和种系传递功能。若把胚胎干细胞注射到受体胚胎内，混合后再植入假孕母体子宫，胚胎干细胞可广泛参与宿主胚胎各组织器官的生长发育，获得包括生殖系在内的嵌合体后代，其遗传特性可进入种系并遗传给下一代，称之为种系传递( g e r m l i n et r a n s m i s s i o n ) ( b r a d l e ye ta l ，1 9 8 4 ) 。5 、胚胎干细胞具有可操作性。在体外，可以对胚胎干细胞进行遗传操作选择，如导八异源基因、报告基因或标志基因，或者利用同源重组的方法插入( 或删去) 某个特定基因，诱导基因突变，基因打靶或导入额外的原有基因使之过度表达( 增加功能) 等。理论上，胚胎干细胞经遗传操作选择后一般仍能保持其扩增和发育的全能性或者多能性，园此可以通过遗传操作选择生产转基因动物或基因有缺失、突变或过量表达的杂合或纯合个体进行各种基因功能的分析( r o b e r c s o n ，1 9 8 6 ) 。6 、胚胎干细胞具有体外培养细胞所有的特征，可以在体外培养扩增，还可以对其进行遗传操作选择和冻存等而不失去其多潜能性。冻存的细胞可以随时解冻。继续培养而不失其原有特性。二、国内外研究现状( 一) 国外e s 细胞研究概况1 9 8 1 年，英国剑桥大学的e v a n s 和k a u f m a n 利用延迟着床的小鼠早期胚胎体外培养，成功地建立了小鼠e s 细胞系。试验结果表明。小鼠e s 细胞嵌合率达6 1 ，其生殖系嵌合率为2 0 ( e v a n se ta l ，1 9 8 1 ) 。同年，美国加州大学1 日金山分校的m a r t i n 利用显微手术法获得小鼠i c m ，同样得到了小鼠e s 细胞系( m a r t i n ，1 9 8 1 ) 。小鼠的e s 细胞系建立较早，其体系已基本成熟完善。小鼠e s 细胞系的建立，为其它动物及人类胚胎干细胞的分离培养开辟了道路，从此进入了胚胎干细胞研究的新纪元。此后，人们分别建立了仓鼠、猪、牛、绵羊、山羊、兔、水貂、鸡、鱼、灵长类等多种动物以及人类的e s 细胞或类e s 细胞系。但迄今为止，除小鼠外，其他动物所分离的e s 细胞都未能证实具有生殖系嵌合能力。1 、小鼠e s 细胞研究概况：自1 9 8 1 年小鼠的e s 细胞系建立以来，很多实验室致力于e s 细胞的建系研究工作，他们通过不同途径分别建立了e s 细胞系。1 9 8 3 年，k a u f m a n 和r o b e r s t o n 用不同品系和孤雌生殖的小鼠胚胎及具有不同遗传背景的胚胎建立了各种e s 细胞系( k a u f m a ne t a l 1 9 8 3 ) 。1 9 8 4 年a x e i r o d 用微滴法将小鼠晚期囊胚直接培养于s t o s t o 细胞是来自s l m d 、鼠胚胎的( s ) 、对硫代鸟嘌呤( t h i o g u a n i n e ，t ) 和乌本苷( o u a b a i n ，o ) 有抗性的成纤维细胞系】饲养层上，获得了e s 细胞系( a x e l r o d ，1 9 8 4 ) 。同年，w o b u s 等首次用原代小鼠胎儿成纤维细胞( p r i m a r vm o u s ee m b r y o n i cf i b r b l a s t ，p m e f ) 饲养层培养e s 细胞，并建立了e s 细胞系( w o b u se ta l ，1 9 8 4 ) 。1 9 8 7年，s m i t h 等人首次用大鼠肝细胞条件培养基( b r l - c m ) 取代饲养层细胞维持已成系的小鼠e s细胞，在小鼠上建立了非饲养层培养系统( s m i t he ta l ，1 9 8 7 ) 。1 9 8 8 年，e i s t e t t e r 直接离散小鼠桑椹胚获得了小鼠的e s 细胞系( e i s t e t t e r , 1 9 8 8 ) 1 9 9 0 年，p e a s e ( p e a s ee ta 1 1 9 9 0 ) 和n i c h o l s ( n i c h o l se ta l ，1 9 9 0 ) 分别在无饲养层条件下向培养基中添自d l i f 获得了小鼠e s 细胞系。此外，y a g i ( 1 9 9 3 )希j d u r c o v a ( 1 9 9 7 ) 分别用免疫磁珠法从混合细胞中分离小鼠e s 细胞，提高了e s 细胞纯化率。