（动物遗传育种与繁殖专业论文）家猪atrn基因多态性及其与重要经济性状的关系研究.pdf

摘要 a t t r a c t i n ( m a h o g a n y m g ) 是常染色体隐性基因，在近几十年里受 到很大关注。已经发现a t t r a c t i n 在黑色素沉着、调节运动行为和基础 代谢、中枢神经的形成及功能、协调t 细胞与巨噬细胞之间的反应等方 面都起着十分重要的作用。a t t r a c t i n 蛋白可以抑制因多食而引起的肥 胖，其在大脑中的表达水平与抑制肥胖症成正相关，而且鼠类 a t t r a c t i n 基因位于包涵几个体重和肥胖q t l 区域内。本研究以丹麦p i g r e s e a r c hs t a t i o ns o w sa n dp i g l e t s 培育的一个复杂近交家猪家系 ( c u p 家系) 0 - 6 代中的1 9 3 头家猪以及湘黄猪1 2 9 头、本地猪种2 5 7 头为试验材料，采用p c r r f l p 分子标记对a t t r a c t i n 基因座位点进行 分析，主要结果如下： 1 用t a q i 限制性内切酶对p c r 产物进行消化，在外来猪种( c u p 家系主要含长白和大约克血缘、湘黄猪主要含杜洛克和皮特兰血缘) 中 能够得到彳孙w 三种基因型一月、彳夙脚，呈现多态性；在本地猪种( 大 围子猪、宁乡猪、沙子岭猪) 中只表现出肋基因型，无多态性；各猪 种4 t r n 基因座的p c r - r f l p 基因型x2 检验结果表明：外来猪种问及每 个外来猪种月册基因座的p c r - r f l p 基因型分布与3 个本地猪种的相比 都差异极显著( p o 0 1 ) ，三个本地猪间a t r i i r 基因座的p c r r f l p 基因 型分布完全一致。 2 采用c r i - m a pv 2 4 软件对c u p 家系资料进行连锁分析发现 a t t r a c t i n 基因座位与1 7 号染色体s w l 0 3 1 位点连锁，重组率和l o d 值 分别为0 2 l 、3 1 9 ，为构建详细的连锁图提供依据。 3 根据外血猪种存在的多态性，分析了a t t r a c t i n 不同基因型与 生产性能的关系。结果表明：在c u p 家系中，三种基因型对于日均屠宰 重的影响基本上无差异；三种基因型间屠宰重有些差异，但并不显著； 而三种基因型对于背膘厚存在着显著的差异( p 0 0 5 ) ，脚基因型个体 背膘最薄，月曰基因型个体居于中间，彳一基因型个体所表现出的背膘最 厚。湘黄猪中，表现为背膘厚以础型优于爿彳型和月占型的趋势。总的 看来，外来品种中，肋型个体背膘最薄。 4 本地猪种的背膘厚通常比外来猪种厚，但本研究在本地猪 a t t r a c t i n 基因座位点无多态性，只有肋型，这与外血猪种凹型最薄 似乎产生了矛盾，本人认为主要是由于：实验的样本含量不够，引起 抽样误差，未能检测到其它基因型；所设计引物的局限性，尚不能在 本地猪该片断区中检测到多态，该引物只适应于外血猪种；不同的遗 传背景所造成的，外来猪与本地猪种间存在着较大的差异，降低了可比 性。这些发现，为对a t r n 研究提供了新的思路。 5 利用本实验设计的引物对所有家猪材料p c r 扩增出来的 a t t r a c t i n 基因座位点产物约为8 9 0 b p ，与e d e a l 等人2 0 0 0 年报导的 9 8 0 b p 有较大的出入，经准确核对所公布基因序列后，推测8 9 0 b p 可能 是比较准确的。 6 本研究表明，在外血猪种中a t t r a c t i n 存在着多态性，与影响 背膘厚的微卫星位点连锁，且b b 型对于背膘厚有着显著效应，等位基 因闯以加性效应为主( p ( 0 0 5 ) ，所有这些为a t t r a c t i n 能否作为背膘 厚的候选基因提供了可行的方案及理论依据。 关键词：家猪；a t t r a c t i n 基因；p c r - r f l p ；背膘厚 a b s t r a c t a t t r a c t i ni sa na u t o s o m a lr e c e s s i v eg e n ea n dr e c e i v e dg r e a ta t t e n t i o nw i t h i nt h e l a s tf e wd e c a d e s a t t r a c t i ni nd i f f e r e n tl i n e sh a sb e e ni d e n t i f i e da t t r a c t i nt oh a v e m u l t i p l e r o l e si n r e g u l a t i n gp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s i t a f f e c t st h eb a l a n c eb e t w e e n a g o n i s ta n da n t a g o n i s t a t