（动物营养与饲料科学专业论文）乳酸杆菌肽聚糖免疫调节作用及其机制初探.pdf

摘要 摘要 论文以乳酸杆菌肽聚糖为研究材料，研究了其对小鼠机体非特异性免疫因子作用及 免疫细胞因子作用，并利用现代分子生物学研究手段，研究其对免疫基因表达的调控，探 讨了乳酸杆菌肽聚糖的信号识别，传递和免疫基因调控通路的分子机制。 分别用无菌p b s ，o 2 m m 1 乳酸杆菌肽聚糖溶液，1 o m m l 乳酸杆菌肽聚糖注射小 鼠三天，实验第四天处死动物检测指标。实验结果显示：肽聚糖能显著增强溶菌酶活力， 溶血素水平，及碱性磷酸酶活力，但并未使机体产生更多的超氧阴离子，也未降低能超氧 化物歧化酶与谷胱甘肽过氧化物酶活力。乳酸杆菌肽聚糖能提高受刺激小鼠腹腔巨噬细胞 中炎性细胞因子白介素1 、t n f a 及脾淋巴细胞中i f n y 的分泌，对抗炎性细胞因子白 介素l o 的分泌并无显著增强作用，小肠m p o 的活性也未提高，表明适量的乳酸杆菌肽聚 糖刺激并未使机体产生过度炎症反应。 采用基因芯片技术和p m m m 探针技术，研究了乳酸杆菌肽聚糖对免疫相关基因表 达的调控作用极其信号传递通路。结果表明，乳酸杆菌肽聚糖刺激小鼠后激活了t l r 2 n f kb 信号通路，肽聚糖通过上调t l r 2 模式识别受体编码基因表达，激活细胞核转录因 子途径而调节免疫相关基因。乳酸杆菌肤聚糖刺激小鼠后同时激活了j a k s t a t 信号通路， 该通路是炎症反应中十分重要的信号调控通路。 采用r t p c r 技术对t l r 2 一n f kb 信号通路进行了初步探讨，结果显示，乳酸杆菌肽聚 糖刺激小鼠三次，2 小时开始t l r 2 表达相对对照组和刺激一次组显著增强，4 小时开始差异 极显著，1 2 小时t l r 2 表达达到最高峰，之后持续表达。乳酸杆菌肽聚糖刺激小鼠后激活了 t l r 2 一n f xb 信号通路，刺激次后t 0 1 l i p 的表达下调，可能在促进信号通路的进行，刺 激三次后t o l li p 的表达没有变化，说明连续刺激后机体对通路进行了负调控，这有助于防 止过度炎性反应的发生。 关键词：乳酸杆菌肽聚糖非特异性免疫炎症基因芯片信号通路调控 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t e f i e c to f 口c f d 6 口c 讲淞p e p t i d o g l y c a n ( p g ) o nm i c e n o n s p e c i f i ci m m u n er e s p o n s ea n d c y t o k i n e sp r o d u c t i o nw e r es t u d i e db o mo np h y s i o l o g ya n dg e n ee x p r e s s i o nl e v e l p gr e c o g n i t i o n ， s i g n a lp a t h w a y sa 1 1 dt a r g e t e dg e n ee x p r e s s i o nw a sa l s os t u d i e d n o m a ll 洲m i c ew e r e 面e c t e d ( t p ) 埘t 1 12 0 0 肛lo f p b so rp g ( o 2m gm l - lo r1 0 m g m l “) f o r3c o n s e c u t i v ed a y s i tw a sf o u n dt h a ts e n l m1 y s o z y m e ，h e m o l y s i n ，a l k a l i n e p h o s p h a t a s ei n c r e a s e da f t e rb o t hd o s eo fp ga d m i l l i s t r a t i o n h o w e v e r p gd i dn o tj n n u e n c e s e m ms u p e r o x i d e a n i o n ，a s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) a i l dp e r o x i d a s e p gi n d u c e dt h e p m d u c t i o no f i n f l a i n m a t o r yc ”o l ( i n e s ( i l 一1 ，t n f i np e r i t o n e a lm a c r o p h a g e s ，i f n 吖ms p l e e n c e l la n dm p 0i ns m a l l 场t e s t i n e ) a 1 1 dd i dn o ti 1 1 d u c et h ei l - 1 0p r d d u c t i o ni n p e r i t o n e a l m a c m p h a g e s e f r e c to fp go nm i c ep e r i t o n e a la 