（动物遗传育种与繁殖专业论文）鸡HFABPEXFABP基因PCRSSCP分析及其与屠宰性状和肉质性状的相关研究.pdf

摘要 本试验以四川省畜牧科学研究院和大恒家禽育种有限公司共同培育的优质肉 鸡( 共2 4 0 只) 为研究对象，对肛删舻基因和e x - f a b p 基因的p c r - s s c p 遗传多 样性进行了研究，同时结合测定的生产资料，分析不同基因型与屠宰性状和肉质 性状的相关性。结果表明： 在第2 、4 、5 、7 和第1 1 对引物中发现鸡沪剐妒基因的p c r - s s c p 多态性位 点且这些位点都主要存在于内含子区域。经p c r - s s c p 分析并结合测序结果发现： 第一内含子存在2 个多态位点即3 3 2g - a 、5 3 4g a ；第二外显子也存在2 个多 态位点即7 8 3c - * t ，8 3 5 c t ；在第二内含子中存在的变异位点为：1 1 9 8 t - c 、 2 3 2 9 c t 。通过最小二乘分析和显著性检验发现，第2 对引物产生的不同基因型 在各品种或品系之间的差异显著( p 0 0 5 ) ，第4 对，第5 对和第7 对引物产生的 不同基因型在各品种或品系之间的差异极显著( p 0 0 1 ) 。经过不同基因型与屠宰 性状和肉质性状的关联分析得知：第5 对引物产生的不同基因型间的活重、屠体 重、胸肌重、腹脂重和腹脂率差异显著( p o 0 5 ) ；第4 对引物产生的不同基因 型间的肌纤维密度( m f n ) 、精氨酸( a r g ) 和苏氨酸( t h r ) 含量差异显著( p 0 0 5 ) ； 第7 对引物产生的不同基因型问的肌苷酸含量( i 肝) 、苯丙氨酸( p h e ) 和苏氨 酸( t h r ) 含量差异显著( p o 0 5 ) 通过对鸡e x - f a b p 基因进行p e r s s c p 分析并结合测序结果发现：在该基因的 扩增区域内存在6 4 5 c - t 、3 2 5 4 c t 、3 2 6 6 t - c 、4 2 7 2 a - - g 和4 2 8 2 a g 等5 处突 变。通过最d x - 乘分析和显著性检验发现，在第4 对引物产生的不同基因型在各 品种或品系之间差异极显著( p 0 0 1 ) 。经过不同基因型与屠宰性状和肉质性状的 关联分析得知：第4 对引物产生的不同基因型间的谷氨酸( g l u ) 和粗灰分( a s h ) 含量差异显著( p o 0 5 ) ；第1 4 对引物产生的不同基因型间的缬氨酸( v a l ) 含 量差异显著( p 0 0 5 ) 在本次实验鸡群中，h - f a b p 基因和e x - f a b p 基因与脂肪性状如皮下脂肪厚、 肌间脂肪含量等不存在显著的相关性，但它们却对于肌纤维密度、谷氨酸、肌苷 酸等影响肉质风味的性状有着较大程度的影响。通过本次实验结果可以推测： 肛捌6 p 基因可能对于鸡屠宰性状和肉质性状具有很大的影响或与控制屠宰性能 和肉质性状的主基因连锁，所检测到的m 1 m 1 - b 2 8 2 - d 1 d 1 基因型的各项性状指 标值均较优良，是很有价值的基因型组合，e x - f a b p 基因可能对于鸡肉质风味性 状有一定的影响，尚可进行更深入的研究。 关键词：鸡；俨朋舻基因；e x - f a b p 基因；p c r - s s c p ；屠宰性状；肉质性状 s t u d yo nt h ea s s o c c i a t i o n sb e t w e e np o l y m o r p h i s m so f c h i c k e nh e a r t t y p ef a t t ya c i d - b i n d i n gp r o t e i n e x t r a c e l l u l a rf a t t ya c i db i n d i n gp r o t e i n g e n ea n ds l a u g h t e ra n dm e a tq u a l i t yt r a i t s a b s t r a c t t h ep o l y m o r p h i s m so fc h i c k e nh e a r tt y p ef a t t ya c i db i n d i n gp r o t e i n ( h - f a b p ) g e n ea n de x t r a e e l l u l a rf a t t ya c i db i n d i n gp r o t e i n ( e x - f w p ) g e n ew e d e t e c t e db y p c r - s s c pm e t h o dw i t hd i f f e r e n tp a i r so fp r i m e r sa m o n g2 2 8c h i c k e n sf r o m8 p o p