（动物营养与饲料科学专业论文）苯二氮卓类药物残留免疫分析方法的研究.pdf

摘要 摘要 本研究旨在研究快速检测苯二氮卓类( b z d ) 的间接酶联免疫( e l i s a ) 方法和竞争性 胶体金免疫层析方法。实验选择了硝西泮( n z p ) 、氯硝西泮( c z p ) 和地西泮( d z p ) 作为研 究对象，首先对三种物质分别进行衍生化，合成相应的半抗原：再将半抗原分别与牛血 清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ) 和卵清白蛋( o v a l b u m i n ，o v a ) 交联，制备成免 疫抗原和包被抗原；将得到的免疫原免疫新西兰白兔，每种免疫原免疫2 只兔子，5 次 免疫后测定每只兔子抗血清的效价，并选择效价高的血清供后面实验用。 设计了检测n z p 的间接竞争e l i s a 方法，并优化稀释缓冲液、p h 、竞争时间等实 验条件确定最终的e l i s a 检测系统。该间接竞争e l i s a 方法的i c s 0 为1 5 3 1n g m l ，l o d 为0 0 8 1n g m l ，检测范围在o 1 7 1 3 8n g m l ，n z p 尿样中的回收率在6 2 8 8 5 6 之 间，相对标准偏差低于5 6 7 ，抗n z p 的抗体对分子结构相似的氯硝西泮，地西泮和2 种代谢物7 氨基硝西泮、7 氨基氯硝西泮都具有交叉反应，但对其他类镇静类药物如盐 酸异丙嗪等则具有较好的特异性，交叉反应率均 o 1 。 本研究还设计了检测n z p 竞争性胶体金免疫层析试纸条，采用柠檬酸三钠还原法 制备了1 8 6n i l l 左右的胶体金溶液。在标记n z p 多克隆抗体时，最佳p h 值为9 ，最适 标记抗体浓度为2 0 g m e 。选用m i l l i p o r e 公司的m 1 3 5 硝酸纤维膜，上海金标有限公 司的v l 7 8 玻璃纤维膜为金标垫，s b 0 6 玻璃纤维膜为样品垫，吸水纸，p v c 底板组装 成试纸条。其中每金标垫上喷涂6 0 此金标抗体，检测线和质控线分别用o 5m g m l 的 n z p 包被抗原和0 2m g m l 的羊抗兔i g g 二抗。用试纸条检测n z p 标准溶液，检测限 为1 5 0n g m l 。 本研究所建立的检测n z p 的间接e l i s a 方法的各项参数都达到了国外试剂盒的指 标和要求，可用于实际检测；本研究的胶体金免疫层析试纸条实验为n z p 胶体金试纸 条的深入研究提供了重要的实验依据，也对食品中其它小分子兽药残留检测试纸条的研 制提供了基础。 关键词：硝西泮；氯硝西泮；地西泮；多克隆抗体；e l i s a ；胶体金试纸条 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ea i mo ft h es t u d yw a st od e v e l o p ea ni c e l i s aa n dac o l l o i d a lg o l dl a t e r a lf l o ws t r i p a s s a yf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fb e n z o d i a z e p i n e s ( b z d ) n i t r a z e p a m ( n z p ) ，c l o n a z e p a m ( c z p ) a n dd i a z e p a m ( d z p ) w e r ec h o o s e nf o r t h er e a s e r c h m e n t ，w h i c hw e r ed e d v e d ，a sh a p t e n t h e n , t h e yw e r ec o u p l e dt ob o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n do v a l b u m i n ( o v a ) t os y n t h e s i z e i m m u n o g e na n dc o a t i n ga n t i g e nr e s p e c t i v e l y a c c o r d i n gt ot h ei m m u n ep r o t o c o l ，s i xn e w z e a l a n dw h i t er a b b i t sw e r ei m m u n i z e df o rf i v et i m e sb yt h r e ei m m u n o g e n sd u r i n gf o u r m o n t h s ，a n dt h ea n t i s e r u mw i t hh i g ht i t r e sw e r ec h o o s e nf o rt h ee x p e r i m e n t ap o l y c l o n a la n t i b o d y b a s e de n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) f o rt h e d e t e r m i n a t i o no fn z pw a sd e v e l o