（动物遗传育种与繁殖专业论文）mPRβ在猪卵母细胞体外成熟过程中的表达和作用的研究.pdf

m p rb 在猪卵母细胞体外成熟过程中的表达和作用的研究 摘要 孕激素膜受体( m e m b r a n ep r o g e s t i nr e c e p t o r s ，m p r s ) ，是最近发现 的一个大的蛋白家族成员，包括q 、b 和y 三种亚型。以往研究显示，它 们在低等脊椎动物卵母细胞成熟过程中起着重要的作用。但是，到现在为 止，还没有它们在哺乳动物卵母细胞成熟过程中的表达和作用的相关研究。 为了检测m p rbm r n a 是否在猪卵母细胞一卵丘细胞复合体 ( o o c y t e c u m u l u sc o m p l e x e s ，c o c s ) 中表达，本实验利用g e n e b a n k 上猪 m p rb 的c d n a 序列设计引物，扩增出了一段1 4 4 7 b p 序列，并将所得序列进 行了测序和b l a s t 比对。结果显示，所测得的序列与g e n e b a n k 上c d n a 序 列的同一性为1 0 0 ，说明m p rbm r n a 在猪的c o c s 中有表达。随后，用半定 量r t - p c r ，分析了猪c o c s 体外成熟过程中，o h ，1 2 h ，2 0 h ，3 6 h 和4 4 h 五 个时期m p rbm r n a 的表达情况。结果显示，2 0 h 和3 6 hm p rbm r n a 的表达量 显著高于o h ( p o 0 5 ) ，其它各组间没有显著差异。在整个成熟过程中，m p r bm r n a 的表达呈先升高后降低的趋势，并在2 0 h 达到峰值。为了研究促性 腺激素对m p rbm r n a 的表达是否有影响，将成熟培养液中的l h 或f s h 去除。 结果显示，去除培养液中的l h 或f s h ，对m p rbm r n a 的表达没有显著的影 响。 以上在转录水平上对m p rb 在猪c o c s 中的表达进行了分析。为了进一 步在翻译水平上研究m p rb 在猪c o c s 中表达的规律，利用m p rb 的一段多 肽制备了抗体，进行蛋白分析。w e s t e r nb l o t t i n g 结果显示，在o h 没有 m p rb 表达，在2 0 h 有高的表达量，而在4 4 h 其表达量又降到很低水平。三 个时期的表达量之间差异显著( p 0 0 5 ) 。免疫荧光分析显示，m p rb 至少 部分定位在卵丘细胞的膜上。而在小鼠的胎儿成纤维细胞( m o u s ee m b r y o f i b r o b l a s t s ，m e f s ) 中，m p r1 3 主要定位于内质网上。在猪c o c s 的成熟培 养液中添加1 0 的抗血清m p r1 3 抗体，可以明显地抑制卵丘细胞的扩展 ( p o 0 5 ) 。最后，通过生物信息学分析发现，这个蛋白可能是通过胞吐参 与了卵丘细胞扩展过程。 总之，m p r1 3m r n a 和蛋白都在猪c o c s 体外成熟过程中，呈特定的表达 模式。其亚细胞定位具有组织特异性，并且该蛋白与卵丘细胞的扩展相关。 关键词：孕激素膜受体b ；猪卵母细胞一卵丘细胞复合体；体外成熟； 表达模式；亚细胞定位；卵丘细胞扩展 e x p r e s s i o na n df u n c t i o n o fm e m b r a n e p r o g e s t i nr e c e p t o rbi np i go o c y t e s m t u r e d 肼玎豫d a b s t r a c t m e m b r a n ep r o g e s t i nr e c e p t o r s ( m p r s ) w e r et h em e m b e r so fap r o t e i n f a m i l yi s o l a t e dr e c e n t l y m p r si n c l u d e dt h r e ei s o f o r m s ，w h i c hw e r en a m e d m p r a ，ba n d 丫r e s p e c t i v e l y a c c o r d i n gt op r i o rs t u d i e s ，t h e yp l a yr o l e s i n r e g u l a t i n gt h eo o c y t e sm a t u r a t i o no fl o w e rv e r t e b r a t e s h o w e v e r , a sf a r a si k n o w , t h e r ew e r en oa n yd a t ar e p o r t e da b o u tt h e i re x p r e s s i o na n df u n c t i o ni nt h e p r o c e d u r eo fi nv i t r om a t u