u l a t i o n s ( i n c l u d i n g5p u r el i n e sa n d3e r o s s b r e d sd e v e l o p e db ys i c h u a na n i m a l s c i e n c ea c a d e m ya n dd a h e np o u l t r yb r e e d i n gc o m p a n y ) b a s e do nt h ed e t e c t i o no f p o l y m o r p h i s m s ，t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tg e n o t y p e so ns l a u g h t e ra n dm e a tq u a l i t yt r a i t s w e r ea n a l y z e d i nt h i se x p e r i m e n t , t h es i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m so fc h i c k e nh - f a b p g e n ea n de x - f a b pg e n ew e d e t e c t e db yp c r - s s c pm e t h o dw i t l ld i f f e r e n tp a i r so f p r i m e r sa m o n g2 2 8c h i c k e n sf r o m8p o p u l a t i o n s r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e r ew e l es i x m u t a t i o ns i t e si nh - f a b pg e n e ：3 3 2 g - * 5 3 4 g - - , 凡7 8 3c - - , t ，8 3 5 c - t ，l1 9 8 t c ， 2 3 2 9 c - * t ，t h ex zt e s tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nt h e f r e q u e n c yo fg e n o t y p e sa m o n gb r e e d s 口 o 0 5 ) ( f r a g m e n t2 ) a n de x t r e m i t y s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s i nt h ef r e q u e n c yo fg e n o t y p e sa m o n gb r e e d s 口 o o d ( f r a g m e n t4 ，5 ，7 ) i ne x - f a b pg e n e , t h e r ew e r ef i v em u t a t i o ns i t e s ：6 4 5 c - - , t ， 3 2 5 4 c - - - t ，3 2 6 6 卜c ，4 2 7 2 a g ，4 2 8 2 a - - - g ，t h ex 2t e s tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r e w a se x t r e m i t ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nt h ef r e q u e n c yo fg e n o t y p e sa m o n gb r e e d s 口 o 0 1 ) ( f r a g m e n t4 ) b a s e do nt h ed e t e c t e dp o l y m o r p h i s m s ，t h ee f f e c t so fd i f f e r e n t g e n o t y p e so ns l a u g h t e ra n dm e a tq u a l i t yt r a i t sw e r oa n a l y z e d i nh f a b pg e n e , t h e r e w e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e g e n o t y p e sa n dm e n 9a r ga n dt h r ( p ( o 0 5 ) ( f r a g m e n t4 ) ；s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e e ng e n o t y p e sa n dl w , c