（劳动卫生与环境卫生学专业论文）几种美白化学物对皮肤黑素细胞的生物学效应.pdf

几种美白化学物对皮肤黑素细胞的生物学效应 ( 中文摘要) 对几种常用美白化学物进行了黑素细胞毒性和黑素合成的功效 测试，初步探讨黑素细胞的黑素合成新机制，以期为今后美白化学物 的研究开发和卫生监督提供依据。 鼬用熊果苷、曲酸、v c 衍生物、干草提取物和氢醌等化学物进 行细胞毒性试验。结果显示，这些化合物均可明显损伤b 一1 6 黑素瘤 细胞和人皮肤黑素细胞。美白化学物对人皮肤黑素细胞的损伤比b 一1 6 细胞株更为敏感。使用时建议以低于5 0 9 9 m l 剂量为宜；并在美白化 妆品和临床用药中应不使用或严格限量使用氢醌。在筛选美白化学物 时以人皮肤黑素细胞的毒性结果为依据，b 一1 6 细胞株的毒性结果为 参考。 几种美白化学物均可抑制b - 1 6 细胞株和人皮肤黑素细胞的黑素 合成，但对酪氨酸酶活性抑制不明显。在皮肤美白功效评价中，应以 黑素含量改变的结果为基准。有条件时，可采用图像分析技术进行黑 素的定量分析。 实验显示，抑制与信号传导有关的蛋白激酶c 和腺苷酸环化酶， 可影响黑素细胞形态和细胞周期，降低黑素细胞中黑素含量，但对酪 氨酸酶活性影响不大。在干扰黑素合成过程中，蛋白激酶c 的作用强 于腺苷酸环化酶，两者且具有相加作用。提示蛋白激酶c 和腺苷酸环 化酶可能是干预黑素合成的重要途径之一。 市售护肤化妆品和美白化妆品可引起不同程度的轻度皮肤损害， 应引起重视。 植物提取物一f 1 0 3 4 ，毒性较低，可明显降低黑素细胞中黑素含量， 有望成为美白化妆品的有效成分。 提出了包括细胞实验和动物及人体肤色变化检测的美白化学物 功效评价程序的初步建议。 论文对美白化学物的安全使用、功效评价方法及黑素合成机制的 新见解等提出了具有理论意义和实际应用价值的合理性建议。y ， 关键词 黑素细胞j 美白化学物细胞毒性信号传导功效评价 中图分类母：t q 6 5 8 蒸塞塑茎 b i o l o g i c a le f f e c t so f s e v e r a ls k i n l i g h t e n e r s o nh u m a n m e l a n o c y t e s ( a b s t r a c t ) i no r d e rt oi n v e n ts k i nl i g h t e n e r sa n d p r o v i d eab a s i sf o rh y g i e n i cs u r v e i l l a n c e ， t h em e a s u r e m e n to f c y t o t o x i c i t ya n de f f i c a c yw e r ep e r f o r m e di nh u m a nm e l a n o c y t e s f o rs e v e r a lc h e m i c a l s t h en e wm e c h a n i s m so fm e l a n o g e n e s i sw e r ea l s o s t u d i e d i n i t i a l l y c y t o t o x i c i t yo fs e v e r a lc h e m i c a l s ，s u c h a s a r b u t i n ，k o j i ca c i d ，a s c o r b i c a c i d d e r i v a t i v e s ，l i c o r i c ee x t r a c ta n dh y d r o q u i n o n ew a se x a m i n e du s i n gb o t hh u m a n m e l a n o c y t e sa n db - 1 6m e l a n o m ac e l l s h u m a nm e l a n o c y t e sw e r ed a m a g e di nt h e l o w e rd o s e so f t h o s e c h e m i c a l s ，c o m p a r e dt ob 一1 6m e l a n o m a c e l l s i ti ss u g g e s t e dt h a t t h ed o s eo ft h o s ec h e m i c a l ss h o u l db el e s st h a n5 0 0 9 m la n d h y d r o q u i n o n es h o u l dn o t b eu s e d ( o ri t sd o s es h o u l db el i m i t e ds t r i c t l y ) w h e nu s i n gf o rl i g h t e n i n gc o s m e t i c s a n d o rd r u g s t h ec y t o t o x i c i t yd a t af r o mh u m