（免疫学专业论文）蛋氨酸脑啡肽单独或联合il2、ifnγ对小鼠cd4t细胞作用的研究.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要”1 英文论著摘要”4 二、英文缩略语”7 三、论文 前言“8 日玎舌“ 材料与方法8 结果15 讨论19 结论2 1 四、本研究创新性的自我评价2 2 五、参考文献2 3 六、附录 综j 苤2 5 在校期间科研成绩3 4 致谢3 5 个人简介3 6 中文论著摘要 蛋氨酸脑啡肽单独或联合i l 2 、i f n 一丫对 小鼠c d 4 + t 细胞作用的研究 刖菁 蛋氨酸脑啡肽( m e t h i o n i n ee n k e p h a l i n ，m e n k ) ，是由肾上腺产生的前激素和 前脑啡肽衍生而来，由5 个氨基酸残基组成的内源性阿片肽。近年来研究表明，适 宜浓度的m e n k 通过作用于免疫细胞上阿片受体( o p i o i dg r o w t hf a c t o r r e c e p t o r , o g f r ) ，对免疫系统活性具有显著的调节作用，有人称它为新型细胞因子 或阿片生长因子( o p i o i dg r o w t hf a c t o r , o g f ) 。经典阿片受体可分为p ( m u ) 、8 ( d e l t a ) 、 脚a ) 等几种亚型【l 】，m 踟 o 0 5 ) 。体内m e n k + i l 一2 组和m e n k + i f n 吖组与 m e n k 组相比小鼠脾c d 4 + t 细胞队6 受体m r n a 的表达量均显著增加( p 0 0 5 ) 。 三、e l i s a c d 4 + t 细胞上清液中i l 2 、i f n 吖的产生水平：体内外各实验组与对照组比， 均明显增加( 闷0 5 ) ，体内m e n k + i l 一2 组和m e n k + i f n - y 组与m e n k 组相比i l - 2 、 i f n - i 量显著增加( p o 0 5 ) 。 结论 m e n k 单独或联合i l 2 、i f n y ，在体内能显著增加小鼠c d 4 + t 细胞数量， c d 4 + t 细胞队6 阿片受体m r n a 水平表达及细胞因子i l 一2 、i f n - ，含量；体外 m e n k 单独应用可以显著增加小鼠c d 4 + t 细胞数量，c d 4 + t 细胞队6 阿片受体 m r n a 水平表达及细胞因子i l 2 、i f n - t 含量；但体外m e n k 联合i l 2 或i f n 吖 与m e n k 单独作用时相比无明显差异。 2 体 关键词 蛋氨酸脑啡肽；c d 4 + t 细胞：i l 2 ；i f n - 7 ：c 5 7 b l 6 d x 鼠 阿片生长因子受 3 英文论著摘要 e f f e c t so nm o u s ec d 4 + tc e l l sb ym e t h i o n i n e e n k e p h a l i n ( m e n k ) a l o n e o ri nc o m b i n a t i o nw i t h i n t e r l e u k i n 一2o ri n t e r f e r o n 一丫 i n t r o d u c t i o n m e t h i o n i n ee n k e p h a l i n ( m e n k ) ，t h ee n d o g e n o u sn e u r o p e p t i d e ，i sd e d v a t i z e db y p r e h o r m o n ea n dp r o e n k e p h a l i nw h i c hi sp r o d u c t e db ya d r e n a l ，i ss u g g e s t e dt ob e i n v o l v e di nt h er e g u l a t o r yl o o pb e t w e e ni m m u n ea n dn e u r o e n d o c r i n es y s t e m s i ti s p r o p o s e dt h a tt h i sm o l e c u l eb ec l a s s i f i e da sa l li m p o r t a n tc y t o k i n eo ro p i o i dg r o w t h f a c t o r t h u sm e n ka p p e a r st ob ea ni m p o r t a n ti m m u n o m o d u l a t o r ys i g n a l i n