w ，b m w ，a wa n d a p ( p o 0 5 ) ( f r a g m e n t5 ) a n ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e e ng e n o t y p e sa n dt h r ) p h e a n di m p ( p ( o 0 5 ) ( f r a g m e n t7 ) ；i ne x - f a b pg e n e ，t h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s b e t w e e ng e n o t y p e sa n dg l ua n da s h ( p 0 0 5 ) ( f r a g m e n t4 ) ；a n ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s b e “v e e l lg e n o t y p e sa n dv a l ( p o 0 5 ) ( f r a g m e n t1 4 ) i tw a gc o n c l u d e dt h a th - f a b p g e n ew a s t h em a j o rg e n e sa f f e c t i n gt h es l a u g h t e rp e r f o r m a n c ea n dm e a tq u a l i t yt r a i t s o fc h i c k e no rl i n k i n gw i t ht h em a j o rg e n ei nt h e s eb t r a i n $ t h em u t a t i o nc o u l db eu s e d 嬲t h em o l e c u l a rg e n e t i cm a r k e rt os e l e c tt h eh i g hq u a l i t yc h i c k e n t l l ec o m b i n a t i o no f m i m l - b 2 8 2 - d 1 d 1w a sa l li d e a lm o d e lf o rb r e , e d i n gi np o u l t r yb e c a u s ei tc o u l dn o t o n l yi m p r o v es l a u g h t e r , b u ta l s oi n e r e a s em e a tq u a l i t y t r a i t s k e yw o r d s ：c h i c k e n ；h - f a b pg e n e ；e x - f a b pg e n e ；p c r s s c pp o l y m o r p h i s m ； s l a u g h t e rt r a i t ；m e a tq u a l i t yt r a i t ， 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得 的成果，尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含 其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其 它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一起工作的同志对本研究所做的 任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：； 小照 年占月拐日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学 可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：；瓶。j 、教 导师签名： 谰年月潴日 “- 1 年多月、矿日 口川农主土学羽卯届硕士毕圭论文 1 文献综述 1 1f a b p s 家族的研究进展 1 1 1 概述 1 9 7 2 年，美国学者0 c k n e r 等“1 在研究肠道吸收脂肪酸的过程中首先发现了脂 肪酸结合蛋白( f a t t ya c i d - b i n d i n gp r o t e i n ，f a b p ) 。随着进一步的研究发现： f a b p s 是相对分子量为1 4 1 6 k d a 的细胞内蛋白质，它广泛分布于哺乳动物、鱼 类、鸟类和昆虫的不同组织中。