r e c e p t o r so nm e l a n o c y t e s ，m o d i f i e sb e h a v i o u ra n db a s a l m e t a b o l i cr a t e ，i n t e r v e n e sd e v e l o p i n gt h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e ma n di t sf u n c t i o n ，a n d m o d u l a t e sa ni n t e r a c t i o nb e t w e e na c t i v a t e dtc e l la n dm a c r o p h a g e s t h ea t t r a c t i n g e n ee n c o d e sap r o t e i nt h a ti si n v o l v e di nt h es u p p r e s s i o no f d i e t i n d u c e do b e s i t y ，i t s e x p r e s s i o nl e v e l i nt h eb r a i nh a sas i g n i f i c a n t r e l a t i o n s h i pw i t ho b e s i t y ，t h e r o l e i n d i c a t e st h et h e r a p e u t i c p o t e n t i a l o fa t t r a c t i ni nt h et r e a t m e n to f o b e s i t y f u r t h e r m o r e ， t h em u r i n ea t t r a c t i nl o c u si sl o c a t e di nar e g i o nh a r b o r i n gs e v e r a lq t lf o rb o d y w e i g h ta n df a t n e s s i nt h i ss t u d y , t h ep o l y m o r p h i s mo f a t t r a c t i ns i t ew a sd e t e c t e db y u s i n gp c r r f l p i nac o m p l e xi n b r e dp i gf a m i l y , x i a n g h u a n gp i g sa n d , d m cn a t i v e b r e e d s t h er e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sb e l o w ： 1 t h eg e n e t i cv a r i a t i o no f a t r nl o c ii np i g si n c l u d i n gc u pr e s o u r c ep o p u l a t i o n ( t h ef o u n d e rb o a ra n d s o ww c r co ft h ei a m d r a c ea n dy o r k s h i r eb r e e d s ) ，x i a n g h u a n g p i g ( t h e f o u n d e rb o a ra n ds o ww e r e o ft h ed u r o ca n d p i e t r a i n ) , n a t i v e b r e e d s ( n i n g x i a n gp i g ，s h a z i l i n gp i ga n dd a w e i z ip i 由w a sd e t e c t e db yp e r r f l p w i t ht a q i t h er e s u l t ss h o w e da s ：t h et w oe x o t i cb r e e d si n c l u d i n gc u pr e s o u r c e p o p u l a t i o n , x i a n g h u a n gp i g w e r ep r o v e dt ob e p o l y m o r p h i ca tt a q i - r f l ps i t e , g e t t i n gt h r e eg e n o t y p o s ：a a a b , b b b u tt h et h r e en a t i v eb r e e d si n c l u d i n gd a w e i z i p i g ，n i n g x i a n gp i g , s h a z i l i n gp i gw e r ep r e s e n t e do n l yb bg e n o t y p ea n dn ov a r i a t i o n a tt h et a r q l - r f l ps i t e t h ex 。