p e d i n f l u e n c eo fs e v e r a lp h y s i c o c h e m i c a ip a r a m e t e r ss u c h a si o n i cs t r e n g t h ，p ha n dc o m p e t e t et i m e ，w e r es e l e c t e dt op r o v i d eah i g h e s ts e n s i t i v i t yo nt h e e l i s af o r m a t 1 1 1 ei c s oa n dl o dw e r e1 5 31n g m la n d0 0 81n g m lr e s p e c t i v e l y t h e l i n e a rr a n g ew a sb e t w e e n0 17a n d13 8n g m l t h er e c o v e r i e so fn z pi nu r i n ew e r er a n g e d f r o m6 2 8 t o8 5 6 t h et o e 伍c i e n t so fv a r i a t i o n ( c v ) o ft h es t a n d a r d sa n dt h es a m p l e s w e r es5 6 7 t h es p e c i f i c i t yw a se v a l u a t e db ys e v e r a ls t r u c t u r a l l yr e l a t e ds u b s t a n c e s ，a n d s i g n i f i c a n tc r o s s r e a c t i v i t i e sw e r ef o u n d e do fc l o n a z e p a m ，d i a z e p a m , 7 一a m i n o n i t r a z e p a ma n d 7 一a m i n o c l o n a z e p a m b u tf o ro t h e rt y p e so fs e d a t i v e ss u c ha sp r o m e t h a z i n eh y d r o c h l o r i d e ，i t s h o w e dg o o ds p e c i f i c i t y , t h ec r o s s r e a c t i o nr a t eo f o 1 t h ec o l l o i d a lg o l dl a t e r a lf l o ws t r i pa s s a yw a sa l s od e s i g n e df o rt h ed e t e c t i o no fn z p 1 1 1 ec o l l o i d a lg o l dp a r t i c l eo fa b o u t18 6n 1w a so b t a i n e db yr e d u c i n gt h eg o l dc h l o r i d ew i t h s o d i u mc i t r a t e t h eo p t i m u mp hw a s9a n dt h eo p t i m u ml a b e l i n gr a t eo fp o l y c l o n a la n t i b o d y w a s2 0r t g n 1 l n i t r o c e l l u l o s em e m b r a n em 13 5o fm i l l i p o r e ，g l a s sf i b e rv l 7 8 ，g l a s sf i b e r s b 0 6 ，a b s o r bp a da n dp v cb o a r do fs h a n g h a ib i o g o l dc o m p a n yw e r ec h o s e nt oa s s e m b l e i m m u n o c h r o m a t o g r a p h i cl a t e r a lf l o ws t r i p 砀ec o l l o i d a lg o l d - l a b e l e da n t i - n z pa n t i b o d yw a s d i s p e n s e do nt h eg l a s sf i b e rv l 7 8 、i t l l6 0l x l u n i t t h et e s tl i n ea n dc o n t r o ll i n ew e r e s e p a r a t e l yd i s p e n s e dw i l 0 5m g m ln z p - o v aa n d0 2m g m lg o a t r a b b i ti g gt h e d e t e c t i o nl i m i to ft h es t r i pw a s15 0n g m lf o rd e t e c t i n gt h en z ps t a n d a r ds o l u t i o n a 1 1o ft h ep a r a m e t e r so ft h ei c e l i s