此后，还有许多实验室陆续报道建立了小鼠的e s 细胞系。2 、猪e s 细胞研究概况：1 9 9 0 年，p i e d r a h i t a 分离得到猪的类e s 细胞系，但所得到的类e s 细胞没有进一步分化的能力( p i e d r a h i r a ，1 9 9 0 b ) 。同年，e v a n s ( 1 9 9 0 ) 、s t r o j e k ( 1 9 9 0 ) 、a n d e r s o n( 1 9 9 0 ) 也分别报道成功地建立了猪类e s 细胞系。s t r o j e k 认为，在初次分离培养时，饲养层中加入猪子宫成纤维细胞，能够促进胚胎贴壁和细胞克隆的形成。因为猪子宫成纤维细胞与囊胚之间存在内分泌协同关系。1 9 9 4 年，w h e e l e r 获得了能参与嵌合体形成的猪类e s 细胞系，但未证明能否参与生殖系嵌合( w h e e l e r , 1 9 9 4 ) 。1 9 9 8 年，g o l u e k e 等培养机械分离的6 7 d 的i c m 建立了猪的e s 细胞系，并产生转基因嵌合体猪( g o l u e k ee ta l ，1 9 9 8 ) 。3 、牛e s 细胞研究概况：1 9 9 2 年，s a i t o 在加有l i f 的培养基中培养牛的i c m ，分离出e s 细胞，但传至4 代后丢失( s a i t o ，1 9 9 2 ) 。s i m s 采用低密度悬浮培养法用加有硒、胰岛素、转铁蛋白和5 f c s2中国农业科学院硕士学位论文文献综述的培养液，共得1 5 个细胞系。将此e s 细胞聚集生氏，可得类胚体。用这种细胞核移植到去核卵母细胞中体外培养至囊胚，再移植到假孕牛子宫内，虽后得到4 头牛犊( s i m s ，1 9 9 3 ) 。1 9 9 4 年，s t i c e等建立了牛的类e s 细胞系( s t i c ee ta l ，1 9 9 4 ) 。1 9 9 7 年c i b e l l i 通过分离培养7 d 牛胚胎i c m 获得牛的e s 细胞系，并利用转基因技术得到了生殖系嵌合牛( c i b e l l i ，1 9 9 7 ) 。1 9 9 8 年。p a m p a i 等建立了牛的类e s 细胞系( p a r n p a ie ta l ，1 9 9 8 ) 。2 0 0 1 年，m i t a l i p o v a 等报道所建立的牛e s 细胞系在体外培养超过三年，已传至1 5 0 代( m i t a l i p o v ae ta l ，2 0 0 1 ) 。4 、羊e s 细胞研究概况：1 9 8 7 年，h a n d y s i d e 等用绵羊皮肤成纤维细胞和羊胚胎成纤维细胞作饲养层，对7 日龄和8 日龄绵羊囊胚进行e s 细胞分离培养，只培养出了内胚层样细胞。而无e s样细胞的出现( h a n d y s i d ee t a l ，1 9 8 7 ) 。p i e d r a h i t a 对绵羊e s 细胞进行分离培养结果只得到上皮样细胞( p i e d r a h i t ae ta l ，1 9 9 0 b ) 。1 9 9 1 年，n o t a r i a n n i 等分离克隆出了绵羊的e s 细胞( n o t a r i a n n ie ta l ，1 9 9 1 ) 。1 9 9 4 年，t s u c h i y a 等人从绵羊中分离获得生长缓慢，能传至四代的类e s 细胞集落( t s u c h i y ae ta l ，1 9 9 4 ) 。1 9 9 6 年，m e i n e c k e t i l l m a n n 分别建立了绵羊和山羊的类e s 细胞系( m e i n e c k e - t i l l m a n n ，1 9 9 6 ) 。同年，c a m p b e l l 等建立了绵羊的类e s 细胞系，进行核移植得到4只羔羊( c a m p b e l le ta l 。1 9 9 6 ) 。5 、灵长类动物e s 细胞研究概况：1 9 9 5 年，t h o m s o n 等人以小鼠胚胎成纤维细胞( m e f ) 为饲养层，从恒河猴囊胚获得第一个灵艮类的e s 细胞系。对该胚胎干细胞培养传代一年后，依然保持未分化状态，核型正常( x y ) ，且具有e s 细胞所有的特征( t h o m s o ne ta 1 1 9 9 5 ) 。