（农药学专业论文）甲萘威、乙霉威和克百威与DNA的相互作用.pdf

摘要 农药化合物一般都对生物体具有生物效应。作为药物分子的靶标之一，d n a 与药物分子 的作用可能会引起遗传信息的改变。所以研究环境中的农药残留对d n a 的作用机理具有重要 的意义。 本文利用荧光以及紫外光谱的方法研究了三种农药甲萘威、乙霉威以及克百威与小牛胸腺 d n a 的作用机理，结果表明： 1 、实验条件，包括溶液p h ，溶液温度，反应时间，溶液极性以及溶液浓度等对药物与小 牛胸腺d n a 作用具有影响。 2 、不同温度下的猝灭常数说明小牛胸腺i ) n a 对药物分子的荧光光谱存在静态猝灭；荧光 光谱、紫外光谱的偏移，k t f e ( c n ) 。 的猝灭作用显示药物分子可以嵌入小牛胸腺d n a 双链； 热力学的计算确认小牛胸腺d n a 的碱基与药物分子之闻存在范德华作用；溶液极性改变小牛胸 腺d n a 的空间结构而影响其与药物分子的作用：离子强度不会改变两者的作用强度。 3 、药物活性与小牛胸腺d n a 对药物的猝灭常数存在对应关系；药物生物活性是其亲疏水性、 平面结构面积、取代基种类、取代基的亲给电性、取代基位置、空间结构底等综合作用的结果。 4 、在药物分子、小牛胸腺d n a 与溴乙锭共存体系中，后两者对于药物分子都存在荧光猝灭 效应；溶液极性以及离子强度可以改变小牛胸腺d n a 的空间结构而减少药物与溴乙锭在小牛胸 腺d n a 上的结合位点。 5 、甲萘威与小牛胸腺d n a 之间的猝灭具有良好的线性关系，所以甲萘威可以用于荧光探针 而对脱氧核糖核酸进行定量分析。 关键词：农药，小牛胸腺d n a ，光谱学，相互作用 a b s t r a c t i ti sw e l lk n o w nt h a tp e s t i c i d e so f t e nh a v eb i o l o g i c a le f f e c t s a so n eo fp o s s i b l et a r g e t s ， d n ac a nb ea t t a c k e db yt h em o l e c u l e so fp e s t i c i d e s ，w h i c h m a yb r i n gg e n e t i ci n f o r m a t i o n s o m ec h a n g e s s oi t i s i m p o r t a n tt os t u d yt h em e c h a n i s mo ft h e i ri n t e r t e r a c t i o n s t h ei n t e r a c t i o nm o d e sb e t w e e nc a l ft h y m u sd n aa n dc a r b a r y l ，d i e t h o f e n c a r b ， c a r b o f u r a na r es t u d i e db yf l u o r e s c e n c ea n du vs p e c t r a t h er e s u l t ss h o wt h a t ： 1 t h er e a c t i o nc o n d i t i o n s ，i n c l u d i n gc o n c e n t r a t i o no fp e s t i c i d e s ，p ho fs o l u t i o n ， t e m p e r a t u r eo fs o l u t i o n ，r e a c t i v et i m e s ，p o l a r i t yo fs o l v e n ta n di o n i ci n t e n s i t yo f s o l u t i o n a l lh a v ee f f e c t so nt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e np e s t i c i d e sa n dc a l ft h y m u sd n a 2 t h eq u e n c h i n gc o n s t a n t sa td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sa r ew e l lc o n c l u d e dt h a tc a l f t h y m u sd n al e a dt ot h es t a t i ca n df l u o r e s c e n tq u e n c h i n go fp e s t i c i d e s ：b o t ht h es h i f t s o ft h e i rf l u o r e s c e n c ea n du 1 ，s p e c t r aa n dt h eq u e n c h i n go fk 4 f e ( c n ) 6 i n d i c a t et h a t t h em o l