1 1 ds p l e e nc e l lg e n ee x p r c s s i o nw a ss t u d i e db yu s i n gg e n e c h i pt e c h n o l o g ya 舭rm i c ew e r ei r l j e c t e d 、v i t i lp go n c eo rf o rt h r e et i m e s ( o n ed o s ep e rd a y ) t h er e s u l t sr e v e a l e dm a tt 1 1 et l r 2 - n f bp a t l l w a yw a sa c t i v a t e d e x p r e s s i o no ft l r2w a s u p r e g u l a t e d ，a c t i v i t yo f n f - k b l ，n f k b 2ka n dtc e l ln u c l e a rf a c t o rw a sa c t i v a t e dw h i c hr e s u l t e d m e x p r e s s i o no fi m m u i l er e l a t e dg e n e s 1 1 1 ej a l 【s 诅tp a m 啪yw a sa l s oa c t i v a t e d ，w h i c hm i 曲t p l a yar 0 1 ei nr e g u i a t i n gi n f l a n m l a 的r yr e s p o n s e 彤r - p c rw a su s e dt of h r t l l e re x p l o r ei n n u e n c eo fp gi nt l r n f k bp a t h w a yi tw a sf b l l l l d t h a te x p r e s s i o no ft l r 2 、v a sh i g l l i yu pr e g u i a t e d2h o l l r sa r e rt h el a s ti n j e c t i o no ft h r e ed a yo f a d m o i l i t i o l l su p ) ，w 1 1 i c hb e c 锄em o r es i g n j 6 c a n ta f t e r4h o u ra n dr e a c h e dp e a k1 2h o u r sl a t e l e x p r e s s i o no ft b l l i pw a sn o tc h a n g e d 1 1 l i si m p i i e dt l l a t 山ed o 、v i lr e g u l a t e dp a m w a yw a s a c t i v a t e dw h i c hc o u l dp r e v e n tt 1 1 eo v e rd e v e l o p m e mo f i n f l 猢a t o r y r e s p o n s e k e yw o r d ：l a c t o b a c i l l u sp e p t i d o g l y c a i l ，n o n s p e c i f i ci i i l 】m m er e s p o n s e ，i n n 蝴a t o r yr e s p o n s e ， g e n c h j p ，s i g n 甜p a t h w a y ，r e g u l a t i o n i i 、独创性声明 y 9 6 8 0 1 2 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：日期：川年，月谚日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 垒觋一刖黑较似 以半f争 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 自二十世纪初，俄国著名的微生物学家，诺贝尔生理及医学奖获得者e m e t c h n i k o f f ( 1 9 0 8 ) 发表了“长寿说”“1 以来，乳酸杆菌与人、动物健康及保健关系的研 究从未停止过。含有活菌和或死菌( 包括其细胞成分和产物) 的乳酸杆菌制品，经口或 其他粘膜途径投入，可改善粘膜表面微生物或者酶的平衡，刺激特异性或非特异性免疫， 维护人与动物的健康，所以受到了医学和营养学界的广泛重视。包括乳酸杆菌等在内的益 生菌作为饲料添加剂，不但具有提高畜禽生产性能和防治疾病的作用，而且具有无污染， 无抗药性和无残留等优点，可克服抗生素和化学药物在饲料中长期大量使用造成的微生态 失调、畜禽抗病力和生产性能下降、抗药性及产品药物残留等副作用。随着研究的不断深 入，乳酸菌已被广泛应用于饲料、医药保健和食品等各领域。 1 2 乳酸杆菌免疫活性研究进展 免疫可广泛地分为固有性免疫和适应性免疫。固有性免疫，又称非特异性免疫，是机 体对进入体内的抗原物质的一种无选择性排斥、清除功能。