v a l u eo fa t r ng e n o t y p ed i s t r i b u t i o na tt h e t a q i r f l ps i t ei nd i f f e r e n tp i g si n d i c a t e dt h a ta t r ng e n o t y p e d i s t r i b u t i o n b e t w e e ne v e r ye x o t i cp i gb r e e da n de v e r ye x o t i cp i gb r e e db e t w e e ne v e r y n a t i v ep i gb r e e da l lh a dh i g h l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s ( p 0 o i ) t h ea t r n g e n o t y p ed i s t r i b u t i o no f t h r e en a t i v ep i gb r e e d sw a st h es a m e c o m p l e t e l y 2 i nas e x - a v e r a g e da n a l y s i si nc u pr c s o u r c cp o p u l a t i o nu s i n gc r i - m a pv 2 4 a t r nw a sl i n k e dt oo n em i c r o s a t e l l i t e m a r k e r ( s w l 0 3 1 ) o nc h r o m o s o m e l 7 ，t h e r e c o m b i n a t i o n 丘e q u e n c ya n dl o d 5 c o r e si s 0 2 1 ，3 1 9 ，r e s p e c t i v e l y i tp r o v i d e sa n o p p o r t u n i t y f o rf u r t h e rd e v e l o p m e n t o f l i n k a g em a p s 3 a c c o r d i n g t h e p o l y m o r p h i s mo fa t r n l o c is i t ei ne x o t i c p i gb r e e d , t h e g c n o t y p ew a sa n a l y z e dw i t ht h ep h e n o t y p eo f t h es l a u g h t e r e di n d i v i d u a l s i ts h o w e d a sf o l l o w ：i nc u pr e s o u r c ep o p u l a t i o n , t h eg e n o t y p eo fa t r nh a sn os i g n i f i c a n t r e l a t i o nw i t ha v e r a g ed a i l ys l a u g h t e r g a i na n ds l a u g h t e rw e i g h t ，b u tw a si ns i g n i f i c a n t r e l a t i o nw i t hb a c k - f a td e p t h ( p 0 o s ) ，t h eb b g e n o t y p e sw a st h eb e s t ；i nx i n a g h u a n g p i g t h er e s u l t sw a ss i m i l a rt ot h ec u pr e s o u r c e p o p u l a t i o n s o w ec a ng e tt h e c o n c l u s i o nt h a tt h eb b g e n o t y p ei na t r n s i t eo ft h ee x o t i cb r e e d sw a ss u p e r i o rt o o t h e r si nb a c k - f a td e p t h 4 g e n e r a l l y ，t h en a t i v ep i gb r e e d sb a c k f a td e p t h i st h i c k e rt h a nt h ee x o t i c s i n t h i ss t u d yt h e r ew a s o n l yb bg e n o t y p ei na t r n l o c is i t eo ft h en a t i v eb r e e d s ，b u tt h e b b g e n o t y p ei n d i v i d u a