e c u l e so ft h ep e s t i c i d e si n t e r c a l a t ei n t ot h et w i n - s c r e w ss t r u c t u r eo fc a l f t h y m u sd n a ：t h et h e r m o d y n a m i cc a l c u l a t i n gd e m o n s t r a t e st h a tt h e r ee x i s t sv a n d e rw 姐1 s f o r c eb e t w e e nt h em o l e c u l e so fp e s t i c i d e sa n dc a l ft h y m u sd n a a d d i t i o n a l ，t h ep o l a r i t y o fs o l v e n ta f f e c tt h ei n t e r a c t i o n sb yc h a n g i n gt h es t r u c t u r eo fc a l ft h y m u sd n a ，b u t i o n i ci n t e n s i t yd o e sn o tc h a n g et h ei n t e r a c t i o n s 3 、t h eb i o a c t i v i t i e so fp e s t i c i d e sa r ed i r e c t l y p r o p o r t i o n a lt oq u e n c h i n gc o n s t a n t s b i o a c t i v i t i e so fp e s t i c i d e sc o l l i eo u ta st h er e s u l t so fh y d r o p h i l i cp r o p e r t i e s ，a r e a s o fp l a n a rs t r u c t u r e s ，v a r i e t i e so fs u b s t i t u t e dp r o u p s ，e l e c t r o p h i l i cp r o p e r t yo f s u b s t i t u t e dp r o u p s ，p o s i t i o no fs u b s t i t u t e dp r o u p s ，a n ds p a t i a ls t r u c t u r e s 4 、c o n s i d e r i n gt h es y s t e ma m o n gp e s t i c i d e s ，c td n a a n de t h i d i u mb r o m i d e ，t h el a t t e r t w oc o m p o u n d sc a nb o t hl e n dt ot h ef l u o r e s c e n tq u c h e n i n go fp e s t i c i d e s b ym e a n so f c h a n g i n gt h es p a t i a ls t r u c t u r eo fc a l ft h y m u sd n a ，t h ep o l a r i t yo fs o l v e n ta n di o n i c i n t e n s i t yo fs o l u t i o nd e c r e a s et h en u m b e ro fp o s i t i o n st h a tp e s t i c i d e sa n de t h i d i u m b r o m i d ec a nb i n dt o 5 、o w i n gt ot h el i n e a rr e l a t i o no ft h eq u e n c h i n gb e t w e e nc a r b a r y la n dc td n a ，c a r b a r y l i sr e g a r d e da so n ek i n do ff l u o r e s c e n tp r o b et od e t e c td n a k e yw o r d s ：p e s t i c i d e s ，c td n a ，s p e c t r u m ，i n t e r a c t i o n i i 独创性声明 y6 596 18 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：- 乙立佥 时间：瑚侔朔日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：h 乞点念 时间：娜年局彳钿 导师签名 灸狱 第一章前言 1 - 1 研究背景及意义 毒理学是研究外来化学物质对生物体的作用机理、生理效应、生理效应的严重程度以及频 率的一门科学。