这是生物体在种系发育的长期 过程中逐步建立起来的一系列天然保护能力。适应性免疫，又称特异性免疫，其是由t 淋巴细胞和b 淋巴细胞介导的免疫，特征为特异性和记忆性。非特异性免疫是特异性免疫 的基础，特异性免疫所产生的免疫物质又能增强非特异性免疫的作用。 乳酸杆菌对机体免疫的调节依赖于宿主的免疫状态，在健康及疾病个体中，乳酸杆菌 通过激活吞噬细胞、提高细胞因子水平、增加自然杀伤细胞活性( n k 细胞) 和提高免疫 球蛋白水平，最终诱导机体增强免疫反应强度。已有报道，乳酸杆菌可以活化特异性与非 特异性免疫反应细胞( 如淋巴细胞和巨噬细胞) ，提高免疫球蛋白水平，活化细胞因子。 增加乳酸杆菌的摄入量或用乳酸杆菌刺激体外培养细胞，可刺激巨噬细胞的吞噬功能。1 、 淋巴细胞增殖。“、抗体“”1 和i l 一1 、i l 一6 、t n f a 、i f n y 等细胞因子的产生“”、t 细胞。2 ”和自然杀伤细胞“的活性，最终提高了机体的免疫监视功能或激发抗肿瘤免疫 反应。s c h i f f r i nej ( 1 9 9 7 ) 等发现乳酸杆菌能刺激小鼠肠道上皮细胞分泌细胞因子和 表面分子( 如i c a m 一1 、m h c 。) ”“。c h r i s t i n el ( 1 9 9 8 ) ，s h i d ak ( 1 9 9 8 ) 等发现乳酸杆 菌能增强巨噬细胞吞噬病原菌的能力。“别。t e j a d a ( 1 9 9 9 ) 等发现乳酸杆菌能刺激小鼠腹 腔巨噬细胞产生i l 一6 、i l 一1 2 、i f n v 、n 0 等细胞因子”“，通过发酵乳制品口服两种 乳酸杆菌，会快速定植于结肠，在几周内都可以增强血液白细胞的吞噬作用。h a l l e r ( 2 0 0 0 ) 等发现乳酸杆菌能刺激人外周血单核细胞产生i f n y 和i l 一1 2 ，刺激n k 细胞表达”。 人体肠道免疫系统会随年龄的增加而衰退，对肠道感染疾病变的易感，用乳酸杆菌作为功 能性食品，来提高机体免疫力，增强疾病抵抗能力已越来越受到重视。然而，乳酸杆菌发 江南大学硕士学位论文 挥作用的机制当前还不清楚，乳酸杆菌的细胞壁组分可能是乳酸杆菌发挥免疫刺激作用的 物质基础。从分子水平研究乳酸杆菌及其细胞壁组分和机体免疫系统对话及免疫稳态维持 之间的关系是阐明乳酸杆菌作用机理的关键。 1 3 乳酸杆菌肽聚糖研究进展 1 3 1 肽聚糖的化学组成与结构 肽聚糖( p e p t i d 0 9 1 y c a n ，p g ) ，又叫黏肽或胞 壁质，是原核细胞生物特有的化学物质，是细菌细 胞壁主要成分。如图卜l 所示，肽聚糖由聚糖支架、 肽侧链和肽桥组成。不同种类的细菌肽聚糖链骨架 基本是相同的，均由n 一乙酰葡糖胺( g ) 、n 一乙酰胞 壁酸( m ) 相闯排列组成，不同的主要是四肽链氨 基酸的组成及两条四肽链间的交联方式。连接于胞 壁酸乙酰基上的四肽侧链随菌种而异，主要表现在 四肽链第三位氨基酸的种类上。四肽链一般可以用 r 卜d 一谷氨酸一r 3 一d 一丙氨酸的通式表示。r l 大多是 l 一丙氨酸，少数是甘氨酸或l 一丝氨酸，而r 3 的变 化较大，可以是内消旋的二氨基庚二酸，l 一赖氨 图1 1 肽聚糖结构示意图 酸，l 鸟氨酸，l - 二氨基丁酸，有时也可以是同 型丝氨酸或l 一丙氨酸( 金黄色葡萄球菌为l 一赖氨酸，大肠杆菌为二氨基庚二酸) 。四肽 链第二位的d 一谷氨酸也可羟基化，游离的a - 羧基可酰胺化或被甘氨酸等取代。革兰氏阳 性菌相邻聚糖骨架的四肽侧链通过五肽桥连接，二者之间以酰胺键连接。葡萄球菌的五肽 桥由五个甘氨酸组成。五肽桥的一端连在四肽侧链的第三位赖氨酸上，另一端连在相邻聚 糖链上四肽( l 一丙、d 一谷、l 一赖、d 一丙) 侧链的第四位丙氨酸上，从而构成三维立体网状 结构。革兰阴性菌无五肽桥，相邻四肽( l 一丙、d 谷、d a p 、d 一丙) 侧链直接以肽键相连， 构成二维片层结构。例如，大肠杆菌直接由四肽侧链第三位的二氨基庚二酸与相邻四肽侧 链末端的丙氨酸连接( 图l 下) 。 1 3 2 肽聚糖的分类 不同种类的细菌肽聚糖链骨架结构基本相同，其差异主要是四肽链氨基酸的组成以及 四肽链的交联方式“”。通过对许多不同的革兰氏阴性菌肽聚糖的肽链部分氨基酸组成与顺 序的研究表明，革兰氏阴性菌的肽聚糖结构变化不大，它们肽聚糖中只含有以l ：l ：1 5 一1 0 比率的d g 1 u 、m d d m 和d ，l a l a 。革兰氏阳性菌的肽聚糖中肽链的组成与结构排列有 很大变化。根据连接在n 一乙酰胞壁酸上的相邻的两条短肽( 肽亚单位) 之间交联方式的不 同，将肽聚糖分为a 、b 两群，其中一条肽亚单位的3 位氨基酸与另一肽亚单位的4 位氨基 第一章绪论 酸之间交联的肽聚糖属于a 群；一条肽亚单位的2 位氨基酸与另一肽亚单位的4 位氨基酸 之间交联的肽聚糖属于b 群，这群肽聚糖比较少见，只在某些棒状细菌特别是植物病原性棒 状杆菌中被发现。 1 3 3 细菌细胞壁肽聚糖的生物合成 革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖通过三步合成： 第一阶段，于细胞质发生如下反应，然后a l a 、g 1 u 、l y s 和a l a a l a 逐个被加到n a p ： u d p 。 