r a t i o no fm a m m a l i a no o c y t e i no r d e rt od e t e c tw h e t h e rt h em p p - mm r n ac o u l de x p r e s si np i g o o c y t e c u m u l u sc o m p l e x e s ( c o c om a t u r e di n v i t r o ，r t - p c ra n dd n a s e q u e n c i n gw e r eu s e d t h ep c rp r o d u c tw i t ht h ee x p e c t e ds i z eo f1 4 4 7 b pw a s o b t a i n e du s i n gp i gm p r bs p e c i a lp f i m e r s t h eb l a s tr e s u l ts h o w e dt h a tt h e s e q u e n c eo b t a i n e di nt h ee x p e r i m e n tw a sap a r to fm p r b ，w h i c hc o n f i r m e dt h e e x p r e s s i o no fm p r bm r n a i np i gc o c s t h ed y n a m i cr u l eo fm p r l 3m r n a w a sa l s oa n a l y z e db ys e m i q u a n t a t i v er t - p c r t h ec o c sm a t u r e df o ro h ，1 2 h ， 2 0 h ，3 6 h ，4 4 hr e s p e c t i v e l yw e r ed i v i d e di n t o 讯eg r o u p s t h e r e s u l to f s e m i q u a n t a t i v er t - p c rs h o w e dt h a tt h em p r be x p r e s s i o nl e v e l so f2 0 ha n d 3 6 hg r o u p sw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fo hg r o u p ( p o 0 5 ) t h e r ew a s n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea m o n gt h eo t h e rg r o u p s w h e nt h el ho rf s h e x c l u d e df r o mt h em a t u r a t i o nm e d i u m ，t h ee x p r e s s i o no fr n p r 8w a sn o ta f f e c t e d ， r i w h i c hi n d i c a t e dt h ee x p r e s s i o no fm l l 如w a sn o tr e g u l a t e db yg o n a d o 仃o p h i n i no r d e rt oa n a l y z et h ee x p r e s s i o no fm p r i i nt h et r a n s l a t i o n a ll e v e l ，t h e a n t i m p r bs e r u mw a sp r e p a r e d s u b s e q u e n tw e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i si n d i c a t e d t h a tm p r bp r o t e i nw a sn o td e t e c t e da to hd u r i n g m ，h o w e v e r ，t h e r ew a sa h i 曲l e v e la t2 0 ha n dt h e r e a f t e rd e c r e a s e dt oal o wl e v e la t4 4 h t h e r ew e r e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e sa m o n gt h et h r e et r e a t m e n t g r o u p s ( p o 0 5 ) t h e i m m u n o f l u o r e s c e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a t 珈l p r1 3w a sl o c a t e da tt h ep l a s m a m e m b r