由于j 农业生产的发展和科学技术的进步，生物体的化学物质的暴露量以及暴 露频率越来越多。这不但需要对己有的化学物质的生理效应进行重新评定，而且也需要对待开 发的化合物进行全面评估以阐明其对于生物体的生理效应，从而为制定环境卫生标准、评价环 境质量以及采取相应的防治对策提供科学依据。 环境毒理学作为毒理学研究中新发展起来的边缘学科，是研究化学物质及各种环境因素对 环境中生物体生物效应的- - i 1 综合性科学。其主要包括以下内容：( 1 ) 研究化学物质与生物体 相互作用的一般规律，包括吸收、分布、代谢、排泄等过程和发挥生理效应的作用机理：( 2 ) 研究化学物质与生物体的作用条件及影响因素，以观察其在环境中的浓度、分布、变迁、侵入 方式、接触时间以及其它作用条件的影响；( 3 ) 研究化学物质及其衍生物的生物效应和评定方 法，从而为制定环境卫生标准提供依据。这就决定了环境毒理学的研究具有以f 特点：( 1 ) 研 究对象广泛；( 2 ) 它不仅需要研究化学物质对生物体的急性效应，而且更需要研究其慢性效应： ( 3 ) 研究化学物与其环境降解产物的生理效应以及不同暴露途径对生物体所产生的综合影响。 如果外来化合物能够引起生物生理效应发生变化，那么这种变化必然是从个体的最基本的 分子水平上开始，然后逐级展开而最终引起突变。现在利用化学物质是否能够与d n a 形成d n a 加合物已经成为判断化合物生物效应强弱的一个预期生物标志物。而农药化合物一般都具有生 物生理效应，这主要表现为“三致”，而“三致”都直接或闻接地与d n a 的突变有关；部分化 学农药作为环境激素而可引起染色体的诱变。流行病学的研究发现d n a 加合物的水平与“三 致”呈正相关：许多农药接触者的染色体畸变率明显高丁对照组。而且通过生物标志物的研究， 尤其是化学物质生物活性作用机制和“结构一生物活性”关系的研究不但可以用于指导筛选有 待合成的化合物，从而可以缩短研究时间，节省大量的人力与物力；而且可以提供简单快捷的 方法来淘汰生物生理效应较高的化合物而筛选出环境安全性的化台物以提高环境安全以及环境 质量。因此在新农药化合物的开发研制过程中，开展生物标志物的研究为农药新品种的开发与 研制提供了科学依据以及前瞻性而具有极大的预测价值。 对d n a 加合物研究大多局限于在生物活体内的化合物致突变试验，当然己开始了离体 d n a 加合物实验的研究。但都尚米从分子水平上研究农药化合物对于d n a 的损伤机制。论文 研究的目的主要在于阐述三种药物与c t d n a 的作用模式，以及e b 在判断嵌插作用方式中的其 它作用，所以具有一定的创新意义。 1 2 农药残留的环境毒理学研究进展 1 2 1 环境毒理学的研究进展 人类对于环境毒理学的认识经历了一个漫长的历史。占代人类对于环境毒理学的认识主要 来自于实践中所积累的天然药物治疗疾病与解救中毒的经验，例如明朝的李时珍的本草纲目、 明朝的宋应星天工开物都开始对于萌芽状态的环境毒理学进行了初步的探讨。 第一本有关毒物的著作是a b a n o ( p d ) 于1 4 7 2 年出版的，而o r f i l aj b 则是环境毒理学的 奠基人。他提出了各种毒物的化学鉴定与分析的方法，并且系统的考虑了毒物的生理效应、病 理症状。 现代环境毒理学，一方面因为有机合成化学的问世与应用而为环境毒理学的发展提出了 新的挑战，另方面也随着医学、物理学、生物学、化学的相关发展而日益深入。例如。第一 次世界大战前后，美国科学家h a w k 和o s e r 通过对维生素的研究，建立了一些生物活性生物测 试的基本方法：2 0 世纪3 0 4 0 年代，g e l l i n g 就磺胺等抗菌药物生物活性机制进行了研究； m i l l e r 夫妇对化学致癌作用进行了研究，尤其是对d i ) t 和有机磷农药进行了系统研究；6 0 年代 以来，反应停事件、水虞病事件以及寂静的春天的出版，使环境毒理学发生以前所未有的 速度发展，环境毒理学研究已深入到细胞和分子水平”1 。 现代环境毒理学的研究主要集中在观察和识别外源性化合物对于人体及环境的影响的描 述性毒理学以及探讨外源性化合物对丁生物体有害影响的作用机制与毒理机制的研究“1 。 1 2 2 农药残留的生物效应的研究进展 农药化台物一般都对于生物具有一定的生物效应。其中一些性质不稳定的农药，通过水解、 光解、氧化、酶解、或微生物降解而最终作用甚微；但部分农药虽然并非十分稳定，但对高等 动物却具有异常的生理效应会存在生理生物效应问题；而一些性质较稳定的农药化合物残留， 通过生物富集和食物链而进入生物体甚至人体内。晟后出现了严重的农药残留问题。当这些残 留物进入生物体内而富集到一定程度时就会产生慢性中毒，这主要集中在“三致”也即致癌、 致畸与致突变问题上。其中致突变与致癌作用最终都是与d n a 的改变有关而致畸是药剂对于 生殖系统毒副作用的结果。而张宗炳认为致癌、致突变都是由于遗传物质发生了改变，而致畸 也有一部分与遗传物质的改变有关”。 化学农药不但可以造成农药残留问题，而且部分化学农药还具有环境激素作用。虽然其引 发遗传变异的可能性很小，但并不排除其可能性：且其可能结合在d n a 上，继而翻译成蛋白质 并表现出拟激素作_ f ； j ”1 。