u t 氓罢要塞凳n a g ：udp 墨! 兰雪 n a p ：u d p ( n a g ：乙酰氨基葡萄糖；n a m ：氨 基葡萄糖) 第二阶段，发生于细胞膜， n a m a e l a a 连接到载体脂肪( 异戊问二 烯基十碳酸磷酸盐，c 5 5 ) ，然后n a g 连接到载体脂肪形成n a g n 删一a e l a a 复合体，最后n a g n a m a e l a a 被释放到 细胞膜的另一侧。 第三阶段，发生于细胞膜外侧，单 个暨兰尊掣竺聋量! 拿犁孑雾篓圭链。 图1 2 细菌细胞壁肽聚糖的 这样的连续反应合成的肽聚糖形 成多层结构，在细菌细胞壁外侧，当外层丢失后，新的肽聚糖层又会在内层形成，外层的 不断丢失推动着新的内层不断外移油1 。 革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖的合成与革兰氏阳性菌相似，n a g h 和n a m 一五肽在细胞质 装配后嵌入细胞膜内部形成肽聚糖前体由c 5 5 一载运脂肪运出细胞质膜，然后在青霉素结 合蛋白( p b p s ) 作用下肽聚糖前体互相结合形成初生肽聚糖，其它青霉素结合蛋白主导的 转肽作用使初生肽聚糖与细胞壁层合成一体。由于抗生素的的长期使用，细菌的肽聚糖合 成途径可能会适应性的改变，从而出现对抗生素的耐受性。对细菌肽聚糖合成的研究，有 利于新的抗生素的研究。l i p i di i 是一种肽聚糖合成中间产物的相似物，可以作为抑制 剂用于研究与肽聚糖合成有关的酶“。 1 3 4 肽聚糖的代谢 主要存在于哺乳动物和人类血液中的n 一乙酰胞壁酸一l 一丙氨酸酰胺酶可以特异性地水 解细菌细胞壁肽聚糖”“，把肽聚糖水解成肽亚单位和多糖链两个部分。肽聚糖单体作为哺 乳动物血浆水解酶作用的底物进行代谢。这些肽亚单位进一步作为l ，d 氨基肽酶的底物， 将l 一丙氨酸从肽的氨基末端劈开。肽聚糖缺少了糖苷部分，其有益和有害的特性都将消 江南大学硕士学位论文 失。上述这些酶虽然没有直接的杀菌活性，但它们的生物学功能就是把那些具有生物学活 性的肽聚糖降解成无活性的产物。在哺乳动物的尿液中可以检测到这些无糖部分的肽的存 在。 1 3 5 乳酸杆菌肽聚糖免疫活性研究进展 乳酸杆菌及其制品益生作用的研究虽已有百年历史，但直到上世纪八十年代，科学家 们才逐步注意到乳酸杆菌细胞壁中存在活性成分。t o m o h i k o0 9 鲫a 等( 1 9 8 2 ) 研究发现， 肠道正常菌群细胞壁( 或肽聚糖) 可以影响肠的收缩性，认为这些细菌细胞壁制品或类似 的合成化合物可以用于临床以增强机体的先天性和获得性免疫，提高对各种会扰乱肠道功 能的感染和恶性肿瘤的抵抗力”。f r i e n d 等( 1 9 8 4 ) 报道，保加利亚乳酸杆菌细胞壁成 分同样能显著抑制小鼠e h r l i c h 腹水瘤的生长。1 。s a t o 等( 1 9 8 8 ) 制备了乳酸杆菌的细胞 壁、细胞浆、多糖和肽聚糖，研究了它们促进小鼠抵抗单核细胞增多性李司氏菌感染的效 果，向腹腔注射乳酸杆菌的这些细胞组分可以诱发腹腔炎症细胞的产生，其中肽聚糖的效 果最为明显。静脉注射乳酸杆菌的细胞壁能引起最强的抗单核细胞增多性李司氏菌感染作 用，肽聚糖也有保护活性，因此，乳酸杆菌增强机体抵抗单核细胞增多性李司氏菌感染的 能力可能归功于其细胞壁组分，特别是肽聚糖部分。s e k i n e 等( 1 9 9 5 ) 曾报道双歧杆菌 完整肽聚糖能激活小鼠腹腔巨噬细胞，使其i l 一1 、i l 一6 及t n f u 的m r n a 表达增强，他认 为，肽聚糖成分在双歧杆菌提高机体免疫监视功能方面可能起重要作用。5 1 。孟凡伦等 ( 1 9 9 8 ) 通过研究乳链球菌s b 9 0 0 胞壁肽聚糖( l a b p g ) 的生物学活性，发现l a b p g 无毒、 安全可靠；腹腔注射l a b p g 后，腹腔巨噬细胞数目增多，细胞吞噬功能明显增强，血清溶 菌酶活性增强；y c 一花环实验表明，腹腔注射l a b p g 的小鼠腹腔巨噬细胞表面c a b 受体活 性增强，y c 一花环形成率较高，说明l a b p g 对于腹腔巨噬细胞有一定的激活作用，可作为 机体的免疫激活剂。“。马西艺( 2 0 0 3 ) 等研究认为乳酸杆菌肽聚糖能激活n k 细胞、腹腔 巨噬细胞产生i f n y 、t n 卜d 和n 0 ，其可能部分介导了它的抗肿瘤作用1 。 以上研究结果表明，肽聚糖是人类免疫系统的激活剂，少量肽聚糖对于宿主重要生理 功能的维持和促进是非常重要的”3 。细胞壁肽聚糖可经口服或非胃肠道途径增强宿主的免 疫监视功能，加强各种细胞因子的产生“，提高n k 和巨噬细胞活性等，提高局部免疫功能， 发挥自稳调节和抗感染、抗肿瘤效应。i s h i h a r a ( 1 9 8 9 ) 等将青春型双歧杆菌的肽聚糖注 射于恶性黑色素瘤患者的皮肤转移灶内，发现它能使转移灶体积明显缩小，效果和i f n y 相 当。这些作用可能是由于肽聚糖能激活巨噬细胞使其分泌更多的i l 一6 、i l 1 2 和n 0 ，而 这些介质都具有广谱的掷瘤活性，它们的诱生介导了肽聚糖酌抑瘤过程“。