a n eo fc u m u l u sc e l l s h o w e v e r , i nm o u s ee m b r y of i b r o b l a s t s ，m p rbw a s l o c a t e da tt h ee n d o p l a s mr e t i c u l u m w h e n1 0 a n t i m p r8s e r u mw a sa d d e d i n t ot h em a t u r a t i o nm e d i u m , t h ec u m u l u s e x p a n s i o n o f p i g c o c sw a s s i g n i f i c a n t l yi m p a i r e d 口 o 0 5 ) ，i i h er e s u l to fb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i si m p l i e d t h a tt h ep r o t e i nm i g h tb ei n v o l v e di nc u m u l u s e x p a n s i o nt h r o u g he x o c y t o s i s i nc o n c l u s i o n ，m p r bc a nb ee x p r e s s e dw i t has p e c i a lp a t t e r ni np i gc o c s t h es u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no fm p r bi sv a r i e df r o mt i s s u et ot i s s u ea n dt h e p r o t e i ni sr e l a t e dt oc u m u l u se x p a n s i o n k e yw o r d s ：m e m b r a n e p r o g e s t i nr e c e p t o r1 3 ；p i go o c y t e c u m u l u sc o m p l e x e s ； i nv i t r o m a t u r a t i o n ；e x p r e s s i o np a t t e r n ；s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n ；c u m u l u s e x p r e s s i o n i v 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均己在论文中明确说睨并致谢。 论文作者签名： 仫物演五讶年月侈日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 囤卸时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：厩恒善导师 o 馥年e 黾i ：日 m p rb 在猪c ( ) c s 体外成熟过程中衷越乖，作用的研究 第一部分文献综述 l 广西大掌硬士掌位论文m p rb 在猪c ( ) c s 体外成熟过租中表达和作用的研究 第一章孕激素膜受体的研究进展 孕激素是一种重要的类固醇激素，它在体内主要由黄体细胞合成。卵泡内膜细胞和 妊娠时的胎盘也能产生。另外，孕激素还是雌激素和雄激素的前体n 1 ，因而在生殖和类 固醇发生过程中起着重要的作用。具体说来，这些作用包括妊娠的维持，孕期乳房的发 育，发情期对下丘脑的反馈性作用等。 在过去3 0 年中，积累的资料已经证实，孕激素( 其它类固醇激素也是如此) 主要 通过简单扩散进入靶细胞，然后通过调节靶基因的转录来发挥生理作用。在孕激素起作 用的细胞中，存在着特异的孕激素核受体，这种受体与孕激素结合后，发生构象改变， 并且从细胞质中转移到细胞核中来发挥生理作用圆。但是，与其它类固醇一样，孕激素 也存在着很多的极其迅速的作用( r a p i da c t i o n s ) 豫帕，这些作用在l h 内或几分钟内 就发生，因而不能用经典的核受体的作用模型来解释。为了阐明孕激素和其它类固醇激 素快速作用的机理，在最近3 0 年中，学者们做了大量的工作。其中，膜受体一直是研 究者最感兴趣的方向之一。这篇综述就是对孕激素膜受体研究的部分总结，特别是新发 现的孕激素膜受体( m p r s ) 的研究进展情况。 1 1 经典的孕激素受体及其作用方式 为了说明孕激素膜受体的不同，有必要先介绍一下经典的孕激素受体及其作用方 式。经典的类固醇激素受体是一个大的超家族。这个家族包括糖皮质激素受体，雄激素 受体，孕激素受体，雌激素受体和正反式维甲酸的受体等乜1 。所有的这个家族的成员都 有两个重要的功能域：d n a 结合功能域，配基结合功能域1 。孕激素受体包括两种亚型， 孕激素受体a 和b ( p r o g e s t e r o n er e c e p t o raa n db ，p r b ) 嘲。