（免疫学专业论文）treg细胞和il18在脑胶质瘤中的作用研究.pdf

111111 1 1 1 1 1 1 1 1 111 11 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 19 014 2 6 1 7 ”1 4 的作用研究 000 1 5 l i po i b l pob 1 7 ”000 ”1 8 ”2 4 ”“2 6 ”3 3 ”一3 6 小结一一3 9 参考文献3 9 第二部分t r e g 细胞促进胶质瘤细胞免疫逃逸机制研究 前言4 2 月i j 舌“一”“”“一”“”“”“”“”“”一”“4 2 材料与方法4 3 结果一”一”一”“”“”“4 8 附i 羽5 0 附表“”一“”一”一”“一“”一”5 8 讨论一”“”“”“一一“一5 9 小结”一一”一”一”“”“一一“6 1 参考文献6 2 第三部分i l - 18 对胶质瘤组织中t r e g 细胞的调节作用研究 前言6 6月! j 舌”“”一”“”“”“”“”一“一“”一“6 6 材料与方法6 7 结果7 3 附图：7 6 附表8 4 讨论- o o oooo oob6ooooo ooo ”“”一8 5 小结o ooooo o oo ooooeiooo “”一”一“”ooo ooo oooo oooooooq 一”8 6 参考文献o e ooooo o o 8 7 结论0 00 000 ”一一”一一”9 0 综述一t r e g 细胞与肿瘤免疫治疗策略9 1 综述二i l 一1 8 在抗肿瘤免疫治疗的研究进展1 0 5 致谢”一”一“”“”“一”“”“”一”o o o d oo oooooooo0 1 1 7 个人简历1 1 8 中文摘要 t r e g 细胞和i l - 18 在脑胶质瘤中的作用研究 摘要 目的：脑胶质瘤，尤其是高级别胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，肿 瘤呈浸润性生长，手术很难将其全部切除，尽管结合放化疗等综合治疗， 但胶质瘤患者的预后仍十分不理想，复发率高，高级别胶质瘤患者的生存 时间甚至不足1 年。随着分子生物学研究的不断进展，胶质瘤的免疫治疗 逐步得到人们的重视。 胶质瘤细胞的侵袭性与其复杂的病理生理学特点有关，其逃逸免疫监 视能力限制了机体产生有效抗肿瘤免疫反应，调节性t 细胞 ( c d 4 + c d 2 5 + f o x p 3 + t 细胞，t r e g ) 在肿瘤细胞免疫逃逸过程中扮演重要 角色。t r e g 细胞具有免疫抑制作用，对维持机体免疫稳态发挥着重要作 用。t r e g 细胞在抑制效应性t 细胞功能的同时，也降低机体对肿瘤细胞 的免疫反应，间接促进了肿瘤细胞的生长。在多种恶性肿瘤组织中( 如乳 腺癌，卵巢癌，肺癌，肝癌，恶性淋巴瘤等) 有大量t r e g 细胞浸润，其 在患者外周血淋巴细胞中的比例也明显升高。并且，t r e g 细胞的数量与 肿瘤的发展和预后呈负相关，清除t r e g 细胞或抑制其功能有助于机体抗 肿瘤免疫功能的恢复。 t r e g 细胞分为天然型和诱导型，前者由胸腺产生，后者可在外周由 非调节性t 细胞转化而来。在肿瘤微环境中，异常增多的t r e g 细胞也分 为两类，一种是在肿瘤细胞趋化下，由外周迁徙而来，一种是在肿瘤局部 特定环境中由非调节性t 细胞转化而来。浸润在肿瘤中的t r e g 细胞在肿 瘤细胞作用下分化成熟，具有肿瘤特异性，可阻止效应性t 细胞( 主要 是c d 8 + 和c d 4 + t 细胞) 的功能。在肿瘤局部，t r e g 细胞和效应性t 细胞 在数量上的不平衡是引起肿瘤细胞免疫逃逸的重要因素。因此打破这种不 平衡成为肿瘤免疫治疗新的策略。 白细胞介素1 8 ( i l 1 8 ) 作为前炎因子，常高表达在多种自身免疫疾 病组织及体液中，如类风湿性关节炎、结节病、红斑狼疮等。在这些患者 体内，t r e g 细胞明显减少，而效应性c d 8 + t 细胞功能由于失去t r e g 细胞 的抑制作用而明显上调，导致自身免疫性疾病发生。i l 1 8 的高表达应与 中文摘要 t r e g 细胞的减少存在某种关联。此外，i l 1 8 本身也具有明显抗肿瘤功能， 包括诱导t 细胞和n k 细胞产生i f n - 丫，增强n k 细胞和c t l 细胞的细胞 毒性，促进活化的c d 4 + t 细胞分化成为辅助性t 细胞和效应性t 细胞。 在肿瘤动物模型研究及临床试验中，i l 1 8 已被证实具有抗肿瘤功能，但 在肿瘤微环境中是否能够逆转t r e g 细胞的免疫抑制作用，尚缺乏研究报 道。本研究旨在探讨t r e g 细胞在脑胶质瘤组织中的数量与肿瘤发展的关 系，探讨其免疫抑制性功能的机制，以及i l 1 8 对t r e g 细胞的调节作用。 方法： 1 收集2 0 0 7 年9 月至2 0 0 9 年9 月在河北医科大学第四医院神经外科 治疗的脑胶质瘤患者的外周血及肿瘤组织标本，共7 6 例。同期因脑疝行 脑内减压术获得的正常脑组织标本及健康人群外周血标本作为阴性对照。 分离肿瘤组织及正常脑组织中浸润淋巴细胞及患者、健康对照者外周 血单个核细胞。采用流式细胞术检测组织中及外周血中t r e g 细胞、c d 4 + t c d 8 + t 细胞的含量及比率，分析其与脑胶质瘤患者临床、病理学特征及 预后的关系。 采用e l i s a 法测定脑胶质瘤患者外周血中t g f p l 的含量。采用逆转 录聚合酶链反应( r t - p c r ) 技术定量检测外周血单个核细胞中 f o x p 3 m r n a 的含量，分析两者表达的关系。 