f a b p s 是细胞内脂肪酸结合蛋白多基因家族的成 员，主要功能是推动细胞内长链脂肪酸的运输，协助将脂肪酸运至进行b 氧化的 场所，以及甘油三酯和磷脂的合成部位【2 3 1 ，它们是贮藏三酰甘油和产生肌肉和肝 脏的重要能量来源，也能构成复杂的脂质，如磷脂和胆固醇，同时f a b p s 还使细 胞得以拥有一个细胞内脂肪酸及其c o a 的储存库，能够在较大范围内以调节脂肪 酸浓度的方式来调控机体内的多种生化过程，尤其是脂类代谢过程1 4 】。f a b p s 分 布于哺乳动物的心肌、小肠、肝脏、脂肪组织、脑、表皮等组织中【5 6 】。 不同类型的f a b p s 可被分成两个主要的群体 8 1 ：血浆结合蛋白( f a b p p m ) 和 细胞内或细胞质蛋白( f a b p c ) 。目前已经确定f a b p s 有9 个家族成员，包括肝脏 型( l i v e rf a b p ) 、小肠型( i n t e s t i n a lf a b p ) 、心脏型( h e a r tf a b p ) 、脂肪细胞 型( a d i p o c y t ef a b p ) 、表皮型( e p i d e r m a lf a b p ) 、回肠型( i l e a lf a b p ) 、脑型 ( b r a i nf a 8 p ) 、睾丸型( t e s t i sf a b p ) 和髓磷脂p 2 型( m y e l i nf a b p ) ，另外 还有细胞视黄酵结合蛋白( c r b p ) 基因、细胞视黄醇酸结合蛋白( c r a b p ) 基因( 表 1 1 ) 。且每一种都展现了各自独特的组织分布特性，但它们都有一个相对稳定的 半衰期( 2 3 天) 。不同类型的f a b p 序列有着较大的同源性【刀。 1 1 2f a b p s 染色体定位 f a b p s 基因染色体图谱揭示了不同类型f a b p 在染色体基因组中的分布情况 ( 表1 2 ) 。但是在一些场所或所在地却创造了一个同线性群体：一朋陂e - f a b p 和肛倒矾通过对鼠基因组序列的详细分析表明即使这些基因位于同一个染色体 的亚区，其间的跨距也要少2 0 0 b p 。俨删髟假基因位于人类染色体1 3 q 1 3 一q 1 41 1 9 1 ， 他的序列与基因序列有高度的相似性，表现出了8 0 一致性例。无内含子的俨捌妒 假基因也同样在鼠1 2 l 】和猪瞄】中发现。 _ 川农业土学嬲届硕士毕生论文 表1 1 脂肪酸结合蛋白家族 t a b l e l 1t h ef a t t y a c i d - b i n d i n gp r o t e i nm u l t i g e n ef a m i l y f b p l f a b p 2 f a b p 3 f b p 4 f b p 5 p 跚6 f a b p 7 肝脏型 小肠型 心脏型 脂肪细胞型 表皮型 回肠型 脑型 l f a b p 、z - p r o t e i n 、h e m eb i n d i n g p r o t e i n 、h e p a t i cf a b p i f a b p m u s c l ea n dh e a r tf b p 、h f a b p i m m m r y d e r i v e dg r o w t hi n h i b i t ( m l g i ) a - f a b p 、a p 2 、a l b p e f a b p 、k f a b p 、s k i nf a b p p s o r i a s i s - a s s o c i a t e d f a b p ( p a f a b p ) 、l l b p g a s t r o t r o p i n 、l l 响 肼、i b a b p b f a b p 胎儿肝脏、肝脏、胰腺、 肾、小肠 小肠 心脏、乳腺、胚泡、脑、 大动脉、肾、肾上腺 脂肪细胞、阑尾、胎儿甲 状腺，皮肤、胎盘 舌上皮细胞、眼、猪鼻、 表皮、手指 视丘下部、舌、大肠 胎儿的脑、扁桃体、嗅球、 枕叶 f a b i 瑁髓磷脂m p 2扁桃体、嗅球，脊髓 塑望墨垄型! 坠竺堡婆璺：量! 壁 表1 2f a b p 基因染色体定位鲫 t a b l e i 2c h r o m o s o m a ll o c a t i o no f t h ef a b pg e n e s f a b p s 家族中所有的基因结构都是保守的，由4 个外显子和3 个内含子组成。睾 丸型f a b p 基因只在啮齿类动物中被确定【2 3 洲，外显子相对较短，最短的外显子4 编 码1 6 - 1 7 个氨基酸而最长的外显子2 几乎编码t 6 0 个氨基酸2 甜。内含子的长度在同 族体中并不相似，猪h - f a b p i i q 含子i 大概有4 2 k b 2 2 1 ，但鼠争删膨内含子1 只有0 4 k b 嗍。f a b p 基因包含的规则t a t a 盒位于信使核糖核酸起始位置上游的2 3 3 0 个核苷 附近。 