a n m e l a n o c y t e sc o u l db eu s e da sc r i t e r i a ， b u tt h o s ef r o mb 1 6m e l a n o m ac e l l s o n l y a sr e f e r e n c ef o rt h e s c r e e n i n go fs k i n l i g h t e n e r s s e v e r a lc h e m i c a l ss i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e dt h em e l a n o g e n e s i s ，b u td i dn o tr e d u c et h e a c t i v i t i e so f t y r o s i n a s es i g n i f i c a n t l yi nb o t hh a m a nm e l a n o c y t e sa n db 一1 6m e l a n o m a c e i l s i nt h ee f f i c a c ym e a s u r e m e n to fs k i nl i g h t e n e r s ，t h ec o n t e n t so fm e l a n i ni sm o r e i m p o r t a n tt h a nt h ea c t i v i t i e so ft y r o s i n a s ea n dt h ei m a g ea n a l y s i ss y s t e mc o u l db e u s e dt oq u a n t i t a t em e l a n i n t h ei n h i b i t i o no fp r o t e i nk i n a s ec ( p k c ) a n da d e n y l y lc y c l a s e ( a c ) r e l a t e dt o s i g n a lt r a n s d u c t i o nc a ns i g n i f i c a n td e c r e a s et h ec o n t e n t so fm e l a n i n ，i n f l u e n c et h e m o r p h o s i sa n dt h ec y c l ek i n e t i c sa n dn o tr e d u c et h ea c t i v i t i e s o ft y r o s i n a s ei n m e l a n o c y t e s ，s i g n i f i c a n t l y p k cd e c r e a s e dm e l a n o g e n e s i ss t r o n g e rt h a na c ，b u ta n a d d i t i o n a la c t i o nw a so b s e r v e dw h e nt h ec o m b i n e di n h i b i t i o no fp k ca n da c i tw a s s u g g e s t e d t h a tp k ca n da c m a yp l a ya ni m p o r t a n t r o l et oi n t e r f e r em e l a n o g e n e s i s i ts h o u l db e p a i d m o r ea t t e n t i o nt oc o m m e r c i a lp r e v e n t i v ea n d l i 曲t e n i n gc o s m e t i c s ， w h i c h m a y c a u s ea ni n j u r yo fs k i n ap l a n te x t r a c t ( f 1 0 3 4 ) c o u l db e c o m ea ne f f e c t i v e i n g r e d i e n t o f l i g h t e n i n g c o s m e t i c s ，d u et oi t sl o wt o x i c i t ya n de f f e c to nd e c r e a s i n gt h ec o n t e n t so fm e l a n i n i nt h i s s t u d y , a ne f f i c a c ym e a s u r e m e n to fs k i nl i g h t e n e r s ，i n c l u d i n gt h et e s to f m e l a n o c y t e sa n d t h em e a s u r e m e n to fs k i nc o l o ri nh u m a na n