gm o l e c u l e t oe x e r tr e g u l a t o r ya c t i o n sc o n c e r n e d 、析t l lt h ee x p r e s s i n go fr e c e p t o r s t h ec l a s s i c a l o p i o i dg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r ( o g f r ) c o n t a i n e d a ( m u ) 、f i ( d e l t a ) 、r ( k a p p a ) i m m u n e w i d e s p r e a dm e n kc e l l s u r f a c er e c e p t o r ，m e n k 谢t ht h eb o d y so p i o i dr e c e p t o r s ， r e g u l a t et h ei m m u n es y s t e mf u n c t i o n s t u d i e sh a v es h o w nt h a tm e n ka l o n ea n di n c o m b i n a t i o nw i mi n t e r l e u k i n - 2o r i n t e r f e r o n - 丫c o u l d i n c r e a s et h ef u n c t i o no f i m m u n e ，b u tt h em e c h a n i s mw a sn o tc l e a r t h i si n v e s t i g a t i o nm e a s u r e dt h e e f f e c t so nt h eo p i o i dg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r s ( o g f r ) o nc d 4 + tc e l l sb ym e t h i o n i n ee n k e p h a l i n ( m e n k ) g o n ea n di nc o m b i n a t i o n w i t hi n t e d e u l d n 一2o ri n t e r f e r o n - 7i nv i v oa n dv i t r o ，i n c l u d e dt h en u m b e ro fc d 4 + t c e l l s , t h ee x p r e s s i o no fo p i o i dg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r sa n dc y t o k i n el e v e l so f s u p e m a t a n t sw h i c ht oe x p l o r et h ei m m u n o l o g i c a le f f e c t so fm e n k ，t h ef i n d i n g sm a y p r o v i d em e a n i n g f u lt h e o r e t i c a la n de x p e r i m e n t a lb a s i sf o rt h ec l i n i c a la p p l i c a t i o n m a t e r i a l s a n i m a l m a l ec 5 7 b l 6m i c e6 - 8w e e k s ( w e i g h i n g18 - 2 0 9 ) w e r ep u r c h a s e df r o mt h e s h a n g h a is i p p r b ke x p e r i m e n t a la n i m a lc o ，l t d m e t h o d s 4 1 p r i m a r yc e l lc u l t u r e 、t r e a t m e n ta n dm a g n e t i cb e a de n r i c h e dc d 4 十tc e l l s 2 f l o wc y t o m e t r yd e t e c t e dt h en u m b e ro fc d 4 + tc e l l sw i t hd i f f e r e n tt r e a t m e n t 3 r t - p c ra n a l y s i sf o re x p r e s s i o n so ft h r e eo g f rm r n af r o ms p