（动物遗传育种与繁殖专业论文）猪DGAT1基因和Ob基因多态性及其与背膘厚的关系.pdf

a m i b f t d g a t l d n t p s e o t a e b l p l g l e d i n o b p a g e 0 t l s d s s n p s s c s s c p 1 f e m e d t e t g t r i s u 丁r x a l 符号或缩略谢醴嘲 a m d i c ；j l i n b a c k h i h i c k n e s s d i a c y y c e r o la c y l t m n s f c i 粥el d e o x y r i b o n u c i e o s i d et “p h o s p h a i e s e t h y l e n e d i a m i n et e t 瞳a c e t i ca c d e t h i d i u mb f o m i d e i s o p r o p y i o - p - d g a l a c i o s i d e o b e s e p o l y a c j y i a m i d eg e le i e c t r o p h o r e s i s a “a n t i t a i v et r a tl o c i s o d j u md o d e c y ls u l f a t e s i n g i en u c i e o l i d ep o i y m o r p h i s m s u ss c m 如c h f n o s o i n e s i n g i e s l r a n d e dc o n f o m l a t j o np o l y m o r p l l i s m n ，n ，n n t e l r a m e t h y ie t h y l e n e d l a m i n e l r i s * h c l e d l a8 u 虢r t r i g l y c e r j d c t 1 1 y d f o x y lm e c h y la m i n om e l h a n e u n l m n 5 j a 玎n gr e g ；o n 5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o 】y 1 一d - g a f a c l o s j d o 氨苄肯霉豢 背牒厚 二酰甘油酰基转移酶 二磷酸脱氧核= 廿= 乙二胺四乙酸 澳化乙锭 丙基硫化，b d 半乳糖苷酶 瘦素 肥胖瑟闶 多聚丙烯酰胺凝胶电淋 数釜瞧状照位 十二烷基硫酸钠 单核苛酸多态性 猪染色体 单链构象多态性分析 n ，n ，n n 四甲基乙二胺 t 缓冲渡 甘油二酯 三羟基氨基甲烷 翻泽腥 5 溴一4 氯，3 吲哚* 0 一d 一二r 乳 糖萤 关予学位论文原创性帮使麓授权的声暌 本人所里交翡学位论文，是在导l 零指导下，独立避行 科学研究所取褥的成聚。对在论文研究裳间给予指导、帮 助和擞出重要贡献鲢个人或集俸，均在文中鞠确说甓。本 声明的法律责任出本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关缳留和使用学位论文 的规定，同意学校保留和按要求离国家有关部门或机构送 交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 投由东农业大学可以将本学位论文的全都或部分逡窑缡入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手 段傈存论文霸汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此斌定。 论文捧者签名： 导师签名： 宙暇 莠善 强 期：。( 矗盘 山东农业人学 0 i | l ：学位论文 中文摘要 d 6 玎基因鞠的熬嘲是与动物豫肪沉积有关鲍两个鬟要蔟鳓。本试 验对猪d ( 甜穷翻拍慕强邋行s n p 扫描和多态性分辛厅，以期在这两个基 邀i 上找到2 j 猪背艨烀钶关舟勺分) = ：杯配，为优质、高产瘦肉型猪选育掇供一 条分子育种途径。 猪d 洲7 1 ，研究方词，本研究刘+ 莱兕猪d g 爿7 1 ，外娃子6 至外盟予8 共 4 7 6 b p 的j - 一列进行了兜隆、测序( g e n b a n k 收录号：d q 2 8 9 5 9 6 ) ，在外盟 子6 平u 8 上检测到蕊处s n p s ，d c 卅n 内禽子6 和内含子7 上有保守的g t ：a g 拼接识别序列；在莱菀猪和西方猪种外显了6 至8 未发现类似牛k 2 3 2 a 的镄 义突变：针列大白猪和蘩芜猿外豆子8 上的s n p 进行p e r s s e p 检测，发现 菜芜猪群馋处于h 搬d y w o n b e r g 乒锯状态( p 0 0 5 ) ，大自猪群体均为e c 缝合体；克隆了猪o ( 秘翱5 调控区的帮分垮歹l ( 7 3 7b p ) ，程2 4 l b p ( 辛g 褥 子起始密码子a t g ) 发现一处蠡攀个稼瞟呤( a ) 簸失产生静舞s n p 位点( 定 义为等位螫囚d e i ( a ) ) ( g 口n b a n k 收录弓：d q 4 6 3 3 2 l 一2 2 ) ：对大自猪、大菜 二元杂交母猪、社洛克猪幂【】菜蕊猪进行了p c r s s c p 检测，结粱发现蘩芜 猪群体d c l ( a ) 等位基因频率最高，所检测的3 0 头个体均为d e l ( a ) d e l ( a ) 纯合型，所检测的四个群体均处于h a r d y ，w c i n b c r g 平衡状态( p 0 0 5 ) ； 大莱二元杂交母猪群体不同基幽型的猪背膘厚差片不显著( | p 0 0 5 ) ，在仔 猪初生重方面，d e l ( a ) d e l ( a ) 个体与+ d e i ( a ) 个体差异显著( ， o 0 5 ) ：大莱= = ：_ ：元杂交母猪群体偏离h a r d y w e i n b e r g 平衡状悉 ( j d 0 0 5 ) ，w h e r e a si ny o r k s h i r eo n l yg e n o t y p e c cw a sd e t c c t e d ad e l e t i o no fa d e l l o s i l l e ( a ) ，a t 一2 41 ( r e l a t i v et oi n i t i a t i o n c o d o na t g ) ，d c s i g n a t c da sd e i ( a ) a l i c i e ，w a sf o u n dj nl a i w uc o m p a r e dw i t h y o r k s h i r e ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b c rd q 4 6 3 3 2 l - 2 2 ) w ec h e c k e dt h i s m u t a t i o ni ny o r k s h i r e ，y o r k s h i r e l a i w u ，d u r o ca n dl a i w up 远sa n df o u n d t h a tt h eg e n o t y p ef r c q u e n c yo fd e l ( a ) d e i ( a ) i sl h eh i g h e s ti nl a i 、v l lp i g s ：a l l l a i 、v up i g st h a tw e r ec h e c k e dw c r eh o m o l o g o u sd e l ( a ) d e l ( a ) n od e v i a t i o n f r o mh a r d y - w e i n b e r gc q u i l i b r i u mw a sd e t c c t e di ny o r k s h i r e ，d u r o ca n d y o r k s h i r c x l a i w up i g s a c m s sg e n o l y p e s ，o n t e s tb a c k f a tt 1 1 i c k n e s sw a sn o t d i f k r e n t ( p o0 5 ) ；h o w c v c r ，b i r t hw e i g h td i f - f e r ss i g n i n c a n t l y ( 尸 0 ，0 5 ) t h eb a c k f a tt h i c k i l e s s 1 搬d 蝴r ，腻和曲堪l 太l 多态性艘1 j 背膘厚的关系 a n o n gd i f k f e n tg e n o t y p e sw 班en o td i f 琵r e n tf ：f 0 。0 5 ) i ns u m m a r y ，w ef o u 娃d3s n p si nd 酬玎a f 话1s n pi n 聍垂g 卵a r 斌 8 n a i y s e dt l 诧r e l a i o n s h i pb e 、w e nt h e s es n p s a n d h eb 丑c k 盎tt h i c k n e s si np i g s t h 。p r e s e ms t u d yp v i d e ss o m ed 越af o rd i s s e c t i n g 如eg e n e t i e so fb a c k 鲰t t 1 1 i c k n e s s t h es n p sl o c a t c di np r o m o t e rr e g i o nr e q u i r e s 矗l r t h e ra n a l y s i sb y d e s i g n j n gp o r c i n ep e d i g r e et oe s t i m a t ei t se f f b c t so rc u l t u r i n ga d i p o c y t ec e l l s t oc h e c kt h ec x p r e s s i o nc h a n g c so r p o r c i n ed ( 己47 ya n dd 6g e n e s k e yw o r d s ：p i g ；d 6 7 y ；d 6 黜a ；s n p ；b a c k f a tt l l i c k n e s s 4 由东农业凡学锻 弹倥论文 l 文献综述 猪是与人类关系最为密切的家畜之一，它与人们的日常生活息息相 芙。