（动物遗传育种与繁殖专业论文）影响猪体细胞克隆胚胎生产效率因素的研究.pdf

摘要猪的体细胞克隆在农业和医学领域具有巨大的应用前景，尤其体现在作为研究人类疾病的动物模型、人类异种器官移植方面。本研究利用屠宰场猪卵巢，对体细胞克隆胚胎生产中的一系列相关因素进行研究，为转基因克隆猪的生产奠定了基础，结果如下。不同时间段添加外源激素对猪卵母细胞体外成熟的影响：猪卵母细胞以n c s u 2 3 + 1 0 p f f + 1 0 i u m l p m s g + 1 0 i u m l h c g + 1 0 n g m l e g f 为成熟液体外培养4 4 h ：前2 2 h 在培养液中添加激素，后2 2 h 不加激素以及添加激素连续培养4 4 h 。结果发现：后2 2 h 去除激素显著提高了孤雌胚胎的卵裂率、囊胚率( p 0 0 5 ) ，对卵母细胞的核成熟影响不大，因此，在体外成熟的后2 2 h 将激素去除是有必要的。猪体外成熟卵母细胞孤雌激活的方案：( 1 ) 不同的电场强度的影响：电场强度为2 0 k v c m 时，卵裂率、囊胚率均显著高于其他两组( 1 6 k v c m ，2 4 k v c m ) ( p 0 0 5 ) ；( 2 ) 放线菌酮( c y c l o h e x i m i d e ，c h x ) 不同添加方式对激活效果的影响：发现电激活前用1 0 p gc h x 处理mi i 期卵母细胞，卵裂率有显著的提高( p 0 0 5 ) ，囊胚发育率也有提高；电激活前用1 0 9 9c h x 处理mi l 期卵母细胞0 、1 0 、6 0 r a i n ，与对照组相比，处理卵母细胞6 0 m i n ，囊胚率显著提高( p o 0 5 ) ；mi i 期卵母细胞进行电激活后，辅助i o p g c h x 作用，卵裂率、囊胚率都有显著的提高( p 0 0 5 ) ；m i i 期卵母细胞进行电激活后，辅助1 0 p gc h x 作用( 3 h 、4 h 、5 h ) ，提高了孤雌胚胎发育率，各组之间差别不大：mi i 期卵母细胞进行电激活l h 后再用c h x 辅助激活，与激活后直接加入c h x 相比，卵裂率、囊胚率有显著的提高( p 0 0 5 ) ，但4 5 枚5 0 山的培养密度下胚胎的发育率稍高。t s a 对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育的影响：5 n mt s a 处理对卵母细胞体外核成熟无显著影响，并且显著提高了其后孤雌胚胎卵裂率、囊胚率( p 0 0 5 ) ；5 0 n mt s a 处理显著提高了孤雌胚胎的卵裂率、囊胚率( p o 0 5 ) ；5 0 n mt s a 处理2 4 h 能显著提高胚胎的卵裂率、囊胚率( p 0 0 5 ) 。( 1 ) 重构胚构建后，有必要恢复一段时间再进行融合，研究了不同的恢复时间对于( s o m a t i cc e l ln u c l e a rt r a n s f e r ，s c n t ) 胚胎发育的影响，结果显示，恢复时间( 1 2 h ) 时，重构胚融合率显著提高，但是，导致碎裂率的显著上升( p 0 0 5 ) ，影响了囊胚的发育；恢复2 0 4 0 m i n 有利于胚胎的正常发育：( 2 ) 不同的融合激活间隔时间对s c n t s 发育的影响，融合后不再进行二次激活的组作为对照，与融合后0 5 一- 1 h 、1 5 2 h 再次进行激活的效果相比，融合激活间隔时间为1 5 2 h 时显著提高了胚胎发育率( p 0 0 5 ) 。总之，通过对体细胞克隆过程中的一系列环节进行优化，建立了一个相对稳定的技术平台；并尝试研究了c h x 对于卵母细胞孤雌激活的影响；t s a 对卵母细胞体外成熟以及孤雌胚胎发育的影响，取得了初步的结果。关键词：猪；t s a ；c h x ；融合；激活a b s t r a c ts o m a t i cc e l ln u c l e a rt r a n s f e ri np o r c i n ei ss i g n i f i c a n t ，e s p e c i a l l ya sm o d e l sf o rt h es t u d yo fh u m a n- d i s e a s e ，o rt h ep i gi sg e n e r a l l ya c c e p t e da st h es p e c i eo fc h o i c ef o rx e n o t r a n s p l a n t a t i o n t h ep a p e ri n v e s t i g a t e di nv i t r om a t u r a t i o no fp o r c i n eo o c y t e s ，f u s i o na n da c t i v a t i o na n di nv i t r oc u l t u r e a io ft h e s ew i l lb ep r o v i d i n ge f f e c t i v et e c h n o l o g yp a r a m e t e rf o rp r o d u c t i o no fc l o n e dp i g s t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ：t h eh o r m o n er e q u i r e m e n t si nd i f f e