ad e v e l o p e dh a dr e a c h e dt h el e v e lo ff o r e i g n s t a n d a r d s ，a n di tc o u l db ea p p l i e di n t op r a c t i c e ；7 n l em e t h o da n dd a t ap r o v i d e db yt h e c o l l o i d a lg o l dl a t e r a lf l o ws t r i pa s s a yc o u l do f f e ral c a dt of u r t h e rr e s e a r c hi n t ot h e a p p l i c a b i l i t yo fg o l dl a b e l e dl a t e r a lf l o ws t r i pa s s a y sf o rn z pa n dl a yaf o u n d a t i o nf o r d e v e l o p i n gt e s ts t r i pf o rd e t e c t i n gr e s i d u e so fo t h e rl o wm o l e c u l ev e t e r i n a r yd r u g si nf o o d k e y w o r d s ：n i t r a z e p a m ；c l o n z e p a m ；d i a z e p a m ；p o l y c l o n a la n t i b o d y ；e l i s a ；c o l l o i d a lt e s t s t r i p 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是芬人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 期： 2 鲤巨! ! ! 笪 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 j 签 名：凄辜d 也- 一导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 随着全球经济一体化进程的发展和公众生活水平的提高以及食品科技的发展，食品 种类和销售范围逐渐扩大，食品安全事件时有发生，新的有毒有害物质不断被发现，食品 安全日益成为公众和政府关注的焦点，成为一个全球性的重大战略性问题。 所谓食品安全是指，食品按其原定用途进行制作或食用时，不会使消费者受害的一 种担保。也就是说，食品中不应含有可能损害或威胁人体健康的有毒、有害物质或因素， 不会导致消费者急、慢性中毒或感染疾病，不会产生危害消费者及其后代健康的隐患。 它关系到人们的健康和生命的安全，关系到民族素质，关系到本国农产品、食品在国际 市场上的竞争力以及国际形象，关系到食品行业能否健康稳定的发展，因此食品安全受 到各国政府的高度重视【l 】。 尽管我国政府一贯重视食品安全问题，也做出了许多努力，食品安全、食品卫生已 经被写入了中央文件“十一五”发展规划和纲要中【2 】，国务院多次协调关于如何进一步加 强食品安全的监督管理问题，各职能部门也加大了检查监督力度，舆论对食品安全问题 的报道明显加强了。 动物性食品( a n i i l l a l d e r i v e df o o d s ) 又称动物源性食品( f o o d s o f a n i m a lo r i g i n ) 是指由动 物生产的肉、蛋、奶等可食性组织及其加工的产品，由于动物性食品安全不仅和人们的 生活、身体健康有着非常密切的关系，而且可能关系到人类的未来( 如转基因动物食品的 安全问题) ，所以越来越引起人们的关注。动物性食品的安全问题牵涉面很广，安全的动 物性食品必须具备哪些条件( 或标准) ，在目前条件下，有学者把动物性食品安全限定在 “无疫病、无残留、无污染、无后遗作用”四个方面还是比较恰当的【3 1 。 随着畜牧业的发展，饲养和防治疾病的水平也在迅速提高，人们开始广泛应用药物 防治疾病或作饲料添加剂以促进动物生长。在人们获得可观的经济效益后发现药物已在 动物体内残留。兽药残留是指“兽药在动物性食品中的残留”的简称，它是指动物在使用 药物治疗后，药物的原形或其代谢产物可能蓄积、储存在动物的细胞、组织或器官中【4 】。 常见的残留药物大致分为抗生素类、驱肠虫药类、生长促进剂类、抗原虫药类、灭锥虫 药类、镇静剂类和肝肾上腺素能受体阻断剂及其它化学物质等【5 】。当人们食用了残留超 标的动物食品后，会在人体内蓄积，可能产生过敏、畸形、癌症等不良后果，直接危害 人体的健康和生命【6 ，7 1 。同时，由于抗生素的滥用，动物体内的常见细菌产生了强大的抗 药性，致使细菌性传染病严重，动物食品在加工之前就成为带病体的可能性增大，这样 的食品被食用之后也会导致人体内抗药性的增强。1 9 9 2 年，在美国有近一万名患者死于 抗生素耐药性细菌感染。 对人体影响较大的兽药及药物添加剂主要有抗生素类( 青霉素类、四环素类、大环 内脂类、氯霉素类等) ，合成抗菌素类( 呋喃唑铜、恩诺沙星等) ，激素类( 己烯雌酚、雌 二醇、丙酸睾丸酮等) ，肾上腺皮质激素，p 兴奋剂类( 克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴 胺等) ，安定类，杀虫剂类等瞵j 。 