猪肉是世界上消耗量最大的肉类，猪肉产量在很大程度上关系着人们 的m 常生活。随着我国国民经济的迅速发展，人们的生活水平不断提高， 对肉类，特别是对猪肉的需求量f 1 益增拄乏，大大推动了养猪业的发展，使 我踊成为蜒界上养猪数量和猪肉j 扯量媛多的鲻蓉。 众掰周甄，猪肉的产量和品质与猿豹品霉孛鞠饲养管淫有直接关系，其 中遗传闲索起主要 乍用。因为口感鞍萤莽方瑟的关系，长期以来久稻一直 对瘦肉擞猪债有独钟，把降低体藉率、瓷赢痰囱率 乍为家猪育稳鼹主要曩 标，经过育种、营养和饲养管理专家的强同努力，匿前世界上已经育成了 多个瘦肉型品种。猪的胴体脂肪率已经从4 0 降到1 5 以0 左右。 随肴生活水平的提高，人们寸猪肉的潞质提出了更高的要求。如何在 保证瘦肉率的前提下，提高猪肉肉质成为当i j f 猪遗传育种工作的重要研究 课题。遗传学家也在笑注和努力研究相荚拱围，以期阐明各种候选基因可 能对猪脂肪代谢产生的影响。 阁内外不同猪种的背膘厚差别较大，火自猪、长自猪等瘦肉型猪种背 艨较游，属于低艟舫猪种；因 l 地方品种如絮笼猿等背艨较厚，属于离脂 黪猪稚。分布于我国境内的各个本地 嚣种凭借葵凌虞鳐荚，繁殖力强等特 点事誊氆孬，其共同鸵优点是繁臻力离、抗邀瞧强、国度好、能大量利用 青糖饲籽；毽也有些不足，如生长速痰较凝、鹰宰牵偏低、脶体骚多蠢少。 莱芜猪烧我国优秀的地方猪种，原产予l l l 东蘩莞，疑有五千多年的饲养历 史，具有繁殖力高、哺育力强、肉质好、抗逆性强、较易沉积肌内脂肪和 肉质鲜美婷优_ 。莱芜猪在1 9 8 2 年被中图猪品种志收录，是我国地 方猪种的宝贵基因库。莱芜猪的脂肪沉积能力很强，肌内脂肪含量最高可 达1 0 1 4 ，远高于西方猪种，在撼圆组水平浆芜猪与西方猪种相比也有 较大区别。莱芜猪作为高体脂猪种，其越阏频率与引进猪种的显著差异提 示，装茏猪特有的基因型可能与高体脂和高舰内脂肪宙量性状有一定程度 的橱美枝。 涵毒 = 鸳艨瘁有较高的遗传力( 0 1 4 o 6 ) ，与瘦翔率有较高的遗传相关 穰口删f ? 摹埘和曲臻心多各挂款j 5 j f 鞣厚豹关系 ( 。o ，5 一o 7 ) ，统计资料显示，猪的体脂与背膘厚具有高度遗传相关，在同等 饲养管理条件下背躲较厚的个体体脂较多，所以选择活体背膘厚作为提商 瘦彗l 率静选嚣矬状可以使瘦凌率褥到翌著的遗传改滋。 对背膘厚性状递行标电选择对于提高猪嗣镪= 品瑷和猪肉经济价悠其 有霍要意义。 l 。l 澎响脂肪沉积的基因 1 1 1 脂肪酸结合蛋自基因 脂肪酸结合摄自( f a t t y a c j d 。b 油d i n g p r o l e j n ，i 讽b p ) 是小的缬腿内蛋自 蕨，它参与细飚肉黯肪酸的运输，霹将耱肪酸拭缀熬貘上运送到鼹肪酸氯 纯和甘油三醋及磷糟合成的位置。目前发现f a b p 家族的8 个成员都参与 脂肪酸从细胞膜到细胞内的利用过程。在哺乳动物中有2 种脂肪酸结合蛋 囱豁因，被作为研究肌闻脂肪含量的重要候选基因，一种是心脏脂肪酸结 合蛋盎基因( j o a nf a t t y a c i d ，b i 搬d i n gp 鳅e i n ，h f a 转p ) ，勇一秘蹩鼹舫缨 藏型脂肪酸结台蛋臼基因( a d l i p o c y t ef a t t ya c i d b i n d i n gp f o t e i n ， a ，f a b p ) 。h 。f a b p 基凶主要在心且n ! 、骨骼肌细胞和乳腺中表达，对肌问 脂肪含量影响显蔷。a f a b p 基因仅在脂肪细胞中袭达。另外在鸡胚巾分 离如缀照外l s j 蠢酸结会蛋白e x t r e l l u l a rf a 链ya o i d b i n d i n gp r o t e i n ， 蠢f a b p ) ，它主娶在姊嗣经织中袭达，在缀瑰矫靛体液和血清中优先结 台长键不饱和脂肪酸，对于甘油三酯的合成和脂肪酸的代谢起着很煎要的 作用。山于脂肪酸结合蟹自能特界性的结合脂肪酸，起到对脂肪酸的运输 作；锫，因此，攘测它可能对不网缎织中髓肪的沉袄与代落有重要作用。 l _ 1 2 激素敏感瓶n 疗酶基因 激素敏感脂肪酶( l o r m o n e s e n s i i i v el i p a s e ，h s l ) 是最早引发脂肪 筑织中甘漓三酝分解的关键酶秘限遮酶，是分解滕膀缀织中甘酒三疆，释 放出游离的脂肪酸，调控脂肪躐织分解豹最关键阂索，也是影晌动物鼹肪 沉积的关键酶乏。h s 【。基凶主骤穗! 脂肪组织、肾一匕腺、卵巢、心脏、骨 6 山末农业人学碳 学侏论空 骼且几和平滑肌中表达。