2 收集2 0 0 8 年9 月至2 0 0 9 年9 月间在河北医科大学第四医院神经外 科治疗的5 例脑胶质瘤患者手术切除的新鲜肿瘤组织标本。采集同期健康 志愿者外周血标本及行脑内减压术获得正常脑组织为对照。 分别培养正常人脑星形胶质原代细胞及原代胶质瘤细胞，采用免疫组 织化学染色法进行鉴定。胶质瘤组织体外原代培养细胞及星形胶质细胞体 外原代培养均获成功，并经免疫组化染色鉴定、证实。分离组织中浸润淋 巴细胞及外周血单个核细胞后，采用m i n im a c s 免疫磁珠分离技术获得 组织和外周血中c d 4 + c d 2 5 + 、c d 4 + c d 2 5 及c d 8 + t 细胞。经免疫磁珠两 次分选后，c d 4 + c d 2 5 + t 细胞的纯度达8 9 9 2 ，c d 4 + c d 2 5 t 细胞纯度 在9 0 以上，c d 8 + t 细胞纯度达8 7 9 4 。按照不同比例将c d 4 + c d 2 5 + t 和c d 4 + c d 2 5 。t 细胞或c d 8 + t 细胞共同培养，采用 3 明t d r 掺入法检 测c d 4 + c d 2 5 + t 对c d 4 + c d 2 5 t 细胞及c d 8 + t 细胞增殖的影响。 采用w e s t e r nb l o t 法对不同来源的c d 4 + c d 2 5 + t 细胞中f o x p 3 、 中文摘要 c t l a 4 、g i t r 、c c r 4 和c c r 8 蛋白进行定量检测。采用e l i s a 法对胶 质瘤组织原代培养细胞及不同来源c d 4 + c d 2 5 + t 细胞培养上清中 t g f d 1 、c c l l 2 和c c l 2 2 进行定量检测。 3 应用逆转录病毒载体l x s n ，将插入i l 1 8 基因的质粒感染p a 3 1 7 包装细胞，经g 4 1 8 筛选后获得表达i l 1 8 分子的p a 3 1 7 阳性细胞克隆， 用i l 1 8 p a 3 1 7 培养上清转染9 l 细胞，筛选出高表达i l 1 8 的i l 1 8 9 l 细胞克隆，传代培养。 将雄性f 3 4 4 大鼠随机分为2 组，每组1 5 只，分别颅内接种9 l 细胞 和i l 1 8 9 l 细胞，每组分别在颅内接种肿瘤细胞后7 天、1 4 天、2 1 天时 各处死3 只大鼠，每组剩余的6 只大鼠用于观察生存期。 采用逆转录聚合酶链反应( r t - p c r ) 技术定量检测各组大鼠脑胶质 瘤组织中i l 1 8 m r n a 的表达。在颅内接种肿瘤细胞2 1 天时，采用 3 h i t d r 掺入法检测各组大鼠脾细胞增殖反应情况，e l i s a 法检测各组大鼠脾细胞 i f n - y 的产生情况。采用流式细胞术检测各组胶质瘤组织中t r e g 细胞、 c d 4 + t 、c d 8 + t 细胞的含量及比率，分析其与大鼠胶质瘤生长及生存期的 关系。取接种9 l 细胞2 1 天时的大鼠肿瘤组织，分离肿瘤组织中浸润淋 巴细胞，利用m i n im a c s 免疫磁珠分离系统，分选c d 4 + c d 2 5 + t 细胞和 c d 4 + c d 2 5 。t 细胞，将两者共同培养，培养基中加入i l 18 ，观察 c d 4 + c d 2 5 + t 细胞免疫抑制功能的变化。 结果： 1 胶质瘤患者肿瘤组织和外周血单个核细胞中t r e g 细胞比例变化： 流式细胞学检测结果显示，星形胶质瘤患者外周血单个核细胞中 c d 4 + c d 2 5 + f o x p 3 + t 细胞的含量为1 0 4 1 士2 1 3 ，明显高于健康人外周血 ( 4 3 5 士1 0 7 ) ( p m ) 和低 比值组( o 0 5 ) 。而c d 8 + t 细胞在肿瘤组织的浸润 数量亦与患者预后无关( 矿o 0 5 ) 。而以肿瘤组织中c d 8 + t t r e g 细胞比值 作为观测指标时，其比值与胶质瘤患者预后呈正相关，高比值组患者的生 存期明显长于低比值组，两者具有显著差异( 西o 0 5 ) 。 胶质瘤患者外周血单个核细胞f o x p 3 m r n a 表达及t g f p l 含量：胶 质瘤患者外周血单个核细胞中均可见f o x p 3 m r n a 表达，明显高于健康 人，并随胶质瘤恶性级别的增加而升高( p o 0 5 ) 。胶质瘤患者外周血中 均可检测到t g f 1 3 l ，并随着肿瘤恶性程度的升高而增加。直线回归分析 显示，外周血t g f p l 含量与p b m c 中f o x p 3 m r n a 的表达呈正相关 ( f o 9 4 0 ，p o 0 5 ) ，但均明显高于健康者外周血 中文摘要 中的c d 4 + c d 2 5 + t 细胞( 2 3 2 4 - 0 61i - t g m 1 ) ( p o 0 5 ) 。原代胶质瘤细胞大 量分泌c c l 2 2 ( 1 2 1 7 + 1 2 3 i t g m 1 ) ，明显高于c c l l 2 ( 4 6 8 4 - 0 8 3 b t g m 1 ) ( o 0 5 ) 。 3 接种亲代鼠脑胶质瘤细胞9 l 的f 3 4 4 大鼠肿瘤组织中，c d 4 + c d 2 5 + f o x p 3 + t 细胞的浸润数量明显增多，并呈现出时间依赖性。 