由于动物产品的安全是与人类本身健康密切相关，严重的直接危及人的生命安危， 江南大学硕士学位论文 所以动物产品的安全质量历来都列入了政府强制管理的范畴，以国家法律的形式去规 范、去约束。西方发达国家对于动物食品安全性非常重视，2 0 世纪8 0 年代起即开始讨论 食品中的兽药残留并且开始对生产食品的动物限制使用兽药的品种，如欧盟在1 9 9 8 年底 决定禁止使用喹乙醇和卡巴氧；1 9 9 7 年开始讨论动物长期使用抗菌药，特别是饲料添加 剂，会导致细菌赖药性滋生的问题；2 0 0 0 年建议对转基因食品进行安全性评价并对评价 的方法开展研究。由于国外的畜牧业和兽医兽药行业发展都比我们早，因而其所暴露出 的问题也就比较早，所以他们在动物食品的生产管理和安全控制上要比我国完善得多。 改革开放以来，我国在动物性食品安全性的管理上制定了一系列的法规和政策，主 要有：食品卫生法、动植物检疫法、动物卫生法、环境保护法、药品管理法、兽药管理 条例、农药管理条例等。但由于我国畜牧业发展起步较欧美发达国家要晚得多，同时， 由于我国对动物性食品的安全管理由多个部门同时进行，却没有一个相应协调机构，分 工不明确，地方性的差异也比较明显，因此，我国在如何确保动物性食品安全性方面的 法规和管理制度的制定上显得很不健全，在实施上的力度也不够。 对兽药残留实施监控是一个复杂的系统工程，包括法律法规、技术标准、管理体系 结合以及药物的研制、生产、使用及食品和环境监测等诸多环节。从理论和技术角度，建 立适宜的残留分析方法和制定兽药残留标准是最基本的方面。从实践工作角度，完善管 理体制，加强兽药的生产使用管理，加强动物性食品的安全监督是最迫切的。 1 1 苯二氮卓类概论 1 1 1 苯二氮卓类的理化性质 苯二氮卓类( b e n z o d i a z e p i n e s ，b z d ) 多为1 ，4 一苯并二氮卓的衍生物。b z d 类的二氮 卓是一个含有7 原子杂环和二个苯环组成的b z d 类的基本结构，例如安定与氯氮卓的结 构相似，只是1 ，2 位之间的双键变成单键，第二位上的甲胺基为酮基取代，c 1 多了甲 基，n 4 去掉氧。临床常用的有2 0 余种。它们结构相似，但不同衍生物之间，抗焦虑、 镇静催眠、抗惊厥、肌肉松弛和安定作用则各有侧重。本课题主要研究硝西泮( n z p ) ， 氯硝西泮( c z p ) ，地西泮( d z p ) 这三种物质。 r 3 r 5 图1 - 1 苯二氮卓类的结构 fig 1 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo f b e n z o d i a z e p i n e s 2 第一章绪论 1 1 2b z d 的药理性质 苯二氮卓类药物是一类作用突出的化合物，具有抗惊厥、松弛肌肉、安眠和抗焦虑 等临床功用，且毒性较小。所有苯二氮卓类均在肝脏被降解，经去乙基、水解或其他代 谢途径、产生具有生物活性的代谢物，这些代谢物消除缓慢，具生物活性，有一定作用。 某些代谢产物是由多种苯二氮卓产生的。如服用利眠宁、安定或氯硝安定后，血中产生 代谢物去甲安定和去氧安定。苯二氮卓类在血清中与血清白蛋白紧密结合，在尿中主要 以羟化代谢物与葡萄糖醛酸复合物、以及肝脏中生成的相应化合物的形式被清除。在尿 中只发现少量的未变化药物。 1 2b z d 的残留与危害 国外在7 0 年代对b z d 食欲促进剂作了大量深入的研究，试验了近1 5 0 0 种化合物对动 物摄食的影响，发现多种b z d 化合物可促进动物摄食，其中乙磺氟安定的效果最为显著： 肌注、灌服及日粮添加均可有效增加健康动物特别是反刍动物的每餐摄食量及摄食频 率，提高日摄食量 9 1 。近几年来，有些饲料企业为了追求饲料的转化率和高额利润，在 饲料中随意添加镇静、催眠类违禁药物。如在上海饲料办的专项检查中，经抽样检测， “睡大壮”饲料产品中含有大量的安定。安定经肝脏代谢为奥沙西泮，仍有生物活性，故 连续应用可蓄积。虽未见有食入含安定饲料饲养的动物食品中毒报道，但医学界已证实 畜禽产品中的激素及其它合成药物的滥用与残留往往与人类常见的疾病问题和某些食 物中毒有关。 1 - 3b z d 残留的仪器检测技术 目前对苯二氮卓类的仪器检测研究主要使用薄层色谱扫描、气相和液相色谱分析， 这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，对检材的要求也比较高，需要进一步的提纯处理才 能进行。一般的样品前处理包括提取，净化，衍生化。 1 3 1 样本前处理 ( 1 ) 提取：目的是将样品中的痕量兽药从杂质( 干扰物) 中分离出来。不同分析对象， 有不尽相同的提取过程，如漂洗法、振荡法、组织捣碎法、冷浸法、索氏提取 法、超声法、固相萃取法( s p e ) 和超临界萃取法( s f e ) 等。目前应用较多的有振 荡法、组织捣碎法和超声法，而固相萃取法和超临界萃取法日趋广泛，它们具 有快速、简便、所需样品量少等特点。 ( 2 ) 净化：目的是样品提取富集后除去干扰物质。化方法通常有：液一液萃取法 ( l l e ) 、固相萃取法( s v z ) 、固相微萃取法( s p m e ) 、液相微萃取法( l p m e ) 、薄层 层析法、化学方法( 如磺化法) 、冷冻法等。目前，在生物样品的前处理过程中 传统的l l e 仍普遍采用。l l e 方法需根据药物的性质，在酸或碱性条件下分别 提取净化。