da n i m a l ，w a sp r o p o s e d a s a f e t yd o s ew a ss u g g e s t e df o rt h et e s t e dc h e m i c a l sw h e nu s i n ga ss k i nl i g h t e n e r s a tt h es a m et i m e ，t h eu n d e r l y i n gm e c h a n i s m so f m e l a n o g e n e s i sw e r ei n v e s t i g a t e d k e yw o l i d s m e l a n o c y t e s k i nl i g h t e n e r s c y t o t o x i c i t y s i g n a lt r a n s d u c t i o n e f f i c a c ya s s e s s m e n t 前言 前言 ( i n t r o d u c t l 0 n ) 皮肤主要由角质形成细胞( k e r a t i n o c y t e ) 、成纤维细胞( f i b r o b l a s t ) 、 郎格罕氏细胞( l a n g e r h a n sc e l l ) 及黑素细胞( m e l a n o c y t e ) 等四种细胞 组成。角质形成细胞构成皮肤的屏障，成纤维细胞合成的胶元蛋白 构成皮肤的框架，郎格罕氏细胞具有免疫功能1 , 2 1 ，黑素细胞通过合 成黑素，使人类具有不同的肤色，皮肤中的黑素还可以吸收太阳光 中的紫外线，保护人体免受紫外辐射的损伤。 皮肤黑素细胞属腺细胞，具有树状突起，它起源于胚胎神经嵴， 随胚胎发育移行至表皮基底层，并通过树状突起，以1 ：3 6 的比例与 角质形成细胞构成一个表皮单位。皮肤中约有4 0 0 万个黑素细胞， 通过致密斑与基底膜相连。电镜下，黑素细胞核呈圆形，因缺乏张 力细丝，故胞质清亮，无桥粒，有形成黑素的膜性细胞器即黑素小 体( m e l a n o s o m e ) 3 1o 黑素细胞可进行有丝分裂，也可脱离基底层， 并在活的表皮细胞中崩解脱落。黑素细胞合成的黑素，经树枝状突 起分泌到角质形成细胞内，在角质形成细胞溶酶体内降解，随表皮 细胞的脱落而排出。 目前公认的黑素合成途径： 酪氨酸斗多巴一多巴醌啼多巴色素斗二羟基吲哚斗酮式 吲哚斗黑素，合成的黑素叫优黑素或真黑素，皮肤的色素主要由其 组成。在黑素合成中，多巴醌还可通过另一途径经谷光甘肽或半胱 氨酸催化生成褐黑素，但褐黑素在皮肤中的功效尚不了解【4 1 。 在研究黑素合成的过程中，黑素合成机制一直是关注的焦点。早 年研究发现，酪氨酸酶( t y r o s i n a s e ) 是黑素合成途径中关键的限速 酶，但是通过深入研究发现，酪氨酸酶并不是调控黑素合成的唯一 限速酶。除酪氨酸酶外，多巴色素互变酶( d o p a c h r o m et a u t o m e r a s e ) 前言 和二羟基吲哚羧酸( d h i c a ) 氧化酶，也在其中起着重要作用，使 黑素合成机制的探索向前跨越了一步。依据三酶联合作用的观点， 虽能较好地解释黑素细胞合成黑素的机制，仍不够完善，这就为研 究人员提出了新的课题p j 。 随着分子生物学实验技术的发展，研究人员发现：( 1 ) 许多外 界因子可能是通过黑素细胞膜表面的受体进入细胞内，经下游信号 传导来调控相应的靶点，引起细胞物质主要是蛋白质磷酸化或去磷 酸化，对黑素细胞增殖、分化发挥调节作用。可能与黑素细胞增殖、 分化有关的信号传导途径是：二脂酰甘油蛋白激酶c ( d a g p k c ) 途 径1 6 l 、一氧化氮环磷酸鸟苷蛋白激酶g ( n o c g m p p k g v 7 1 、丝裂 原激活的蛋白激酶( m a p k ) 级联途径【8 】和环磷酸腺苷蛋白激酶 a ( c a m p p k a ) 一1 途径。( 2 ) 体内许多因素均可影响黑素细胞与黑素 合成过程。对基因突变鼠的研究中发现，m t 、s p 、s 、l s 、d o m 等 基因片段参与调控神经嵴中黑素细胞的分化增殖，影响多能干细胞 向黑素细胞干细胞的分化，影响包括黑素细胞在内的许多细胞的成 熟。原癌基因c k i t 编码c k i t 受体，c k h 及其配体组成的细胞信号系 统对黑素细胞的分化和生长有重要调控作用【l0 。具有调节作用的激 素主要包括：促黑素细胞激素( m e l a n o c y t es t i m u l a t i n gh o r m o n e ， m s h ) 、促。肾上腺皮质激素( a c t h ) 和雌激素。促黑素细胞激素及 促肾上腺皮质激素可刺激黑素细胞增殖，使黑素细胞树突增多，酪 氨酸酶活性升高，黑素合成增加；在生理状态下，促肾上腺皮质激 素对黑素合成的影响可能要比促黑素细胞激素的作用更大。雌激素 与黑素细胞浆及胞核内的受体结合，使酪氨酸酶活性升高，黑素合 成增加，其中1 71 3 雌二醇作用较强，雌三醇和雌酮作用较弱。