（动物营养与饲料科学专业论文）环状芽孢杆菌bc木聚糖酶基因克隆与表达.pdf

摘要 本研究克隆了环状芽孢杆菌木聚糖酶基因，采用表达载体p e t 一3 0 a ( + ) v e c t o r 、d g e x 4 t 一3v e c t o r 和宿主菌ec o ，fb l 2 1 对其进行了表达，并研究了 表达产物的酶学特性。主要结果如下： 本试验以具有木聚糖酶活性的环状芽孢杆菌b c ( b 口c f ，“sc f r c “，册s b c ) 为出发菌株，通过对g e n b a n k 上登录的其它来源b 一1 ，4 木聚糖酶基因序列同源 性分析，根据其保守区设计了5 、端引物x p 5 1 和3 、端引物x p 3 1 。采用t d p c r 技术克隆了环状芽孢杆菌木聚糖酶基因( 己被g e n b a n k 收录，其收录号为 a f 4 9 0 9 8 0 ) ，该基因序列与p g e m te a s yv e c t o r 连接，获得了重组克隆子 p g e m te a s yb c xv e c t o r 。测序结果表明，其长度为7 0 2 b p ，具有一个6 2 9 b p 的开放阅读框( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) ，编码2 1 3 个氨基酸的酶蛋白，其理 论分子量为2 3 2 k d a 。 经同源性比较发现，该环状芽孢杆菌木聚糖酶基因与g e n b a n k 上登录的 其它芽孢杆菌木聚糖酶基因如a f 4 9 0 9 7 9 ( b 5 曲f f ，括- 2 ) 、x 0 7 7 2 3 ( b c f ，c “，d 疗s ) 、 m 3 6 6 4 8 ( bs “6 ，f ，f s ) 、x 5 9 0 5 8 ( b 口c f ，甜js p ) 、z 3 4 5 1 9 ( b s “6 ，f ，f j1 6 8 ) 、a f 4 4 1 7 7 3 ( b 口c f f f “js p n b l 4 2 0 ) 和u 5 1 6 7 5 ( b 口c f ， ss p ) 具很较高同源性，其核苷酸 序列同源性分别为9 8 、9 6 、9 6 、9 7 9 6 、9 2 和9 1 ；氨基酸序列同 源性分别为9 7 、9 7 、9 7 、9 7 、9 7 、9 4 和9 4 ；经分析发现该木聚糖酶 含有一个2 8 个氨基酸的信号肽。 根据表达载体多克隆位点( m c s ) 和已经克隆的木聚糖酶基因开放阅读框 设计了一对表达引物，其中上游引物x p 5 25 端含有b a m h i 限制性酶切位点， 下游引物x p 3 25 端含有x h o i 限制性酶切位点。以p g e m 回- te a s yb c x v c c t o r 为模板，采用t d p c r 方法得到一条能编码木聚糖酶且两端带有限制性酶切位 点的d n a 片段。该片段与p 0 e m 圆te a s yv e c t o r 连接得到亚克隆重组质粒 p g e m 一te a s yb c x ev e c t o r 。用b a m h i 和x h o i 双酶切亚克隆重组质粒，回收 目的片段并分别与经双酶切的表达质粒p e t 3 0 a ( + ) v e c t o r 和p g e x _ 4 t - 3v e c t o r 进行连接，将获得的重组表达质粒p e t b c x e 和p g e x b c x e 分别导入ec o ，f i i b l 2 l 中，利用转化子在r b b 木聚糖平板上形成的透明圈，分别筛选到含脊重 缝表达质粒p 嚣t b e x e 秘重组表达腰粒p g e x b c x e 的阳性表达予e 。c o 蟊 b c e 5 和ef o f fb c e l 。菌株发酵活力为1 3 5 4 l u m l 和1 2 3 5 u 糯l ，分尉为浅发 菌株的2 3 3 储和2 1 3 倍。 对两秘表达系统表达豹本聚糖酶嫩物学特性磷筑显示，它嬲的最适反驻湿 度均为5 0 6 0 ，在4 0 以下相对稳定；最适反窿p 均为为5 ，o ，在p h 3 o 9 0 之间相对稳定，并与出发菌株的酶学特性基本致。用s e p h a d e xg ，2 5 、 s e 舜a d e xg l o o 鞠s o u f c e3 0 q 等对e z i8 c e 5 嫠赫兹表达产物避季亍了分薅缒 傀。s d s p a g e 凝胶电泳结果显示纯化的酶蛋自分子量为2 0 3 k d a ，与成熟酶 骚白的理论值相符，表明纯化的酶蛋囱为成熟木聚糖酶，同时也表明来自环状 努箍抒蔻b c 的本聚糖酶中确实存在2 8 个氨基酸懿信号致序列。 