萃取溶剂有氯仿、乙醚、乙酸丁酯等或者不同溶剂的混合物。c a r l s e n s ，h a y e sm 等 1 0 1 用含有l 3 甲基1 一丁醇的正庚烷从人体血浆中提取一种新的 安定药，最后用乙醇溶解定容，进行g c m s 分析。此方法的回收率在1 0 0 左 3 江南大学硕士学位论文 右，l o d 达到0 1n g m l 。而且样品基体不同，如其中的脂肪、蛋白质、糖份 和水分的含量不同，对药物的结合程度以及存在的干扰物质也有所不同。s p e 操作简便，可以净化很小体积的样品，溶剂用量少，选择性高，速度快，可实 现自动化，不会发生乳化，净化中引入的杂质少。db o r r e y 掣1 1 】报道了用b o n d e l u t ep h e n y l 柱提取尿中的15 种苯二氮卓类药物，最后用甲醇洗脱并衍生化进 行g c m s 测定，其中各类药物提取率达8 0 以上。h e g eg r e f s l i eu g l a n d 等叫 采用自制的l p m e 装置进行人体血液和尿样中安定及其主要代谢产物n - 去甲 基安定的处理。为了减少蛋白质对药物束缚可加入甲醇；可加入氯化钠和正己 烷脱脂；如尿样中的安定较少，而代谢物多以其结合物一葡萄糖醛酸酐的形式 存在，可通过使用葡萄糖醛酸酐酶使结合物水解，提高地西泮代谢物的检出率。 ( 3 ) 衍生化：最主要目的是为了提高兽药残留检测的灵敏度和选择性。常用的衍生 化方法有硅烷基化、甲基化和乙酰化法1 1 3 1 。对于苯二氮卓类镇静剂来说硅烷基 化衍生物不稳定，极易水解，不适用于常规分析。另外当这些衍生物进g c 柱 时，过量的硅烷基化试剂会污染柱子；烷基化有甲基化和丙基化。这些衍生物 在几天之内都很稳定，检测峰形也很好。但是衍生物需另加一个额外的萃取步 骤来降低l o d ；乙酰化方法通常在吡啶中用乙酸酐作为衍生化试剂，在室温条 件下进行。乙酰化方法解决了硅烷化和烷基化方法所遇到的问题。而且反应试 剂易于氮吹干，减少了额外的萃取步骤，也改善了峰形f l 。 1 3 2 气相色谱法( g c ) 气相色谱法有许多高灵敏、通用性或专一性强的检测器供选用，如氢焰离子化检测 器f i r e ) 、氮磷检测器( n p d ) 等，检测限一般为p e i t g 级。该方法可应用于部分苯二氮卓类 药物的检测【1 4 。1 9 】，但是大多数兽药极性或沸点偏高，需繁琐的衍生化步骤，限制了g c 的 应用。所以，2 0 世纪8 0 年代后h p l c 的发展速度超过g c ，相当数量的兽药采用或改用 h p l c 进行分析，如氯霉素、磺胺类药物等。 1 3 3 高效液相色谱法( h p l c ) 几乎所有的化合物包括高极性离子型待测物和大分子物质均可用h p l c 进行测定。 h p l c 的分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加精细仲5 - - 一1 0o m ) ，需高压泵推动，柱 效高( 1 0 5 塔板m ) ，速度快，灵敏度与g c 相近。与g c 相比，h p l c 流动相参与分离机制， 其组成、比例和p h 值等灵活调节，如离子对色谱、胶束色谱、手性分离色谱等，使许多 极难分离的待测物得以分析。目前大多数兽药残留分析都采用反相h p l c 法。该法常用 于苯二氮卓类物质的检测【2 0 1 。随着仪器的发展，液相色谱仪与质谱仪一起联用建立了更 灵敏、准确的方法l c m s m s t 2 m 6 1 。 1 3 4 高效薄层色谱( h p t l c ) h p t l c 的出现使t l c 进入了复兴时期，现己成为仅次于h p l c 和g c 的残留分析方 法。h p t l c 的斑点原位扫描定量、定性和高效分离材料( 3 - - - 1 0l x m ) 。改变了常规t l c 4 第一章绪论 在灵敏度和重现性方面的不足，但保持t t l c 的简便、快速和样品容量大的优点，可使 用正相或反相板，分辨率几乎与h p l c 相当。h p t l c 在安定残留的快速筛选性检测方面 应用广泛【2 7 ，2 踟。 1 4b z d 残留的免疫检测技 免疫检测技术被列为2 0 世纪9 0 年代优先研究、开发和利用的药物残留分析技术，联 合国粮农组织畔o ) 已向许多国家推荐此项技术，美国化学会将免疫分析和气相色谱、 液相色谱共同列为药物残留分析的支柱技术例。 1 4 1 免疫检测的原理 免疫检测法( i m m u n o a s s a y , i a ) 是借助抗原( a n t i g e n , a g ) 和抗体( a n t i b o d y , a b ) 在体外 特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。抗 原和抗体的结合就像酶与底物的结合，激素与其受体的结合一样，不是化学反应，而是 非共价键的可逆的结合。定性和定位检测比较简单，即用已知的抗体和待检样品混合， 经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生，就说明待检样品中有相应的抗原存在。 若无预期的现象发生，则说明样品中无相应的抗原存在。同理也可用已知的抗原检测样 品中是否含有相应的抗体。 