1 9 9 6 年，t h o m s o n 等建立了8 个狨猴的e s 细胞系，其中两株在体外培养超过一年仍维持正常的二倍体核型和朱分化状态( t h o m s o ne ta l ，1 9 9 6 ) 。2 0 0 2 年，c i b e l l i 等利用恒河猴的卵母细胞孤雌激活后发育形成的胚胎建立了胚胎干细胞系( c i b e l l ie ta l ，2 0 0 2 ) 。6 、人e s 细胞研究概况：1 9 8 4 年，t h o m p s o n ( t h o m p s o ne ta 1 1 9 8 4 ) 和a n d r e w ( a n d r e we ta l ，1 9 8 4 )两个小组分别报道从人的畸胎瘤获得了可在体外分化为神经及其它细胞类型的克隆细胞系。1 9 8 9年，p e r a 等尝试性地从人的畸胎瘤分离胚胎千细胞，初步表明人类胚胎干细胞建系的可行性( p e r ae ta l ，1 9 8 9 ) 。1 9 9 4 年，b o n g s o 等以人的输卵管上皮细胞为饲养层，分离获得了可增殖传代的类h e s细胞，并传至二代( b o n g s oe ta t ，1 9 9 4 ) 。1 9 9 8 年，美国w i s c o n s i n 大学的t h o m s o n 等以s t o 细胞作饲养层，利用体外受精( i v f ) 技术收集发育至囊胚期的人胚i c m ，成功地分离获得了人类e s 细胞系其中一株传3 2 代，具有正常的核型，保持多潜能未分化状态，并能成功地被冷冻和解冻( t h o m s o ne ta l ，19 9 8 ) 。2 0 0 0 年，澳大利亚m o n h 火学和新加坡大学的i v f 专家台作成功地从人囊胚中建立了两株h e s 细胞系，并且在体外分化实验中成功地得到了神经祖细胞( r e u b i n o f f e ta 1 2 0 0 0 ) 。同年，a m i t 等以m e f 为饲养层。经体外培养获得h e s 细胞系( a m i te ta 1 2 0 0 0 ) 。7 、其他动物e s 细胞研究概况：g r a v e s ( 1 9 9 3 ) ，n i e m a n n ( 1 9 9 4 ) ，s c h o o n j a n s ( 1 9 9 6 ) 分别建立了兔的类e s 细胞系。s u k o y a n 等人于1 9 9 2 年从水貂囊胚中分离出类e s 细胞系( s u k o y a ne ta l ，1 9 9 2 ) ，1 9 9 3 年又利用桑椹胚建立了水貂的e s 细胞系( s u k o y a ne ta 1 1 9 9 3 ) 。d o e t s c h m a n 等( 1 9 8 8 ) ，p i e d r a h i t a ( 1 9 9 0 a ) 建立了仓鼠的e s 细胞系。1 9 9 6 年，p a i n 等首次建立鸡的胚胎干细胞系，并获得嵌合体鸡( p a i ne ta 1 1 9 9 6 ) 。2 0 0 0 年，p a r k中国农业科学院硕士学位论文文献综述等也建立了鸡的e s 细胞系( p a r ke ta l ，2 0 0 0 ) 。w a k a m a l s u 等( 1 9 9 3 ) ，h o n g 等- ( 1 9 9 6 ) 建立了青鲚鱼的e s 细胞系，h o n g 等还获得了嵌合体青_ 蕈| 5 。( 二) 国外e g 细胞研究概况p g c s 的起源、迁移及增殖p g c s 是胚胎发育过程中最早可见的细胞之一。目前，p g c s 前体细胞发育的确切时间还不清楚，但有证据表明p g c s 来源于胚胎上胚层( e m b r y o n i ce c t o d e r m ) 由后肠胚层和尿囊基部向胚内迁移，最终经背肠系膜分两部分到达左、右两侧生殖嵴。用碱性磷酸酶( a l k a l i n ep h o s p h a t e s e ，a k p ) 标记p g c s ，p g c s 的高尔基复合体及细胞周缘部位a k p 呈强阳性并且在p g c s 迁移途中持续表达，借此可很容易地和它周围的a k p 反应弱的细胞区别。因此，可以用a k p 追踪p g c s 的迁移过程。