2 口川袁主土季黝7 届嘎士丰业论文 1 1 3f a b p s 的结构 分析f a b p s 一级结构发现有如下规律【9 ，1 0 l ：( 1 ) 大多数f a b p 的氨基酸组成缺 乏或极少含有半胱氨酸和脯氨酸，疏水性侧链的氨基酸较多。( 2 ) 各型之间氨基末 端( 卜2 5 ) 和中段( 9 0 ) 的均一性较强，羧基末端变异较大；( 3 ) 哺乳动物不同种系之 间的相同器官，如心脏、肝脏和髓鞘的f a b p 具有高度均一性( 8 0 - _ 9 0 ) ，而不同 器官类型之间的均一性仅为2 0 - 3 5 i 令人惊奇的是牛心脏型f a b p 与泌乳乳腺中 的生长抑制因子之间，只有6 个位点的氨基酸残基不同，均一性高达9 5 。f a b p 的二级结构主要由二个位于n 端附近的右手口螺旋和由9 2 个氨基酸组成的1 0 个反向平行的1 3 折叠组成( 1 3 a _ bj ) ，这些b 链形成二个几乎垂直的b 片层，第 一个b 片层包括1 3 a 、b b 、1 3 c 、8d 、be 和1 3f n 端前五分之一的氨基酸，第二 个片层由剩下的1 3f 和b g 、1 3h 、pi 、组成，1 3 d 和6e 主链上的原子不是通过h 键直接相连，而是在两链之间有一个5 1 l 埃的缺口，缺口被两链的氨基酸元件 填满，且f 的功能是连接两片层。f a b p 的这种结构保证了它与脂肪酸结合时控制 脂肪酸分子的移动，从而对脂肪酸的摄取、转运等发挥重要作用。 通过x 晶体衍射和核磁共振研究了哺乳动物中的所有脂肪酸结合蛋白( 除 t - f a b p 外) 、鸡卜f a b p 的结晶水溶性结构1 1 1 1 以及无脊椎动物( 如烟草天蛾幼虫的肠 型f a b p e ”1 和沙漠蝗虫中的心脏型f a b p 1 2 1 ) 的三级结构，结果表明，尽管f a b p s 家 族成员的蛋白质序列有所不同，但其三维结构均为一个由两个1 3 片层构成的“壳 形钳夹”0 3 1 4 j s , t 6 1 。1 3a - - 0f 构成此钳夹的一侧，1 3f - bj 则构成钳夹的另一侧，二 者呈近似的正交状态。( 图1 1 ) 图1 1f a b p s 的三级结构图 f i g l1t l m * d i m e m i o n a ls u - u c t u r eo f h o l oe f a b p ( w i t hp a l m i t i ca c i d ) 【1 8 】 _ 川农业土学g o a t 届硕士牛业论文 1 1 4f a b p s 对动物脂肪代谢的作用 动物机体内的脂肪代谢是一个复杂的生化过程，在多种调节因素的作用下， 贮存和动员处于一种动态平衡之中。f a b p 是机体脂肪代谢过程的重要调控因子之 一，主要通过以下途径来调节机体脂肪酸代谢u 卅：第一，增加脂肪酸在膜间的转 运。f a b p 能够使吸附在小单层泡囊上的不饱和脂肪酸游离下来，并能通过降低脂 氧合酶的活性来保护膜内多不饱和脂肪酸不被氧化，促进脂肪酸在细胞内的扩散。 第二，改变与脂肪酸代谢有关酶的活性，如已酰c o a 羧化酶、脂肪酸合成酶等。研 究表明，在鸡孵化后期，由于肝型f a b p 增强了脂肪代谢酶( 如胆固醇酰基转移酶) 的活性，从而提高胚胎对脂肪的吸收。第三，影响细胞内信号转导和基因转录， 如细胞视黄醇及视黄醇酸结合蛋白c r b p 和c r a b p ，可以将它们的配基转运给起反式 作用的核视黄醇及视黄醇酸受体蛋白，形成视黄醇类及其体的复合黄醇及视黄醇 酸受体蛋白，形成视黄醇类及其受体的复合物，从而介导特定基因的表达。第四， 通过对激素的介导作用来调节脂肪酸代谢，如 _ f a b p 在调节雌激素对肝脏合成甘 油三脂中的影响中有重要的作用。图1 2 为说明f a b p s 在炎症和新陈代谢中处于脂 信号调节的中心作用的模型图l 。 图1 2 演示f a b p s 在炎症和新陈代谢的信号途径中的中心作用的模型( 引自l i z a m a k o w s k i p 2 0 0 4 ) f i 9 1 2am o d e ld e m o n s t r a t i n gf a b p sa tt h ec r o s s r o a d so f i n f l a n m n t o r ya n dm e 乜b o l i cs i g h t i n g p a t h w a y s ( c i t el i z a m _ _ a k o w s k i ，2 0 0 4 ) 4 四川农主土学肋，届硕士毕生论文 1 2 胖6 l 塍因的研究进展 心脏型脂肪酸结合蛋白( h e a r tf a t t ya c i d - b i n d i n gp r o t e i n ，h - f a b p ) 是 在1 9 8 8 年的时候，在损伤的心肌中首次发现的。它是脂肪酸结合蛋白家族中的一 员，又被称为f a b p 3 ，分子量为1 5 k d a 。h - f a b p 能在很多组织中表达如心肌、骨 骼肌【划、肾的管状细胞末梢3 ”、大脑的某些部位p 2 】、分泌乳汁的乳腺和胎盘等p 3 1 。 