对抗原或抗体进行定量检测时，以反应中加入的抗原和抗体的浓度与形成免疫复合 物的浓度间的函数关系为基础，根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原( 或抗体) 的含量：在一定的反应条件下，加入的已知抗体( 或抗原) 的浓度一定，反应产生的免疫 复合物多少与待检样品中含有相应抗原( 或抗体) 量成正比。也就是抗体浓度一定时，免 疫复合物越多则样品中的抗原量也越多。可用实验性标准曲线推算出样品中抗原( 或抗 体) 的含量。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等都属于这类方法。 1 4 2 酶联免疫吸附测定( e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) e l i s a 是将抗原和抗体亲合反应的特异性、高专一性与酶对底物的高效催化作用结 合起来的固相免疫测定技术。其测定步骤如下：先将抗体或抗原包被到某种固相载体表 面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体 表面吸附的抗体或抗原发生反应，然后加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法 分离抗原与抗体的复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催 化产生的颜色及其光密度( 0 d ) 值的大小进行定性或定量分析。 免疫反应具有极高的选择性和灵敏l 生( k d = 1 0 。6 1 0 。1 2 ) ，因此，e i a 可使兽药残留分 析的过程，特别是前处理步骤大大简化。与常规仪器检测方法相比，e l i s a 法除具有特 异性强，操作简便、仪器化程度和分析成本低，样品前处理简单，检测时间短，样品容 量大等优点外，亦不存在h p l c 或g c 对代测物蒸气压、热稳定性、卤素、发色团等理 化性质的限制，特别适用于难气化或难分离的高极性、离子型兽药的分析，尤其适用于 现场监控和大规模样本的快速筛选，是目前最理想的残留筛选性分析方法之一。目前几 乎所有重要的兽药残留已建立或试图建立免疫测定法( 多数是e l i s a ) ，如青霉素、链霉 5 江雨大字坝士学位论文 素、四环素、氯霉素、磺胺二甲嘧啶、莫能菌素等【2 9 1 。 将e l i s a 检测所用的试剂组装成试剂盒的形式出售，能够适应市场监督需要快速、 简便、价廉的要求，有利于在基层推广使用，如屠宰厂。屠宰厂通过自身的检验，从源 头控制肉制品的安全。 1 4 3 胶体金免疫分析检测技术 胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种 新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年己在各种生物学研究中广泛使用。在临床 使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生 物芯片中都可能例用到。 1 9 7 1 年f a u l k 和t a y t o r 将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新 的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主 要是免疫层析法( i m m u n o c h r o m a t o g r a - p h y ) 和快速免疫金渗滤法( d o t i m m u o g o l d f i l t r a t i o na s s a yd i g f a ) ，用于检测h b s a g 、h c g 和抗双链dna 抗体等，具有简单、 快速、准确和无污染等优点。 1 4 3 1 免疫胶体金技术的基本原理 胶体金是由氯金酸( h a u c l 4 ) 在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下， 可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电 的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境 下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结 合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如s p a 、p h a 、 c o n a 等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应， 加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学 和细胞生物学等领域。 胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附 机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结 合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。 