机体 中的许多细胞因子对黑素细胞的增殖分化都有影响。能够促进黑素 细胞生长、存活的因子有：碱性成纤维细胞生长因子( b a s ef i b r o b l a s t 前言 g r o w t hf a c t o r , b f g f ) 、内皮素( e t 1 ) 、神经细胞生长因子( n g f ) 等；抑制黑素细胞增殖，使酪氨酸酶活性降低的有：白细胞介素 1 a ( i l 1 a ) 、白细胞介素6 、肿瘤坏死因子等。此外，干细胞生长因 子( s c f ) 能促进黑素细胞分化及黑素合成；干扰素( i f n ) 在一定 条件下，能使黑素细胞形态改变、生长抑制；炎症介质白三烯 c 4 ( l t c 4 ) 是人黑素细胞的促分裂原，能引起黑素细胞快速增生，并 对黑素细胞有趋化作用 i l l 。( 3 ) 体外许多化学因素( 石油类化合物 及砷类化合物等) ，均可刺激黑素细胞增生，黑素合成增加，导致色 素沉着性疾病。物理因素中以紫外线为主，紫外线是人体长期接触 的一个外界刺激因素，它可直接刺激黑素细胞，使黑素细胞树突增 多，酪氨酸酶活性升高，细胞内黑素总量增加。但照射剂量过大， 可使黑素细胞增殖下降，甚至停止。紫外线也可通过角质形成细胞 分泌细胞因子来影响黑素细胞的增殖、分化及黑素合成。以上这些 新的发现，开阔了人们的视野，使黑素合成机制研究进入了一个更 深入、更广泛的领域，也使人们了解黑索合成过程的复杂性。 皮肤由于具有一定的肤色，使人类能够抵御宇宙紫外辐射的伤 害，从而在地球上生存至今。但肤色过深却违背了人类的爱美天性， 尤其亚洲妇女更为崇尚皮肤白皙的美态。随着经济的发展，生活水 平的提高，我国女性为追求生活质量、适应时代交际等需要，也越 来越重视皮肤的白润美，通过使用各种品牌的美白化妆品来达到美 白皮肤的目的。目前比较常用的皮肤美白化学物有熊果苷、曲酸、 v c 衍生物和干草提取物等，这些美白化学物通过抑制黑素细胞合成 黑素而降低肤色。 美白化学物系指可降低皮肤色度或减轻色素沉着，以达到皮肤美 自为目的的天然或人工合成的化合物。然而美白化学物作为外来物 质，在干预皮肤黑素细胞的黑素合成功能，以达到美白皮肤目的的 前言 同时，也干扰了皮肤正常的生理功能，甚至产生皮肤损害 1 2 1 。在美 白化学物的生产、使用过程中存在许多盲区，这包括常用美白化学 物的功效和对黑素细胞的毒性不明确。至今，国内未见有关常用皮 肤美白化学物对人皮肤黑素细胞毒性的研究报道，也缺少有关美白 化学物对黑素细胞功效测试的系统报告。因此有必要对常用皮肤美 白化学物的生理功效和黑素细胞毒性进行检测；调查美白化妆品消 费者的卫生状况；并研究更为有效、确切的美白化学物对黑素细胞 的作用和毒性检测的方法，为美白化妆品的生产、安全使用和卫生 监督提供依据；并探讨黑素合成机制，为美白化学物的研究开发提 供新的理论思路。 第一部分几种美白化学物的细胞毒性检测 c u t a n e o u sc y t o t o x i c i t yo fs k i nl i g h t e n e r s 黑素细胞是皮肤的重要组成细胞之一，存在于表皮基底层，通过 树状突起与角质形成细胞构成一个表皮单位。黑素细胞通过合成黑 素形成皮肤颜色，同时可吸收紫外线，使机体免遭紫外线的损害1 1 引。 但是如果黑素细胞合成的黑素过多或分布不均匀，会导致肤色过深 或色斑，而肤色深浅又为现代女性所关注，尤其是亚洲女性最为崇 尚皮肤白润的美态。由此，许多化妆品或医药公司研制、生产美白 化学物来满足人们美的需求，越来越多的女性使用美白化妆品来增 白皮肤或治疗色素沉着性疾病。如果生产厂家及使用单位对美白化 学物的种类、剂量选择不当，就有可能对美白化妆品的生产者和使 用者的皮肤黑素细胞造成损害，影响机体健康。目前国内尚缺少有 关常用皮肤美白化学物对皮肤黑素细胞毒性的研究报道，为此我们 选择几种常用皮肤美白化学物，以人皮肤原代黑素细胞作为受试细 胞，进行细胞毒性测定，以期为美白化妆品的生产、使用和卫生监 督提供一些依据。由于b 。1 6 黑素瘤细胞株是国际上比较通用的测试 细胞，我们也选择其进行美白化学物的测试，了解人皮肤原代黑素 细胞与b 1 6 黑素瘤细胞株在测试效果上的差异，为美白化学物功效 检测方法的改进提供科学依据。 第一节人皮肤黑素细胞的原代培养 黑素细胞起源于胚胎神经嵴，随着胚胎发育，移行至表皮基底 层。在表皮基底层的黑色素细胞平均为1 5 6 0 c m 2 ，正常情况下，黑 素细胞不发生增殖【14 1 。体外培养时，在培养基中添加一些促黑素细 胞生长因子刺激其生长，可得到纯黑素细胞。体外培养的黑素细胞 不但可用于美白化学物的研究开发，也可以用于临床白癜风的治疗， 因此具有广阔的应用前景。但是体外培养黑素细胞也存在一些问题， 首先是皮肤来源比较困难，二是目前的培养方法均在培养液中加入 一些昂贵的细胞因子，使得培养成本较高。我们参照国内外介绍的 方法，对其进行一定的改进，建立了人体皮肤黑素细胞的原代培养 方法。 