r e n ts t a g e so fp o r c i n eo o c y t e s ：p o r c i n eo o c y t e sw e r ec u l t u r e di nn c s u 2 3 + 1 0 p f f + 1 0 i u m l p m s g + 1 0 i u m l h c g + 1 0 n g m l e g ff o r4 4 hi nv i t r o ，o rf r o mm a t u r ea t2 2 ha f t e rc u l t u r e ，c u l t u r ef o r2 2 hi nt h em e d i u mw i t h o u th o r m o n es u p p l e m e n ts u b s e q u e n tf o ra n o t h e r2 2 h r e s u l t ss h o w e d ：d i f f e r e n ts t a g e s ，h o r m o n es u p p l e m e n tw a sn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n ti nt h er a t eo fm a t u r a t i o n ；b u ti nt h el a t e rf r e e - h o r m o n e - t e s tc l e a v a g er a t ea n db l a s t o c y s tf o r m a t i o nw e r eh i g h e rt h a nt h ef r o n t e r ( p 0 0 5 ) t h ee f f e c t so fd i f f e r e n ta c t i v a t i o nm e t h o d s ：( 1 ) t h ee f f e c t so fd i f f e r e n te l e c t r i cf i e l ds t r e n g t ho np a r t h e n o g e n e t i ca c t i v a t i o n ：f o r2 0 k v c m ，t h er a t e so fc l e a v a g ea n db l a s t o c y s t sf o r m a t i o nw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a no t h e r s ( 1 6 k v c m ，2 4 k v c m ) ( p 0 0 5 ) ；t h ee f f e c t so fc y c l o h e x i m i d ee x p o s u r eb e f o r eo ra f t e re l e c t r i c a la c t i v a t i o no fi nv i t r o - m a t u r e dp o r c i n eo o c y t e so nt h es u b s e q u e n tp a s ( p a r t h e n o g e n i ca c t i v a t i o n ) d e v e l o p m e n t ：t h emi io o c y t e se x p o s u r e dt op z m 3m e d i u mc o n t a i n i n gc y c l o h e x i m i d e1 0 p gb e f o r ee l e c t r i c a la c t i v a t i o ns h o w e dh i g h e rc l e a v a g er a t e ( p 0 0 5 ) a n db l a s t o c y s tf o r m a t i o nt h a nt h ec o n t r o l ；t h emi io o c y t e se x p o s u r e dt op z m 3m e d i u mc o n t a i n i n gc y c l o h e x i m i d el o o gf o r0 ，1 0 ，6 0 m i nb e f o r ee l e c t r i c a la c t i v a t i o n , t h emi io o c y t e se x p o s u r e dt oc y c l o h e x i m i d es h o w e db e t t e rd e v e l o p m e n tb o t hi n10 m i na n d6 0 m i n c o m p a r e dt oc o n t r o l ，o o c y t e st r e a t e dw i t h6 0 m i ne x p o s u r e dt oc y c l o h e x i m i d eh a dah i g h e rc l e a v a g er a t e ，a n das i g n i f i c a n t l yh i g h e rb l a s t o c y s tf o r m a t i o n( p 0 0 5 ) ；t h emi io o c y t e se x p o s u r e dt op z m 3m e d i u mc o n t a i n i n