蓝景刚( 1 9 9 9 ) 等的研究表明，双歧杆菌细胞壁肽聚糖能增强小鼠脾n k 、l a k 细胞杀伤肿瘤靶细胞的活性， 还可以增强小鼠腹腔局部巨噬细胞来源的细胞因子如i l - l 、州f a 、i l 一6 的活性”。江 晓路( 1 9 9 9 ) 等在中国对虾的基础饲料中添加0 2 9 k g 乳酸杆菌肽聚糖，饲养6 0 天后，发现 其能提高血清溶菌酶的活性，并可在短时间内提高血清凝集抗体效价，增强中国对虾的特异 性免疫功能“”。王立生( 2 0 0 0 ) 等用分叉双歧杆菌肽聚糖注射于裸鼠腹腔，发现肽聚糖能激 第一章绪论 活巨噬细胞，使之分泌多量的i l 一6 、i l 1 2 及n o ，这些细胞毒性效应分子介导了肽聚糖的多 种重要生理功能“”。以上研究结果说明细菌细胞壁肽聚糖是一种强免疫增强剂，主要通过诱 导各种免疫调控物质的释放或表达来刺激免疫系统发挥其免疫功能。尽管肽聚糖在活性乳 酸杆菌抑瘤、免疫赋活方面的地位、确切作用及其机制迄今尚未完全阐明，但以上研究启 示，乳酸杆菌细胞壁中所含的肽聚糖成分在乳酸杆菌免疫赋活功能中可能发挥重要作用， 值得深入探讨。 1 4 肽聚糖的分子识别与信号传递通路的研究进展 免疫功能在机体抵抗病原微生物感染、预防癌症和维持健康中发挥着至关重要的作 用。但是，许多体内外因素会影响免疫功能的正常发挥，比如营养失调、年龄增长、体力 压力、精神压力或不良的生活习惯。因此，摄食具有免疫调节功能的食品是防止免疫失衡 的有效方法。人的胃肠道存在大量的共生有益菌，这些细菌是胃肠道或系统免疫稳态维持 不可缺少的组成部分，肠道正常菌群紊乱会导致口服免疫耐受丧失，甚至会引起系统性的 超敏反应。添加某些肠道共生菌的发酵食品有维持健康的作用。食品含有的有益细菌主要 是某些革兰氏阳性乳酸杆菌，大量研究表明乳酸杆菌具有免疫调节的作用，但是其作用机 制当前还不清楚。分子免疫学研究的一些新发现可以为乳酸菌免疫调节的机理提供一些线 索。j a n e w a y ( 1 9 8 9 ) 认为机体对病原的识别是通过模式识别受体( p r r s ) 介导的，这些 模式识别受体可以识别肽聚糖等病原微生物保守分子模式( p a t h o g e n a s s o c i a t e d m o l e c u l a rp a t t e r n s ，p a m p s ) ”“。b r u c eb e u t l e r ( 2 0 0 4 ) 研究认为，确切的讲“p a i p s ” 是所有微生物共有的，而并非只存在于病原微生物，许多微生物体都存在共有的保守分子， 它们对微生物的生理和生存至关重要，包括脂多糖、肽聚糖，鞭毛蛋白，甘露聚糖和病毒 r n a 等，先天性免疫细胞表面的p r r s ( 如t 0 1 1 样受体) 识别肽聚糖等p a m p s 并与之结合， 一旦结合则会激活n f k b 、a p 一1 、f o s 、j u n 等转录因子，这些转录因子则控制免疫反应基 因翻译表达，释放出大量效应分子( 如细胞因子) ，细胞因子协调先天性和适应性免疫反 应发挥作用，例如产生炎症反应，先天性免疫反应向适应性免疫转变则引起针对性的免疫 球蛋白释放或其它免疫反应”，利用脂多糖、肽聚糖等刺激免疫细胞会产生适宜的局部炎 症反应。从而可以起到调节机体免疫系统的作用。所以益生菌在引发机体的免疫反应时 必定是其细胞的保守成分被机体抗原呈递细胞识别而引发的，其细胞成分很可能是其发挥 作用的物质基础。 t o l l 样受体( t l r s ) 是当前研究比较清楚的一种p r r s ，t l r s 是通过分析哺乳动物基因 组于果蝇t o l l 蛋白基因的同源序列时发现的。脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁的主要组分， 现在已经有许多研究表明t o l l l i k er e c e p t o r4 ( t l r 4 ) 是脂多糖的t l r ：h o s h i n ok ( 1 9 9 9 ) 等发现t o l 卜l i k er e c e p t o r2 ( t l r 2 ) 介导着热灭活的革兰氏阳性菌和其细胞壁 组分及分枝杆菌p a m p s ，如细菌脂肽( 1 i p o p e p t i d e ) ，磷壁酸( l t a ) ，肽聚糖和可溶性肺结 核因子( s t f ) 的免疫反应5 “。根据目前的研究，p r r s 的作用模式是十分复杂的，不同的p r r s 江南大学硕士学位论文 在不同组织表达的差异很大，而同一家族的p r r s 识别的受体也是有差异的。大量研究表明 不同的微生物组成分子结合的p r r s 是不同的，所连接的信号通路也是不同的，同时，先天 性免疫被不同的微生物p a m p s 及不同组织划分为不同的特定形式。免疫基因的表达和机体 对感染的反应随微生物结构和生化组分的不同而不同。所以，微生物p a m p s 组分不同及从 不同途径进行免疫刺激对机体的反应将有什么影响，p a m p s 以不同方式接触p r r s 激活的免 疫信号通路是如何发展的，其最终导致的结果如何，是向有益的炎症发展还是向破坏性的 炎症发展，是很复杂的问题，这些问题的解决意义重大。