l s w a st h et h i n n e s to fb a c k - f a td e p t hi nt h ee x o t i cb r e e d s ，s oi t s e e m sas e l f - c o n t r a d i c ta b o u ta t r n p o s s i b l er e a s o n sa r e t h en u m b e r so fs a m p l e w e r et o os m a l lt od e t e c tt h eo t h e rg e n o t y p e s t h ep r i m e r sh a v es o m el i m i t a t i o n s w e r e n te n o u g ht od e t e c tt h ep o l y m o r p h i s mi nt h en a t i v eb r e e d s ，i fc l o u dd i s c o v e r t h r e eg e n o t y p e s ，t h eb b g e n o t y p eo f a t r nw o u l db et h et h i n n e s to fb a c k - f a td e p t h ( 亘) t h e r ea r eh a v em a n yd i f f e r e n c eb e t w e e nn a t i v ep i gb r e e d sa n de x o t i cp i gb r e e d si n n a t u r e ，s oc o u l d n tc o m p a r ed i r e c t l y 5 u s i n gt h ep r i m e r sw e r es h o w n i nt h i se x p e r i m e n to n l yc a ng e ta b o u t8 9 0 b p a t r np c r p r o d u c t ，w a s n o ta s9 8 0 b pa se d e a le ta lh a sr e p o r t e d t h r o u g h c o m p a r i n g t h ea t r n g e n es e q u e n c ew a sp u b f i c i z e db yg e n b a n k , w ee s t i m a t et h a t8 9 0 b pw a s s u p p o s e d t or i g h t 6 i nc o n c l u s i o n , t h e a t r n w e r e p r o v e d t ob e p o l y m o r p h i c a tt h et a q i r f l ps i t e i ne x o t i cb r e e d s ，t h eb b g e n o t y p eh a ss i g n i f i c a n te f f e c to nb a c k - f a td e p t ha n dt h e a s s o c i a t i o ne f f e c to fb a c k - f a td e p t hm a j o rc 孙雠db ya d d i c t i v ee f f e c tf p 4 0 的小鼠比采食脂肪含量 1 0 的小鼠增重加快。相反的是，鲴小鼠不会因采食高脂肪食物而引发肥 胖，实际上m g 小鼠的采食远远大于正常鼠，而且粥只能抑制采食过量 引起的肥胖，不能抑制先天性肥胖症“”。g u n n 等人认为孵需要a g r p 协调作用，但历f 抑制a g o u t i 和m c 4 r 受体与a g r p 刺激食欲是相互独立 的，m g 蛋白可以通过干扰a g r p 的处理过程或通过破坏a g r p 的脱酶受 体“1 。l l 【g 蛋白靠饱和运输方式进入大脑屏障，这种运输系统能力与 m g 抑制肥胖症成正相关o “。b r o n s o n 等人对四f 的作用机制提出新的看 法，因为他们发现a t t r a c t i n 突变个体大脑海绵体有严重的退化，而海 3 绵体与食欲、新陈代谢率有密切关系 2 1j 。g u n n 等人最近研究发现口矿7 和m g 纯合予，能减轻体重和肥胖，并且使运动量增加，其机制是在神 经病理学上丢失了功能，突变鼠中不正常的体重被认为是中枢神经受到 抑制，从而消耗了能量。另外，m g 在促使色素沉着方面所需要的量大 于其在正常神经作用和新陈代谢中的水平“。 1 3 2a r tr s o t in 与中枢神经 l u 等人采用原位杂交检测a t t r a c t i nm r n a 在大脑和脊髓中的分 配，结果发现m r n a 广泛分布于中枢神经系统中。如嗅觉部位，一些边 缘结构、脑干、小脑、脊髓。