在结构上，h s l 柯2 个功能区域：调节区和脂质结 台区域。灞节速两包据2 令磷簸纯位赢，一个稼为诵苇经患，妥一个豁为 蒸本位点。调诲位点可阻调节船l 活性，其变化会澎响脂肪组织的分解。 由于h s l 在脂肪分解代谢中的关键作用，oc s u k 研究认为h s l 基因是与人 和动物脂类代谢性状有关的重嚣基因， s l 可以成为研究整要生产性状的 弦戆嫠因。1 9 8 8 年，大鼠l s l 鏊函全序剜袋军祓溺弼著定位。l g 2 年， 猪 s l 基凶设测知，随后被定位于第6 号染色体p l l q 1 2 。猪h s l 基因包 含9 个外显子，约l l k b ，c d n a 仝长31 2 5 b p 。h s l 基因和燕他一些与动物 尘+ 殴有关静基因均定位子6 号染色葬匏穗近送蠛。 s l 基溺缀毒戆是影鹃 脂肪沉积及瘦肉率等肉质性状的重要基因之。1 9 9 9 年，挪威的h a r b i t z 等在猪h s l 基因2 3 0 l 处发现个山gt 的突变。杨阳根据l l a r b i t z 的研 究会成侧引物，p c r 扩增外显予8 的部分序列，对几种不网瘦肉型猪进 露s s e p 分褫，并对多态往艇点进行克隆瓣序，证实了篓蒸因2 l 处 圭l g 一，1 1 的突变，并且发现在该位点有明显的晶种问差异，根獭研究结果初步 认为猪的 | s l 熬因是影响脂肪沉积性状的重要候选基因之一。 l 。l + 3p p a r _ 鏊舔 p p a r 丫( p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r s a c t i v a t e dr e c e p t o r 过氧化物酶增生活 乞受钵7 ) 是一类由嚣髂褒节戆援激素受钵，聪予棱激素受侮超家蔟，主瑟 在黼胁及免疫系统表达，p p a 脚有2 种异构体p p a r 下l 和p p a f 叶2 ，其中 p p a r y 2 高度表达于脂肪组织，目肥胖关系镣切p p a 脚基本结构包括：氯撼 端酝体依赖姻转录活化区：d 撇结仑区，包台两个锌指结构鞠一个铰链嚣： 羧藏来灞区域，琶括配体结合嚣；二聚体讫器蠢和羧基灞强体依赖的转录 活化区。p p a 脚是诱导脂肪细胞分化的特芹性转录因子，它的激活有助于 脂肪细胞的分化。b a r a k 等( 1 9 9 9 ) 研究发现，pp _ a r 叮2 基因敲除的小鼠由于 分讫箨疆嚣予艇瓣臻死亡，毽落p 强r ￥过度表这刘产生严慧豹l 誓饯瀣紊惑 ( t h a j l e r 2 3 ) 。o l s w a n g ( 2 0 0 2 ) 实验证明，p p a r 7 位点对于 p e p c k c ( p h o s p h o e n o l p y m v a c ec a r b o x y k i n a s e ，磷酸烯醇丙酮酸酯羧激酶) 基熙在曙虢组织的表达和维持p e p e k - c 对甘浊生或豹控制即维持糙肪媳 嚣_ 1 ) g 矗7 f 肇黼窝曲旗糍多态挺菠l i 营瓣浮豹关系 织中甘油三酯的沉积有重要作用。 l 。l 。4 享孛经骚y 球p y ) 基嚣 n p y 属多肽相关肽，其基因定位于第7 号染色体上，n p y 前体含9 7 个 氨旗酸残基，包括2 9 个氨基酸组成的信号肽，3 6 个氨基酸组成的成热肽。 k p y 在中枢神经系统商度表达，是最强有力的摄食刺激因子，大部分n p ￥神 经在弓菰梭释放髑瓣，潞r ，可汉臻强食欲，巍热大褫缓惑。糖凌缓激素 可促进n p y 合成分泌：高脂饮食和胰岛素可抑制n p y 释放。n p y 的受体分 为y 1 一y 6 ，其中与谶食密切相关的魁y l 和y 5 。对以上两种受体拮抗剂的研 究将有助于肥胖的治疗( p a r c e k ，2 0 0 5 ) 。 1 2 乃6 a 研基因研究现状 d g a t 分为d g a t l 和d g a ：r 2 两种类型，两者的同源性为5 4 。 转g a 下l 窟子握露瓣鼗蓥转移酶家羧，d g a t 2 属于姒船m a 般i a 珏a 蕊羧家族。 1 2 id 6 h 盯基凼的发现和定位 d g a t l ( d i a c y l g l y c e r o la c y l t r a n s f e r a s el ，二醮+ 联油酰基转移酶1 ) 是 葶孛缀粒体酶，竣皙涵二醋特异我激溪螽使酝釜纯豹辘酶a 露二酸藜苜 油以菇价键的形式结合，在甘油三脂生成过程中催化最后一步反应并在整 个反应中起重要作用。1 9 9 8 年c a s e s 首先在小鼠上克隆了d g 爿 撼因。 目蕊在小鼠、牛和猪中已经得到了完整的及翎 然因的c d n a 序列。 致a l h “n 等( 2 0 0 1 ) 翅荣麓亲秘法弱器素层辑法簌粪蘩磊扔r f i g 撂黝 r d m 口” 衙”脂质体中分离出d g a t l ，其分子量为3 6k d ，由3 5 5 个氮基 酸组成，理论等电点p i = 9 1 8 。 