首先，知道了肽聚糖等p a m p s 以 不同剂量、不同方式给予引起的后果及其相关的免疫信号通路才能对其应用进行辨证性的 指导，从而确定其正常发挥作用需要的条件，对其在食品或医疗中的应用起指导作用。也 可证明有益微生物和病原微生物p a m p s 和其引起的不同生理病理反应之间是否有联系。第 二，知道了先天性免疫的不同发展方向及向特异性免疫的转变相关联的信号通路，牵扯到 的作用因子，可以为抑制免疫通路的不良发展的药物提供设计的线索。第三，对p a m p s 刺 激后机体免疫相关基因及已知p r r s 的表达，免疫信号传导通路的发展进行研究也可以帮助 新的p r r s 的发现。 关于乳杆菌肽聚糖对免疫相关基因的调控作用至今仍鲜见报道。s e k i n e 等( 1 9 9 5 ) 的研究认为双歧杆菌完整肽聚糖能激活小鼠巨噬细胞，使其i l 一1 、i l 一6 及t n f 一的m r n a 表达增强。”1 。随着人类基因组学的发展，近年已从染色体上克隆出九条肽聚糖受体，部 分受体己完成测序工作。现已初步发现，t l r s n f - kb 介导肽聚糖等对机体的免疫调节 通路，但众多t l r s 对肽聚糖免疫信号的识别及其与n f kb 激活之间的复杂关系，以及肽 聚糖对免疫相关基因表达通路的调控机制，有待阐明。机体的免疫具有错综复杂的关系， 单一的生理检测指标无法综合，全面地研究其生命现象，基因芯片的应用，改变了以往总 采用单因素或多因素的分解分析方法，以一种综合、全面、系统的观点来研究生命现象。 1 5 立题意义和主要研究内容 大量研究表明乳酸杆菌具有免疫调节的作用，但是其作用机制当前还不清楚。t l r s 是p a m p s 先天应答的模式识别受体，目前己发现1 0 种，表达于多种细胞，如粒细胞、单 核吞噬细胞、树突细胞等。不同的t l r s 识别的p a m p s 可能不同，如t l r 2 主要识别脂蛋白 和肽聚糖，肽聚糖被t l r 2 识别后，启动胞内信号传导级联，产生炎性应答。 肽聚糖分子识别与信号传递通路的研究是阐明肽聚糖免疫调节作用机制的关键。传统 的免疫学手段应经不能全面深入的揭示肽聚糖免疫调节作用，在目前从分子水平上进行研 究是揭示肽聚糖作用机制最有说服力的手段，因此肽聚糖的研究必须结合分子生物学方 法。基因表达的变化是调控细胞生命过程的核心，因此，研究细胞或组织在不同状态下基 因表达的差异己成为分子生物学研究领域的热点之一。分子生物学技术的发展为从分子水 平上研究肽聚糖的作用机制提供了可能性和可行性。 基于以上认识，本论文拟从以下几方面开展乳杆菌肽聚糖的免疫活性及其作用机制研 第一章绪论 究 1 乳酸杆菌肽聚糖对小鼠非特异性免疫因子及细胞免疫因子的影响 2 利用现代分子生物学手段，研究乳酸杆菌肽聚糖对免疫基因及免疫通路的调控 在基因水平上探讨其免疫赋活的可能机制。 3 对乳酸杆菌肽聚糖信号传递通路进行初步探讨。 江南大学硕士学位论文 第二章乳酸杆菌肽聚糖对小鼠非特异免疫因子的影响 2 1 前言 免疫功能的正常对任何生物都十分重要，生物的免疫功能是生物在长期的进化过程中 与体内、外各种致病因子不断斗争中形成的，通过识别自身与非自身的大分子物质而起到 抵抗感染、维护机体自身稳恒和免疫监视作用“。 关于乳酸杆菌等消化道有益菌可提高机体的非特异性免疫功能已有较多报道，但有 关其组分，尤其是肽聚糖的生物学活性在哺乳类动物中的应用的研究则相对较少。孟凡伦 ( 1 9 9 9 ) 等报道日本对虾在摄食肽聚糖后，血清淋巴中酚氧化酶活力、碱性磷酸酶的酶活 力有显著提高o “；王秀华( 2 0 0 4 ) 等研究发现乳酸杆菌肽聚糖可提高南美对虾的酚氧化酶 活力”1 ；谷超( 2 0 0 4 ) 等研究则发现双歧杆菌完整肽聚糖可提高小鼠的溶血能力嘲3 。 本实验以不同剂量乳酸杆菌肽聚糖刺激小鼠，观察其对小鼠血清溶菌酶、血清中抗绵 羊红细胞抗体( 溶血素) 含量、碱性磷酸酶活力、机体的超氧阴离子的产生，超氧化物歧 化酶，谷胱甘肽过氧化物酶活力等的影响，进而探讨乳酸杆菌肽聚糖对小鼠机体非特异免 疫因子的影响。 2 2 材料和方法 2 2 1 实验材料 r p m i l 6 4 0 培养基 胎牛血清 谷氨酰胺 超氧化物歧化酶试剂盒 谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒 碱性磷酸酶试剂盒 绵羊红细胞( s r b c ) n b t 乳胶微球 其他试剂均为国产分析纯 2 。2 。2 实验仪器 生物显微镜 台式离心机 h z s h 水浴振荡器 7 2 1 分光光度计 g i b c o 产品 中国科学院上海生化所 华美生物工程公司 南京建成生物工程研究所 南京建成生物工程研究所 南京建成生物工程研究所 无锡市汇生试剂有限公司 s i g m a 公司 s i g 腿公司 日本o l y m p u s 上海精密科学仪器有限公司 哈尔滨市东联电子有限公司 上海第三分析仪器厂 第二章乳酸杆菌肽聚糖对小鼠非特异免疫因子的影响 超净工作台 超级恒温水浴锅 q l 一9 0 l 旋涡混合器 6 5 0 一6 0 荧光分光光度计 m u l t i s k a nm k 3 酶标仪 2 2 3 实验设计与处理 苏净集团安泰公司 上海市化学仪器总厂 江苏海门其林医用仪器厂 h i t a c h i 公司 美国t h e r m o 公司 健康b a l b c5 周龄小白鼠2 4 只，雌雄各半，随机分成3 组，每组8 只，分别作为对 照组，乳酸杆菌肽聚糖低剂量组，乳酸杆菌肽聚糖高剂量组。