材料与方法 试剂 1 胰岛素( 美国s i g m a 公司) 2 m c d b l 5 3 培养基( 美国s i g m a 公司) 3 胎牛血清( 美国g i b c o 公司) 4 c h o l e r at o x i n ，c t ( 美国s i g m a 公司) 5 3 - l s o b u t y l 一1 - m e t h y l x a n t h i n e ，i b m x ( 美国s i g m a 公司) 6 12 一o t e t r a d e c a n o y l p h o r b o l - 13 - a c e t a t e ，t p a ( 美国s i g m a 公司) 7 ，氢化考的松( 上海信宜药厂) 8 青霉素，链霉素( 上海四药股份有限公司) 9 d h a n k s 液( n a c l8 9 ，k c l0 4 9 ，n h p 0 4 。1 2 1 - 1 2 00 0 6 9 ，k h 2 p 0 4 0 0 6 9 ，n a c 0 3o 3 5 9 ，用重蒸水配置。) 1 0 0 2 5 胰蛋白酶溶液( 3 7 5 9 胰蛋白酶溶于5 0 0 m ld 。h a n k s 中。) 1 1 m c d b l 5 3 培养液：其成分为霍乱毒素0 2 p g m l ，i b m x 1 0 。 4 m o l l ，氢化考的松o 5 p g m l ，胰岛素5 9 9 m l ，青霉素1 0 0 u m l ， 链霉素0 1 m g m l ，t p a8 n m o l l 。 仪器 1 光学显微镜，日本，n i k o n 2 倒置显微镜，日本，n i k o n 3 c o ，培养箱，美国r e v c o 公司 4 普通离心机( 转速为1 0 0 0 1 0 0 0 0 r p m ) 5 超净工作台，上海净化设备厂。 6 2 5 c m 2 培养瓶，美国c o m i n g 公司。 培养步骤 取包皮环切皮肤，经d h a n k s 液清洗后，去除皮下组织，并分 割成2 c m x 2 c m 左右的小片，表皮向上铺于平皿中，0 2 5 胰蛋白酶 4 c 消化约1 2 小时。将分离后的表皮置于m c d b l 5 3 培养液中，吹 打成单细胞悬液，离心后计数。按2 1 0 5 r n l 的密度接种于2 5 c m 2 培 养瓶中，隔天换液，1 0 天后备用。 结果 原代培养后第1 0 天，可见黑素细胞贴壁生长，有明显的树突 细胞融合成网，高倍镜下可见黑素颗粒。第1 5 天时，细胞更密集。 兰二墅坌 图1 2 人皮肤黑素细胞，第1 0 天，( x 4 0 0 倍) 图1 4 人皮肤黑素细胞，第1 5 天，( x 4 0 0 倍) 讨论 体外培养人体黑素细胞对研究黑素细胞的生理结构、美白化妆 品的开发、紫外线的防护及临床色素性疾病的治疗等提供重要的条 件和途径。1 9 6 0 年c r u i c k s h a n k 1 5 l 首先在体外培养成功人皮肤黑素 细胞以来，由于培养技术的限制，难以在体外培养条件下，获得大 量纯化的黑素细胞，使有关黑素细胞生理功能及黑素合成机制的研 究一直停步不前。随着细胞生物技术的发展，1 9 8 2 年e i s i n g e r 和 m a r k o 首先获得体外纯化黑素细胞培养的成功1 1 6 l ，使相关研究取得 较大进展。国内，1 9 9 1 年赵辩等首先报道，体外培养人皮肤黑素细 胞成功【1 7 】。这些培养方法均需要在培养液中添加比较昂贵的细胞 因子如：碱性成纤维细胞生长因子、神经细胞生长因子及脑垂体提 取物等，导致培养成本过高，不利于黑素细胞培养方法的推广应用。 我们参照国内外的方法，取长补短，采用m c d b l 5 3 为培养液，取 消添加各种细胞因子，通过调整培养液中c t 、i b m x 和t p a 等的 含量，刺激黑素细胞生长，成功建立了稳定的人体黑素细胞原代培 养方法，可在较短时间内获得大量的纯化黑素细胞，为今后的研究 工作打下了基础。 在培养液中添加c t 、i b m x 和t p a ，对黑素细胞的生长起着 重要的作用，我们发现如能控制好它们的浓度，即使没有细胞生长 因子，黑素细胞也能生长良好，满足实验需要。研究发现，c t 是 腺苷酸环化酶( a c ) 激动剂；i b m x 是磷酸二酯酶抑制剂，两者相 互配合能够调控c a m p a c 信号传导途径，增加黑素细胞中c a m p 浓度，诱导黑素细胞增殖分化【1 8 】。t p a 是蛋白激酶c ( p k c ) 激 动剂，通过刺激蛋白激酶c ，调控二脂酰甘油( d a g ) 蛋白激酶 c ( p k c ) 信号传导，促进黑素细胞的分裂增殖【1 9 】。t p a 是公认 的促癌剂，使用t p a 进行黑素细胞体外培养，黑素细胞是否会发 生恶变，是研究者首要关心的问题。至今尚无t p a 致体外培养黑 素细胞发生恶性转化的文献报道。b e n n e t t 等研究发现，培养正常 人皮肤黑素细胞，传2 7 代后接种于裸鼠，8 周后，常规病理检查及 电镜观察未见异常，传2 8 代后，黑素细胞染色体仍为二倍体。同 样，采用t p a 培养小鼠黑素细胞，传1 5 代后接种同种小鼠和裸鼠， 5 - 6 个月后，经组织学检查未见肿瘤形成 2 0 , 2 1 l 。