l e e nc d 4 十t c e l l so fm i c e 4 e l i s ad e t e c t e dt h el e v e l so fl l 2a n di f n - 丫i nc d 4 + tc e l l s r e s u l t s 1 f l o wc y t o m e t r y t h en u m b e ro fc d 4 + tc e l l si na l le x p e r i m e n t a lg r o u p si nv i v oa n di nv i t r o ， c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ，w e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ( p o 0 5 ) m e n k + i l 2 g r o u pc o m p a r e d 、i t l lm e n kg r o u p ，a sw e l la sm e n k + i f n - 丫g r o u pc o m p a r e d 丽m m e ng r o u p ，t h en u m b e ro fc d 4 + tc e l l sw e r es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d 妒 o 0 5 ) i n v i v o ，h o w e v e r , t h ec o m p a r i s o nb e t w e e ng r o u p sw a sn os i g n i f i c a n ti n c r e a s ei nv i t r op 0 0 5 ) 2 r ，r - p c rc o n f i r m a t i o n t h ee x p r e s s i o no f t h r e ek i n d so p i o i dr e c e p t o r “、6 、1 cm r n aw e r ed e t e c t e di n s p l e e nc d 4 + t c e l l so fm i c e ，a n de a c hg r o u pc o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ，l z a n d6 o g f rw e r es i g n i f i c a n t l y ( 尸 ，m e n k + i l - 2 组( 2 0 0 m g k g + 1 0 4 u k g ) ，m e n k + i f n 吖组( 2 0 0 m g k g + 1 0 5 u k g ) 和m e n k + n x 啪 ( 2 0 0 m g k g + l o m g k g ) 。腹腔注射，每2 4h 给药1 次，连续给药7 天。给药剂量依据： 在预实验中发现，当以上述剂量给药时，小鼠开始出现明显的免疫反应( 以脾脏t 淋巴细胞的增殖反应作为考察指标) 。颈椎脱位处死小鼠进行半定量r t - p c r 、流式 细胞术、e l i s a 等相关检测。 ( 三) 体外c d 4 + t 细胞培养与处理 每批标本需要2 3 只小鼠，颈椎脱位处死7 5 的乙醇中浸泡1 2 分钟，无菌取 出小鼠脾脏，用1 0 f b s r p m i1 6 4 0 培养液制成细胞悬液，1 0 0 0 9 离，t 1 , 1 0 m i n ，用 红细胞裂解液裂解红细胞，r p m i1 6 4 0 洗涤两次，以含1 0 f b s r p m i1 6 4 0 调整细 胞终浓度为1 0 7 个m l 。一部分随机进行如下分组：空白对照组( 不加处理因素) ， 实验组m e n k ( 10 1 2 m ) ，i l 2 ( 2 0 0u m l ) ，i f n 吖( 5 0 0 u m 1 ) ，m e n k + i l 2 ( 1 0 1 2 m + 2 0 0 u m 1 ) ，m e n k + i f n q ( 1 0 。1 2 m + 5 0 0 u m 1 ) 和m n k + 】岖4 1 ( 1 0 1 2 m + 5 0 n m l ) 。每组设三个复孔于2 4 孔板，3 7 、5 c 0 2 孵箱培养4 8 h 后， 流式细胞术检澳w c d 4 + t 数量；一部分磁珠负选试剂盒分离纯化c d 4 + t 细胞，计数 纯化后的c d 4 + t 细胞，用1 0 f b s r p m l l 6 4 0 悬浮细胞沉淀子2 4 孔板，调整细胞数 为3 x 1 0 6 个m l ，经p h a ( 终浓度2 0 p g m l ) 进行常规刺激4 8h 后随机进行如下分组： 空白对照组( 不加处理因素) ，实验组m e n k ( 1 0 1 2 m ) ，i l 2 ( 2 0 0u m e ) ，i f n y ( 5 0 0 u m 1 ) ，m e n k + i l 2 ( 10 1 2 m + 2 0 0 u m 1 ) m e n k + i f n - 7 ( 10 。