这样最终可能会造成如f 结果：影响基因表达进而影响动物生殖能力 或体内激素水平“】：作用于细胞的染色体而改变其携带的遗传信息，导致一些组织、细胞产生 肿瘤。流行病学的研究发现许多农药接触者的染色体畸变率明显高于对照组。 综上所述，无论是“三致”还是环境激素的问题都可能是农药残留通过对片断基因的活化 而形成。显然环境中这样的农药残留对于环境以及生物体尤其是人类是不安全的。 1 3d n a 加合物的研究进展 1 3 1d n a 的结构 生物体的遗传物质主要是染色体而染色体义主要由脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i c 土垦銮錾盔主璺苫兰警鎏苫 玺= 誓i 9 毒 a c i d ，d n a ) 和蛋白质组成所以d n a 是遗传的物质基础。d n a 存在a 、b 、z 型三种空间结构。 其中b 型的d n a 结构是由两条反向平行的脱氧多核苷酸链形成，其中两条链之间的螺旋警现两 种凹形，其中一条沟区较浅而另一条较深，分别称之为小沟与大沟；四种疏水性的碱基位于螺 旋的内侧：带负电荷的、亲水性的磷酸基与脱氧核糖单位处于外侧。d n a 结构的稳定性来源于 三个原因：互补碱基之间的氢键；芳香碱基n 电子之间堆积力磷酸基上的负电荷与介质 中的阳离子之间的静电作用。 小沟 b 图1 1d m 的空间构象 嚎呤嘧啶 a 为d n a 多链核酸链中的一个小片段；b 为d n 的双螺旋模型；c 为取螺旋结构图解 以双螺旋链状结构存在于细胞中的d n a 是由大量的脱氧核糖核酸组成的极长大分子其中 的戊糖和磷酸基( 磷酸根) 起结构骨架作用，而碱基则携带其遗传信息。d n a 的四种碱基为： 腺嘌呤( a ) 、鸟嗓呤( g ) 、胞嘧啶( c ) 、胸腺嘧啶( t ) 。此外还有四种脱氧核糖核苷酸单体： 图卜2 四种脱氧核麓榱苷酸单体的化学结构 a 为57 一腺嘌呤脱氧核糖核酸：b 为5 一鸟嘌呤脱氧核糖核酸； c 为5 一胞嘧啶脱氧核糖核酸；d 为5 一胸腺嘧啶脱氧核糖核酸。 1 3 2 生物标志物的由来 对于环境中的环境污染物，传统的检测方法只能进行简单的定性与定量分析而不能准确反 。玲蜊 c 盯 茚酬铲 ， b 枝喇 + 生国农业大学硕士学位论文第章前言 映污染物在环境中的生物效应。利用污染物与其作用靶标所形成的生物标志物( b i o l o g i c a l m a r k e r s 或b i o m a r k e r s ) 来评价污染物的生物慢性毒性日益受到r 泛重视”。 美国国家环保局将生物标志物定义为穿过机体屏障而进入人类组织或体液的环境污染物所 产生的生物效应”1 。而d e p l e d g e 和f o s s i 等则认为生物标志物是在生物体组织、体液样品或个 体水平上所能检测到的生化、细胞、生理或行为变化，而这种变化可用于阐明生物体暴露以及 暴露所产生的生物效应信息”。g o k s o y r 等则认为生物标志物是生物体暴露于生物弧致死剂量 下的有毒化台物而发生异常变化的信号指标，这种指标不仅可为环境质量退化提供早期警报， 而且可以特异性地检测到环境中“三致”化合物的生物慢性毒性1 。 从广义上说，从暴露到效应产生，其间从分子相互作用、细胞损伤及至整个生物体的生物 慢性毒性反应都反映了生物与环境因子的相互作用。所咀广义的生物标志物是指生物体中与有 害因素接触而产生的有关机体的各种变化，包括生理、生化、免疫、细胞和遗传等方面的改变 【l z 】 o 当然这种最早的作用必然是从个体内的分子水平上开始的，再通过分子一细胞一器官一个 体一种群一生态系统上逐级展开的，因此这种分子水平的检测具有最大的预测价值。因此分子 生物标志物( m o l e c u l a rb i o m a r k e r s ) 更能直接反映外来理化因素与细胞靶分子，特别是生物大 分子如核酸和蛋白质的相互作用及其后果3 。 囡此可以直接借助分子生物标志物来说明生物体内的细胞和组织是否已经暴露于超量的污 染物中。环境污染物是否已对生物体靶标诱发了生物慢性毒性反应，以及药物的生物慢性毒性 效应是否会对种群、群落、或生态系统引起连锁效应”“。 1 3 3 分子生物标志物的种类 目前分子生物标志物大致可分为暴露、遗传易感性和生物效应三类标志物。暴露污染物可 分为与d n a 相互作用的基因生物毒性污染物以及不与d n a 相互作用的非基因生物毒性污染物。 其中前者主要通过形成蛋白质加合物( p r o t e i na d d u c t s ) 、d n a 加合物( d n aa d d u c t s ) 、d n a 一 蛋白交联物( d n a p r o t e i nc r o s s l i n k ) 的改变遗传物质的形式而作用于生物体“5 1 。 1 3 4d n a 加合物的形成 d n a 是生物遗传信息的载体，所以保持d n a 的相对稳定性且有十分重要的意义。许多化台 物可以与d n a 产生相互作用而引起其结构的改变，晟终破坏了遗传信息模板而影响基因调控以 及表达功能。所以研究d n a 与化合物之间的相互作用对于阐明污染物的生物效应机理具有重要 的意义。 