自1 9 8 7 年l e r n e r a b 进行第一例黑素细胞移植治疗白癜风病人的报道【2 2 1 ，自体移植黑 素细胞已有1 0 余年了，未见恶性变报告，使体外培养黑素细胞的 安全性已为广泛接受。 从图1 1 、1 2 、1 3 和1 4 可以看出，黑素细胞生长良好，细胞 数量多，轮廓清晰，随着培养时间的延长，细胞数量增加，树状突 起明显、分枝众多，细胞融合趋势旺盛。细胞内和沿树状突起可见 明显的黑素小体颗粒，表明培养的黑素细胞是正常细胞，具有正常 人体黑素细胞的生理功能，能够合成、输送黑素。此结果显示，原 代培养的黑素细胞可以体现正常人体黑素细胞的形态，具备正常黑 素细胞的生理功能，如果通过体外培养黑素细胞进行各种实验研 究，所获得的数据是可信的，其结果外推到人，应该是可靠的。从 而为下一步的研究工作打下了良好基础。 第二节对人皮肤黑素细胞的毒效应 随着生活水平的提高，人们开始注重外表美，亚洲女性尤其偏 爱皮肤美白类化妆品，使得美白化妆品的需求量不断增加。为满足 广大消费者的需求，化妆品研究生产机构投入大量资金开发美白化 学物，每年都有新型配方的美白化妆品投入市场。在美白化学物的 研究开发过程中，化妆品研究生产机构多注重功效，轻毒性评价， 投入市场的美白化妆品均缺乏细胞毒性检测资料，国内美白化妆品 生产单位，主要是通过购买现有、已知的美白有效成分来生产美白 化妆品，未见全面的美白化学物毒性研究报道。在美白化妆品的宣 传中只提功效不说副反应和毒性，造成消费者购买美白化妆品的盲 目性，导致时有副作用的发生【2 3 1 。 在美白化学物的研究开发过程中，国外通常以b 1 6 黑素瘤细 胞株为受试对象，进行功效和毒性评价，这主要因为b 1 6 是细胞 株，具有经济、来源广、生理功能与人皮肤黑素细胞相似和易于培 养的特点。但是b 1 6 毕竟是肿瘤细胞，由肿瘤细胞的结果外推到 人可能会存在一定的差异。为此，我们以原代培养的人皮肤黑素细 胞作为受试对象，进行常用美白化学物的毒性检测。以期取得更为 可靠的资料，为有关研究工作提供参考。 材料与方法 试剂与仪器： 试剂：( 1 ) 受试物：熊果苷溶液、曲酸溶液、v - c 衍生物溶液、干 草提取物溶液( 上海奥利实业有限公司赠送) 。 ( 2 ) 氢醌( 中国医药上海试剂供应站) 。 ( 3 ) f 1 0 3 4 为植物提取物( 友人赠送) ( 4 ) 甘氨酸( 美国b i o m o l 公司，上海华美公司分装) ； ( 5 ) 乳酸钠( 上海试剂三厂) ； ( 6 ) 二硝基苯肼( 上海试剂三厂) ； ( 7 ) 丙酮酸( 美国a m r e s c o 公司，上海吉泰公司分装) ； ( 8 ) m c d b l 5 3 培养基( 美国s i g m a 公司) 。 2 仪器： ( 1 ) c o ，培养箱，美国r e v c o 公司。 ( 2 ) 7 2 3 0 g 分光光度计( 上海分析仪器厂) 。 ( 3 ) 3 7 0 c 电热恒温水浴锅。 ( 4 ) 3 5 c m 塑料培养皿( 美国c o m i n g 公司) 方法 1 细胞培养 取人包皮环切皮肤( 年龄小于5 0 岁) ，去除皮下组织，经0 2 5 胰蛋白酶消化1 2 小时后，分离表、真皮，吹打表皮获得黑素细胞， 接种于直径3 5 c m 塑料培养皿中，用m c d b l 5 3 培养液，置于c o ， 培养箱3 7 。c ，5 c o ，饱和湿度环境进行培养，隔天换液，于第 九天开始加受试物进行实验。每一次实验取自同一批细胞，初始接 种细胞浓度为1 0 5 左右。细胞接种2 小时后，除设空白对照组外， 并添加受试美白化学物( 参考a s h o kc h a k r a b o r t y 等进行熊果菅功 效测定所使用的剂量【2 4 】) ，各设5 个剂量组，于第3 天更换培养液 和受试美白化学物，连续培养5 天后收获细胞，用台盼蓝染色计数 细胞总数及死亡细胞数，并通过死亡细胞数反映这些化学物的致死 效应，然后将细胞分为三份作为平行样，用作乳酸脱氢酶( l d h ) 测定。 2l d t t 检测【2 5 ，2 6 j 当细胞生长至8 0 融合时，弃去原培养液，分别加入含有受试 物( 熊果苷、曲酸、甘草提取物、v - c 衍生物及f 1 0 3 4 ) 的m c d b l 5 3 培养液，浓度依次为1 0 i t g m l 、3 0 x g m l 、5 0 p g m l 、7 0 p g m l 及 1 0 0 p g m l ，隔天换液，于第五天终止培养。取上清夜0 5 m l 一加0 5 m l 基质缓冲液一充分混匀一3 7 水浴3 分钟一加辅酶10 1 m 1 一摇 匀，3 7 水浴1 5 分钟一加o 5 r n l 二硝基苯肼一3 7 水浴1 5 分钟一 加0 4 m o l ln a 0 h5 m l ，显色后于4 0 0 n m 光谱处进行比色，查标准 曲线，确定l d h ( u n i t l ) 含量。 统计分析 结果 使用e x c e l 软件对数据进行统计分析。 