这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌a 蛋白、免疫球蛋白、 毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基 础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 免疫金标记技术( i m m u n o g o l dl a b e l l i n gt e c h i q u e ) 主要利用了金颗粒具有高电子密 度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配 体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测 方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。 第一章绪论 1 4 3 2 常周的免疫胶体金检测技术 ( 1 ) 免疫胶体金光镜染色法：细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进 行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原 子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。 ( 2 ) 免疫胶体金电镜染色法：可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组 织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。 ( 3 ) 斑点免疫金渗滤法：应用微孔滤膜( 如膜) 作载体，先将抗原或抗体点于膜上， 封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。 ( 4 ) 胶体金免疫层析法：将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记 试剂( 抗体或单克隆抗体) 吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本 垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应， 再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生 特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现 已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。 1 - 5 本课题研究内容，目标 从以上的叙述可以了解到兽药残留是危害人体健康的重要因素之一，而目前快速免 疫检测技术亦是各个国家兽药残留分析的研究方向。由于我国免疫检测技术起步较晚， 大部分免疫检测产品都依赖于进口，而国外进口产品又非常昂贵，影响了免疫检测方法 在我国的推广使用。开发检测苯二氮卓类的试剂盒和金标试纸条，能加快了检测速度， 更适合大批量动物性产品的筛选，并且降低检测费用，从而利于从源头控制苯二氮卓类 的非法使用。 1 5 1 研究内容 ( 1 ) 免疫原的合成与鉴定：将衍生化的苯二氮卓类物质与b s a 和o v a 交联，并对 交联产物进行紫外扫描，通过分光光度法估算交联率； ( 2 ) 抗体的制各：用免疫原b z d b s a 免疫新西兰白兔，定期在免疫后采血以监测效 价，待效价达到所需水平时即可采集血液制备抗多克隆抗体； ( 3 ) 间接竞争e l i s a 方法的建立及优化：采用间接e l i s a 方法、方阵滴定法确定包 被抗原和抗体最适工作浓度，选择高效价的抗体建立间接竞争e l i s a 方法。通 过对包被条件、封闭条件、酶标二抗浓度、二抗反应时间及显色时间等参数的 优化调试，建立检测n z p 的间接e l i s a 方法i ( 4 ) 检测n z p 的间接竞争e l i s a 方法的评估：包括i c 5 0 、线性范围、最低检测限、 添加回收率等参数，并将间接竞争e l i s a 检测结果用仪器分析方法进行确证。 ( 5 ) 胶体金免疫分析方法的初步建立：包括胶体金的制备、胶体金的标记、试纸条 材料的选择、溶液系统的选择等。 7 江南大学硕士学位论文 1 5 2 研究目标 ( 1 ) 分别合成交联比合适的包被抗原和免疫原，包被原能够使抗原充分吸附到固相 载体上，免疫原能够刺激动物机体产生高效价、特异性好、亲和力强的多克隆 抗体； ( 2 ) 通过优化包被条件、封闭条件、酶标二抗浓度、二抗反应时间及显色时间等实 验条件，建立间接竞争e l i s a 方法； ( 3 ) 初步建立胶体金免疫分析方法。 8 第二章苯二氮卓类免疫原的合成与鉴定 第二章苯二氮卓类免疫原的合成与鉴定 根据免疫学领域的著名学者k a r kl a n d s t e i n e r 的理论，相对分子质量小于1 0 0 0 的分 子只具有免疫反应性，而不具有免疫原性，不能直接刺激机体产生特异性抗体。因此， 小分子物质必须与大分子载体如牛血清蛋白，人血清蛋白，和钥孔血蓝蛋白等进行结合， 增加其相对分子质量及抗原分子表面的抗原决定簇结构的复杂性后才具有反应原性。苯 二氮卓类物质的相对分子质量都远小于1 0 0 0 ，所以需要合成相应的免疫原，才能获得针 对苯二氮卓类物质的特异性抗体。 本实验中，选择硝西泮，氯硝西泮，地西泮作这3 种苯二氮卓类物质作为研究对象。 