当化学污染物进入生物体后，可以与d n a 形成亲电性的代谢物，当然也可以进行直接的键 合。这是因为d n a 分子中的嘌呤与嘧啶的碱基及磷酸基团的杂原子上都存在孤对电子，这些原 子都容易成为具有亲电性的代谢中间体的进攻位点。这些具有亲电性的代谢中间体以共价键与 这些位点结合即形成d n a 加合物，这是d n a 化学损伤的虽重要和最普遍的形式。 当然d n a 加台物的形成不是简单随机的，它涉及特定的电化学以及立体化学冈素。而且由 4 于结合位点的不确定性以及化合物代谢的多样性而可形成多种不同的d n a 加合物，所以d n a 加合物的形成、种类以及检测具有较大的复杂性“。 平行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条由核苷酸形成的大小沟组成了脱氧核糖 核酸的小分子作用位点。这些小分子化合物与d n a 的结合模式主要有三种： ( 1 ) 共价结合：包括与亲核试剂的作用及与亲电试剂的反应。主要表现为d n a 的烷基化及d n a 的链间交联、链内交联等共价结合的序列识别能力比非共价结合要强得多。 ( 2 ) 非共价结合：非共价键最主要的是氢键、离子键、范德华力和疏水作用等。虽然这些均属 于弱作用键，但在分子水平的生命现象中上述弱的作用键作用却是一种决定性的因素。当然这 种结合的程度以及方式与具体的环境条件，如温度、离子强度、d n a 的碱基组成以及化合物的 理化性质等有关。其包括三种不同的方式即静电作用、沟区结台以及嵌插结合： 静电结合( e l e c t r o s t a t i eb i n d i n g ) ：d n a 是一种带负电荷的多聚阴离子，阴离子磷酸基部分 能强烈地影响d n a 的构象及其反应。化合物分子通过非特异性的静电相互作用结合于带负电荷 的d n a 双螺旋外部“。 沟区结合( g r o o v eb i n d i n g ) ：即污染物与d n a 的大沟或小沟的碱基对边缘直接发生作用。大 小沟区在电势能、氢键特征、立体效应和水合作用上都有很大的差异。很多d n a 特异性的结合 是作用于d n a 大沟区域，而药物小分子多数作用于小沟区域。典型的小沟区结合的污染物多含 有非稠合的芳香环体系，虽然同样的基团在g c 碱基对上也存在，但鸟嘌呤上的氢基在氢键形成 时有立体障碍而对药物进入g c 富集区有一定的抑制：绝火多数芳香化合物能通过一定的旋转后 结台在d n a 小沟部分的a t 较为丰富的片段通过氢键、范德华力等作用，非嵌入性地捆缚住 d n a 。 嵌插结合( i n t e r c a l a t i v eb i n d i n g ) ：含有平面芳香性稠环结构的化合物以平面芳香环嵌入 d n a 双链之中，并且与d n a 中的碱基对重叠，通过n n 堆积作用及疏水作用而稳定，这是污染 物与d n a 发生作用的最重要的形式之一。通常稠合芳香环化合物都倾向于结合在g c 富集区，而 一些含庞大取代基的分子为保持取代基尽量与母体芳香环结构保持共平面而旋转形成良好的堆 积形状与d n a 碱基结合。当d n a 靶向分子嵌入d n a 碱基对之间后，有的可直接抑制d n a 复制与 转录，有的则在经过进一步活化后引起d n a 断裂受损而影响其功能。影响药物嵌插方式的因素 最具影响的理论是两极互补理论“。具体而言，其存在以下影响因素： id n a 的结构。不同构型的d n a 与同一化台物作用时其键合方式可能会有所不同”“。 i i 化台物的形状。化合物的形状结构与d n a 的匹配程度决定了药物与d n a 的作用模式。采取刚 柔结合的设计思路，即能嵌入d n a 碱基对之间的刚性平面为插入点，与d n a 有特异结合的柔性 侧链作为导向连接结构，且末端具有能断裂d n a 的生物活性部位的不同系列化合物，有利于嵌 插作用”。 i i i 插入基团。化合物以嵌插方式与d n a 结台要求药物的插入基团要有较好的平面性、适中的平 面面积和疏水性。药物的插入配体的平面面积和插入强度成止比。但当增大的面积与插入基团 不在同一平面内而使空间位阻增大时药物与d n a 的作用反而会减弱。当插入基团相同，适当 增大辅助支链的疏水作用也可增强药物和d n a 的结合“。 取代基的差异。当药物嵌入d n a 时，取代基空间空间何阻过大就会减弱这种作用。虽然大的 取代基不利于嵌入剂与d n a 相互作用的动力学因素，但却有利于其与d n a 碱基之间的堆积作_ 丰j ： 5 一些非融合型链状芳环系统的嵌入剂分子的末端带有正电荷而与d n a 之间也有嵌入作用，这很 象小分子与d n a 沟槽结合的模式。“。同一取代基占据不同的位置时，生物活性不一样：而且取 代基不同，药物的生物活性也会发生很大的变化”。但是与未取代的化含物相比，无论是亲电 子基团还是斥电子的基团的取代都会增强小分子与d n a 的结合强度“”。 沟区结台 嵌插结合 图1 - 3 化合物与d n 的三种结合模式 ( 3 ) d n a 断裂。在d n a 修复、转录及突变中是很重要的一个生物学过程。具有剪切作用的分 子断裂d n a 的位点是由其与d n a 结合的选抒性决定的。 