对照组腹腔注射无菌p b s o 5 m l 只，连续三天；低剂量组腹腔注射o 2 m g m 1 乳酸杆菌肽聚糖溶液o 5 m l 只，连续 三天：高剂量组腹腔注射1 0 m g ，m i 乳酸杆菌肽聚糖溶液o 5 m i ，只，连续三天。实验第四 天眼球放血处死小鼠，离心( 1 5 0 0 r m i n 、1 0 r i l i n ) ，取上层血清进行各项指标的测定。 眼球放血处死动物，常规消毒腹部皮肤，以冷的d h a n k s 液灌洗腹腔，洗出液 1 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，去上清，沉淀以无血清r p m i l 6 4 0 洗二次，重悬即为腹腔渗出细胞 悬液，调细胞数为l 1 0 6 m l ，备用。 2 2 4 血清溶菌酶活力测定 ( 1 ) 血清制备：眼眶采血，血液置室温中凝固l 小时，置4 冰箱放置数小时析出血清。 将血清全部倾入离心管。在4 下、2 5 0 0 r m i n 离心3 0 m i n ，取上清液即血清。 ( 2 ) 待测血清酶液：将血清( o 2 m 1 ) 用l 1 5m o l lp b 溶液( o 2 m lp h = 6 2 4 ) 对倍稀释 作为待测血清酶液。混匀，4 保存。 ( 3 ) 底物：以自制的肽聚糖作为底物。 操作方法： ( 1 ) 底物用1 1 5m o l 几的p b 缓冲液( p h = 6 2 4 ) ，配成一定浓度的悬液( a 。a o 6 ) 。 ( 2 ) 取3m l 该悬液与1 0 0 u l 待测血清酶液于试管中混匀( 冰浴) ，于4 5 0 n m 测a 。值。 ( 3 ) 然后置于3 7 ，1 2 0 r m i n 水浴振荡器中保温3 0 m i n ，取出后立即置于冰浴中l o m i n ， 以终止反应。测a 值。 ( 4 ) 溶菌酶活力u 。计算：每毫升酶液3 0 m i n 使底物a 。降低0 1 定为1 个酶活单位。 2 2 5 血清中抗绵羊红细胞抗体( 溶血素) 含量1 5 7 j ( 1 ) 用生理盐水将血清稀释1 0 0 倍。在0 下，吸取l m l 稀释血清于试管中，加入0 ，5 m l l o 的绵羊红细胞，再加入1 m l1 0 豚鼠血清( 补体来源) 混合。置3 7 0 c 恒温水浴中保温3 0 m i n ， 冰浴终止反应。 ( 2 ) 以2 0 0 0r m i n 离心1 0 m i n ，取l m l 上清液，加3 m l 都氏试剂，混匀后静置l o m i n ，在5 4 0 n m 波长处测吸光度( o d ) 值。生理盐水作为空白对照测吸光度( o d ) 值。 ( 3 ) o 2 5 m l 绵羊红细胞，用都氏试剂稀释至4 m l ，摇匀后静置1 0 m i n 。以2 0 0 0r m i n 离心 l o m i n ，取上清液于5 4 0 n m 波长处测吸光度( 0 d ) 值，作为绵羊红细胞半数溶血时的吸光度值。 江南大学硕士学位论文 按下式计算绵羊红细胞半数溶血值c h 。作为血清中抗s r b c 抗体( 溶血素) 含量： c h 。= ( 样品0 d 值s r b c 半数溶血o d 值) 样品稀释倍数 2 2 6 碱性磷酸酶活力的测定 酶活力的测定测定按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行。 2 2 7 超氧阴离子的测定 参考f e r r a n d e z 的方法。取2 5 0 u l 腹腔渗出细胞悬液与等量的n b t ( 以d h a n k s 液配 制成1 m g m 1 ) 溶液，5 0ul 乳胶微球溶液混合，3 7 水浴6 0 分钟，1 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ， 去上清，沉淀以二氧杂环己烷萃取剩余的n b t ，上清夜在5 2 5 n m 处测定吸光( 0 d ) 值。 2 2 8 超氧化物歧化酶，谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定 酶活力的测定测定按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行。 2 2 9 数据处理 用s p s sv e r l o 0 中的o n ew a ya v o n 进行方差分析，并用l s d 法进行多重比较。 2 3 结果与分析 2 3 1 乳酸杆菌肽聚糖对小鼠血清溶菌酶( l s z ) 活力的影响 各组小鼠血清溶菌酶活力如图2 1 。结果分析显示，对照组与低剂量组之间血清溶 菌酶活力差异显著( p 0 0 5 ) ，与高剂量组之间差异极显著( p o 0 1 ) ，低剂量组与高剂量 组之间差异显著( p o 0 5 ) ，表明肽聚糖刺激小鼠后，对血清溶菌酶活力产生明显的增强 作用，且高剂量组效果更为明显。 