1 2 1 几种美白化学物对细胞数量的影响 图1 5 几种美白化学物对细胞数量( 1 0 5 m 1 ) 的影响 ：6十熊果苷 毒5 _ 鲁4 、h + 曲酸 ：3 心 甘草 一一* 一v c 蚓2 受* 3 - ，o 和f 1 0 3 4 羹1 卜c o n t r o l 熏u 。 。 。 。 心、 梦 由图1 5 可见，与空白对照组相比，当几种美白化学物的剂量达到 1 0 肛g m l 以上时，黑素细胞数量均明显下降( p 0 0 1 ) ，其中以干 草提取物的作用最为明显，我们发现的植物提取物f 1 0 3 4 ，当剂量 为5 0 p g m l 时，对细胞数量的影响最明显。 1 2 2 几种美白化学物对黑素细胞的致死效应 图1 6 几种美白化学物的致死效应( x1 0 5 m 1 ) = 吕 【工 2 v 蚓 籁 禽 最 u 碌 o 0 9 o 0 8 o 0 7 0 0 6 o 0 5 0 0 4 0 0 3 0 0 2 o o l o 心、 萨 由图1 6 可见，当几种美白化学物的剂量达到3 0 p g m l 时，就可以 导致黑素细胞死亡数量明显升高( p 0 0 1 ) ，其中以曲酸的作用较 强，干草提取物的作用最小。 1 2 3 几种美白化学物对细胞膜的影响 图1 7 几种美白化学物对细胞l d h ( u l ) 释放水平的影响 2 0 0 0 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 0 心 、爷 f + 熊果苷 + 曲酸 干草 v - c * f 1 0 3 4 一c o n t r o l 由图1 7 可见，当剂量达到5 0 i _ t g m l 时，几种化学物均可使细胞浆 酶l d h 释放水平明显升高( p 0 叭) ，其中曲酸和v - c 衍生物的 作用较强，f 1 0 3 4 的作用最低。 第三节对b 1 6 黑素瘤细胞株的影响 由于b 。1 6 黑素瘤细胞株具有经济、来源广、生理功能与人皮 肤黑素细胞相似和易于培养的特点，为国内外化妆品研究机构广泛 采用，作为美白化妆品功效和毒性检测的受试细胞，我们选择几种 常用的美白化学物，以b 1 6 黑素瘤细胞株为受试对象，进行较为 全面的毒性检测，以观察b 1 6 黑素瘤细胞株测试结果与人皮肤原 代黑素细胞的差异，并对人皮肤原代黑素细胞毒性检测结果作适当 的补充。 材料与方法 试剂与仪器： 试剂： ( 1 ) 受试物：熊果苷溶液、曲酸溶液、v - c 衍生物溶液、干草 1n)*辎涎i。j 提取物溶液和氢醌( 中国医药上海试剂供应站) 。 ( 2 ) 甘氨酸( 美国b i o m o l 公司，上海华美公司分装) ； ( 3 ) 乳酸钠( 上海试剂三厂) ； ( 4 ) 二硝基苯肼( 上海试剂三厂) ； ( 5 ) 丙酮酸( 美国a m r e s c o 公司，上海吉泰公司分装) ； ( 6 ) r p m l l 6 4 0 培养液( 美国s i g m a 公司) 。 仪器： ( 1 ) c o ，培养箱，美国r e v c o 公司。 ( 2 ) 7 2 3 0 g 分光光度计( 上海分析仪器厂) 。 ( 3 ) 3 7 0 c 电热恒温水浴锅。 ( 4 ) 2 5 c m 2 塑料培养瓶( 美国c o m i n g 公司) 方法 1 细胞培养 b 1 6 黑素瘤细胞株购于中科院细胞所。待细胞生长至融合状态， 经0 2 5 胰蛋白酶消化传代，接种于2 5 c m 2 培养瓶中，用r p m l l 6 4 0 培养液，置于c o ：培养箱3 7 。c ，5 c o ：，饱和湿度环境进行培养。 每一次实验取自同一传代细胞，初始接种细胞浓度为1 0 5 左右。细 胞接种2 小时后，添加受试美白化学物( 参考a s h o kc h a k r a b o r t y 等进行熊果苷功效测定所使用的剂量) ，各设5 个剂量组，于第3 天更换培养液和受试美白化学物，连续培养5 天后收获细胞，用台 盼蓝染色计数细胞总数及死亡细胞数，并通过死亡细胞数反映这些 化学物的致死效应，然后将细胞分为三份作为平行样，用作乳酸脱 氢酶( l d h ) 测定。 2 l d i t 检测 当细胞生长至7 0 融合时，去除培养液，分别加入含有受试物 ( 熊果苷、曲酸、甘草提取物、v _ c 衍生物及氢醌) 的1 6 4 0 培养液， 浓度依次为1 0 p g m l 、3 0 t g m l 、5 0 p g m l 、7 0 a g m l 及1 0 0 p g m l ， 隔天换液，于第五天终止培养。取上清夜0 5 m l j j t l0 5 m l 基质缓 冲液一充分混匀一3 7 水浴3 分钟一加辅酶10 1 m l 一摇匀，3 7 水 浴1 5 分钟一加o 5 m l 二硝基苯肼一3 7 水浴1 5 分钟一加0 4 m o l l n a 0 h5 m l 显色一4 0 0 n m 处比色一查标准曲线，确定l d h ( u n i t l ) 含 量。 统计分析 使用e x c e l 软件对数据进行统计分析。 