在视丘下部a t t r a c t i nm r n a 被发现存在 某些特定的核内，包括交叉上核( s u p r a c h i a s m a t i c ) 、视上 核( s u p r a o p t i cn u c l e u s ) 、室旁核( p a r a r e a t r i c u l a rh y p o t h a l a m i c n u c l e u s ) 、弓状核( a r c u a t eh u c l e u s ) 等“3 。k u r a m o t o 等人以及l e m e s 等人发现在小鼠中z 1 t t 盯基因突变可使其中枢神经系统产生液泡 ( v a c u o l a t i o n ) 和髓鞘膜过少( h y p o m y e l i n a t i o n ) ，导致机体早期发 生战栗；进而发生局部麻痹，同时在中枢神经中伴随有肿瘤。通过定位 克隆发现历历小鼠中a t t r a c t i nm r n r 水平在脑中显著减少，确定历 是一个含8 b p 被删除的a t t r a c t i n 剪接供体基因座“”1 。后来又在大 鼠中发现m v ( m y e l i nv a c u l a t i o n ) 是a t t r a c t i n 的一个新的等位基因， 位于3 号染色体上，n o r t h e r n 杂交在四y 大鼠大脑中未发现a t t r a c t i n m r n 表达，染色体检测和序列分析发现包括外显子l 在内的一条染色 体缺失阻3 。“1 d a l i k 等人发现a t t r a c t i nm r n a 及其蛋白质在神经胶质 瘤细胞中存在表达的改变。膜型a t t r a c t i n 在人类u 3 7 3 和u 8 7 神经胶 质瘤细胞中能够分别水解相当于5 和2 5 d p p i v 酶的( 水解) 活性。在 正常的神经胶质中未发现有r t t r a c t i n ，推断a t t r a c t i n 的作用可能是 神经胶质细胞成为肿瘤细胞的工具n ”。高枫等人发现a t t r a c t i n 有可 能是k 5 6 2 细胞表面一个黏附因子受体，与抑制k 5 6 2 细胞向红系分化有 关，( k 5 6 2 细胞系是人红白血病的恶性肿瘤细胞株) n “。b r o n s o n 等人 用鼠2 号染色体a t t r a c t i n 突变进行等位性检测，s o u t h e r n 杂交和p c r 分析表明突变删除了部分基因( 但不至于影响其两旁的基因) ，组织病 理学分析发现大脑海绵体有严重退变1 。g u n n 等人发现在r o t m g p 鼠 大脑和松果体中广泛存在着液泡n ”。t a n g 等人研究认为a t t r a c t i n m r n a 可以下调膜型a t t r a c t i nm r n a ，中枢神经中异常的分泌型 a t t r a c t i n 能阻碍膜型a t t r a c t i n 的产生和功能，可能影响到神经元 外周细胞的反应，进而导致人类神经退化”。 13 3 a t t r a c t i n 与免疫调节 大多数情况下，a t t r a c t i n 蛋白在血浆中的含量保持在一定的水 4 平。当机体发生炎症反应时，巨噬细胞首先与细菌作用，同时将信号传 给t 细胞，血浆中的膜型a t t r a c t i n 蛋白迅速附着在活性t 细胞表面， 在此改变编码，由膜型变成分泌型并释放于血清中。分泌型a t t r a c t i n 再分泌细胞因子( c y t o k i n e s ) 和趋化因子( c h e m o k i n e s ) 诱导巨噬细 胞和t 细胞的聚集o ”3 “。 1 4 问题与展望 短短的几年当中，a t t r a c t i n 基因的研究有了突破性进展，由最初 以为a t t r a c t i n 只能抑制黄毛和肥胖，己扩展到免疫、中枢神经系统等 多个方面。a t t r a c t i n 的作用可能还远远不止这些，而且有许多机制尚 未弄清。新的发现为我们带来了新的契机，如：膜型a t t r a c t i n 在中枢 神经中形成正常髓鞘膜起关键作用，这将为我们研究髓鞘生理学及髓磷 脂病理学提供新的思路；利用其抑制肥胖的功能，可为人类研制减肥药 物提供参考。 此外，a t t r a c t i n 基因在小鼠和人中的研究较多，而涉及到猪和牛 的研究相对较少，仅e d e a l 等人报道在牛和猪中进行了基因分型定位工 作。鉴于a t t r a c t i n 基因位于包涵几个体重和肥胖q t l 区域内，以家猪 为材料，利用o t l 定位对a t t r a c t i n 基因进行研究可能会有新的发现， 如准确估计a t t r a c t i n 基因各种突变型对于经济性状的效应，以及在 基因组定位刻画基因的性状贡献率等。我们以资源家系、湘黄猪和地方 猪种为材料，采用p c r r f l p 技术，检测a t t r a c t i n 基因多态性，并结 合经济性状进行分析及其他方面的研究工作等。为探索a t t r a c t i n 基因 提供实践方法和理论依据。