接种i l 1 8 9 l 和9 l 细胞大鼠脑肿瘤组织中i l 1 8 m r n a 表达：分别 取接种i l 1 8 9 l 细胞和9 l 细胞2 1 d 时的大鼠脑肿瘤组织，经r t - p c r 分 析，结果表明：i l 1 8 9 l 细胞组大鼠脑肿瘤组织中有i l 1 8 m r n a 表达， 而接种9 l 细胞组大鼠脑肿瘤组织中无i l 1 8 m r n a 表达，说明i l 1 8 9 l 细胞在荷瘤大鼠体内仍可表达i l 1 8 。 i l 1 8 对大鼠脾细胞i f n y 产生的影响：接种i l 1 8 9 l 细胞组大鼠脾 细胞可产生高水平i f n 吖( 1 7 8 2 + 1 3 1 p g m 1 ) ，明显高于接种9 l 细胞组 ( 4 0 7 + 5 3 p g m 1 ) ( p o 0 5 ) 。 接种i l 一1 8 9 l 组大鼠生存期为6 6 3 + 5 0 2 d ，明显长于接种9 l 细胞组 大鼠( 4 3 5 + 3 8 7 d ) ( o 0 5 ) 。 结论： 1 胶质瘤患者外周血、肿瘤组织中t r e g 细胞含量明显增加。胶质瘤 组织中c d 8 + t t r e g 细胞比值与患者的预后呈正相关。t r e g 细胞在胶质瘤 组织中的比例尚不能单独作为患者预后的指标。胶质瘤患者外周血中t r e g 细胞的数量与血浆t g f 1 3 l 的水平呈正相关。 2t r e g 细胞在胶质瘤中聚集和发挥免疫抑制作用的可能机制是：胶质 瘤细胞通过c c l 2 2 c c r 4 趋化作用，驱使t r e g 细胞由外周向肿瘤部位迁 移，并在肿瘤部位通过分泌t g f 1 3 l 诱导非t r e g 细胞向t r e g 纽胞转化和 成熟、t r e g 细胞通过细胞细胞接触和分泌抑制性细胞因子t g f 1 3 l 发挥 免疫抑制作用，肿瘤组织中t r e g 细胞数量与其免疫抑制功能密切相关。 3 在荷9 l f 3 4 4 细胞大鼠脑胶质瘤模型中，t r e g 细胞数量明显增多， 并呈现时间依赖性。在鼠脑胶质瘤模型中，i l 1 8 可通过刺激脾细胞增殖， 促进i f n - ) , 分泌，促进c d 8 + t 细胞在肿瘤部位的增殖，提高c d 8 + t t r e g 查塑墨 细胞的比率，解除t r e g 细胞在局部对效应性细胞的抑制作用可抑制鼠脑 胶质瘤的生长，而i l 1 8 在体外对t r e g 细胞增殖和功能无明显作用。 关键词：t r e g 细胞；胶质瘤；细胞因子；免疫基因治疗；免疫逃逸 一 6 s t u d yo nt h ef u n c t i o no ft r e gc e l l sa n di l - 1 8i ng l i o m a a b s t r a c t o b j e c t i v e ：g l i o m a s ，e s p e c i a l l yh i 曲一g r a d eg l i o m a sa r et h em o s tc o m m o n m a l i g n a n tb r a i nt u m o rs h o w e di n f i l t r a t i v eg r o w t h i t sv e r yd i f f i c u l tt oc u tt h e t u m o rc o m p l e t e l y t h eo v e r a l lp r o g n o s i so f g l i o m ap a t i e n t si ss t i l ln o ti d e a li n s p i t eo fc o m p r e h e n s i v et r e a t m e n ti n c l u d i n gr a d i o t h e r a p ya n dc h e m o t h e r a p y t 1一。 lh er e c u r r e n c er a t eo f g l i o m aw a sh i 曲a n dt h es u r v i v a lt i m ef o rp a t i e n t sw i t h h i 曲一g r a d eg l i o m aw e r ee v e nl e s st h a nl y e a r 晰t h t h ec o n t i n u o u s d e v e l o p m e n t o fm o l e c u l a r b i o l o g y , g l i o m ai m m u n o t h e r a p yi s a r o u s i n g p e o p l e sa t t e n t i o ng r a d u a l l y t h ea g g r e s s i v en a t u r eo ft h i sn e o p l a s i ai sc l o s e l y r e l a t e dt oi t sc o m p l e xp a t h o p h y s i o l o g y i np a r t i c u l a r , e v a s i o no ft h ei m m u n e s y s t e mb yg l i o m a sl i m i t se f f e c t i v ea n t i t u m o r a lr e s p o n s e s c u r r e n te v i d e n c e s u g g e s t sam a j o rr o l ei nt h ee v a s i o no fi