其中入的p r b 由9 3 3 个氨基酸组成，p r 缺少n 端1 6 4 个氨基酸，但是其余部分与p 相同m 。a 型和b 型之 问可以形成二聚体，可以形成三种形式的二聚体：a r 、b b 和a b 口1 。由于二聚化，导 致了识别序列的二次重复性，最终导致受体可以与d n a 高亲和性的结合同。 p r s 起作用的机制与其它类固醇相似。孕激素进入靶细胞后，先与存在于细胞质中 的受体结合；这种结合导致了p r s 与热休克蛋白9 0 ( h s p 9 0 ) 的结合被打破，使得p r s 成为游离的单体；这种游离的单体可以通过核膜上的转运子移位到细胞核中。在细胞核 内，p r s 以二聚体的形式与r n a 聚合酶i i 形成复合物，并结合到d n a 激素应答元件上， 2 广西大学凋匿七掌位论文m p rb 在猪c o c s 冀汐卜成熟过程中表述和作用的研究 启动基因的转录，从而发挥特定的生理作用脚。 p r s 的分布范围广泛，包括子宫内膜珀1 ，胎膜阳1 ，乳腺n 帕，中枢神经系统n k 埘，各种 生殖系统肿瘤等n 妇。因而，p r s 现在也作为可能的认知与行为相关基因，动物生殖相 关的基因，各种肿瘤潜在的标记物和治疗靶点基因而被广泛研究。 1 2 孕激素的迅速的非基因组作用 类固醇非基因组作用的研究，最早可以上溯到上个世纪四十年代。那时，s e l y e 就 发现了多种类固醇的非基因组作用n 羽。随后的时间中，学者一直关注这个问题，并作了 大量的研究探索。因为用单纯的孕激素孵育，就可以诱导两栖类卵母细胞减数分裂的恢 复，因此两栖类一直是研究孕激素作用的良好模型n 盯。孕激素诱导卵母细胞成熟的恢 复，并不依赖于转录的启动，即在非洲爪蟾卵母细胞成熟的恢复过程中，蛋白的合成是 必须的，而r n a 的合成则不是必须的n 。将去核卵母细胞与孕激素孵育，同样可以发生 类似减数分裂的分裂过程嗍，这进一步证实了，核受体的转录功能对于分裂并不是必须 的。在另一种两栖类r a n a 中，用孕激素- b s a 的复合物( 一种研究孕激素膜作用的常用 方法，这种物质不能透过细胞膜) ，可以诱导r a n a 的卵母细胞发生多种反应，包括3 0 分钟内p k c 的升高、1 0 分钟内d g 含量和i p 3 k 活性的升高、g v b d 的发生等，更重要的 是，这些作用并不能被孕激素核受体的颉抗剂r u 4 8 6 所阻断瞳。以上的研究充分证实在 两栖类卵母细胞成熟过程中，源于细胞膜的非基因组作用确实至关重要。 在其它物种和其它组织细胞中，孕激素也起着重要的非基因组作用。t e s a r i k 等发 现，孕激素可以通过与人精子膜上的受体结合，引起钙内流及其所引发的胞吐作用嘲。 孕激素还可以通过非基因组作用调节哺乳动物性行为渊。b r 锄l e y 珏町在一篇综述中，对 多种孕激素的非基因组作用作了详细的描述( 见图i - i ) 。 1 3 曾经发现的多种孕激素膜受体 在孕激素非基因组作研究过程中，人们曾发现多种与孕激素有特异亲和力的蛋白， 这些蛋白包括g a b a 受体，孕激素膜受体组分1 ( p 4m e m b r a n er e c e p t o rc o m p o n e n tl ， p g r m c l ) ，孕激素膜受体( m e m b r a n ep r o g e s t i nr e c e p t o r s ，m p r s ) 。还有一些研究者发 现，孕激素核受体( p r s ) 也可以移位到细胞膜上，并且介导一些孕激素非基因组作用。 下面将对g a b 受体，p g r m c l ，和p r s 移位到细胞膜上所起的作用进行介绍。关于m p r s 的研究，将在后面详细介绍。 3 m p rb 在猪c o c s 体外成熟过程中笨这和作用的研究 表1 - 1 图中显示了多种1 卜基因组作用，包括p k c i p 3 k 通路的激活，i d a p k 通路的激活，n a 和k 离 子通道的激活，钙的内流等1 2 制。 f i g u r e1 - 1 i nt h ef i g u r e ，m u l t i p l en o n g e n o m i cf u n c t i o n so fp r o g e s t e r o n ew e r ed e s c r i b e d t h e s ef u n c t i o n s i n c l u d e dt h ea c t i v a t i o no ，fp k c f i p 3 ka n dm a p kp a t h w a y s ，t h ea c t i v a t i o no fn aa n dki o nc h a n n e l s ， c a l c i u mi n f l u xa n ds oo n t “i 1 3 1g a b a , 受体 g a b a 受体是一种介导y 一氨基丁酸作用的生理性受体，存在于细胞膜上。