更加深入地采用不同的研究方法从不同的角 度在不同的动物中对a t t r a c t i n 基因进行研究探讨，将对生物制药、抑 制肥胖、基因治疗等有深远意义。 2 材料与方法 2 1 系谱与性状记录 2 1 1 资源家系 供试猪为丹麦p i gr e s e a r c hs t a t i o nf o rs o w sa n dp i g l e t s 培育的1 个连 续近交系分离家猪( 吴晓林博士受赠) 。系祖为纯种的长白公猪和大约母猪，杂 交产生1 代。从f l 代开始，近交始于父女回交，此后又连续近交4 代，以同胞 交配为主，并兼有不同比例的亲子回交。o 一6 世代该家系有效记录个体猪总数 目达2 1 3 头。系谱见图2 m1 。本研究选择l 6 世代1 9 3 头个体进行分析( 1 7 4 头能准确区分基因型，1 2 4 头有完整记录) 。分析性状为屠宰重( s w t ) 、日均屠 宰重( a d s g ) 和背膘厚( b f d p ) 图2 丹麦c u p 家系猪的系谱图 f i g u r e2t h ep e d i g r e es t r u c t u r eo fad a n i s hp i gf a m i l y ( c u pf a m i l y ) 2 1 2 湘黄猪及地方猪种 实验所用供试猪系湘黄猪第9 世代核心群生长后备种猪( 1 2 9 头能 区分基因型，1 2 4 头有完整记录) 全群按生长后备猪饲养标准及培育 条件饲养于省畜牧兽医研究所实验种猪场。于2 0 0 2 年5 月1 6 1 8 日分 3 个批日，在空腹1 2 h 后称取试猪体重。同时，采用鼻棒站立保定法和 专用笔式测膘尺，于试猪左侧距背中线2 5 c m 处，测量6 - 7 肋间( 前 f a t d e e p l ) 、胸腰结合( 中f a t d e e p 2 ) 、腰荐结合( 后f a t d e e p 3 ) 等3 点平均背( 皮) 膘厚( m e a no ft h r e ep o i n tf a t d e e p ，m f d ) ”“，共 观测日增重( d a i l yg a i ni nd a t e f r o mb o r nt ot e s t ，d g ) 、均膘厚2 个性状。 大围子猪样品采自长沙县双江镇保种区( 9 7 头) ；沙子岭猪样品采 自湘潭县砂子岭( 8 4 头) ：宁乡猪样品采自宁乡县流沙河( 7 6 头) 。 2 2p c r r f l p 分析 6 2 2 1 主要试剂和仪器 试剂：忍g d n a 聚合酶、d n t p s 、m g ”、t a q i 限制性内切酶、电泳琼 脂糖( 进1 ：3 ) 、矿物油、蛋白酶k 、1 0 0 b p d n al a d d e r 购自晶美生物工程公 司：e p p e n d o r f 离心管、t i p s 、t r i s 碱、硼酸、e d t a 、饱和酚、氯仿、无 水酒精等购自上海生物工程公司。 仪器：d n a 扩增仪、高速离心机、恒温水浴摇床、分光光度计、超 净工作台、微量加样器、高压灭菌锅、稳压稳流电泳仪、琼脂糖凝胶电泳 槽、紫外光观察仪、计算机、数码相机。 2 2 2 基因组d n a 提取 资源家系高分子量d n a 分离参见f r e d h o l m 等( 1 9 9 3 ) 报导”。湘黄猪 和地方猪种d n a 提取方法如下。“： 取一小块耳样，去毛、洗净、剪碎； 加入提d n ab u f f e r ( 1 0 m me d t a + i o m mt r i s h c i ( p h = 7 4 ) + 2 s d s + 3 0 0 m mn a c l ) 0 6 m l + 蛋白酶kl o p l ( 1 0 m g m 1 ) ； 4 5 ( 3 7 - 5 0 ) 3 h 。摇床约1 8 0 转分钟； 离心去沉淀( 1 1 0 0 0 r p m ) ，加等体积饱和酚( o 6 m 1 ) 抽提，数次到无蛋 白： 加入等体积氯仿抽提( 卜2 ) 次，取上清液； 两倍无水乙醇沉淀d n a ，摇匀、离心、倒掉溶液，保留沉淀； 7 0 酒精l m l 洗涤1 次，倒掉上清液，4 u 低温干燥； 加入2 0 0 4 0 0 u l t e ( t r i s - h c i i o o m l i + e d t a1 r a m ) 悬浮d n a ； 分光光度计分别测定d n a 样品在2 6 0 n m 和2 8 0 n m 时的光密度计算其 浓度和纯度； 将各种浓度的d n a 统一稀释为5 0 n g l i l ，备用。 2 2 3p o r 引物合成 根据1 9 9 8 年和2 0 0 0 年g e n b a n k 公布的人和小鼠a t t r a c t i nc d n a 序列 ( 参考e d e a l 等人报导，登录号为a b o l l 2 0 、a f l 2 0 3 1 8 ) ，利用p r i m e r 3 软 件设计“3 ”，由上海生物工程公司合成。 