以小鼠为例，p g c s 最早出现在交配后第7 天( 7d a y sp o s tc o i t u m ，7 d p c ) ( 原肠中期) 此时p g c s 为8 个体积较大的a k p 阳性细胞，位于胚外中胚层；7 5 d 约有4 0 5 0 个a k p 阳性细胞，位于原条的末端近尿囊蒂处；8 d p c ( 原肠胚形成后期) 在后躅内胚层和尿囊基部，出现不足1 0 0 个p g c s = 8 5 d p c 的p g c s 大部分位于尿囊蒂和原条尾端的卵黄囊脏层，即后肠开口的边缘并与之结合。大约有1 5 0 个：9 5 d p c 少量p g c s 位于卵黄囊和尿囊底部，大部分细胞埋藏于席肠中( 通常在中胚层) ；1 0 5 d p c 细胞开始由后肠迁入悬挂于背侧体壁的发育中的肠系膜，少部分p g c s 进入生殖嵴；1 1 5 d p c 大部分p g c s r j 达生殖嵴：1 2 1 3 d p c 时，p g c s 停i 七迁穆，p g c s 开始分化成可确认的雄性或雌性配子并停止在有丝分裂期( 雄性) 或减数分裂期( 雌性) 。此时，p g c s 逐渐失去了运动能力，在形态上亦不同于迁移的细胞，细胞表面特性发生了明显改变。而没有到达生殖嵴的p g c s 。进入周围其它器官，如肾上腺和肾( b u e h r , 1 9 9 7 ) 。一般认为在后肠形成以前，p g c s 的迁移主要是通过形态改变而被动进行的：从质肠到生殖嵴则是一个主动迁移的过程。大部分p g c s 在1 1 5 d p c 到达生殖嵴，大约1 3 5 d p c 时增殖停j h 。p g c s在迁移过程中和到达生殖嵴后两天内增殖非常活跃，p g c s 细胞群体的倍增时间大约为1 6h 。以小鼠为例，p g c s 数目由原来的不足1 0 0 个( 8 d p c ) 增加到2 5 0 0 0 ( 1 3 5 d p c ) 个。迁移中的p g c s 有许多指状、钝性的伪足，大量的p g c a 呈哑铃状，具有极性的细胞质，p g c s 以阿米巴运动的方式向生殖嵴移动，一旦到达生殖嵴，它们就呈卵圆形。在所有的脊椎动物和很多非脊椎动物中，p g c s的迁移过程与小鼠基本相似。值得一提的是禽类的p g c s 是通过血液迁移到生殖嵴的，但在哺乳动物p g c s 迁移过程中井未在血液中发现p g c s 。在p g c s 迁移的不同阶段中，一系列细胞外信号在不同的时间和不同的空间表达，并一起参与了p g c s 的迁移。p g c s 的迁移是一个复杂的过程，涉及到一系列不同功能分子的联合作用来共同完成，其中包括胞外基质( e c m ) 、细胞因子( s t e e l 和t g fb1 ) 、生殖嵴的趋化作用、生殖细胞间及生殖细胞与体细胞间的相互作用。( 1 ) 趋化性：在胚胎发育过程中，生殖嵴释放某种趋化物质吸 p g c s 向其移动的。小鼠胚胎生殖嵴的细胞产生一种可扩散的转移生长因子t g f 2b1 ，而p g c s 带有t g f 2bl 的受体，故可沿该生长因子的浓度梯度进行迁移。另一种趋化因子是s t e e l 因子( s t e e lf a c t o r ，s lf ) ，通过s lf 的趋化作用可调控p g c s “归巢”。4中国农业科学院硕士学位论文文献综述奠曼皇皇曼鼍量舅曹吕量詈曼烹曼曼曼阜_ i i! l ii 篁皇烹! 曼( 2 ) 接触引导作用：在迁移过程中，周围的细胞和基质影响p g c s 的运动，层连蛋白和纤连蛋白引导p g c s 的移动，在p g c s 的迁移过程中具有重要的作用。( 3 ) p g c s 细胞间的差异粘附作用：p g c s 细胞之间的接触对细胞迁移的影响最大。1 0 5a p e p g c s通过细跃的突起互相连接，在背系膜还未完全形成时即开始从后肠迁移，几乎是直接从后肠进入背正中线，然后进入发育中的生殖嵴，这表明p g c s 问的连接有助于引导那些后期离开后肠经肠系膜最后进入生殖崤的细胞的移动( 李光鹏等，1 9 9 8 ：李臻等。1 9 9 9 ；傅文玉等，2 0 0 1 ) 。1 、小鼠e g 细胞研究概况；早在7 0 年代，j e o n 等( j e o ne t a l ，1 9 7 3 ) 和b r i n s t e r ( b r i n s t e r , 1 9 7 7 ) 分别对小鼠p g c s 的形态结构和能量代谢进行了研究。1 9 8 2 年，f e l i c e 等用e d t a p e r c o l l 法分离到小鼠p g c s ( f e l i e ee ta