1 3 5d n a 加合物与三致之间的关系 化合物与细胞内大分子结合而形成大分子加台物。在化学致癌作用过程中起到关键性的作 用，这得到了已有实验的支持：( 1 ) 大多数污染物同时也是致突变物；( 2 ) 许多污染物的致突 变和致癌性取决于它能否转变为致癌性的代谢物，并与d n a 的亲核点进行结合；( 3 ) d n a 加合 物的水平与致癌性或致突变性早正相关性；( 4 ) d n a 和污染物的相互作用可以活化肿瘤基因“。 这样形成的加合物一旦逃避生物自身的修复，就可成为致突、致畸、致癌的最小因子而被 认为是致肿瘤过程的一个重要起始阶段。虽然d n a 加合物的形成并不一定导致突变，突变并不 一定导致癌变。即只有当加合物形成于d n a 的某一特定位点，并在复制和转录过程中引发一系 列基因改变，才会导致细胞恶性转化。因此d n a 序列紊乱长时间得不到恢复，才是d n a 加合物 导致癌症发生的关键所在，这就意味着d n a 加合物是化学污染物与癌症之间的一个分子桥梁”。 1 3 6d n 加合物研究的意义 由于致癌机理尚未完全阐明，常规的致癌实验周期长而难以适麻药物筛选的需要。但通过致 突变试验或观察细胞的体外恶性转化等途径找出一种快速检验方法是可能的。虽然目前还不能证 明相对致突变与致癌之间的关系但许多致癌性物质也同时具有致突变性质，即致癌性与致突变 性之间具有高度相关性，所以可通过致突变试验来反映化学物质的致癌性“。 开展以d n a 为药物作用靶标所形成的d n a 加合物的研究对于评价有机化学物的潜在致癌作 用具有很大优势。目前常用的药物筛选方法分体内筛选和体外筛选两种：前者虽然准确性较高， 但需在活体内进行，耗费大，周期长；后者准确性差，但操作简便，耗费低，周期短。不但如 此，药物生物活性筛选现在己由简单直观的动物模型转变为针对药物具体生物作用靶标的命中 6 率更高的筛选体系。其中这些作用靶标可以是蛋白质( 如酶、受体) 或核酸( d n a ，r n a ) 。而酶和 受体都是从d n a 经转录、翻译等过程产生的蛋白质，所以从理论上来看d n a 应是药物设计过程 中更为重要的生物靶标。因此d n a 与其靶标相互作用的研究不论对药物的体外筛选，还是对阐 述抗癌、抗病毒药物和污染物的作用机理都具有重要的意义”“。 事实证明在体内与d n a 发生作用的药物都能一定程度上在体外与d n a 发生作用。因此可通 过体外药物与d n a 作用的研究而获得更方便的检测方法，这在初步筛选方法中是一个有相当发 展前途的方向。 而且从根本上而言，癌基因表达也遵守中心法则。这说明肿瘤必将是在d n a 的复制、r n a 的 转录、蛋白质的翻译等备水平上对癌基因的表达。所以小分子与d n a 的相互作用是以d n a 为靶 标分子的各种物质生物效应的分子基础，其键合状态可能是导致癌变、突变及细胞死亡的重要 环节1 。 尽管对于d n a 加合物的研究尽管剐刚起步，而且也存在一些缺点与局限性，但是由于其具 有其它方法不可类比的优点而决定了对d n a 加台物的研究无论从理论上还是从实际中都具有重 要的价值。 1 3 7 农药残留- - d n a 加合物的研究进展 很多农药化合物具有一定的致突变、致畸以及致癌性。例如敌枯双( 对动物有致畸作用) 、 二溴氯丙烷( 对动物有致突变和致癌作用) 、普特丹( 对动物有致畸作用) 、培福朗( 有慢性毒性) 、 六六六和滴滴涕( 易在环境和食品中残留，影响人体健康) 、二溴乙烷( 使人、畜致癌，而且还 能引起精卵子遗传失常，使胎儿致畸、致突变和肝、肾受损) 、杀虫脒( 对动物有致癌作用，对 人有潜在的致癌危险) ”“，以及甲胺磷( 致突变) 、甲基对硫磷( 致畸，生态毒性大) 、对硫磷 ( 致畸，生态毒性大) 、久效磷( 致畸) 、氧化乐果( 致突变) 、敌百虫( 致突变，致畸，致癌) 、 敌敌畏( 致突变，致畸) 、乐果( 致突变，致畸，致癌) 、滴滴涕( 致突变、致瘤，生物富集性 强) 、三唑磷( 慢性毒性，生态毒性大) 、甲基异柳磷( 生态毒性大) 、五氯酚( 致突变，致畸， 致癌) 、林丹( 致胚胎毒，生物富集性强) ”。而实验证明农药化台物在生物体内代谢所产生的 代谢物的基因毒性可能会更为强烈。如o r t h o p h e n y l p h e n o l ( o p p ) 并非是一种直接的致癌物，但 由于o p p 代谢或o p p 代谢产物在o p p 引起的膀胱癌中具有重要的作用”；实验说明氨基甲酸酯类杀 虫剂氨甲叶酸没有明显的基因毒性，然而其代谢产物的活体实验证明其具有明显的基因慢性毒性 l a t 马拉硫磷不完全代谢为m a l a o x o n ，而且这种代谢相对于昆虫而言较慢，但是马拉硫磷的代谢 物m a l a o x o n 在一定程度上具有基因慢性毒性”。 对于化台物的“三致”的研究主要集中在化学致突变作用。盛琴琴等对倍硫磷致突变作用进 行了姐妹染色单体互换试验( s c e ) ，鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验( a e m s 试验) ， h d n a 修复合成试 验( u d s ) 均为阴性结果，这初步表明无致突变作用”1 。