y 一氨基 丁酸是一种常见的抑制性神经递质，同g a b a 受体结合后，可以引起氯的内流和神经细 胞膜的超极化，从而达到抑制细胞兴奋性的目的心引。 早期的研究显示，孕激素可以增加大鼠中枢神经系统中特定部位的g a b a 受体数量 心。随后，m a r i ad o r o t am a j e w s k a 发现，孕激素的类似物可以竞争性地抑制多种镇静 药物的作用，而且是通过抑制氯离子的内流来实现的乜引。这就提供了一种假设，即孕激 素及其类似物，或者它们的代谢产物，可以竞争性地与g a b a 受体结合。随后的研究给 出了更多的证据来支持孕激素或其代谢产物，可以与g a b a 。受体结合而发挥生理作用 雎8 。川。这时人们提出了这样的问题：是不是其它的孕激素始于膜的作用或非基因组作用， 也是由g a b a 受体介导的呢? 4 m p r1 3 在稿rc ( ) c s 体外成囊。过稿l 中毒口冬和作用的研究 为了解答上面的闯题，一些繁殖领域的学者作了相关的研究。e r d o 研究发现，在卵 巢中，确实存在g a b 受体的亚单位嘞1 。但是，利用g a b 氏受体特异的阻断剂，并不能阻 止孕激素的抗颗粒细胞凋亡的生理作用，这说明，在卵巢中，孕激素的非基因组作用 不是由g a b a 受体介导的。因此，关于g a b & 受体是否为生理条件下的孕激素非基因组受 体的观点，仍需大量的实验证实。 1 3 2p g r m c l m e y e r 等人，在猪的肝细胞膜上分离出一种2 8 k d a 的蛋白，这种蛋白可以在体外与 孕激素结合m 1 。随后，这个蛋白被部分测序，其c d n a 也被分离和测序，从c d n a 推测出 的蛋白序列可以推知，该蛋白含有一个跨膜域- 后来，这个蛋白被命名为孕激素膜受 体组分l ( p g p 瑚c 1 ) 嘲。用免疫组织化学的方法，p e l u s o 发现，这个蛋白在大鼠的卵巢 中也有表达，其表达量受e c g 调控；其亚细胞定位也很特别，在未经e c g 处理时，位于 细胞核的周围，经e c g 处理后，则移位到细胞膜上；并且，在黄体细胞中，该蛋白高表 达；这些说明这种蛋白可能是一种潜在的孕激素膜受体删。在功能方面，p g r m c l 可以在 大鼠卵巢中起到抗颗粒细胞凋亡的作用。在神经系统中，也有这种蛋白的分布( 被命 名为2 5 d x ) 。在脊髓的腹角中，这个蛋白定位在神经细胞的膜上；在脊髓受到损伤时， 孕激素可以使这个蛋白及其r n a 上调，而经典的核受体，在相同的情况下则下调；因此 作者推测，这个蛋白对脊髓神经元的保护和再生可能起到重要的作用嘲。 但是，对于这个蛋白是孕激素膜受体的观点，也有一些不同的意见。在一篇综述中， m a l l e r 列举了几处存在疑问的地方：1 ) 该蛋白与孕激素的亲和力不高；2 ) 原核表达 的这种蛋白与孕激素没有亲和力；3 ) 向非洲爪蟾卵母细胞中注射该蛋白的m r n a ，所表 达的蛋白不定位在膜上，也不影响卵母细胞的成熟h 町。有学者进一步指出，这个蛋白主 要定位在内质网上，而不是细胞膜上h 。这说明这个蛋白是否介导孕激素膜受体生理功 能的受体，还有待进一步研究。最近，一些研究者发现，这个蛋白分布极为广泛，包括 从动物，植物到微生物h 羽。这个蛋白可以与细胞色素酶p 4 5 0 形成复合物，并且调节该 酶的功能“巩枷：还有人认为它与膜泡运输有关池1 。这些新的观点，为这个蛋白功能的研 究提供了方向。 1 3 3p r s 移位到膜上介导非基因组作用 孕激素核受体移位到膜上，并引发非基因组作用，也是以非洲爪蟾卵母细胞成熟过 程为模型研究的。在2 0 0 0 年，两个研究组从非洲爪蟾的卵母细胞中克隆到了与哺乳动 物p r s 相似的孕激素受体h r 删。超表达这个受体，可以增加卵母细胞对p 4 的敏感性嘛删； 5 m p r8 在猪c o c s 体外成熟过程中表达和作用的研究 利用p r 的反义核苷酸处理，可以减弱孕激素的作用嘲。p r 这种诱导卵母细胞成熟的作 用，是与姒p k 相关联，并且激活了p 1 3 k 通路h 刀。 这些实验说明，p r 很可能是位于细胞膜的附近，或者在细胞膜上。后续的实验证实 了这种假设。m a r t i n e z 等，将肉豆蔻酰化和棕榈酰化位点加到p r 的氨基端，可以明显 的增加p r 的膜定位，更重要的是，可以明显地增强p 4 诱导成熟的作用嗍。m a r t i n e z 等随后的实验显示，是p r 的配基结合域而不是氨基端，与膜定位有关。这说明，至 少部分的非基因组作用，是由移位到细胞膜的孕激素核受体所介导的。 1 4 孕激素膜受体( m p r s ) 的发现和研究进展 ， 上述蛋白，都能部分解释孕激素的非基因组作用，但是以上哪一种蛋白也不能完全 解释所有的孕激素非基因组作用。这时，z h u 等从鱼、人、小鼠等多种物种的多种组织 中，分离得到了孕激素膜受体( m e m b r a n ep r o g e s t i nr e c e p t o r s ，m p r s ) 的m r n a ，并对 它们的全序列进行了克隆测序，并对蛋白的构、可能的功能、物种间的进化进行了分析 魄飘3 。