gc y c l o h e x i m i d el o g ga f t e re l e c t r i c a la c t i v a t i o ns h o w e dh i g h e rc l e a v a g er a t ea n db l a s t o c y s tf o r m a t i o n ( p 0 0 5 ) ；t h emi io o c y t e se x p o s u r e dt op z m 3m e d i u mc o n t a i n i n gc y c l o h e x i m i d elo l a gf o r3 h ，4 h ，5 ha f t e re l e c t r i c a la c t i v a t i o n ，n od i f f e r e n c ew a sf o u n di nb o t hc l e a v a g er a t ea n db l a s t o c y s tf o r m a t i o n ；t h emi io o c y t e sw e r ee x p o s u r e dt op z m 3m e d i u mc o n t a i n i n gc y c l o h e x i m i d e10 l a gi m m e d i a t e l yo re x p o s u r e dt ot h a tf r o ml hl a t e ro re x p o s u r e dt op z m 3a l o n ea f t e re l e c t r i c a la c f i v a t i o n c l e a v a g er a t ea n db l a s t o c y s tf o r m a t i o ns h o w e dt h eh i g h e s ti nt h es e c o n dt r e a t m e n t ( p 0 0 5 ) t h ee f f e c to ft r i c h o s t a t i na ( t s a ) ，a ni n h i b i t o ro fh i s t o n ed e a c e t y l a s e ，o nt h em a t u r a t i o no fp o r c i n eo o c y t e sa n dd e v e l o p m e n to fp a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o si nv i t r o ，t h ed i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sa n dt r e a t m e n td u r a t i o no ft s ai nv i t r om a t u r a t i o na n dc u l t u r ee m b r y oi n v e s t i g a t e d ：( 1 ) t h em a t u r a t i o no o e y t e st ot h em e t a p h a s ei i ( mi i ) s t a g ec u l t u r e dw i t h5 n mt r i c h o s t a t i naw a sn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tf r o mt h ec o n t r o lt r e a t m e n t ，m e a n w h i l e5 n m t s at r e a t m e n ts u p p o r t e dah i g h e rc l e a v a g ea n db l a s t o e y s td e v e l o p m e n tr a t e ( p 0 0 5 ) ；( 2 ) t h ep a r t h e n o g e n e t i ce m b r y oe x p o s u r e di n5 0 n mt s as u p p o r t e dah i g h e rc l e a v a g ea n db l a s t o c y s tf o r m a t i o n ( p 0 0 5 ) ；( 3 ) t h ep a r t h e n o g e n e t i ce m b r y oe x p o s u r e di n5 0 n mt s af o ru pt o2 4 hs u p p o r t e dah i g h e rc l e a x + a g ea n db l a s t o c y s tf o r m a t i o nt h a nt h eo t h e r s ( p 0 0 5 ) ( 1 ) t h es c n t sw e r ef u s i o n e da f t e ri n j e c t i o n ( 2 0 - - - ，4 0 m i n ，1 2 h ) ，1 2 hi st o ol o n gf o rt h ed e v e l o p m e n t ，i ti m p r o v e dt h ef u s i o nr a t e ( p 0 0 5 ) ，b u tt h ef f a g e t i o nr a t