李丽等对异丙甲草胺原药进行了其微核试 验及a m e s 试验，试验均为阴性结果，这说明丙甲草胺作为除草剂还是比较安全的1 。迄今检测d n a 损伤最灵敏的终点是测定d n a 断裂。早期的检测方法如速度沉降法、羟基磷灰“柱层析分析法、 中性膜洗脱法等方法灵敏度低，操作条什不易控制，所获得的结果只反映群体细胞d n a 损伤效应， 不能对单个细胞进行分析。而琼脂糖凝胶电泳( s c g e ) 是在核酸沉淀法、晕圈分析及弱碱性条什 7 f 的单细胞凝胶电泳等检测技术基础上逐步发展起来的一种检测哺乳类有核细胞d n a 断裂的新技 术”“。利用s c g e 检测受损伤的d n a 带，从而判断涕灭威及其复合污染物对d n a 损伤的程度“。而 d n a 加台物可以用于衡量生物体的化学物质暴露量是一种环境效应的监测工具”。实验研究发 现a l a c h o r 以及它的代谢物在0 7 5 一1 o m g m l 的实验浓度范围内能够与小牛胸腺d n a 进行结合。虽 然观察到的小牛胸腺d n a 虽然与合成的a l a c h o r 以及它的代谢物的d n a 自d 合物存在差异，但a l a c h o r 以及它的代谢物的d n a 自d 合物仍然是a l a c h o r 的细胞毒性以及致癌性的导火索”“。 目前对d n a 自d 合物研究大多局限于在生物活体内进行的化合物致突变试验，而对于d n a 自d 合物 的检测主要集中在”p 后标记法。”p 后标记法技术能够检测出微量的d n a 加合物及其类似物”。分 别收集被七氯污染过的衰败的蛇麻草以及没有被七氯污染过的正常的蛇麻草( 这两种样品的蔓都 同样被使用过其他的农药) ，最后利用”p 技术对其中的d n a 加台物进行检测，发现在正常的样品 中存在8 种d n a 的加合物( 这可能是由于其它药品所造成的) ，而在衰败的样品中有1 6 种d n a 自n 合 物，其中有9 种新d n a 的加台物在衰败的蛇麻草中被检测出。这说明蛇麻草的衰败是由于这些新的 d n a 自f l 合物所引起的。d n a 自d 合物的形成可以延缓细胞发育同样而可以证明七氯的这种细胞毒性 “。”p 后标记法的检测也发现很多农用化学品具有基因毒性：以不吸烟的相似年龄的人群做对照， 对5 不吸烟而接触过温室农用化学品的花农的白细胞中的d n a 自n 合物进行分析，实验证明试验组人 群中的d n a 加合物的水平明显高丁| 对照组。这说明d n a 加合物的水平与接触量密切有关”“。通过”p 后标记法研究谷硫磷，s e n c o r ( m e t r i b u z i n ) ，利谷隆，敌草快，百菌清与i m i d a c l o p r i d 的基冈 慢性毒性，将这些物质经生物代谢后分别与离体小牛胸腺d n a 进行作用。实验发现除百菌清之外 其它化合物的代谢物均能产生明显的d n a 加合物1 。而且”p 后标记法可以分析二氯胺基酚一d n a 加合物1 。 也开始了离体d n a 2 n 台物实验的研究。如以丝裂霉素c ( 唧c ) 为阳性对照，选择马拉硫磷、呋 喃丹、氯氰菊酯为代表，分别测定了有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯类农药及两两混配农药对 离体小牛胸腺d n a 吸收光谱的影响，而从分子水平上探讨其可能的诱变作用1 。 1 3 8d n a 加合物的检测方法 ( 1 ) 免疫法：基本原理是抗原与抗体的反应。已发展的方法有竞争性放射免疫测定( r i a ) 、固 相竞争或非竞争性酶联免疫吸附测定法( e l i s a ) 以及超酶促放射免疫测定( u s e r i a ) 等。免疫法的 优点是特异性强，简便快速，不需要酶解d n a 链，用免疫沉淀技术可以将有加合物的d n a 链和 无加合物的d n a 链分离。其缺点是抗体存在交叉反应，所需d n a 营大，而且对非抗原性加合物 和未知抗原加合物的检测无能为力”“。 ( 2 ) 荧光法：基本原理是通过某些化合物( 特别是多环芳烃) 的d n a 加合物具有荧光的特性来测 定，目前发展的技术有同步荧光色谱法，激发一发射荧光法低温激光法。荧光法的优点是不破 坏d n a 链就可以测定，而且可以确定加台物的不同立体异构体及不同结合位点上的加台物t 也 可以研究d n a 加合物形成和切除与时间之间的动态芙系。其缺点是所需d n a 样品量大，而且不 能检测非荧光化学物或混合物中未知物质所形成的加合物”“。 ( 3 ) 高效液相色谱法及气质谱法：高效液相色谱法( h p l c ) 和气相色谱法( g c ) 联合其它敏感的 检测法检测d n a 损伤己成为一种趋势。如h p l c 一”p 后标记方法是非常敏感的方法。气质联用 r 法( g c - m s ) 虽然灵敏度稍低，但可以提供加合物准确的结构信息”“。 ( 4 ) ”p 后标记法：是在8 0 年代发展起来的一个非常灵敏的检测方法。该方法归纳起来有标准 法，强化法，丁醇富集法，核酸酶p i s 1 富集法，双核营酸5 一单磷酸法。