这类蛋白具有七次跨膜结构，与g i 相偶联，体外表达的这种蛋白与孕激素有较 高的亲和力和特异性随副1 。所有这些，使学者们认识到，一种可能的重要孕激素膜蛋白 被分离出来了。下面将具体介绍这类蛋白的研究进展。 1 4 1 孕激素膜受体的分类及其结构特性 z h u 等在2 0 0 3 年，首先在斑点鳟的卵巢中发现一种从未发现过的基因，这种基因编 码的蛋白满足以下七种特征：正确的结构、组织特异性、细胞分布特异性、类固醇结合、 信号转导、激素调控和生物学稳定等类固醇膜受体的作用、计算机模型预测显示这种蛋 白具有七个跨膜域删。n o r t h e r nb l o t 分析显示，这种n d 王n a 只存在于脑和生殖系统，抗 体分析显示，这种蛋白只存在于生殖组织细胞膜上；用大肠杆菌表达系统生产的重组蛋 白，与孕激素有高亲和力、可饱和性和特异的单个结合位点；在转染的哺乳动物细胞中， 孕激素可以改变信号传导通路、激活m a p k 、抑制腺苷酸环化酶，并这种受体对于腺苷酸 环化酶的抑制作用对百日咳毒素敏感，说明这种受体可能与一种抑制性g 蛋白相偶联； 孕激素和促性腺激素都可以调控斑点鳟卵巢中该基因m h n a 和蛋白表达水平，受体的量 与孕激素的浓度和卵母细胞的发育时期相关；因而推测它可能与抑制性g 蛋白相偶联， 并且抑制孕激素诱导的卵母细胞的成熟；综合这些结果，可以推测，这种鱼蛋白是一种 孕激素膜受体，它介导诱导卵母细胞成熟的孕激素非经典作用侧。 同时，z h u 等在多种物种上，包括人、小鼠、猪、非洲爪蟾、斑马鱼、河豚等分离 到了与斑点鳟相似的m r n a ：它们的核酸序列，氨基酸序列和蛋白结构都与斑点鳟m p r 6 m p rb 在猪c o c s 体外成熟过程中表达和作用的研究 相似；根据不同物种的c d n a 序列和氨基酸序列的相似性分析，将孕激素膜受体分为三 个大类，孕激素膜受体a 、p 和y ( m e m b r a n ep r o g e s tinr e c e p t o r s 。【，pa n d ，m p r 伐，p a n dt ) 。计算机结构分析结果显示，这些孕激素膜受体，都有7 个跨膜域，这三种亚型 的差别主要在于8 个，1 6 个，3 8 个特征性的氨基酸上的不同。m p r - q 的特征性的氨基 酸位点在胞外环( 约占胞外环的6 3 ) ，而m p r b 的特征性位点在n 一端( 约占n 端的2 0 ) ， 跨膜区( 约占跨膜区的4 0 ) ，胞外环( 约占2 7 ) ，胞内环( 约占1 3 ) ，而i i l p r y 则主 要在跨膜域( 约占8 2 ) ，见图1 - 2 ；人c i ，b ，y 的转录体的大小从2 8 到5 8 k b ，并 且在生殖，神经，肾和肾上腺等不同的组织有不同的分布。用大肠杆菌生产的重组的 人q ，y 和小鼠的1 3 对孕酮有高亲和力；进一步分析显示，y 对于孕激素的结合是特 异的，并具有快速的结合和解离。经大肠杆菌表达的重组的蛋白与孕激素的结合力的试 s u r f a c e c o o h 。i i 譬_ p r c p o l e dm o d e lf r n i e o no 士e 址贰r 。u tp u 翟 j v e 一阳t n 椭ep l a s am e m b r o n eb a r e do n 畸d r o p h d 记be n d ，h a 7 9 no f 小e m ：n c 敬i d 他f d u c a n a f z e db y 巧v 劭e a c h 摹r c l cr e p r 黔e n ；so n eo n ：n oa ( ! dr e s ；d u er e s ；d u e s ；d e r n l c a ! n 豫t r 。u t p r aa n d 击c cc 士e r ，n 出哺：e p r , a r s4 他：n d 江5 翟db ：h e f i u e dc o i o r e dc ir c i e t a r ，；n c 贰：dr e s ；d u e s d ；a g n 扰；c 酽：h 3 d a d e 酊e5 ：p “ o n 56 8 f 刁，t 3 3 ( 鼬，2 1 5 f s ) ，2 7 9 f o ，1 1 0 f y ) 3 1 1 f 日3 1 3 l ja n d3 2 拿f 订( 专| l e d b l a c kc l r d e s ) y 小o w ；矗p o ：e n t 。 s ：e 耐n l ：n k e dg i y c o 野i - o n ac y s ：e i n er e , d u e o t h e p r o p o s e d m o d e l s c r 咖t m p r $ a n d 孵p r 玳v e r y 一i a r w ；：h l a r g e n - ：e r 钟5 n 引a n d ；e c o n de x a a c e l l u l a r i o = # d o m ；n s ，a n da i h o nc - e r mt n ad o a 纳f n o ：s h o w n ) a l n ；n oa c ；dr e s ；d u e sd ：a g n c s ! ； ( o f 一昨3 = 3 f e 蕺p o s i t i c r 任6 “， 1 le n 越 l ，器 v j 1 0 2 l ) 1 1 4 “i 鞯 s j 1 6 7 ( s l2 0 3c r ，2 0 4 ( p ) 2 0 5 一，2 0 6 l p ) ，2 13 r j ，z 6 6 l v ) ，j 西( s ，3 2 8 f r n ：h e n ：吖n ；n j ie n d h u r r 墟n 仃p r 3 图卜2 计算机预测的m p rq 的跨膜域畸。 