1 2 m + 5 0 0 u m 1 ) 和m e n k + n x ( 1 0 m m + 5 0 n m l ) 。每组设三个复孔，于3 7 c 、5 c 0 2 孵箱继续 培养。刺激4 8h 后收集上清冻存于7 0 c ，用于e l i s a 检i 9 1 j i l 2 、i f n - 7 含量；细胞 沉淀计数后冻存于t r i z o l 中，用于提取r n a ，r t - p c r 半定量检测。 ( 四) 流式细胞术检测c d 4 + t 细胞数量 体内处理组小鼠颈椎脱位处死，浸入7 5 的乙醇中浸泡1 2 分钟，无菌取出小 鼠脾脏，用1 0 f b s r p m i1 6 4 0 培养液制成细胞悬液，1 0 0 0 9 离一已, 1 0 m i n ，用红细 胞裂解液裂解红细胞，r p m i1 6 4 0 洗涤两次。以含i o f b s r p m i1 6 4 0 调整细胞终 浓度为1 0 7 + w a 。取0 1 m l 细胞悬液至流式管中，1 0 6 个细胞力i l u lf i t c 标记的c d 4 抗体，涡旋振荡1 0 s ，4 c 避光3 0 m i n 。2 f b s p b s 洗液洗涤两次，1 0 0 0 r m i n ，离 , 0 1 0 m i n ，弃上清，向细胞沉淀中加2 f b s p b s0 5 m l ，上机检测。 ( 五) 磁珠负选试剂盒分离纯化c d 4 + t 细胞 无菌条件下制取小鼠脾淋巴细胞悬液，细胞浓度调至1 0 7 个m l 。试剂盒分离 纯化c d 4 + t 细胞，方法如下： 1 、计数细胞，用lxb di g m a g t mb u f f e r 悬浮细胞沉淀，细胞数在1 0 - 2 0 x 1 0 6 m l 。 2 、每1x 1 0 6 细胞加入5 u l c d 4 + t 鸡尾酒，在冰上孵化1 5 m i n 。 3 、1 x b u f f e r 洗标记的细胞，3 0 0 9 离心7 m i n ，小心抽吸上清弃之，留细胞沉 淀。 4 、充分涡旋b d p l u s ，每1 x 1 0 6 细胞加入5 u lp l u s 。 5 、彻底混匀，在6 1 2 致冷3 0 m i n 。 6 、用l x b u f f e r 将上述细胞调至2 0 8 0 x 1 0 6 个m l 。 7 、将细胞制备液移至1 5 m l b d 离心管中，最大体积不超过3 m l ，放在磁场中 8 m i n 。 8 、取出磁场中的离心管，小心抽吸上清夜移至另一新的无菌e p 管中。 9 、再向阳性管中加入同体积的1 x b u f f e r ，用吸管吹打1 0 。1 5 次，再放入磁场 中8 m i n 。 1 2 1 0 、小心吸取上层清液，并放入上述无菌e p 管中。 l1 、重复i j 步骤，将收集的e p 管中的液体，2 0 0 0 r r a i n ，离心1 0 r a i n ，弃上清， 加入l m l p b s ，吹打细胞，2 0 0 0 r m i n ，离心1 0 r a i n ，弃上清，流式细胞仪检测纯化百 分率( 一般 8 9 ) ( 图1 ) 。 纯化前纯化后 图1 ，磁珠纯化c d 4 + t 细胞 ( 六) 半定量r t - p c r 反应 1 、t r i z o l 试剂提取c d 4 + t 细胞总r n a 。 ( 1 ) 计数细胞，每1 0 7 个加l m lt r i z o l ，0 2 m l 氯仿，充分混匀，室温放置3 5 分钟。 ( 2 ) 1 2 0 0 0 9 ，4 c 离心1 0 m i n 。 ( 3 ) 取上清，加等体积异丙醇，充分混匀，室温放置1 0 m i n 。 ( 4 ) 1 2 0 0 0 9 ，4 c 离心1 0 m i n 。 ( 5 ) 去上清，加7 5 乙醇l m l 洗涤沉淀。 ( 6 ) 7 5 0 0 9 ，4 c 离心5 m i n ，去上清。 ( 7 ) 重复( 5 ) 一( 6 ) 步骤，超净台上挥发乙醇。 ( 8 ) 沉淀加适量的d e p c 处理水，溶解总r n a 。 ( 9 ) 所提r n a 于紫外分光光度计下检测其纯度( o d 2 6 0 r t r n o d 2 8 0 n m = 1 8 2 0 ) 并进行定量。 