此外又发展了一 些”p 后标记法与其它诸如免疫法，h p l c 法，荧光法等结合的方法，其中以丁醇富集法和核酶 富集法使用广泛。该方法的优点是所需d n a 量少，非常适合只能提供少量d n a 的人体样本的检 测，不需要事先制各加合物标样，用空白对照可以定量计算加合物含量，既可用于单一加合物 的检测，也可用于复杂混合物的测定及未知的内源性亲电性物质所形成的加合物的测定。其缺 点是特异性较差，步骤比较多，稳定性不易掌握，不同的实验室所测定的结果差别根人”。 ( 5 ) 序列凝胶电泳及印迹分析技术：序列凝胶电泳及印迹分析技术是生物学中用来研究d n a 与其它分子相互作用最基本的两种手段。凝胶电泳可以考察d n a 剪切或其它分子与d n a 螺旋共 价结合留下的永久性“痕迹”，研究其它分子与d n a 作用的序列特异性”“。 ( 6 ) 光谱法：d n a 分子中的碱基在2 6 0 n m 附近处有吸收。可以用光谱方法考察d n a 结合其靶标 分子后结构上的变化来研究结合机理”“。 ( 7 ) 电化学方法：对于一些吸收光谱比较弱，或由于其电子跃迁谱带与d n a 的谱带发生重叠而 无法用紫外可见等方法来研究的分子，却有可以用直接或间接伏安法方便地进行研究。尤其是 对于一些主要通过静电结台模式与d n a 作用的分子。采用表面电化学方法可获得许多其它方法 无法得到的信息”。 ( 8 ) n m r 谱：n m r 谱能够直接提供配合物和d n a 键合的详细信息，用于更深层次上探测小分子 化合物与d n a 的键台机理及作用位点( 如d n a 的大沟、小沟、或碱基位置的特异性结合等) 。 ( 9 ) 单晶x 射线衍射技术：已广泛用于研究其他一些类型配合物与d n a 的相互作用，并获得 了结构方面的详细信息”“。 1 4 荧光探针的研究进展 由于核酸本身的荧光很弱，因而不能直接利用荧光技术对其进行定性定量研究，而必须引 入外源性物质来强化其荧光，这就是所谓的荧光探针。利用小分子荧光探针对核酸荧光的增强 作用来进行核酸的定性定量分析，方法比较简单，应用较广；而且可以研究化合物与d n a 作用 的类型、位点以及作用力而可以阐述化台物与d n a 作用的作用机理。这些荧光探针可以简单分 为以f j l 种： 1 4 1 有机化合物 有机化台物是核酸荧光探针研究最早，发展最快的一类探针。其中溴化乙锭是应用最早， 也是应用最广的荧光探针。当少量的溴化乙锭加入核酸时，溶液的荧光强度出现急剧增强。这 不仅可用于核酸的定性定量分析。也可以用于研究核酸与其它化台物的作用机理“。d n a 三 螺旋结构的发现，进一步扩展了溴化乙锭的应用范围，在检测三螺旋d n a 和研究其与三螺旋d n a 的作用方式等方面的。l 作迅速开展。1 。 9 基于4 ，6 - - - - - 眯基一2 一苯基吲哚( d a p i ) 可以嵌入d n a 的碱基对之间”，这可用于凝胶过程 中d n a 的选择性着色，也可用于匀浆和细胞中的d n a 的测定”“。而h o e c h e s t3 3 2 5 8 由于同样 可以嵌入d n a 的碱基对之间而可以用于精确测定d n a t ”、细胞和粗处理组织匀浆中d n a 的测定 “”以及检测单链d n a ”。小檗碱也可以与d n a 产生嵌插作用而通过荧光增强建立了检测d n a 的 灵敏方法。吖啶橙作为一种阳离子荧光探针也可以通过嵌插或静电作用而与d n a 进行作用而 用于d n a 的定量分析”“。 利用d n a 对藏红t ( s t ) ”、耐而蓝( n b ) ”和甲基蓝”荧光具有猝灭作用，从而建立了测 定d n a 的荧光猝灭法。 在表面生物活性剂的作用下，吖啶黄( a y ) 可以形成形成二聚体而使荧光减弱。d n a 的加入 能调节a y 的单体和二聚体之间的平衡而可用于d n a 的灵敏检测：而且水杨酸”“以及邻氨基 苯甲酸”“由于形成二聚体而产生自猝灭d n a 与其结合后能够破坏二聚体而同样可以用于检测 d n a 。 单聚体噻唑橙染料( t 0 ) 和恶唑黄( y o ) 以及它们的二聚体t o t o 和y o y o 在水溶液中不发荧 光，但与d s d n a 形成络合物后荧光量子产率显著提高而用于检测d n a ”“以及r n a ”“。 1 4 2 金属离子 稀土金属离子具有光谱线窄、光寿命长、能发射特征荧光并与生物分子具有很大的亲和力 等特点，所以常常用于研究核酸等生物物质，其中e u ”以及t b ”应用最为广泛”7 77 ”。 1 4 3 金属配合物 分为稀土金属配合物以及过渡金属配合物。其中稀土金属配合物分为两类通过荧光增强的 机理所建立的分析方法。例如t b + - 环丙沙星、e u 3 + i d t p a 、e u ( p h e n ) ：c 1 。( h z 0 ) ( c 。h s 0 h ) 1 、 e u ”一联毗啶1 、l a 3 + - - p h e n 一邻苯二甲酸”、l a ”- - 8 - - 8 羟基喹啉”“等金属配合物体系都可 以用于d n a 的定量分析：但t b ”一钛铁试剂体系却是通过d n a 猝灭其荧光的原理而测定d