正向引物( f o r w a r d ) ：5 - - g t g t a c a a g g a g a a g t c a g g a g - - 3 反向引物( r e v e r s e ) ：5 一g a t c t a t t t 批g t c t a g g c a c - - 3 2 2 4p o r 扩增 p c r 反应体系为l o u l ： d d h 2 0 l o x b u f f e r m g c l 2 ( 2 5 m m ) d n t p ( 4 m m ) t e m p l a t ed n a ( 2 5 - 5 0 n g p 1 ) a m p l it a qg o l d ( 5 p m 1 ) p c r k i ne l m e r p r i m e r ( f o r w o r d ) p r i m e r ( r e v e r s e ) 矿物油 7 删删州恻删删唧捕 扩增反应为：9 5 c 预变性3 m i n ；i 0 个循环反应( 9 5 01 5 秒；6 4 。c 退火 3 0 秒，每个循环退火温度降低l ；7 2 c 延伸1 分钟) ；然后固定退火温度循环 反应2 5 次( 8 9 c 变性1 5 秒；5 5 0 i 匮火3 0 秒；7 2 c1 分钟) ；7 2 。c 后延伸5 分钟， 降温至4 c 终止反应。程序如下。”： p r o g r a ms e t t i n g ( p c rt h e r m a lf ile ：t o u c h d o w n ) l “ s t e p 9 5 co o h r ：0 3 m i n ：o o s e c 2 “s t e p 9 5 co o h r ：o o m i n ：1 5 s e c 3 “s t e p 6 4 co o h r ：o o m i n ：3 0 s e c 1 o c c y c e 4 “s t e p 7 2 c0 0 h r ：o l m i n ：o o s e c 5 “ s t e pg o t os t e p2 f o r9t i m e sm o r e 6 ” s t e p 8 9 co o h r ：o o m i n ：1 5 s e c 7 “ s t e p 5 5 co o h r ：0 0 m i n ：3 0 s e c 8 “s t e p 7 2 co o h r ：o l m i n ：o o s e c 9 “ s t e pg o t o s t e p6f o r2 4t i m e sm o r e 1 0 ”s t e p 7 2 co o h r ：0 5 m i n ：s e c l l ”s t e d 4 c0 0 h r ：o o m i n ：s e e 1 2 “s t e p e n d 2 2 5p 傀产物消化 酶切反应体系： d d h 2 0 0 6 5 m l o x b u f f e r 0 1 0 l l l l t = q i o o u m ) 0 2 5 l | l p c r 扩增产物1 0 0 0 脚 抬口i 限制性内切酶先与水和缓冲溶液稀释，每批以十管计算，然后往l o p l 产物中每管加l p l 酶切液，混匀后瞬时离心，放入p c r 仪中6 5 1 2 恒温3 小时。 2 2 6 检测和定型 琼脂糖凝胶电泳 电泳浓贮存液t b e ( 每升) ： 5 ： 5 4 9t r i s 碱 2 7 5 9硼酸 2 0 m 10 5 t o o l le d t ( p h 8 0 ) 准确称取2 9 琼脂糖粉，倒入三角烧杯；用量筒量取5 0 m l0 5 x t b e ， 加热溶解；待冷却至7 0 左右加入溴化乙锭摇匀；倒入平放封口插梳的装胶 槽； 凝胶聚合后拔出梳子，撕下封口胶带，将装胶槽放入装有0 5 x t b e 电 泳液的电泳槽； 在酶切产物中加入2 p l 载样缓冲溶液，用微量取样器将样品点入梳孔， 同时点上标记i o o b p d n a1 a d d e r ； 上样完毕，接通电源，8 0 - 1 5 0 伏电泳卜i 5 小时。 在紫外灯上观察电泳结果并拍照，同时测量m a r k e r 片断和等位基因的迁 移距离，据相应的m a r k e r 片断长度大小估计等位基因片断长度的大小1 。 8 2 3 统计分析 2 3 1 等位基因频率 由于r f l p 按简单的孟德尔式等显性遗传，可以根据基因型频率计算其等位 基因频率“1 “。 2 3 2 连锁分析 采用c r i - - m a p2 4 ( h t t p 删k u n n l t u t o r i a l s g e n o m i c s c r i m a p d o c h t m l ) 。 2 3 3 相关效应分析 采用s a s ( 6 1 2 ) 统计软件，对1 2 4 头资源家系猪( 1 2 4 头湘黄猪) 生产性能 性状不同基因型时进行显著性检验和多重比较，相关效应分析模型为： y i n l = 1 1 + s a g e + g n r t + s e x j + m + e j 式中y 为合并屠宰重( s w t ) 、日均屠宰重( a d s g ) 和背膘厚( b f d p ) 性状的表型 值；u 为总体平均值；s a g e 代表屠宰日龄效应；g n r t ，和s e x ，分别为第i 世代 ( i = 1 ，2 ，4 ) 和第j 性别效应( j = l 。