1 3 2 、r n a 反转录合成c d n a ：反应体系为 m g c l 2 ( 2 5 m m ) lo x b u f f e r d n t p ( 10 m l v l ) r n a s i nr i b o m u c l e a s ei n h i b i t o r ( 1u i t 1 ) a m vr e v e r s e t r a n s c r i p t a s e o l i g o ( d t ) l s p r i m e r r n a s ef r e eh 2 0 r n a 2 m l u l 1u 1 o 2 5 l l l 0 5 m o 5 u l 3 7 5 u l l u l t o t a l1 0 u 1 条件为：3 0 1 0 m i n ，4 2 3 0 m i n ，9 9 5 m i n ，5 c5 m i n 。 3 、阿片受体基因的扩增 ( 1 ) 按如下体系进行p c r 扩增目的基因： 5x p c rb u f f e r t a qh s ( 1 0 0 u u 1 ) 灭菌蒸馏水 上游引物 下游引物 1 0 u l 0 2 5 u l 2 8 7 5 u l 0 5 1 1 1 0 5 u l t o t a l4 0 u l ( 2 ) 3 0 个循环后于7 2 c 延伸5m i n 。p c r 扩增产物在l 琼脂糖凝胶上电泳， 以i b - a e t i n 作为内参照，以靶基1 7 7 1 1 f i - a c t i n 灰度比值作为m r n a 的相对表达强度进 行半定量检测。 1 4 ( 七) e l i s a 检测c d 4 + t 细胞上清液中i l 2 ，i f n - 7 水平 l 、包板 包被液溶于1 l d h 2 0 ，过滤除菌，1 0 0 洲孔，4 c 包被过夜。 2 、加封闭液 弃上清，用p b s t 缓冲液洗板3 次，加入封闭液2 0 0 洲孔，3 7 。c 孵育1 h 。 3 、加待测品 弃上清，p b s t 缓冲液洗板3 次，加入标准品和待测细胞上清。1 0 0 洲孔，3 7 c 孵育2 h 。 4 、加酶标抗体 弃上清，p b s t 缓冲液洗板3 次，加入已稀释的酶标抗体( 稀释倍数见说明书) ， 1 0 0 u l 孔，3 7 2 h 。 5 、加底物 弃上清，洗板5 次，加新配制的底物，1 0 0 u l 孔，避光3 0 m i n 。 6 、终止反应 每孔加终止液5 0 u l ( 2 m 1 2 s 0 4 ) ，反应1 5 m i n ，酶标仪上4 5 0n m 波长处读取 o d 值，通过绘制标准曲线求出指标含量。应用s o f t m a xp r 0 4 3 1l s 软件分析， 绘制标准曲线，计算细胞因子含量( p g m 1 ) 。 ( 八) 统计学处理 采用s p s s l 7 0 软件包进行统计学分析，实验结果以x ：k s 表示，组间比较采 用单因素方差分析，p ( o 0 5 有显著差异。 结果 一、流式细胞术检测c d 4 + t 细胞数量结果 体内外各实验组小鼠脾c d 4 + t 细胞的数量与对照组相比，表达均差异显著 ( p 0 0 5 ) ；体内组m e n k 联合i l 2 、i f n 吖与m e n k 单独作用时i ：g c d 4 + t 细胞的数 量明显增加( p o 0 5 ) ；体内外纳洛酮组c d 4 + t 细胞数量与对照组相 1 5 比明显减少( p 0 0 5 ) ( 图2 ) 。 移 扩 勺 图2 ，流式细胞术检测c d 4 + t 数量 注：幸p 0 0 5 为体内与对照组比较有差异者# p 0 0 5 为体外与对照组比 较有差异者十p o 0 5 为与m e n k 组比较有差异者 二、e l i s a 检测c d 4 + t 细胞分泌细胞因子水平 ( 一) e l i s a 检钡, t j c d 4 + t 细胞上清液中i l 2 的分泌水平 体内外不同药物处理组作用4 8h 后c d 4 + t 细胞上清液中i l 一2 的分泌水平结果 ( 图3 ) 。各实验组与对照组相比均差异显著( p 0 0 5 ) ；体内实验中，m d 呱+ 蜊吖组与m e n k 组相比差异显著( 尸 0 0 5 ) 。纳洛酮封闭组i l - 2 水平显著下降( 尸 o 0 5 ) ， 显示m e n k 作用可以被纳洛酮阻断。 1 6 0 4 0 2 0 0 木+ 木 隅。厂霾 毒 善 广霾。厂 霉+木+ 。吻。 b l a n k 1 6 s o 5 o 5 o 5 o 3 3 2 2 l l 一一oo扣+_6do p c p o h - a d _ 皇 【置avd净di n 。- i h 图3 ，体内外不同实验组小鼠i l 2 分泌水平检测结果 注：p 0 0 5 为体内与对照组比较有差异者聋p 0 0 5 为体外与对照组比较有 差异者卯 o 0 5 为与m e n k 组比较有差异者 ( 二) e l i s a 检测c d 4 + t 细胞上清液中删吖的分泌水平 体内外不同药物处理组作用4 8 h 后c d 4 + t 细胞上清液中i f n 叫的分泌水平结果 ( 图4 ) 。