m m u n er e j e c t i o nb yc d 4 + c d 2 5 + r e g u l a t o r ytc e l l s ( t r e g s ) t r e g sa r el y m p h o c y t e st h a th a v eap h y s i o l o g i c a lr o l ei nt h em o d u l a t i o no f t h ei m m u n e r e s p o n s e s p e c i f i c a l l y , t h e s ec e l l sp r e v e n ta u t o i m m u n i t yb y i n h i b i t i n ga u t o r e a c t i v ee f f e c t o rtl y m p h o c y t e s ，w h i c h d o w n r e g u l a t e st h e a n t i - t u m o r a lr e s p o n s ea n dp r o m o t e st h eg r o w t ho f t u m o r m a n ys t u d i e sh a v e f o u n dal a r g ep o p u l a t i o no ft r e g sw e r ei n f i l t r a t e di nt h et i s s u ea n db l o o do f m a n ym a l i g n a n c i e si n c l u d i n g b r e a s t ，o v a r i a n ，l u n g ，l i v e rc a r c i n o m aa n d m a l i g n a n tl y m p h o m a i t ss u g g e s t e dt h a tt h e p o p u l a t i o no ft r e g sw a s c o r r e l a t e dn e g a t i v e l yw i t ht h e p r o g r e s s i o na n dp r o g n o s i so ft u m o r d e p l e t i o n o ft r e g so ri n h i b i t i o no fi t sf u n c t i o nh a sb e e na s s o c i a t e dw i t hr e c o v c r yo f a n t i t u m o r a lr e s p o n s e t r e g sa r ed i v i d e di n t ot h y m u s d e r i v e dt r e g so rn a t u r a lt r e g s ( n t r e g s ) a n di n d u c i b l et r e g s ( i t r e g s ) n t r e gd e v e l o p m e n tt a k e sp l a c ei nt h et h y m u s a n di t r e g sa r ev e r ys i m i l a ri nf u n c t i o nt o n t r e g sb u td e r i v ef r o mn o n - t r e g c e l l si nt h ep e r i p h e r yu n d e rs p e c i f i cs t i m u l a t i o n n ea b n o r m a li n c r e a s i n g f r e g si nt u m o rm i c r o e n v i r o n m e n ta r ea l s od i v i d e di n t ot w o g r o u p s o n eg r o u p - 一一 7 英文摘要 i n c l u d e st r e g sm i g r a t e df r o mp e r i p h e r yu n d e rt h ei n f l u e n c eo fc h e m o k i n e s t h eo t h e rg r o u pa r ei n d u c e df r o mc d 4 十c d 2 5 - tc e l l su p o nt h ee x p o s u r et ot h e s u p p r e s s i v ec y t o k i n em i l i e ua tt h et u m o rs i t e t r e g ss e p a r a t e df r o mt u m o r i n f i l t r a t e d l y m p h o c y t e su s u a l l yr e p r e s e n tt u m o r - s p e c i f i ca n t i g e n t h e d i f f e r e n t i a t i o na n dm a t u r a t i o no ft r e g st a k ep l a c eu n d e rt h ea c t i o no ft u m o r c e l l s ，w h i c hp r e v e n tt h ef u n c t i o