ew a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h eo t h e r ( p 0 0 5 ) ，2 0 4 0 m i nr e c o v e r yw a ss u i t a b l ef o rt h eb l a s t o c y s tf o r m a t i o n ；( 2 ) t h es c n t sw e r ea c t i v a t e di nd i f f e r e n tt i m e ( 0 h 、0 5 lh 、1 5 2 h ) a f t e rf u s i o n ，t h er e s u l t ss h o w e dw es h o u l da c t i v a t es c n l s1 5 2 hl a t e r t h ee f f e c td o n o rc e l lt r a n s f e c t e do rn o tt ot h es c n t s ，t h e r ew a sn os i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n tb e t w e e nt h e m ( p o 0 5 ) i nc o n c l u s i o n , w eh a de s t a b l i s h e das t a b l ep l a t f o r mf o rt h ep r o d u c t i o no fp o r c i n ee m b r y o sb ys o m a t i cc e l ln u c l e a rt r a n s f e r k e yw o r d ：p o r c i n e ；t r i c h o s t a t i na ：c y c l o h e x i m i d e ；f u s i o n ；a c t i v a t i o ni v英文缩略表v i i独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：刘釉时间：硼年6 月5日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)论文作者签名：刨商时间：2 硼年 月f 日翩签名榴丁青间：2 硼年月5 日中同农, jr , g ： 学甍再页j j 学伊论文第一寺引言曼! ! 曼曼窒曼曼曼曼曼! ! ! 曼! ! 曼! ! ! 曼iii i 鼍曼! 曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼! 蔓第一章引言1 1 体细胞克隆猪的研究意义2 0 世纪9 0 年代，世界上首例成年体细胞克隆动物绵羊“d o l l y ”( w i l m u te ta 1 ，1 9 9 7 ) 诞生，揭开了哺乳动物体细胞克隆时代的序幕。此后相继有小鼠( w a k a y a m a e t a l ，1 9 9 8 ) ，牛( c i b e l l i订a 1 ，1 9 9 8 ) ，猫( s h i ne ta 1 ，2 0 0 2 ) ，兔( c h e s n ee ta 1 ，2 0 0 2 ) ，骡子( w o o de ta 1 ，2 0 0 3 ) ，马( g a l l ie l a l ，2 0 0 3 ) ，大鼠( z h o ue t a l ，2 0 0 3 ) 等动物的体细胞克隆后代出生。迄今为止，体细胞克隆已经在1 3 个物种中取得了成功( p e t e r s e ne ta 1 ，2 0 0 8 ) 。体细胞克隆技术的成功使现代生物技术翻开了崭新的一页，已向世人昭示了其在畜牧业生产、疾病治疗、医药生产、生物学基础理论研究以及野生濒危动物保护等诸多领域所蕴藏的巨大应用价值。体细胞克隆猪的诞生已将近8 年，猪作为重要的经济动物是与人类生活关系最为密切的家畜，同时因为其在解剖学、生理学及营养代谢等方面与人类极为相似，所以备受众多科学家及投资家的青睐( 芮荣等，1 9 9 9 ；崔文涛等，2 0 0 7 ) ，尤以小型猪见长。我国是一个养猪大国，猪的品种资源十分丰富，尤其是具有独特的优质小型猪资源。在养猪生产中，饲料转化率高，肉质好，产肉量高，生产周期短，繁殖力强而且具有一定抗病性等是生产者始终较为关心的性状指标。克隆技术的应用和研究，使高新生物技术与动物繁育生产相结合，理论上可使家畜育种工作实现无限生产基因型完全一致的后代，从而极大地提高育种效率，为核心群的定向培育和改良建立一条高效途径( 张德福等，2 0 0 7 ) 。同时，体细胞克隆结合遗传修饰技术可以在传统遗传育种技术的基础上培育猪的新品种，扩大猪群数量；将克隆技术与转基因技术有机结合起来：先将外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞的细胞核移植到去核的卵母细胞，组成重构胚胎，再把其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩后便可得到转基因的克隆猪，可大大提高家畜转基因的效率( 崔文涛等) 。猪可取代鼠、猴、犬、兔、猫等做前临床动物实验，长期以来，小鼠一直被作为研究人类生理的动物模型，发挥了一定的作用，但是也存在着一些限制：比如人类的纤维囊泡病是因为跨膜传导调节蛋白的某一基因突变引起的，但是当同样的突变在小鼠身上发生时，不会产生相同的表型。另外，小鼠的体型太小，有些操作不易进行。