结果 1 3 1 美白化学物对b 一1 6 细胞数量的影响 表1 1 几种化学物对b 1 6 细胞数量( 1 0 6 ) 的影响( i s ) 组别 熊果苷曲酸甘草提取物v - c 衍生物 氢醌 【p g m 1 ) c o n t r o l6 3 5 0 0 26 3 3 0 0 4 6 4 0 0 0 36 4 1 0 0 26 3 6 0 0 2 1 0 4 6 8 0 0 2 木木4 4 9 0 0 3 木丰4 4 7 0 ，0 5 木木5 5 6 0 0 3 半半1 2 3 0 0 6 木半 3 0 3 1 4 0 0 4 4 0 6 0 0 7 4 0 9 0 0 2 3 8 4 0 0 4 o 0 9 0 0 0 1 * 5 03 0 6 0 0 4 $ 3 8 9 0 0 2 # i 3 5 2 0 0 3 3 0 4 0 0 3 扣10 7 0 2 1 3 0 0 2 3 5 8 0 0 4 3 4 2 0 0 3 2 8 1 0 0 3 $ 0 1 0 01 6 9 0 0 7 1 9 9 0 0 2 # k 1 8 7 0 0 2 # k2 1 4 0 0 2 0 注：与对照组相比，料( t 检验，p 0 0 1 ) ，”0 ”：细胞全部死亡脱落。 由表1 1 显示，几种美白化学物均可明显抑制细胞生长，以氢醌 对细胞生长数量的作用最大，5 0 p g m l 以上各组由于毒性过强，第三 天换液时，细胞全部死亡脱落，到第五天时已不能看到存活细胞， 计数为零。其他几种化学物的作用基本相似。 1 3 2 美白化学物对b 一1 6 细胞的致死效应 表1 2 几种化学物对b 一1 6 细胞( 1 0 6 ) 的致死效应( i s ) 注：与对照组相比：+ p o 0 5 ， + p o 0 1 。 细胞的致死效应以细胞的死亡数量来表示，从表1 2 结果可见， 氢醌对细胞的致死效应最强，5 0 p g m l 以上各组细胞基本死亡，由于 需要在第三天给细胞换液，死亡细胞随废液而弃去，故第五天终止 实验时，培养瓶中已无细胞可计数。v - c 衍生物作用居次。 1 3 3 美白化学物对b 1 6 细胞膜的影响 表1 3 几种化学物对b 一1 6 细胞l d h 释放水平( u l ) 的影响( i 。) ( i 茹” 熊果苷曲酸 甘草提取物v - c 衍生物氢醌 1 08 9 3 9 5 4 - 6 5 19 3 5 8 6 4 - 2 5 6 5 8 8 6 2 8 4 - 9 1 89 2 9 6 4 _ 4 - 2 3 0 8 ( 一) 3 09 0 7 4 2 4 - 1 0 0 89 2 1 5 6 4 - 2 6 8 48 8 3 2 0 _ - - 4 - 5 2 4 9 7 6 1 3 4 - 1 2 1 9 自 ( ) 5 09 1 5 5 4 4 - 7 0 09 2 5 0 3 4 - 2 4 0 1 9 0 2 6 0 - - + 6 5 29 8 8 4 8 - + l l7 l # ( 一) 7 01 1 5 5 4 9 - + 8 6 9 9 #1 1 9 3 3 3 - + 7 i 6 l #1 0 8 6 3 3 - + 7 57 1 1 2 4 7 4 0 4 - 4 6 6 0 ” ( 一) ! q q! ! ! ! ：i ! 圭墅：! ! 黧 ! ! ! ! ：! ! 圭! ! ：1 2 11 1 1 1 ：垫圭i ! ：! ! 兰! ! ! ! ：! ! 圭! ! ! ：! ! ：i = 2 注：与对照组相比4p 0 0 5 ， + p 0 0 1 ，( 一) 氢醌组无法检测l d h 。 表1 3 的结果显示，v - c 衍生物在较底浓度时就使细胞释放l d h 水平升高，氢醌由于细胞毒性太强，导致细胞数量太少，无法检测 l d h 释放水平。 讨论 黑素细胞属于腺细胞，具有树状突起，合成的黑素经由树状突 起分泌进入角质形成细胞，随角质形成细胞的脱落而排出体外。b 1 6 黑素瘤细胞株的基本结构以及黑素合成功能与人正常的皮肤黑素 细胞基本一致，在人体皮肤黑素细胞原代培养较为困难的情况下， 国外化妆品生产企业的科研单位，在筛选美白化学物的过程中，广 泛采用该细胞株作为美白化学物功效测定的受试细胞。但是b 1 6 黑素瘤细胞株属于恶性肿瘤细胞，与人皮肤原代黑素细胞相比，其 不需特殊刺激因子也能在体外不断增殖分化。为此我们先后选用人 皮肤黑素细胞和b 1 6 黑素瘤细胞株为受试对象，分别对几种常用 美白化学物进行毒性测试，以评价美白化学物的有害效应，并比较 两种受试细胞的差异，为毒性评价方法的改进提供依据。 我们参考美国学者e i s i n g e r 等f 1 6 】和我国学者赵辩等【1 7 】手艮道的方 法，对人皮肤黑素细胞的原代培养方法进行了适当改进，并取得人 皮肤黑素细胞体外原代培养的成功，由于没有使用细胞生长因子， 使改进后的方法更为经济，并能够在较短的时间内获得较大数量的 细胞，细胞形态正常，具备黑素合成功能，从而为以人皮肤原代黑 素细胞进行功效、毒性检测及黑素合成机制探讨奠定了良好的基 础。 具有美白功效的化学物或通过抑制黑素细胞中酪氨酸酶活性， 或通过目前尚不了解的途径抑制黑素合成，从而达到皮肤美白的目 的，但是这些外源性化学物美白皮肤的同时，也有可能损害护理部 位的皮肤。在国内，至今未见有关美白化学物对人体原代培养皮肤 黑素细胞毒性