5 0 4 0 v r3 0 蜒 瘟2 0 翘 缝1 0 姿 鲁0f ， l 对照组 2 低剂盘组高剂量组 图2 一l 肽聚糖对小鼠血清溶菌酶活力的影响 f i g 2 一le f f e c t so fp go ns e r 岫l y s o z y ea c t i v i t yi nm i c e 2 3 2 乳酸杆菌肽聚糖对小鼠溶血素含量的影响 各组小鼠机体溶血素含量如图2 2 。结果分析显示，各实验组之间溶血素含量差异 极显著( p o 0 1 ) ，表明肽聚糖刺激小鼠能显著增加机体的溶血素含量。 l o 第二章乳酸杆菌肽聚糖对小鼠非特异免疫因子的影响 l t i l 对照组 低剂量组高剂量组 图2 2 肽聚糖对小鼠血清中溶血素含量的影响 f i g z 一2t h ee f f e c to f p go na n t i - s r b ca 1 1 t i b o d yi nm i c e 2 3 3 乳酸杆菌肽聚糖对小鼠碱性磷酸酶活力的影响 各组小鼠机体碱性磷酸酶活力如图2 3 。结果分析显示，对照组与低剂量组之间碱性 磷酸酶活力差异极显著( p o 0 1 ) ，与高剂量组之间差异也是极显著( p o 0 5 ) ，表明肽聚糖刺激小鼠后，小鼠机体内超氧化物歧化酶 活力并未发生变化。 阳帅加m 0 os5)|塌扣瑶皇晕婆鲁 江南大学硕士学位论文 邑 器 u j 茸 8 ， 对照组 2 低剂量组高剂量组 图2 4 肽聚糖对小鼠对小鼠机体超氧阴离子产生的影响 f i g 2 4e f f e c t so fp go ns u p e r o 羔i d ea n i o np r o d u c t i o i nm j c e 2 0 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0f 。：， 对照组低剂量组 高剂盈组 图2 5 肽聚糖对小鼠超氧化物歧化酶活力的影响 f i g ，2 - 5e f f e c t so f p go ns u p e r o x i d ed i s m u t a s ea c t i v i t yi nm i c e 2 3 6 乳酸杆菌肽聚糖对小鼠谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响 各组小鼠机体谷胱甘肽过氧化物酶活力如图2 6 。结果分析显示，各实验组之间谷 胱甘肽过氧化物酶活力差异不显著( p o 0 5 ) ，表明肽聚糖对小鼠机体内谷胱甘肽过氧化 物酶活力作用不明显。 。1 5 。 盏1 0 0 耋 i 5 0 跨 0f - ， 对照组 2 低剂量组高剂量组 图2 6 肽聚糖对小鼠谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响 f i g 2 6e f f e c t so fp go ng l u t a t h i o n 。p e r o x i d a s ea c t i v i t yi m i c e 第二章乳酸杆菌肽聚糖对小鼠非特异免疫因子的影响 2 4 讨论 非特异性免疫是指无特殊针对性的对病原体的天然抵抗力。它是在生物进化过程中逐 步形成的，不只是某个个体所特有的，而是种系所共有的，可遗传的。它与机体的组织结 构和生理功能有密切关系。在抗感染过程中，它发挥作用快、范围广泛，是抗感染的第一 道防线。非特异性免疫主要包括下述五方面：皮肤、粘膜和屏障结构的屏障作用，淋巴组 织( 淋巴结、脾等) 的过滤作用，血清、体液和组织分泌物的杀菌作用，单核一吞噬系统 的吞噬作用，炎症反应的病理防御作用。小鼠机体在抵抗入侵的病原生物过程中，主要依 靠其非特异免疫防御系统来清除异物，该系统由参与免疫反应的血淋巴细胞和体液因子组 成，在多种非特异免疫因子中，溶菌酶活力，溶血素水平，磷酸酶，超氧化物歧化酶、谷胱 甘肽过氧化物酶等酶活力和单核细胞的吞噬指数高低常被用做衡量机体免疫活力高低的 参照指标。 腹腔巨噬细胞是在种系进化过程中较早出现的免疫细胞，作为一种非常活跃的非特异 性防御细胞，对外来病原菌、病毒及体内的肿瘤细胞具有杀伤作用，担负着机体的非特异 性免疫功能。正常条件下，巨噬细胞处于静息状态，一经激活。在功能上可出现显著变化。 马西艺( 2 0 0 3 ) 报道乳酸杆菌肽聚糖能激活小鼠腹腔巨噬细胞，增强其杀瘤活性，分泌多 量的细胞毒性效应分子m ，。 溶菌酶是由中性粒细胞、单核吞噬细胞合成并释放的物质之一，是吞噬细胞杀菌的物 质基础，可以作为评价单核细胞吞噬功能的专一标志酶。c a s t r o 等人提出，血清溶菌酶 含量的高低，能反映腹腔巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的能力”3 。k o k o s h i s 等认为，血清溶菌 酶含量可作为衡量腹腔巨噬细胞免疫功能的一项指标6 ”。其具体作用机制是溶菌酶能够破 坏溶解革兰氏阳性细菌细胞壁粘性多肽中的乙酰氨基多糖，并使之裂解被释放出来，形成 一个水解酶体系，从而破坏和消除侵入体内的异物，提高机体的