人( 舶袱，s 妒括淞) 的d g 吖旗因被定位于h s a 8 q 2 4 1 3 ；小鼠( 胍撂 磁掰o “f 绺) o 翻耍媛定位子1 5 号袋怨彝：大惑( 畏蹦凇站o w 踞蟊淞) 0 g 掰 蒸必定位于7 号絷识体q 3 4 ，字d g 裔乃基因定位予1 4 号染色傣1 9 c m 处； 猪( 黝j5 c 阳历) d g “吖基因定位于4 号染色体。 山东农业人学坝l 学位论文 1 2 2d 6 h ”基凶的结构和体内表达情况 牛和猪d g 爿州基因均由1 7 个外显子和1 6 个内含子组成( 见图1 一1 ) ， n o n n e m a n 和r o h r e r ( 2 0 0 2 ) 筛选出猪d g 朋1 的c d n a 序列( g e n b a n k 收录号是a y 0 9 3 6 5 7 ) ，其长为1 9 3 5 b p ，包括1 9 8 b p 的5 u t r ，1 4 7 0 b p 的 编码区和2 6 1 b p 的3 u t r ，与小鼠、人和牛的同源性分别为8 3 、8 8 和9 1 。 d g m n ，在猪体内，。泛表达，所有器官和组织内都可以检测到浚基因 的存在，脂肪代谢旺盛的脂肪组织、骨骼肌、小肠、结肠和睾丸中d g 爿丌 的表达量最多( y j ，2 0 0 4 ) 。 l，3jsr b9 1 0 1 71 3 1 41 5 6 玎讣“f 蠕u l 扫o f 日x 0 1 u l 州引龇3 慵l l - ：碍0 j 4 s1 1 36 68 8h 31 s 6 c 十耐r 太小 1 0”3 ：】l g l h n 删hd - _ i ，1 k 一l 。_ j j l l 一li _ 一一一一一一“1 小 幽i 1 牛d g 爿基冈结构幽 f i g 小1t h es t r u c 【u r eo f b o v md 酬r ，g e n e 1 2 3d 6 h 基因的功能 甘油三酯是真核动物贮存能量的主要方式，d g ”过度表达，可使 甘油三酯合成量增加，d g 省”缺乏可使甘油三酯的水平下降。y u 等( 2 0 0 4 ) 发现，敲除d g 爿州基因的小鼠乳腺中1 a g 合成下降，泌乳能力下降，皮 脂腺功能异常，皮毛缺损，皮肤干燥。h u b e r t 等( 2 0 0 3 ) 证明，含有d g 彳丌 基因的小鼠脂肪细j j f ! i 要比d g 以 基因缺失小鼠的脂肪细胞大( 见图1 2 ) 。 g r i s a r t ( 2 0 0 3 ) 发现d g a 丌可以提高牛乳中乳脂的含量。 虢0 g 矗r f 雉斑秘o 雄辩每恋性技其5 j 镛躲蜉靛关系 鹜l ，2 嵌魏搿正常窝 歃失，、鼠e 肪细匏豹比较( h 曲e n 等，2 3 ) f l g1 2 ，c 。m p 矗r a s 。n 西c e | l sf r o mo 酬+ 广a n dd 酬盯7m i c e ( h 曲e f c e ta i ，2 0 。3 ) 组织内缺乏d g 冀积的小鼠可以存活，但怒较瘦。这种小鼠虽然能够 合成甘油三酯，但不会肥胖。雌性动物如果缺乏d g 纠，则不能泌乳。 对于缺乏d g 的成年母牛，如果用d g m 吖的替代物进行治疗，对于其 泌乳和脂肪蓄积均有髭蓿的促进作用，可见d g 么 对促进脂肪合成、乳 鼹率、泌乳量起着重蒙蚋作臻。 l 。3 幻基因研究魏状 1 3 1 曲基因的发现 美国洛克菲勒大学学者z h a n g 等( 1 9 9 4 ) 首次从小鼠中克隆到肥胖旗 因( 0 6 e s eg e n e o r 曲g o n o ) ，以及入类租关基因的间源序列。不久，小陵、 大氯帮人类雏幻恭因稳继渡克隆并定位。小蔽曲基因位予第6 号染笆体， 入西基凼位于7 q 3 l + 3 。曲錾嚣在脊稚动貔中英有搿凌保守牲，人和小藏酌 曲基因均含有三个外翌予和弱个内含子( s o n e ，2 1 ) 。猪基因定霞于第 1 8 号染色体。猪d 6 丛圆c d n a 序列已被克隆，其编码的0 6 基因蛋白氨 基酸序列和人、小鼠曲熬因蛋白的同源性分别为8 6 o 和8 3 4 ( 戴茹 娲等，2 0 0 0 ) 。 l e p t i n 是( ，6 基测在脂肪维织中表达鲍一种餐臼质，它由1 6 7 个氨基 酸瞧成，n 末端台有由2 1 个氨基酸缀残的信号获序列，在。6 基因分泌入 j 盘豹过程中，信号骚被去除，形成成熟的疫索，作为 ；i = 肉重要的调节因予 发挥其生理馋角。 山东农业人学埘l + 学伸论文 基凶编码脂肪组织特异性m r n a ，翻译成只有分泌蛋白性质的蛋 自质，血液循环中的的基因为多肽类激素，含有1 4 6 个氨基酸，其活性 蔼l 位为1 0 6 1 4 0 个的氨麓酸残基。曲基因的分予爨约为1 6 ，o d a ，通过 特异槛受体及多重神经黢通路 睾嗣予中撅神经系统，搦铡食欲，增趣能量 消耗，降低月s 肪沉积，在动物聪群发展过程中起摘抗和摊铡的作用阻a l a a s e ta 1 1 9 9 5 1 。 1 3 2 础基因的表达 0 6 基因只在成熟约脂肪组织f 】表达，并且在不嘲都位脂肪组织中的 表达堑各不翱同。m a s 溉a k i 等( 1 9 9 5 ) 碡 究发现皮。f 脂肪缓织0 6 基因 i 强心a 表达东平较网艨、腹膜昶弱系搂器脑组织高。