f i g u r e1 - 2 t h et r a n s m e m b r a n ed o m a i n so fm p r a l j j 试验显示，孕酮对小鼠的m p r - b ，人的m p r - q ，m p r - y 都有高的亲和力，而m p r 与雌 激素，雄激素和皮质激素都有极低的或没有亲和力。所有的这些，都符合孕激素膜受 体的特征。因此，研究者将其命名为孕激素膜受体( m e m b r a n ep r o g e s t i nr e c e p t o r s ， m p r ) 。 1 4 2m p r s 所属的蛋白家族 t a n g 等人对通过m p r s 的同源性的分析，将这组蛋白归类为孕激素和脂类受体 m p rb 在猪c 0 c s 体外成熟过程中表达和作用的研究 ( p r o g e s ti na n da d i p o qr e c e p t o r s ，p a q r ) 家族魄1 。这个家族一共包括l l 亚类蛋白， 所有的1 1 类蛋白都在人上有表达。这个家族的成员的特征是含有一个溶血酶原的结 构域( h e m o l y s i n d o m a i n ) 嘲。这个结构域最早在细菌中发现。在细菌中，它的作 用是用来在哺乳动物的血细胞膜上打孔1 。在这个家族中，很多蛋白的功能还不是很清 楚。现在已知的p a q r l 和p a q r 2 是调节脂类代谢的重要蛋白，它们的过表达可以缓解糖 尿病的症状嘲1 。p a q r l 和p a q r 2 也具有七次跨膜的结构，但是它们的这种结构不同于g 蛋白偶联的受体，它们的n 端在胞内，c 端在胞外。这种蛋白在酵母中也有表达。在 酵母中，它也表达在膜上，但是它们在酵母中的主要功能是调节锌离子的代谢，它在酵 母中的表达受脂类的调控，说明它可能与脂类代谢也有关系嘲。 m p r s 分别属于p a q r 5 、7 、8 ( 分别对应y 、q 、b ) 。上面已经介绍，这三种蛋白 的n 端都在胞外，而c 端在胞内。在人上，1 1 亚类p a q r 的表达涉及到几乎每一个组织。 其中除了p a q r 6 只在脑中特异表达外，其他的十种均在多种组织中有表达侮嬲。这种表达 模式与z h u 等人的结果略有不同，z h u 等发现p a q r 5 ( m p ry ) 主要在肾脏中表达，而p a q r 8 ( b ) 则主要在脑中有表达凸。这种差异可能是由于检测方法的不同所造成的，前者用 的是基因芯片技术，后者用的是d o tb l o t 的方法，前者的灵敏度更高一些。 p a q r 广泛分布于生物界，从真细菌，酵母，植物，到高等动物都有它们的分布瞰1 。 但是，至今为止，还不知道它们在真细菌中的功能，只是证实了一种在细胞膜上打孔的 功能3 1 。这种进化上极度保守的蛋白家族的许多功能还有待研究。但是，这么保守的蛋 白在生命活动中必然承担着重要的功能。 1 4 3 | i l p r s 起作用的分子机制的研究进展 在m p r s 发现伊始，z h u 等就对其作用的分子机制作了研究侧。z h u 等通过将m p r q 转染乳腺癌m d a - m b - 2 3 1 细胞，发现在经过孕激素处理3 0 m i n 后，c a m p 的浓度明显下降， 并且这种作用可以被g i 特异抑制剂百日咳毒素所抑制，这说明这种受体可能是一 种与抑制性g 蛋白相偶联的受体嘲1 。通过e r k l 和e r k 2 的磷酸化分析发现，用孕激素预 处理转染后的细胞，可以明显地增加e r k l 2 的磷酸化程度硎。这说明，m p r s 与其配体 结合后，可以激活l d a p k 通路，m p r s 所介导的卵母细胞成熟，至少部分是由于凇p k 通路 激活所引起的。关于以上机理，m a l l e r 曾经做过综述嘲，见图卜3 。 进一步的实验证实，在转染的m d a - m b - 2 3 1 细胞中，m p rq 可以与g i 发生共沉淀，突变 m p rq 的第三胞内环和c 端序列，可以使这种共沉淀活性消失；这说明m p ra 至少是部分 通过第三胞内环和c 端来与g i 相互作用钉。在其他鱼类一斑马鱼上，也得出同样的结论， 8 m p rb 在猪c o c s 体外成熟过程中表达和作用的研究 即m p rq 和1 3 可以通过g i 抑制腺苷酸环化酶的活性、激活m a p k ，这些作用需要与孕激 素结合才能达到旧1 。