2 ) ：m 。为基因型效应；e 。，为随机误差n ( 0 ，07 ) 。 3 结果与分析 3 1p o r - - r f l p 检测结果 经p c r 扩增后，用4 琼脂糖凝胶电泳检测结果见图3 ，扩增产物长度约为 8 9 0 b p 。用t a q l 酶切后出现多态性，根据条带的数目和位置，确定有三种基因型， 7 0 0 b p 的为从基因，7 0 0 b p + 4 5 0 b p + 2 5 0 b p - 一条带的是a b 基因型，4 5 0 b p + 2 5 0 b p 两条带的为b b 基因型。另外一些较小的带纹在4 琼脂糖中观察不到。 图3 部分试验猪a t r n 基因检测结果第1 - 2 泳道为纯合子 ，第3 - 5 泳道为杂合子 a b ， 第6 - 9 泳道为纯合子且8 ，第1 0 泳道为p c r 产物，第1 1 泳道l o o b pd n a l a d d e r 。 f i g3 t b t m gr e s u l t so fa t r ng e n ei np a r t i a le x p e r i m e n t a lp i g s l a m l - 2 a a 萨n o t y p e ； l a m 3 - 5 ：a bg e n o t y p e s ；l a n e 6 - 9 ：b bg e n o t y p e s ；l a n e l 0 ：u n c u t ；l a n e l l ：1 0 0 b pd n al a d d e r 3 2 月7 再位点在不同猪群中的基因频率和基因型频率 根据p c r - - r f l p 结果对5 个品种( 系) 猪群体进行了不同基因型的统计， 表15 个猪种a t r n 基因的p c r - r f l p 基因型和基因频率分布 型：! 生螋鲤堂鲤堂墅唑堕坐型坚婴垫墅暄坐 品种 样本数 基因型分布频率 基因频率 b r e e d s n o o f s a m p l eo e n o t y p ed i s t r m u t i o n 岫n 呵 a l l e l ef r e q u e n c y a aa b b bab 1 0 结果表明，三个地方猪种2 5 7 个样品所扩增的a t r n 基因片段均存在2 个t a q l 酶切位点，只发现b 等位基因，而外来品种均存在a 和曰等位基因，即存在多 态性，但是不同品种基因频率分布不同。经检验各品种内基因频率和基因型频率 均符合哈代一温伯定律。 各种猪a t r n 基因座的p c r r f l p 基因型分布x2 检验结果列于表2 。从表2 可以看出，每个外血猪种a t r n 基因座的p c r r f l p 基因型分布与3 个本地猪种 的相比均差异极显著，3 个本地猪种相互间的a t r n 基因座的p c r - r f l p 基因型 分布x2 检验值均为零，表明3 个本地猪种间该基因座的基因型分布完全一致， 这主要是因为3 个本地猪种a t r n 基因座的p c r r f l p 检测结果全为b b 纯合子 型，此情况下x2 检验时的理论数与实际数相等。外血猪种各基因型分布的x 2 检验差异极显著，表明外血猪种间该基因座3 种基因型的分布也存在着差异。 表2a t r n 基因的t a q l - r f l p 基因型分布x2 检验结果 t a b l e2 x2 v a l u e o f a t r n g o n o t y p e d l s t f i l m f i o na tt h er q i - r f l ps i t e c u p f a m i l yn i n g x i n g s h a z i l i n g d a w e i z i + p 0 0 5 ，”p 0 0 1 ( x o s 圆= s 9 9 ，x2 伽l 秽2 x ) 3 3 月7 再与微卫星标记的遗传连锁分析 利用c r i - m a p 软件的t w o p o i n t 分析a t r n 与1 7 号染色体上其它座位的连 锁情况，结果见表3 。从表中可以看出a t r n 和位点s w l 0 3 1 的重组率为0 2 1 ， l o d 值为3 1 9 ，可以推断a 刁w 与s 、1 0 3 1 是连锁的，这和e d e a l 等人报导的 a t r n 与s w l 0 3 1 连锁( 重组率和l o d 值分别为0 2 0 ，4 1 7 ) 相一致。但目前还 不能将a t r n 插入到已经构建的微卫星图谱中，还需要进一步的核对基因型，排 除一些可疑个体，找到更多的连锁位点。a t r n 与猪1 7 号染色体微卫星框架标 记遗传图谱关系可见图4 。 表3a t r n 与其他座位的t w o p o i n t 连锁分析 t a b l e3t w o p o i n t l i n k a g ea n a l y s i s a t r n b e t w e e n o t h e