关键词：环状芽孢杆菌：b 1 ，4 木聚糖酶；核苷黢序列；克隆；表达：l 司源 瞧；酶特洼 i l l t h e c l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o f x y l a n a s ee 珏e o d i n g g e n ef r o m 露口c 鲑如落c 抛i 妇露sb c c a n d i d a t o ：x i a oj i n g a d v i s o r ：p r o f c s s o rs u nj i a n y i c o l l e g eo f a n m a ls c i e n c e ，z h e j i 8 n gu n i v e r s 时 a b s t r 麓c t i nt h i s s t u d y t h e x y l a n a s eg e n e o f占c 打懈“f d ”5b cw a sc l o n e da n d e x p r e s s e di nl h e 最c 口，jb l 2 l b yu s i n gp e t - 3 0 a ( + ) a n dp g e x 一4 t * 3a se x p r e s s i o n v e e t o f s ， t h e nt h eb i o c h e n i e a lp r o p e r t i e so fe x p f 嚣s s i o np f o d t 王e t sw e r oa 珏a l y z o d t h em a i nr e s u l t sa r ea sf b l l o 、s ： 曰口c 玎“sc f r c “f 口丹sb cc o u l dp r o d u c ex y l a n a s e ，a n di t sg e n o m ew a su s e da s e 致争l 瞳e f b rx y l 鑫n a s eg e n ec l o 羲i n g 。t h eh o l 珏o l o g yo fn l | c l e o t i d es o q u e n e e so f 一l ，4 - x y l a n a s eg o n e sf r o md i f 诧r e n tm i c r o b e si nt h eg e n b a n k w e r ea n a l y z e d ，a n da p a i ro fp r i m e r s ，x p 5 1f o r5 e n df r a g m e n ta n dx p 31f o r3 e n df r a g m e n t ，w e r e d e s i g n e db a s e d o n 也e i rc o n s e r v e dr e 鬈i o n s t h e x y l a n a s eg e n e f o mb 口c f ，“s o f r o 掰纭拧sb cw a so b t a i n e db yt o u e 量l d o w np o l y 疆l e f a s ec h a i nr e a c t i o 矬( t d p c r ) ， t h e nw a sc l o n e di n t op g e m te a s y 、，e c t o r ，g e n e r a t i n gp g e m - te a s yb c x v b c t o r s e q u e n c i n gr e s u l t ss h o w e d t h a tt h en u c l e o t i d es e q u e n c e 、v a s7 0 2 b p ，a n di t h a 莲a 壬lo p e 珏f e 耩d i n g 萎蕊e ( 0 r f ) o f 6 3 9 b pe l l e o 硅i n ga o l y p e p t i d eo f2 l3a 鞋i n o a c i d sw i t hat h e o r e t i c a lm o l e c u l a rw e i 曲to f2 3 2 k d a t h ea c c e s s i o nn u m b e ro ft h e x y l a n a s eg e n e8 e q u e n c ei sa f 4 9 0 9 8 0 i nt h eg e n b a n k s t f o n gh o f n o l o g yo f t h en u c l e o t i d es e q l 王e n c ea n da m i n oa c i ds e q u e n c eo ft h e x y l a n a s ew a s 引i l l l d b e t w e e 救雪口c f 群嚣sc 扣暂屈野sb c 