秘基因主要在入移 小鼠的脂躲组织中表达，丽在其他大多数组织中检测不到0 6 基因的表达， 但是，研究发现猪拍基因在肝脏、心脏、脾脏、肌肉组织中也有微量表 达，这说明猪d 6 基因的分稚及其调控机制与人和小鼠存在差异( 杨华等， 2 0 0 i ) 。 动物和a 盘中l e p t i n 水平具有明显的昼夜节镎，郎午夜至早晨较高，中 午至下午较低。i e p t i n 踩冲瞧释放懿频率、幅凄及骚夜节律与性别、l 翌辟 程度和获岛素承乎有一定关系( s a a de t a l ，1 9 9 8 ) 。 。6 基因的表达受到多种因桑的影响。雕前认为，l e p t i n 与神经内分泌 之问组成一个闭合环路，通过作用于下丘脑、胰腺等处发挥功能，同时义 受这些神经内分泌系统的负反馈调节，另外，0 6 撼因对其自身的表达电 具有调：甘作用。李庆梅等( 2 0 0 5 ) 认为l e p i i n 町能通过其爱体直接作用于 下丘脑的促性腺激素释敦激素( g n r h ) 神经元调节动物的生殖和内分泌 活动。还寿磺究发现，袋禹素、蔼萄糖等均可露j 激0 6 繁强的表达 ( 己e i 赫1 9 e t 2 0 0 0 ) 。弧o r n 等( 2 0 镛研究证实，提蠢营养可以增热牛乳房 鏊赝中l c 牟i n 的台量，但l e p t i n 不会直接作用予乳腺缏胞。目前研究者已 将0 6 基因在大肠杆菌中离效融合表达，为口6 纂因的表达和表达产物的纯 化打下基础。 辅0 g 4 姥渊和曲犟瓣善意髓鼓l c1 j 萤般弹瓣关系 1 3 3d 哆基因的作用殿其作用的分子机理 随蓑对0 6 蘩潮研究的不凝深入，a 稍发现确基戮具有广泛沟生理功 能，基因表达产物l e p t i n 的研究对于揭示肥胖、糖尿病、高血藤等多种 疾病的发生机制县有熏要意义( f n m s i n ne ta l ，1 9 9 8 ) 。1 e p t i n 在体内主疆参与 机体的体重调节，在调节食欲、能量消耗、体内脂膳储存、食物摄入与能 鼙消耗的反馈调节中超嚣 嵩重要的 乍眉( g u e o r g u i e v ，2 1 ) 。另外l e 西n 与体内多种内分泌激豢的调节有一定关系。动物实验证实，l e p t i n 可以往 小鼠的进食次数明盟减少，体重和体脂含量下降( k o i a c z y n s k je ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 进一步研究发现，l e p t i n 与下丘脑部位的受体发生结合后引起神缀肽 y ( n e u o p e p t i d o x n p y ) 合成分泌减少积黑色豢缀照蒯激激素 ( n 他i a n o ，e y t e - s t i r n u i a i n gh o 吼o n e ，m s h ) 分泌蹭艇，进而引起食欲降低、 能鬃消耗增加、性生贿功能改变等生理变化；i e p t i n 作用于前脑，调控后 脑对过饱刺激信号产生反应( g r c g o r ye ta i ，2 0 。5 ) ；l e p i n 可作用于中枢神 经系统，遥过增热交感褥经系统的活性，使贮存的大量缝量转交成热& 释 放，造成产热增加( c a r oe t 萄，1 9 9 6 ) ；l e p 娃n 直接挪制强肪组织中腊类魏合 成，出有人认为l e p c i n 的作用是促进脂肪细胞的成熟( c a r oe ta l ，1 9 9 6 ) ； e l e r e r i o u 等( 2 0 0 4 ) 实验证实l e p t i n 是体内骨形成的强抑制子：麒岛索可 以健邋l e 嘶n 酶分泌，闷时l e p t h 及过柬对竣岛豢的合成、分泌笈撂负反 馈调节( h a l a a se ta i ，i 9 9 5 ) ，在分化后觞脂肪细胞中，】e 两n 搀制幽麒岛索导 致的脂肪酸增加( i 1 0e ta l ，2 0 0 6 ) ：l e p t i n 还可咀加重服岛索抵抗( c o h e ne t a l ，1 9 9 6 ) ；当赋岛索抵抗时，因血中肢鼬索水平升商，可问接促使啦中i e p t i n 求警势齑( k o l a c z y n s k io ta l ，1 9 9 6 ) ；餐j 娃中存在l e p t i n 受体，所以l o p l i n 可 童接对肾脏发挥调羧 乍闫，l e 球i n 作蠲于管，j 、管，g l 筵稼钠莉 邋增加及嚣 量增加( j a c k s o ne ta i ，1 9 9 6 ) ；长期给予j c p t i n ，可使大鼠心率加快，血压升 高( s h e ke ta 1 ，1 9 9 8 ) ；l e p t j n 可能作用予下丘脑垂体性腺轴，促进性成熟， 并为受孕骰准备；l e p t i n 漩够逆转锻饿引起的免褒功戆受驻f l o 撼c t a l ， 9 98 ) ti e p t 汪能够影嘛盎中掣状淼激象、皮质酮、生长激素静水平，可 能与促红细胞生成索有协同作用，并刺激造血千细胞的增生，主动参与造 血过棍；l e p t i n 外显予上的多态可以最著影响猪的繁殖性状( 刘佳琼等， 山东农业人学坝l 。