由于这3 种物质的结构中都不含有可与蛋白直接交联的基团，所以首先分别对这3 种物 质进行衍生化，得到相应的半抗原，然后将半抗原与不同的蛋白交联，分别合成免疫原 和包被原。半抗原结构采用薄层层析法( x l c ) 、液相质谱( l c m s ) 联用方法进行鉴定； 半抗原与蛋白交联结果通过紫外扫描的方式初步鉴定，采用紫外分光光度法估算两种偶 联复合物的交联比。 2 1 实验材料 2 1 1 试剂 硝西泮( n i t r a z e p a m u m ，n z p ) ，纯度9 9 5 江苏恩华药业有限公司 氯硝西泮( c l o n a z e p a n ，c z p ) ，纯度9 9 5 江苏恩华药业有限公司 地西泮( d i a z e p a m ，d z p ) ，纯度9 9 8 湖北制药有限公司 牛血清蛋i 刍( b s a )上海伯奥生物科技有限公司 卵清白蛋白( o v a ) ，批号0 3 0 6 0 2 ，电泳纯上海伯奥生物科技有限公司 还原铁粉( a r )国药集团化学试剂有限公司 甲醇( a r )国药集团化学试剂有限公司 氯化铵( a r )无锡民丰化工厂 薄层层析硅胶( g f 2 5 4 ，化学纯)青岛海洋化工有限公司 乙酸乙酯( a r l国药集团化学试剂有限公司 正己烷( a r ) 国药集团化学试剂有限公司 丁二酸酐( a r )国药集团化学试剂有限公司 乙酸( a r )国药集团化学试剂有限公司 乙酸酐( a r ) 国药集团化学试剂有限公司 甲苯( a r )国药集团化学试剂有限公司 乙醚( a r )国药集团化学试剂有限公司 过硼酸钠( a r )国药集团化学试剂有限公司 三乙胺( a r )国药集团化学试剂有限公司 二氧六环( a r )国药集团化学试剂有限公司 氯甲酸异丁酯( a r )上海飞祥化工厂 9 江南大学硕士学位论文 n ，n 一二甲基甲酰胺( a r ) 硼酸( a r l 硼砂( a r ) 盐酸( a r ) 亚硝酸钠( a r l 氢氧化钠( a r ) 碳酸氢钠( a r ) 磷酸氢二钠( a r ) 磷酸二氢钠( a r l 2 1 2 主要仪器设备 l c q d e c a 型高效液相色谱一质谱联用仪 w f zu v 2 8 0 2 p c s 紫外可见分光光度计 w h 2 微型旋涡混合仪 磁力搅拌器 台式离心机 c o s t a r 9 6 孔8 1 2 可拆酶标板 m u l t i s k am k s 酶标仪 p h s 一3 t c 精密酸度计 a b1 0 4 一n 型电子分析天平 1 0 1 一a 型电热恒温鼓风干燥箱 u 3 0 0 0 紫外扫描仪 z f 9 0 型暗箱式紫外透射仪 2 1 3 溶液系统 ( 1 ) 硼酸盐缓冲液( p h9 0 ，0 2m o l l ) 中国医药集团上海化学试剂厂 中国云岭化工厂 中国云岭化工厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 中国医药集团上海化学试剂厂 中国上海虹光化工厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 美国f i n n i g a n 公司 上海仪器有限公司 上海泸西分析仪器厂有限公司 德国i k a 公司 上海安亭科学仪器厂 上海吉泰生物科技有限公司生产 t h e r m ol a b s y s t e m s 公司生产 上海天达仪器有限公司 上海m e t l l e rt o l e d o 集团 通州市扈同制药机械设备厂 日本津岛 上海顾村电光仪器厂 0 0 5m o l l 硼酸钠：四硼酸钠1 9 0 7g 加水至1 0 0m l 。 o 2m o l l 硼酸：硼酸1 2 3 7g 加水至1 0 0m l 。 将4 8m l 的硼酸钠溶液与1 2m l 的硼酸溶液混合即为p h9 o 的硼酸盐缓冲液。 ( 2 ) p b s ( 0 0 1m o l l ，p h7 4 的磷酸盐缓冲液) 8 0gn a c i + 2gk c i + 2gk h 2 p 0 4 + 3 6 2gn a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，高纯水定容至1 0 0 0m l ， 使用时稀释1 0 倍。 1 0 第二章苯二氮卓类免疫原的合成与鉴定 2 2 实验方法 2 2 1 免疫原的合成 2 2 1 1n z p 免疫原的合成 0 2 n f e 1 面r h 2 图2 一ln z p 免疫原合成路线图 f i g 2 - 1c h e m i c a l r o u t et os y n t h e s i z ei m m u n o g e nf o r n z p ( 1 ) n z p 的衍生化 采用铁粉还原法【3 0 】，称取o 1 6 8g 还原铁粉于5 0m l 圆底烧瓶中，加入2m l 水、 0 0 5 3g 氯化铵，水浴中加热1 5m i n 。另称取0 2 8 1gn z p ，用一定量的甲醇溶解后，分 3 次加入上述的反应液中，回流反应4 - 6h 。趁热过滤铁粉，将滤液进行减压蒸馏，得到 的残留物用少量热甲醇溶液溶解，低温析出沉淀，过滤、干燥得到半抗原7 氨基硝西泮 ( n z p - 7 一a ) a ( 2 ) n z p 与b s a 的偶联 根据b e r n a r df e r l a n g e r l 3 1 1 提供的原理，采用重氮化交联方法，称取0 0