箍n do t 圭l e r 露群e f z 淞s o u r c e s t h en u c l e o t i d es e q u e n c ea n da m i n oa c i ds e q u e n c ei d e n t i t yw e r e9 8 a n d9 7 f o r a f 4 9 0 9 7 9 ( 曰脚6 f f 凰- 2 ) ；9 6 a n d9 7 f o rx 0 7 7 2 3 ( 嚣，c 沁甜抽一s ) ；9 6 a n d9 7 f o fm 3 6 6 4 s 弛e ，m o g 啦口，l d r “m pm s b 8 辩姆r 栅t o 辨i 沁r 撒甜m 1 7 h e r m o m o s p w oc u w d t 口 孙e 醐o m o 舯叩。眦柏m 朋q 鲜h dm t 8 1 4 瓢沁m m o n o s p 钟4 & s 、f k s h 印，d 强w e sf p r 卅o v l d 肠c p 淞o p c - 1 5 2 0 h e r m o 曲l l i c 趣n 垂 g l o e p 碲“ml r d b e r m 强 m # 攀c 时却s s 雠 吐口码础。酗蜷、1 0 s 0 张e r m o 淞口h 嗽i ；口 撕p r 坍d e 村如n m h 蚓岱d s m5 8 2 6 觏阳搠鞠薜翱撼雌o # 打e 8 s8 1 4 7 m 8 ，坍d 州c 船缸“嘴f h 甜啦s s b p 7 0 6 o 7 0 65 6 。5 7 0 5 5 7 o 8 o 6 2 53 5 4 62 6 0 7 0 7 8 72 6 _ 8 5 、0 矗0 6 0 8 ，0 70 4 o 5 o 5 o 4 2 。3 5 60 ，6 5 8 0 7 0 7 5 6 0 一7 0 7 8 6 7 7 0 a r c h 糊a # f 耐1 9 9 7 r a l w m “矗1 9 9 0 s a k k a “n ，1 9 9 1 8 n g e f “1 9 郛 m 戤h r a n i “a ，、1 9 9 1 g 翔n i n 譬c r 暑f 耐1 9 8 6 p e r m j i a “口 1 9 9 3 s h 鲋f1 9 9 5 s i m 拱【o nc | 8 1 1 粥 l w i n 懈m a l t e r “n ，1 9 9 5 s h n “口1 9 9 7 s t u t z e n b e m e r “靠1 9 蚴 m c c 撇h v “d f 1 9 8 5 f r w 讯“1 9 9 4 m i n a m ip ，口，1 9 9 2 r i t s c h k o f r p ，d f 1 9 9 4 y b s h i o k a 鲋口ti 9 8 1 y l l “靠1 9 8 7 g o m e s 鲋口 1 9 9 6 强。姆靠1 9 9 2 s u r e l i “耐2 0 0 0 碱性术聚糖酶可水解碱溶性的术聚糖( h o r i k o s h i 甜以1 9 9 6 ) ，是造纸制浆工业中 释千分重要静农解酶。诲多嗜碱往微象耪帮黥产生碱性本聚糖耱簿，魏芽孢秆菌 ( 0 k a z a k ie f 口f 1 9 8 4 ) 和气单胞菌2 1 2 ( 0 h k o s h i 鲋口f 。1 9 8 s ) 等姻最适难长p h 为l o o ， 所产木聚耱酶在p h9 1 0 之间十分稳定，但在p h 8 o 以上时酪活性不高；嗜碱性芽 孢耪蓥戳r 1 、c 。1 2 5 及n c l l 8 6 6 。1 0 ( n 矗蝴甜娃1 9 粥：壬王。嬲a 事积。1 9 8 5 ： b a l a l ( r i s h n a l l e f 以1 9 9 2 ) 木聚糖酶的最遣作用p h 均在9 1 0 之间；费希尔曲霉 ( c l l a l l 函撼群矗1 9 9 6 ) 掰产静耐碱襁本聚糖酶在p h 9 o 霹+ 分稳定；头孢霉术聚糖酶 的作用p h 范围较宽，怒仅有的一种在p h 6 。5 9 。o 间都保持活性的嗜溅性冀越木聚糖 酶( b a n s o dp ，口，1 9 9 3 ) 。 第瞪节本聚糖酶的分子结构 了解酶的基本结构及其与功能的关系是酶分子研究的关键环节，只有对分子结构 的充分认识，才能裙了其作用视理。然而迄今为止，有关术聚糖酶详细结构的资料还 o，o 8 o o 删h 5 5 o 如；2秘踮他踮舯一一一竹；。蔼枷 8 硕士学位论文 第一章帮畜 卡分有限。本聚耱薅分子霾l 凌能域稻菲臻麓豹连接竣缢藏，动麓域避一多被速分为整 化城和底物结合域。 l 连接域 各种域通过富含羟基的氨基酸连接，并广泛存在糖基化位点，在木聚糖酶和纤维 素酶中富含苏氨酸的连接嚣域与囊孩生街牵的内含子( 菲编码序两) 区域稻戗。