沪刷舻是一种脂溶性蛋白，它对甘油三酯的积累和氧化以及脂肪酸在细胞内的运 送起重要作用p 4 5 】，当心肌梗塞或萎缩的时候它还常常作为一种生物标记被释放 到血液循环中【孤明。 1 2 1 h - f a b p 基因的分子结构 通过基因组的克隆，使整个人类俨朋舻基因的译码区、5 和3 的侧翼序 列被分离出来。其基因结构如图i 3 所示【3 8 j ：4 个外显子和3 个内含子的间距大 约为l o b p 。外显子1 包含了所有5 未翻译序列并编码最初的2 4 个氨基酸，外显 子2 和3 分别编码5 9 和3 4 个氨基酸，外显子3 编码最后的1 6 个氨基酸和3 未 翻译的区域。第一个公认的p o l y - a 信号序列a a t a a a 在终止密码子之后降低了 2 2 8 个核苷。 h 1 4 图i 3i i - f a b p 基因结构图( 引自q i n g h u aq i a n ，1 9 9 9 ) f i 9 1 3t h es u u c t u r eo f h - f a b p g e n e 心脏型脂肪酸结合蛋白是种能在脊椎动物和无脊椎动物的肌肉组织中表达 的蛋白【3 9 ，帅】，即使是在昆虫和哺乳动物间他都具有高度的保守性，而且研究发现 他在所有的肌肉组织中能代谢产生脂肪酸。肌肉中脂肪酸的代谢能力与肌肉中 俨棚舻含量存在较强的相关性。平滑肌主要是依赖一些含有较低水平心脏型脂肪 酸结合蛋白的碳水化合物，而这类脂肪酸结合蛋白在一些红肌中的含量却有所增 口，f 糸丘土学e o o z 届碛士丰宴论文 加，随着红肌中b 氧化率的升高，同时也就增加了肌肉中h - f a b p 的水平【4 l 】。在 所有哺乳动物中，心肌主要依靠脂质来提供能量和面对高速率的p 氧化，同时也 含有大量的脂肪酸结合蛋白这一发现同样在那些需要通过维持高强度新成代谢 来保持较长周期的非哺乳动物中得到了证实，如在西方的矾鹞( 一种在南美和北 美太平洋海岸飞行的海鸟) 的飞行肌中9 的细胞溶质都是胪刷丑p 这些f a b p 又 能反映肌肉中脂肪酸的氧化程度【4 2 l 。 在持久训练或增强脂肪酸的利用后，肌肉中的h - f a b p 水平也会增加。如长时 间电刺激老鼠的比目鱼肌( 小腿后面的一块扁平肌肉) 可导致i t - f a b p 的表达水平 增加3 0 4 。体内实验也证实了这点：在8 星期的游泳后，老鼠骨骼肌中肛尉妒 的浓度也增加了3 0 【4 3 】。在后来更为详细的研究中认为俨用舻可能是脂肪酸的传 感器并能调节该基因自身的表达。 通过研究h - f a b p 基因敲除的老鼠更能证实h - f a b p 在脂肪酸运输和代谢中的 重要的作用。缺少h - f a b p 并不会导致表型上的不同，同时心肌和骨骼肌的组织学 也表现正常i 删，但是，心肌中脂肪酸的吸收将会显著下降。由于削弱了脂肪酸的 吸收，因此动物中心肌的收缩只能依靠葡萄糖氧化来为休眠的动物提供充足的能 量【蚓。然而，高强度的新成代谢不能使能量持续恒定。当运动时，缺少萨例妒 的老鼠很快就会感到疲惫，为此可以发现在心肌的新成代谢中h - f a b p 发挥着本质 作用。所以，在需要大量的能量时h - f a b p 发挥着重要的作用。 1 2 3h - f a b p 基因的多态性与脂肪性状的关系 ( 1 ) 猪h - - f a b p 基因多态性与脂肪性状的关系 国外对这方面的研究始于1 9 9 7 年，以荷兰的g e r b e n s 等对猪俨翩卯基因与 i m f 含量的关系研究最为全面、细致。1 9 9 9 年，g e r b e n s 等1 4 9 】为了发掘猪肉品质 的遗传标记，研究了杜洛克h - f a b p 基因多态性和肌内脂肪含量之间的关系。结 果表明，纯合基因型之间对肌内脂肪含量的影响约有0 4 的差异。当基因型是 a a d d h h 时，肌内脂肪含量最高。g e r b e n s 等认为，h - f a b p 基因的多态性对杜洛 克猪的肌内脂肪含量有显著的影响，可以作为i m t 的候选基因。2 0 0 0 年，g e r b e n s 掣删研究了h - f a b p 遗传多样性对中国的梅山猪和西方猪种( 大白猪或兰德瑞斯) 的f 2 代杂交猪肌内脂肪含量的影响，结果表明，萨尉妒基因多态性对猪肌内脂 肪含量有显著影响。w j o nm e a d u s 5 1 1 研究了h - f a b p 基因对猪背最长肌中大理石 6 _ 川农互土学嬲届硕士毕主论文 纹状脂肪的影响，发现种公猪的基因型对后代的肌内脂肪含量有极显著影响； h - f a r p 基因的h i n f i 位点和a - f a b p 基因对i m f 含量没有显著影响。 在国内，也已开始研究中国地方猪种中肛刷卯基因与肌内脂肪含量间的相互 关系。王存芳( 2 0 0 2 ) 瞰】讨论了日剧8 p 基因对杜洛克、汉普夏、长自猪、大约克 和莱芜猪的i i v l f 含量的影响。