将从羊中分离得到的m p r 与g f p 融合表达，发现融合蛋白的超表达， 可以引起细胞内钙离子浓度升高，这种升高的具体机制还不清楚，估计是通过调节内质 网钙的释放引起的哺引。向非洲爪蟾卵母细胞中注射m p r1 3 特异抗体，可以抑制由孕酮引 起的m o s 合成、c d c 2 去磷酸化和m a p k 激活嘞1 。这种结果与上面用转染细胞所得出的结 果一致。更有趣的是，在体外表达系统中，激活这两种受体，可以导致p r b 反式激活， 这是第一个孕激素膜受体和核受体之间通话的证据哺。 p 9 0 r s * j i 誊誊蠹黪灞舔留辫 m y t l 稳臻彩锈v 移 e f j o 翟 ，羹。差。 麓嚣 l l 虿v 。l 委? a c t i v eie 弘：2i 蟋纛 毒 e r mf n a lv e s i c l eb r 霉ak d o w n 图卜3 孕激素通过m p r 起作用的分子机制旧1 。 f i g u r e1 - 3 t h es i g n a lt r a n s d u c t i o nm e c h a n i s m o fi l l p r 5 6 1 1 4 4m p r s 在生殖系统中功能的研究进展 1 4 4 1 孕激素膜受体在精子受精中的作用 m p rb 在猪c 0 c s 体夕卜成熟过程中裹这和作用的研究 早在1 9 9 4 年嘲，有些学者就发现，孕激素可能通过激活一种与孕激素偶联的特异钙 离子通道，来启动精子顶体反应的发生。随后，研究者又发现，孕激素可以增加一种9 7 k d a 蛋白的酪氨酸磷酸化程度，说明酪蛋白激酶被激活；孕激素还可以诱导膜磷脂的降解， 从而导致血小板激活因子的合成和花生四烯酸的释放。这些生物化学研究显示，孕酮能 够在人精子中激活多种信号通路；该学者也研究了孕酮对人体外受精程序和多精子受精 的影响，结果显示，孕酮可以增高精子细胞内钙浓度和促进顶体反应的发生，从而使人 多精子受精率降低和人体外受精率的升高嘲。这些研究显示，精子对孕酮结合能力的改 变可能是一种导致受精率低下的原因。但是，孕酮是通过哪种精子膜蛋白所起的作用， 仍然不清楚。研究者利用一种抗体直接对抗孕激素核受体的c 一末端( p - 结合区) ，发现 了两种不同于经典核受体的精子蛋白；配基结合分析显示，孕酮可以与这两种蛋白特异 结合，这说明孕酮通过精子膜蛋白参与卵母细胞的受精过程洲。动物实验研究表明，成 熟诱导类固醇( m i s ) ( 多种孕激素类似物) 可以激活和斑点鳟十分相近的物种a t l a n t i c c r o a k e r 精子膜上的受体m p r ，刺激精子的运动；c r o a k e r 精子具有与孕激素结合的高的 亲和力和特异性，这正是m p r 所具有的特征；在体外，用促性腺激素处理c r o a k e r 睾丸 组织，可以使m p r 的浓度数倍增加，这说明孕酮的作用至少部分是由n i p r 介导的嘲。但 是，是不是所有孕酮的作用都是由m p r s 所引起的，以及m p r 起作用的具体分子机制都 还不清楚。 1 4 4 2 孕激素膜受体在卵巢中的作用 尽管有证据显示，孕激素旁分泌在大鼠黄体中起作用，但是没有在这个腺体中检测 到经典孕激素受体存在。c a i 等发现，黄体细胞膜可以与孕酮呈特异性结合：低浓度孕 酮可以降低3 h 孕酮的结合，而其它激素如皮质激素、雌激素等则没有效果；在大鼠黄体 中，表达三种可能的孕激素受体：m p r q 、m p r b 、m p r y ；m p r q 和m p r y 在妊娠期的 转录水平稳定的增加，而m p rb 则保持不变；在分娩前，随着孕酮水平的降低，m r rq 和m p rb 转录也降低；与妊娠中期相比，黄体m p rq 蛋白水平在黄体末期下降； e r g o c r i p t i n e 可以抑制黄体中促乳素的分泌，也可以明显降低m p ra ，m p rb 的表达； 如果在用e r g o c r i p t i n e 处理的同时使用促乳素，可以阻止它的作用；这个发现为可能 的孕激素膜受体在大鼠的黄体中表达并起调控作用提供了证据嘲。相似的，m p ra 在猪 黄体细胞消退前，其m r n a 的水平也下降m 。 1 4 4 3 孕激素膜受体在卵母细胞成熟中的作用 前面已经介绍，体细胞在促性腺激素刺激后所产生的孕酮，可以中断完全生长的青 1 0 m p r9 在猪c o c s 俸外成熟过租中表达和作用的研究 蛙卵母细胞减数分裂阻滞n 6 眠咖。许多证据显示，孕酮可以与卵母细胞表面相互作用， 来调控随后的事件，最终导致生发泡破裂( g v b d ) 。向裸卵注射孕激素，不能诱导细胞 分裂圳，而用不能通过膜的孕酮多聚物来处理卵母细胞，却可以诱导卵母细胞成熟分 裂恢复。这些初步证实是通过膜的作用来诱导了非洲爪蟾卵母细胞成剃豫7 3 1 。 一些研究者在两栖类卵母细胞的细胞膜上，发现了一组孕激素结合位点。在这个研 究中，细胞膜和经1 0 5 ，0 0 0 9 离心从两栖类卵母细胞得到的细胞质，都与合成的孕激素 3 h r 5 0 2 0 有较高亲和力。s d s - p a g e 显示，细胞膜上的蛋白大小为1 l o