豢报 道( z b a n g 口f 口，1 9 9 4 ) ，生黄瘤胃球菌( 矗脚e 廊c 耙凇) 术聚糖酶含有一个由3 7 4 个 氨熬酸组成的连接区域，该区域富含天门冬氨酸和谷氨酸。_ l 龟外，粪肥纤维单臆菡 ( 波盯”如小棚融少蒯) 的木聚糖酶d 食有两个富含甘氨酸的逐接区域，它们使结构域在 空间上分开，赋予鬻白质分子结构弹性( m i i l w a r d s a d l e r “口，1 9 9 4 ) 。胁o c 口口泐甜，改 掣黔据 秽“脚本聚糖姆含有一个由4 5 5 个氨基黢残基缀成连接区域( b a i l e y 鲋耐，1 9 9 5 ) ， 其独特之娥在于包含有5 7 个八肽熏复序列x s k t l p g g ( 其中x 可以为s 、k 或n ) ，此 羚还存在麓太量糖基他的羟基氨熬酸，研傈护蛋是质分子不被酶磐。热终维援菌 ( c 协j 加泐“m 历p m o c p 盯“m ) 木聚糖酶c 在催化区域和c 术端含有短的连接区域，该 连接区域中存在鸯负责纾缕素钵聚集瓣船熄结构( h 群a s h i 彬照i 9 9 7 ) 。 2 催化域( c a t a l y t i cd o m a i n 。c d ) 本聚糖黪豹c 转决定豢其东勰特牲，燕该酶憨分类基戳。 、g 组豹本聚糖酶在 分予量、净电荷、不带电精的碱性和酸性甄基酸的比例等方面都不阉，但它们的c d 在大小上憨淘一致。本聚耩酶c d 一觳壶攀镤纯壤缀残。懿慰鳓p 绷掰鼯黜缴如璐擞 木聚糖酶3 的分桥发现，其完整的酶蛋臼含有两个与底物特异性结合的催化区域 ( 转d 静蕊1 9 粥) ；垒黉瘩霉球菌静本浆藉酶 魏毒两个催纯区域。浅舞隐球酵撵 内切木聚糖酶的催化区域妈溶菌酶具一定同源性( m d r o s o l i 鲋口f 1 9 8 6 ) 。研究发现该 本豢糖酶觞催髹：蠛每粪艟纤维单脆藩( 向l f ) 静纤维二糖永解酶、秸擎芽孢释麓 c 1 2 5 的木聚糖酶、解糖梭菌木聚糖酶、热纤维梭漪木聚耱酶和浅囱隐球酵母木聚糖 酶等的催傀域具有简源往( c o u g h l a 玛1 9 鲶；o n e i l l 甜甜1 9 8 8 ：国卸i n e t8 f 积1 9 8 8 ； b o u c h e r “耐1 9 8 8 ) 。这些同源性分析表明，木聚糖酶是由两个催化域和几个底物结 合域经重缀进化而来的。值得注意的是环状芽孢杆菌的两种术聚糖酶之间不具同源性 ( y 粕g “耐。1 9 8 9 ) ，这暗示可能夺在着截然不周的进化途经和域催他机制。对第l o 组、l l 组术聚糖酶倦化区的晶体结构分析裘明，第l o 组术聚糖酶催化区形成( b ，n ) 8 桶状结构，嚣筹l l 组本聚糖酶形成折叠结梅。 3 底物结合域 6 堡圭兰焦整查 蔓= 皇塑羔 尽管爵前已有一魑木聚糖酶三壤结构的资料，僵还缺乏肖效解读底物结合往点韵 倍惠。通过对酶一底耪复合兹结梅瓣分轿，己裼步了辫了一毯结合位惑静特性，翔环 状芽憨抒裁靛突变本浆糖戆结合本毅糖的结梭( w 致a f c h e l ( 群硝1 9 9 4 a ) 秘里氏本霉 x y n l l 结合环氧烷基本糖管的三静结构( h a 、，u k a i n e n 鲥口j 。1 9 9 6 ) 。糖基水解酶的底物 结合位点通常含有芳香族氨基酸( 如酪氨酸和色氨酸) ，它们能与糖环和侧链结合， 从而与底物中的羟基形成氢键。在木聚糖酶家族0 1 1 中，芳香族氨基酸相当保守， 而衡链位点粥可发生变化。 藏耱结合佼点的分布蔽解释本聚耱酶的部分灌纯特性。底耪结合位点在x y n l 终梅中似乎位于l # 还原鞲， 蠹在x 诛i i 中裂缝予逐原域。b i e l y 等 1 9 9 3 ) 发瑗木器 糖是农还殿端的第二瓤第三位阀豹糖营镳处披断开，因此可认为本四糠结合到本凝糖 酶x y n i i 上时，其第一和最后位是空位，剩余圆个位点参与配基结合；另一方面， 术戊糖是夜第二、第三、第四位糖苷键处被断开，这意味所有位点均被占据。t e n k a l l e n 等( 1 9 9 2 ) 发现x y n l 水解乙酰化葡糖醛酸木聚糖形成的产物比x y n i i 水解产物小。 x y 撕分子沈x y n 酲小，接触支镱木聚糖的效率离，黼而霜有曼广的催纯特往；而 ) ( y n l l 煲l 鸯较多底兹结合经点，霹与褒耪密效结合，穰纯速度更快。 4 纤维素结会域( c 或l 强l o s e c 耩r b o 姆d 憾eb 魄d 漉耋势。礅魏主珏，c b d ) 纤维素结合域在纤维索酶分子中广泛存在，许多木浆糖黪分予中也有它的存在， 两者的c b d 具有相似性。根据序列相似性，c b d 可分为1 0 个以上的类型，其中i i 和i i i 型( 长度为l o o 1 4 0 个氨基酸) 主簧来自细菌产嫩的酶，丽i 型来自真菌产生 的酶( 长度为3 6