结果发现，限尉8 p 基因的h h - d d - b b 单倍体具有最高 的i m f 含量，在各个p c r - r f l p s 中，d d 、1 l h 和b b 分别具有最高的最d , - - 乘均值。 庞卫军等1 5 3 1 ( 2 0 0 5 ) 利用p c r - r f l p 分子标记技术，检测了杜洛克猪、长白猪、大自 猪、内江猪、荣昌猪、汉江黑猪、汉中自猪、八眉猪和野猪共计2 6 5 头猪胪删舻 基因5 上游区和第二内含子区的遗传变异，并利用最小二乘模型分析了h f a b p 基因对猪肌内脂肪( i m f ) 含量的遗传效应。结果发现，俨删凰隧因的a a - d d 一哪基因 型与肌内脂肪含量有显著关系。 ( 2 ) 牛h - f a b p 基因多态性与脂肪性状的关系 李武峰( 2 0 0 4 ) 口荆用p c r - r f l p 方法在牛伊栩舻基因内发现了1 个变异酶切 位点，为第二内含子上的h a e i i i r f l p 。对此多态性片段进行克隆测序分析，结果 表明此酶切位点是由于1 0 0 6 位的碱基c g 的突变引起。利用最小二乘法拟合线 性模型对不同分子标记基因型效应值间肉品质大理石花纹和嫩度性状差异显著性 检验，结果表明：牛t t - f a r p 基因中的h 等位基因，尤其是h h 纯合基因型对牛肉 嫩度剪切力值有较大的影响 ( 3 ) 鸡- f a d t p 基因多态性与脂肪性状的关系 王启贵( 2 0 0 2 ) 嗍等对鸡脂肪酸结合蛋白基因编码区的单核苷酸多态与腹脂性 状进行了相关研究，结果表明，该基因对于鸡腹脂蓄积具有很大的影响或与控制 腹脂性状的主基因连锁，可用于对鸡脂肪性状进行分子标记辅助选择。叶满红 ( 2 0 0 3 ) 【4 7 】等为进一步对不同鸡品种间肌内脂肪沉积差异与它们的关系进行相关研 究，利用p c r - r f l p 技术在伊捌膨基因上发现在第二内含子处有一个b l h a i 多态位点， 结果表明这些等位基因与肌内脂肪沉积有关潘爱銮( 2 0 0 5 ) 1 4 8 1 采用p c r - r f l p 技 术对金水乌鸡、武定鸡、湖北红鸡、青脚麻鸡、矮黄鸡和隐性白羽肉鸡6 4 品种的 鸡的俨蜊县f 基因进行多态性分析，结果推测a 基因可能是影响肌内脂肪沉积的优势 基因。 7 口，- f 袁业主学2 卵，届j 置士丰主论文 1 3e x - f a b p 基因的研究进展 1 3 1 白卅b p 基因的概述 细胞外脂肪酸结合蛋白( e x t r a c 宅l l u l a rf a t t ya c i db i n d i n gp r o t e i n ，e x - f a b p ) 是 由g e n t i l i 等( 1 9 9 8 ) 首次从鸡胚中分离出的、一种分子量为2 1 k d a 的分泌性蛋 白。该蛋白在鸡胚发育早期新形成的肌管中、鸡胚发育期的肥大软骨组织、肌肉 纤维和血液中的粒性白细胞中均有表达，但其主要的表达部位是外周组织5 6 j 。 g i a n n o n i 等( 2 0 0 4 ) 报道e x - f a b p 是一种由鸡的肥大性软骨细胞前体分泌的载脂 蛋白，首先出现在肥大性软骨细胞肥大部分核心的边缘部位 5 7 1 。g e n t i l ic 等 ( 2 0 0 5 ) s s l 研究发现在鸡胚发育的早期，e x - f a b p 散布于鸡胚的所有组织中，其 中心脏中该基因的转录水平和厨卅舻含量最高。当机体受到外界刺激或处于病 理状态产生应激时，肠卅占p 基因的的表达水平急剧增加，例如注射了内毒素、 脂多糖 l p s ) 的鸡胚中检测到蜃硎矽基因m p , n a 含量显著增加，肝脏和心脏中 凸倒卯基因的表达达到其各自的最高水平【5 9 1 ；此外，在骨性关节炎以及癌症患 者的软骨细胞中也有该基因的表达嗍与此相似的是，鼠乳腺癌细胞分泌的n r l 与炎症患者或恶性肿瘤患者的粒性自细胞以及上皮细胞分泌的n g a l 在肥大性的 软骨细胞、形成中的骨骼肌纤维细胞以及发育中的心脏细胞中都有表达。此外， 骨性关节炎患者和软骨肉瘤患者成熟的软骨细胞中也有n r l n g a l 的合成，而且引 起炎症的因子也能诱导体外培养的软骨细胞和成肌细胞分泌n r l 捧 。因此我们推 断，厨捌跛n r l n g a l 和s i p 2 4 这3 个种蛋白的组织表达能够显示出机体处于 生理发育状态或者病理应激状态。 1 3 2 & 卅舻基因的分子结构 到目前为止，在鸡的组织中发现的软骨形成相关蛋白家族的成员有四个：软 骨形成相关载脂蛋白一b ( c h o n d r o g e n e s i s a s s o c i a t e dl i p o c a l i n sb ，c a l b ) 、 软骨形成相关载脂蛋白一y ( c h o n d r o g e n e s i s - a s s o c i a t e dl i p o c a l i n s y ， c a l y ) 、凸尉妒基因以及g g a l - c 8 g c 。