学位论文 2 0 0 2 ) ：汪以真等( 2 0 0 5 ) 对仔猪皮下脂肪i e p t i n 的表达量进行了分析， 发现1 - 5 6f 1 龄的仔猪1 e p l i n 表达世呈现先商后低的趋势：孔路军等( 2 0 0 5 ) 实验发现，瘦肉型猪血清中0 6 基凶含量显著高于脂肪型猪，0 6 基因m r n a 表达丰度和l e p t i n 浓度呈高度正斗且关，两者与初产母猪血清f s h 、l h 和 总产仔数成j f 相关，与初生个体重呈负州关。l e p t i n 的作用如图1 3 ( a ) 所 示。 帅。= 裔+ 黜 e ：! 咖掣“67 哎岁。翟甄。 枷删s 8 卜一 ”啊哪啪” ( a ) ( b ) 幽】一3l e p t i n 的作川( a ) 及分f 机理( b ) ( 摘白生物谷例站) f i gl 一3t 1 1 e “i n c t i o n s ( a ) a n dm o 】e c l j i a rm e c h a n i s m ( b ) ( d o w n l o a df r o m h t t p ：，w w w 七j o o nc o m ) o f l e p t i n 作为出脂肪组纵分泌的与体内生化反应相关的肽类激素，1 e p t i n 主要 功能之一就是通过作刚于垂体，调节采食行为和新陈代谢。l e p t i n 另外一 个靶细胞是骨骼肌，骨骼肌中活化的1 c p t i n 信号能激活a m p 活性蛋白激 酶( a m p k i n a s e ) ，而a m p k i n a s e 能够通过各种信号反应出营养物在体 内的代谢过程( 参见a m p k 通路和s n f l 通路) 。a m p k 可以将乙酰c o a 羧化酶( a c c ) 磷酸化造成a c c 酶失活。a c c 催化脂酰c o a 生成丙二 酰c o a ，丙二酰c o a 能够抑制脂肪酸利用肉碱棕榈酸转移酶i 进入线粒 体进行氧化和产生能量( 线粒体肉碱棕榈酸转移酶通路) 。l e d t i n 的存在可 以激活a m p k ，而造成a c c 被抑制，丙二酰c o a 水平降低，从而增加了 脂肪酸的氧化，减少了细胞内的脂肪含量。骨骼肌内脂肪的降低使得胰岛 索信号和糖类消耗恢复到f 常水平，减少胰岛素抵抗。( 具体模式见图 1 3 ( b ) ) 。 狮d 6 一r ，雄i 太l 和0 6 堆多态傩及1 0 j 背牒厚的关系 1 4p c r s s c p 检测方法 瑚q a 鼹碱基置换突变( 点突变) 会造盛单链豹分化折叠，使单链在 棼受性聚雨烯酰黩凝获中电泳速度不同，造成了d n a 的举链构象多念 ( s i n g l e s t r a n d o dc o n f o r r n a t i o np o l y m o 攀h i s m ，s s c p ) 因此我们可鞋旯】s s c p 方法对点突变进行多态性分柝。p c r s s c p 是一种基于p c r 的单链构象 多态分析技术。这种方法检测突变位点的种类和数量非常丰富，检测灵敏 性商，所需要的仪器和试剂比较容易得到，成本不是太高，一般生物化学 翻分子遗传学实验室都可以进行检测。p c r s s c p 可以检测所有的点突 变，尤其适蠲于检测，、片段渊a ( 姜运良等，2 o ) 。 山东农业人学坝l + 学位论史 2 本课题的研究目的、意义 髓薅沉积性状是猪鹩露要经济性状，与猪肉的融蕊及其经济价值紧密 联系，找到彩确猿骚黪沉积麴主效基因，阕鞠猪稚髓溅稂兹原理，对予提 高猪肉品矮郓猪肉蠡毫经济徐值意义重大。猿d g 囊掰蕊隧和曲基因都是与 脂肪代谢有关的基因，了解这两个基因的作j 罾机制和对猪背膘厚的影响对 瘦肉型猪育种工作有熏爱意义。 猪d 侧丁，基因是关于猪脂肪沉积的巫要候选撼因。g r i s a r t 等( 2 0 0 2 ) 对d 0 4 ”基因序列进行了分析，发现该基因的突变怒造成脂肪沉积的主要 蹶瑙之一，引起遗传学家们的广泛关注。近期磺究袋甥，d g 冀”基因突 变可链l 旨踌沉积产生水溺程度鳃变化。雨魏对积弘鄹鍪凼的绩稳、染 色体定位及表达分援等_ 簌猪上已有初步了解，但在莛与猪背膘厚之间的关 系方丽仍知之甚少。研究浚基因与猪背膘厚之陋j 的相关性，将有助于找出 控制猪背膘厚的主效撼因或紧密连锁的分子标记。 猪0 6 基因是与猪脂肪分解有关的一个重龋调控因子，其表达水平可 能与背膘厚有关。牛的基因主要与摄食、能量消耗、繁殖和免疫功能有 关，不但在曲基因编码霹出现纳突变会造成摄食、霉l 髓率、弱体月基肪古 登的变化，5 非翻译区申静突变也会对血渍l e p t 濂含量、生长、白色l 旨肪 缀织、摄食行为和蒯俘缀成产生显著影响( r a m s a y ，2 1 ) ，所戬礤究猪 曲基因5 调控区的多悉性有助于找到其与背牒沉积关系的一些线索，研 究结果将有助于深入理解猪0 6 基凶与背脓厚的关系。另外，c h e n 等( 2 0 0 2 ) 通过实验发现，在人的肥胖治疗过程中，如果抑制d g “ 基因活性，那 么将会减轻胰岛素和楚围的抗性。这个实验结果表明，d g 矗玎基因和 拍基因可在菜种狴度上存在一定的联系。 