no fe f f e c t o rtc e l l s ( m a i n l yc d 8 + ，c d 4 + ) i m b a l a n c eb e t w e e nt r e g sa n dc o n v e n t i o n a ltc e l l sp l a yar o l ei nt h ei m m u n e e s c a p eo ft u m o rc e l l sa n dr e c o v e r yo fi m b a l a n c em a yb ean e ws t r a t e g yf o r t u m o rt r e a t m e n t a sp r o i n f l a m m a t o r yc y t o k i n e ，i n t e r l e u k i n18 ( i l 一18 ) h a sa l s ob e e n i m p l i c a t e di nm u l t i p l ea u t o i m m u n ea s s o c i a t e dd i s e a s e ，s u c ha sr h e u m a t o i d a r t h r i t i s ，s a r c o i d o s i s ，l u p u se r y t h e m a t o s u s t r e g sh a v eb e e nr e p o r t e dt ob e d e c r e a s e do rt oh a v ed e c r e a s e df u n c t i o n a la c t i v i t yi nan u m b e ro fa u t o i m m u n e d i s o r d e r s ，a n di ti sp o s s i b l et h a ta ni m b a l a n c eo ft r e g sa n de f f e c t o rtc e l l sd u e t od i f f e r e n t i a li l - 18s i g n a l i n gc o n t r i b u t e st ot h el o s so ft o l e r a n c e s e v e r a l p r e c l i n i c a ls t u d i e sh a v es u g g e s t e dt h a ti l 一18m a yh a v es i g n i f i c a n ta n t i t u m o r e f f e c t s i l 一18e n h a n c e st h ep r o d u c t i o no fi f n - yb ytc e l l sa n dn kc e l l sa n d c a na u g m e n tt h ec y t o l y t i ca c t i v i t yo fn kc e l l sa n dc y t o t o x i ct l y m p h o c y t e s ( c t l ) i l 一18p r o m o t e st h ed i f f e r e n t i a t i o no fa c t i v a t e dc d 4t c e l l si n t oh e l p e r e f f e c t o rc e l l so ft hlo rt h 2t y p e i t sn o tc l e a r , h o w e v e r , t h a ti l 一18c a n m a n i p u l a t et h ef u n c t i o no ft r e g si nt u m o rm i c r o e n v i r o n m e n t a i mo fo u ri n v e s t i g a t i o ni st od i s c u s st h ee x p r e s s i o no f t r e g si nc a n c e r t i s s u ef r o mp a t i e n t sw i t hg l i o m a , t h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ep o p u l a t i o no f t r e g sa n dp r o g r e s s i o no ft u m o r , i n v e s t i g a t et h ei n h i b i t o r ym e c h a n i s mo ft r e g s f o ri m m u n ef a n c t i o n ，a n a l y z et h em a n i p u l a t i o no fl l 一18o n t r e g s m e t h o d s ： 1t u m o rt i s s u ea n db l o o do f 7 6p a t i e n t sw i t ha s t r o c y t o m aw e r ec o l l e c t e d ， w h ow e r eo p e r a t e di nt h ed e p a r t m e n to fn e u r o s u r g e r yo ft h e4 廿1 h o s p i t a l a f f