它们的作用与载脂蛋白血球素n l ( 1 i p o c a l i n sa l p h a - l - m i c r o g l o b u l i n ，a l m g ) 、y 链互补因子8 ( c o m p l e m e n t f a c t o r8g a n m l ac h a i n ，c 8 g c ) 、前列腺素合成酶d ( p r o s t a g l a n d i nds y n t h a s e ， 8 _ 川农土土学羽卯届硕士毕生论文 p g d s ) 以及嗜中性粒细胞白明胶酶相关载脂蛋白( n e u t r o p h i g e l a t i n a s e a s s o c i a t e dl i p o c a l i n ，n g a l ) 的作用互补【6 2 】。该家族各成员基因不仅具有相 似的外显予内含子分界，而且具有相似的外显子大小，所编码的蛋白质外形大小 也相似。c a l b 基因有一个可以编码约1 9 k d a 多肽的开放阅读框；厨一翮舻是一 种分子量为2 1 k d a 的分泌蛋白；g g a l - c 8 g c 的分子量大小为2 2 k d a ，除了包含载脂 蛋白家族的保守序列外，还包括3 个半胱氨酸残基【酿删。在软骨形成后期的软骨 细胞中c a l 一8 、c a l y 和鼢朋铲基因进行大量转录f 6 5 】。此外，分化间期的软 骨细胞在激素的刺激下或软骨细胞处于分化过程中都会发生这些基因的诱导性转 录。 g i a n n o n i 等( 1 9 9 9 ) 【鹋】成功克隆并测序了鸡的易朋卯基因，其全序列长 5 1 4 8 b p ，包括2 9 6 9 b p 的5 端调控区、6 个外显子、5 个内含子以及1 5 7 b p 的3 7 端非翻译区，共编码1 7 8 个氨基酸。通过对全蛋白基因结构和功能的分析，发现 启动予序列同人类的p 2 0 k 存在较大差异，该基因与其他种类载脂蛋白基因位于染 色体的同区域，在n t 一9 2 6 至n t 一6 2 9 的区间( 尤其在肥大性软骨细胞中相应的 染色体区域) 表现出强大活【6 1 1 。在软骨细胞分化过程中，启动子a p - 1 参与了 厨卅舻基因的表达调控【6 3 l 。 1 3 3 & 嘲舻基因的功能 在细胞外的体液和血清中丘喇妒优先结合长链不饱和脂肪酸( 亚麻酸、油 酸、花生四烯酸) 和长链饱和脂肪酸( 硬脂酸) ，并将其运送到靶器官上；对其他 疏水性分子，如视黄酸、黄体激素、前列腺素、长链的醇或醛以及短链脂肪酸等 没有结合能力嘲。由此可见，肠蜊妒对配体的选择具有很强的特异性。g e n t i l i c 等( 2 0 0 5 ) 5 8 1 的研究结果表明：经厨删& p 基因c d n a 的互补链转染的软骨细胞 和成肌细胞的增殖过程受阻，并且出现细胞的周期性死亡；通过显微注射法给鸡 胚注入e x - f a b p 抗体则有7 0 的试验鸡胚出现死亡，靶器官为心脏，心脏中周期 性死亡的细胞和脂肪酸的含量显著增加。由此可见，脂肪酸( 尤其是e x - f a b p 的 配体脂肪酸) 的堆积导致了心脏细胞的死亡，这表明了网舻在脂肪酸的转运、 甘油三酯的合成和脂肪的代谢起着很重要的作用( c a n c e d d a 等，1 9 9 6 ) 吲。向处于 增殖期的软骨细胞中导入e x - f a b p 基因的c d n a 后其发育能力大大降低：增殖和分 9 目川农土土学肋7 届曩士平宴论文 化受到了抑制。程序化凋亡的细胞数目大大增加。用成肌细胞做试验，结果也发 现大量细胞的死亡和肌管形成的受阻。以上的研究表明，历删即参与调控鸡的 肌纤维、骨骼形成过程。 1 3 4 & 卅妒基因作为影响禽肉质性状侯选基因的研究 王启贵等( 2 0 0 1 ) 在明星肉鸡和丝毛乌骨鸡杂交产生的杂交f 2 代鸡群中发现 肠- 剧目p 基因5 端调控区的3 处碱基突变和1 处碱基插入、统计发现不同的基因 型之闻腹脂重和腹脂率的差异显著( p 0 0 5 ) ，并再次提出e x - f a b p 基因 可能是鸡脂肪性状的主效基因或与控制该性状的主效基因相连锁1 6 0 1 。李慧锋等 ( 2 0 0 4 ) 在北京油鸡中发现了盘硎妒基因的3 个s n p 位点：1 5 4 2 b p 处g a 、1 5 5 2 b p 处g - - a 和1 5 8 4 b p 处a - - g ，统计结果表明，船基因型有较低的皮下脂肪厚( p 2 扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测 f i g 3 2 a n a l y s i s o f p c r a m p l i f i c a t i o n u s i n 9 1 ) 2 ( 2 ) 引物4p c r 产物的扩增结果 图3 3p 4 扩增产物琼脂糖