本试验以猪d 6 奠乃秘曲基因作为经选基圆，叛不同腊膀类型品种猪 为试验材料，通过测序和p e r s s e p 技术对它们避 亍孳孩营酸多态往分 析，找出潜在的多态性位点，分析各种基因型在不同晶种猪群体中的分布， 分析不同基因型背膘厚之间的关系，以期找到上述基因多态性与猪背膘厚 的关系，为猪肉质性状的改良提供依据。 狮d g 爿r ，壮和0 6 难多态性髓1 e j j 前膘厚的共系 3 材料与方法 3 1 材料 3 1 1 实验样品的来源、采样方法及背膘厚测定 从山东省莱芜猪原种猪场采集3 0 头菜芜猪，l 3 9 头大莱二元杂交母 猪耳组织样品；从山东省农业科学院畜牧兽医研究所良种猪培育中心采集 3 5 头杜洛克猪和7 头大自猪耳组织样品；从烟台益生种猪场采集3 3 头大 白猪耳组织样品。从德州市肉联厂生猪定点屠宰车川采集4 0 0 头杂交育肥 猪上皮和肌肉组织样本，共计6 4 4 头。取得耳组织样品后，立即放入7 0 的乙醇中，一2 0 低温保存。 对所采集实验动物的说明：在莱芜猪场和农科院猪场所采集的莱芜 猪、大白猪、杜洛克猪均为纯种：大莱二元杂交母猪是莱芜猪和大白猪的 杂交后代，各含有一半的莱芜猪和大自猪血统，均在6 月龄左右；杂种育 肥猪是去势的公、母猪，主要来自德州附近地区，如吴桥、南宫、恩城等 地。该地区的生猪均为长大二元杂交，或长大和本地品种的三元杂交个体， 以农户饲养为主，育肥后期使用玉米、豆粕型高能量r 粮饲喂，一般饲养 6 7 个月后出栏，屠宰个体体重均达在l o o 公斤以上。 本试验所采用的背膘厚测量方法有两种：一种是胴体测背膘。在猪进 行工厂化屠宰后，使用游标卡尺对猪分割后的右侧胴体第6 7 肋问，用一 点测背膘法测量猪背膘厚。一种是活体测背膘。在利一猪场内，将猪赶入保 定笼中，使用n o v e k o 便携式b 超仪活体测量猪背膘厚。用b 超仪测 量背膘时，在距离猪背中线4 6 c m 处取肩胛骨后缘，最后肋骨和髋结节 ( 腰角) 前缘三点的平均值，在统计分析中使用的背膘厚数据是这三点的 平均值。 山东农业人学坝卜学他论文 3 1 2 主要试剂及来源和主要的仪器、设备 表3 1 上要试剂及来源 t a b l e3 - lo r j g j no fm a i nr e a g e n c 试剂名称公司或厂商 d n i p m l x m g c l 2 r 勋g d n a 聚合酶 l a 而q d n a 聚合酶 1 0 p c r b u 艉r 2 g cb u f r e r i p m d l8 一t 载体 d n a 凹i | 叟试剂盒 止0 d r i 内切酶 胁加i l i 内切酶 蛋白酶k d n am a r k c rd l 2 0 0 0 琼脂糖 胰蛋白胨 酵母提取物 丙烯酰胺 甲义双丙烯酰胺 t e m e d t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 t a k a r a 公司 t a k 址己a 公司 t a k a r 丑公司 t a k a r a 公司 德国m e r c k t a k a r a 公司 上海生工 o x o i d 公司 o x o i d 公司 a m r e s c 0 a 1 r e s c 0 a m r e s c o 其它试剂均为国产分析纯。 主要的仪器、设备： 移液器( 德国e p p e n d o r f 公司) 祈d g 一丌坫i i 和。6 基多态性及1 j ，膘厚的关系 凝胶屯泳成像仪( g e l3 0 0 0s e r i e st r a n s i l l u m i n a t o rt u 一2 0 ) 制冰机a f 2 0 0p s c5 0 r ( 美国) 电热恒温水浴器( 上海一恒科技有限公司) a r a 5 2 0 型电子天平( 美国公司1 格兰仕微波炉( 广东格兰仕集团有限公司) 蒸气消毒器( 上海申安医疗器械厂) 冷冻离心机( 德国e p p e n d o r f 公司) 稳压电泳仪d y y - i i l 8 型( 北京六一仪器厂) 垂直板电泳槽( 北京东方特力科贸公司) 恒温振荡器t h 2 型( 江苏太仓市实验设备厂) 台式高速离心机5 4 1 5 d 型( 德国e p p e n d o r f 公司) p t c 。15 0 型p c r 仪( m jr e s e a r c hi n c 1 超净：i ：作台( 苏州中亚净化设备有限公司) 恒温培养箱p y x d h s 型( 上海市跃进农场医疗机械厂) 索尼s 4 0 数码照相机( 开本索尼公司) 3 1 3 主要分子生物学数据库及软件 常用例站： g e n b a n k ：h t t p ：，、v w n c b i ，n l m ，n i h ，g o v ( 可满足各方面的序列数据库 查询要求) l o c u s l i l l k u n j g e n e ：h t t p ：w 、v 、v n c b i n l m n i h ，g o v l o c u s l i n “或u n i g e n e ( 非冗余数据库，g e n b a n k 中最有价值的部分) 所用软件： p r i m e r5 o