各实验组与对照组相比均显著增加( p 0 0 5 ) ，体内实验中，m e n k + i l 2 组与m e n k 组相比差异显著( p o 0 5 ) 。纳洛酮组i f n 丫水平显著下降( p o 0 5 ) ，显示 m e n k 作用可以被纳洛酮阻断。 ，、 一 高 a 、_ ， 一 d d 一 3 5 0 5 0 0 0 k 之i 5 0 匠 h 0 + 毒 木 誊 i 鼻 虞 善 ：嚆 誊+ 广1 木+ i 搦 图4 ，体内外不同实验组小鼠i f n 吖分泌水平检测结果 注：p 0 0 5 为体内与对照组比较有差异者# p 0 0 5 为体外与对照组比较有 差异者+ p 0 0 5 ) 。当m e n k 联合i l 2 或i f n y 对 c d 4 + t 细胞作用与m e n k 单独作用时比队6 阿片受体m r n a 的表达明显增强 ( p ，0 0 5 ) 。且p 阿片受体量最多( 图5 ) 。 1 7 ml23 456 5 0 0 b p 蜃罱枣_ i _ 鼍钏h n 4 0 0 b 备- - ：二：_ _ i - l l i i - i l i i i l i l i _ 。r 弘r e c e p t o r 猢0 0 t m ：l 互z = = = = = = = 卜- 2 0 2 b p 6r e c e p t o r 4 3 0 0 0 0 b p b p ，c 唧t o r ；勰习量蔓曼墨= = = = = 卜9 6 b p 1 1 1 1 o o 0 0 秽 扩 一 图5 ，体内实验组小鼠脾c d 4 + t 细胞三种阿片受体和1 3 - a c t i np c r 扩增结果 注：m ：m a r k e r1 ：对照组2 ：i l 2 组3 ：i f n 吖组4 ：m e n k 组5 ：m e n k + i l 2 组6 ：m e n k + i f n l , 组搴p 0 0 5 为p 阿片受体与对照组比较有差异者 孝尸 0 0 5 为6 阿片受体与对照组比较有差异者+ p 0 0 5 ) ( 图 6 ) 。 1 8 8们基暑u警导g曲苗擎-i 脚t i n 雪0 0 0 0 b b p y m12 3456 r e c e p t o r 器0 0 0 b b p p 叶- - 6 嘲t 盯：翟 ( r 印 o r 矗 u 们 h 器 量 u 母 譬 g 弓 菪 一 - - 一5 0 0 b p 2 0 0 b p 啼 1 0 0 b p 囫ur e c e p t o t 6r c c c p t o t 2 0 2 b p + 一9 6 b p 矿 矿 杉 图6 ，体外实验组小鼠脾c d 4 + t 细胞三种阿片受体和b a c t i np c r 扩增结果 注：m ：m a r k e r1 ：对照组2 ：i l - 2 组3 ：i f n 吖组4 - m e n k 组5 ： m e n k + i l - 2 组6 ：m e n k + i f n 吖组木尸 0 0 5 为p 阿片受体与对照组比较有 差异者聋尸 o 0 5 为6 阿片受体与对照组比较有差异者 讨论 m e n 是一种内源性阿片肽，大量的研究已经表明m e n k 对机体多种细胞功 能有调节作用，近年来m e n k 已经被认为是一种新型细胞因子( 1 2 1 ，现已人工合成。 机体免疫细胞表面广泛存在着阿片受体，m e n k 通过与这些受体的相互作用而起 到免疫调节作用。m e n k 主要与表达上述受体的免疫细胞结合后，可双向调控胞 1 9 内c a l v p 、钙离子、蛋白激酶k 以及蛋白激酶a 的水平，通过影响第二信号通路而 发挥免疫调节效应1 5 1 。特别是当机体受到感染时，这种免疫调节作用更加明显。 与m e n k 结合的该种受体也被发现表达在肿瘤细胞上，表现对肿瘤的生长有抑制 作用【6 - 9 。m e n k 在一定浓度范围( 1 0 0 u g k g ) 对h i v 感染者有治疗作用，并能明 显改善a i d s 患者状况，明显增加患者外周j i i t c d 4 + t 细胞【1 3 1 5 】。 m 2 是免疫调节中起重要作用的t 细胞因子，有多种生物学功能。它能激活多 种免疫细胞，其中特别是诱导t 淋巴细胞增殖，发挥免疫效应；同时能促进m q 和 懒胞等的增殖，还具有诱生分泌多种细胞因子等免疫活性物质。通过复杂的免 疫调节使机体表现出抗肿瘤、抗感染改善免疫功能和状态等。另外，有研究发现， m e n k 能促进人t 细胞i l 2 分泌和i l 2 受体表达【1 1 j 。 硎吖是一种具有免疫调节作用的干扰素，主要由活化的1 1 1 细胞和n k 细胞产 生。其生物学