i l i a t e dt oh e b e im e d i c a lu n i v e r s i t yf r o ms e p t e m b e r , 2 0 0 7t os e p t e m b e r , 2 0 0 9 n o r m a lb r a i nt i s s u ea n db l o o dw e r eu s e df o rc o n t r o l ，w h i c hw e r ef r o m p a t i e n t sw i t hd e c o m p r e s s i o ns u r g e r yf o rh e r n i a t i o na n dh e a l t hv o l u n t e e r s 8 英文摘要 t i l sa n dp b m c sw e r es e p a r a t e df r o mt u m o rt i s s u ea n db l o o d t h e f r e q u e n c yo ft r e g s ，c d 4 十t c e l l sa n dc d 8 十tc e l l sa n dr a t i ob e t w e e nt r e g sa n d o t h e rtc e l l si nt i l sa n dp b m cw e r ed e t e c t e db yf l o wc y t o m e t r y t h e n ，t h e f r e q u e n c ya n dr a t i oo ft r e g sw e r ea n a l y z e da n do b s e r v et h er e l a t i o n s h i p b e t w e e nt r e g sa n dc l i n i c a lp a t h o l o g i c a lc h a r a c t e r s ，p r o g n o s i so fp a t i e n t sw i t h a s t r o c y t o m a e x p r e s s i o no ft g f - 1 3 1i np e r i p h e r yb l o o dw e r ea n a l y z e db ye l i s a t h e f o x p 3 m r n a i np b m cw e r ed e t e c t e d b yr t - p c r , a n da n a l y z e t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ee x p r e s s i o no f f o x p 3 m r n a a n dt g f p 1 2t u m o rt i s s u ea n db l o o do f5p a t i e n t sw i t hg l i o b l a s t o m aw e r ec o l l e c t e d ， w h ow e r eo p e r a t e di nt h ed e p a r t m e n to fn e u r o s u r g e r yo ft h e4 mh o s p i t a l a f f i l i a t e dt oh e b e im e d i c a lu n i v e r s i t yf r o ms e p t e m b e r , 2 0 0 8t os e p t e m b e r , 2 0 0 9 n o r m a lb r a i nt i s s u ea n db l o o dw e r eu s e df o rc o n t r o l ，w h i c hw e r ef r o m p a t i e n t sw i t hd e c o m p r e s s i o ns u r g e r y f o rh e r n i a t i o na n dh e a l t hv o l u n t e e r s p r i m a r yg l i o m ac e l l sa n dp r i m a r yn o r m a la s t r o c y t ew e r ec u l t u r e di nv i t r oa n d i d e n t i f i e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , r e s p e c t i v e l y p r i m a r yg l i o m ac e l l sa n d p r i m a r yn o r m a la s t r o c y t e sw e r ec u l t u r e ds u c c e s s f u l l yi nv i t r o ，a n di d e n t i f i e d b yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y c d 4 + c d 2 5 + tc e l l s ，c d 4 + c d 2 5 tc e l l sa n dc d s + t c e l l sf r o mt i la n dp b m cw e r ei s o l a t e db yi m m u n o m a g n e t i cs e p a r a t i o n s y s t e m a f t e rm a g n e t i ca c t i v a t e d c e l ls o r t i n g ，t h ep u r i t yo fc d 4 十c d 2 5 ， c d 8 + tc e l l sw a s 8 9 9 2 ，h i g h e r t h a n9 0 a n d 8 7 9 4 ， r e s p e c t i v e l y c d 4 + c d 2 5 。t c e l l sw e r et h e nc o c u l t u r e dw i t hc d 4 十c d 2 5 十tc e l l s i nd i f f e r e n tp o p u l a t i o n 【3 i - i 一t d ri n c o r p o r a t i o nw e r eu s e dt od e t e r m i n et h e p r o l i f e r a t i o no f c d 4 + c d 2 5 tc e l l s e x p r e s s i o no ff o x p 3 ，c t l a 一4 ，g i t r , c c r 4a n dc c r 8p r o t e i nw e r e d e t e c t e db yw e s tb l o t t h es e c r e t i o no ft g f p l c c l 2 2a n dc c l12i nt h e m e d i u ms u p e r n a t a n to fp r i m a r yg l i o m ac e l l s ，p r i m a r yn o r m a la s t r o c y t ea n d d i f f e r e n tc d 4 + c d 2 5 + tc e l l s 33 0m a l ef i s h e r 3 4 4r a t sw e r ed i v i d e dr a n d o m l yi n t o2g r o u p s ：9 lg r o u p a n di l 18 9 lg r o u p 9 lc e l l sa n di l - 18 9 lc e l l sw e r ei n o c u l a t e di n t ot h er i g h t c e r e b r a lh e m i s p h e r e ，r e s p e c t i v e l y t h r e em i c eo f e a c hg r o u pw e r ek i l l e do nt h e 9 英文摘要 7 m 14 ma n d21 吼d a ya f t e ri n o c u l a t i o no ft u m o rc e l l s ，t h es p l e e n sa n dt u m o r s w e r eo b t a i n e df r o mm i c e 6r a t sr e m a i n e do fe v e r yg r o u pw e r eo b s e r v e df o r o v e rs u r v i v a lt i m e e x p r e s s i o no fi l 18 m r n a i nr a tt u m o rt i s s u ew e r ed e t e c t e db yr t - p c r 【3 h i t d ri n c o r p o r a t i o n w e r eu s e dt od e t e r m i n et h e p r o l i f e r a t i o n o f c d 4 + c d 2 5 tc e l l s t h ef r e q u e n c yo ft r e g s ，c d 4 + tc e l l sa n dc d 8 + tc e l l sa n d r a t i ob e t w e e nt r e g sa n do t h e rtc e l l si nt i l sa n dp b m cw e r ed e t e c t e db y f l o wc y t o m e t r yo n21 吼d a ya f t e ri n o c u l a t i o no ft u m o rc e l l s i f n - ? p r o d u c t e d b ys p l e n o c y t e sw e r ed e t e c t e dw i t h e l i s a o n21 吼d a ya f t e ri n o c u l a t i o no ft u m o rc e l l s ，c d 4 + c d 2 5 十tc e l l s ， c d 4 + c d 2 5 岬rc e l l sa n dc d 8 + tc e l l sf r o mt i la n dp b m co fr a t sw e r ei s o l a t e d b yi m m u n o m a g n e t i cs e p a r a t i o ns y s t e m c d 4 十c d 2 5 t c e l l sw e r et h e n c o c u l t u r e dw i t hc d 4 + c