相比之下，基因修饰的猪则较适合作为模型( p a r t h e r e t a l ，2 0 0 4 ) 。体细胞克隆猪的重要意义还在于治疗性克隆与器官移植：通过核移植技术，以病人的细胞为供体构建重组胚胎，然后从重组胚获取与病人遗传构成相同的胚胎干细胞，可从根本上克服免疫排斥反应；用于异种组织器官移植，欧洲国家已经将猪的心脏、肾、肝及神经细胞移植给相应器官衰竭的晚期患者及帕金森病患者。中同农, l i a r , l 学院硕士学伊论文第”事弓i 言_1 2 影响猪体细胞克隆效率的因素猪的体细胞克隆研究较慢，主要原因是猪的生殖细胞、胚胎体外显微操作难度较大、妊娠维持有别于其他家畜，需具备一定量的胚胎数等等，直到2 0 0 0 年，体细胞克隆猪才终于有了突破，p o l e j a e v a 等首次获得了体细胞克隆猪的成功，同年o n i s h i 等和b e t t h a u s e r 等相继分别成功地得到了体细胞克隆猪。中国农业大学在2 0 0 5 年获得了克隆猪，成为世界上第七个拥有自主克隆猪能力的国家。目前猪的体细胞克隆效率取得了很大的提高，第一例克隆猪诞生时的囊胚形成率尚不足1 0 ，现在很多实验室的效率都能超过2 0 ( k e e f e re ta 1 ，2 0 0 8 ) 。但是也还存在很多问题，胚胎移植后流产率高，胎儿围产期死亡率高，出生后成活率低，后代生理异常发生频繁等，极大地限制了克隆技术的商业化应用。主要因为核移植包括一系列复杂的程序：供体细胞培养、卵母细胞的体外成熟、去核、融合、激活、重构胚的体外培养和胚胎移植，任何一步不理想，都会影响到克隆胚胎或动物的发育。以下从几个方面进行综述。1 2 1 卵母细胞成熟的研究进展相对体内成熟的卵母细胞来说，体外成熟的卵母细胞来源丰富，价格低廉。但质量存在许多问题，如细胞质成熟不充分、体外受精胚胎和克隆胚胎的囊胚发育率低、产仔率低等。猪卵母细胞体外成熟( i nv i t r om a t u r a t i o n ，i v m ) 的研究与其它动物相比更是进展缓慢，可能与其体外成熟时间较长有关。卵母细胞的成熟过程就是卵母细胞的获能过程，这一获能过程包括恢复减数分裂并进入到第二次减数分裂中期的核成熟和经历一系列复杂生理生化变化的细胞质的成熟。如何调节诸方面的因素达到细胞质和细胞核共同成熟，以提高成熟率是卵母细胞体外成熟的关键性问题。( 1 ) 卵母细胞来源的影响：随着猪卵母细胞直径的增加，其体外培养的成熟率逐渐上升。一般认为，猪完全的减数分裂能力要在卵泡直径达到3 m m 或者更大时才能获得( m a r c h a le t a l ，2 0 0 2 ) 。据研究报道，中等直径的卵泡( 3 6 m m ) 内卵母细胞有较高的成熟率，小卵泡( 6 r a m ) 的卵母细胞在体外培养时退化严重，可能与其过早成熟而发生老化有关( 王海等，2 0 0 2 ) 。所以，用于体外培养的卵母细胞取自中等直径的卵泡有利于成熟，实验中我们一般选择3 - 6 r a m 的卵泡抽取。另外，来自明亮卵泡的卵母细胞的成熟率明显高于来自浑浊卵泡的卵母细胞；卵巢处于无黄体期时卵母细胞体外成熟率优于黄体期和黄体前期卵巢上卵母细胞成熟率，这都为我们在实验中抽取合适的卵泡提供了参考。( 2 ) 培养基的影响目前基础培养液以t c m l 9 9 和n c s u 2 3 使用居多，我们在试验中使用的是n c s u 2 3 培养基。( 3 ) 激素的影响根据已有的国内外研究结果推测，促性腺激素诱导卵母细胞恢复减数分裂可能通过2 条途径：诱导卵丘扩展使颗粒细胞与卵母细胞的间隙连接中断，使卵丘细胞的信息不能传入卵母细2中同农、i k 科学院硕士学伊论文第一章引言胞，从而解除卵丘细胞对卵母细胞恢复减数分裂的抑制作用，使卵母细胞减数分裂重新启动；诱导卵丘细胞产生一些刺激因子，如减数分裂激活物质( m a s ) 和c a 2 + 等，克服抑制物质的作用而促进减数分裂的恢复。f o l l i c u l a rs t i m u l a t i n gh o r m o n e ( f s h ) 、l u t e i n i z i n gh o r m o n e ( l h ) 在猪卵母细胞体内成熟和排卵时起重要作用，但似乎p m s g 、h c g 对促进体外成熟更为有效。研究证实，在猪卵母细胞体外成熟过程中，成熟前期卵母细胞的生长需要促性腺激素的支持，而成熟后期去掉激素可以促进卵母细胞成熟。研究结果发现，在猪卵母细胞体外成熟过程中，培养前2 0h 加入激素，后2 0h 去除，可增加卵母细胞成熟率，促进卵母细胞减数分裂胞质成熟( d ep f a ，2 0 0 1 ) 。( 4 ) 卵泡液的影响卵泡液是卵母细胞体内发育的介质，含有大量来自血清的生化因子和卵母细胞及卵泡细胞的分泌因子，作为卵母细胞发育的微环境，对其成熟具有重要的调节作用，能提高卵母细胞质成熟的质量，增加胚胎的发育能力。曾有研究将猪卵母细胞分别培养在含1 0 犊牛血清( f c s ) 、1 0 新生仔猪血清( np s ) 、0 4 聚乙烯醇( p v a ) 和1 0 猪卵泡液( p f f ) 的培养基中，经培养后，p f f组卵母细胞的( g e r m i n a lv e s i c l eb r e a k d o w n ，g v b d ) 发生率及成熟率均略高于其它三组，并且，在体外条件下，p f f 能有效地降低猪卵母细胞染色体异常的发生率，调整和加速极体排出，使核质成熟时间趋于同步化。添加适量的p f f 对猪卵母细胞体外成熟有一定的促进作用，添加浓度过高则相对抑制卵子核成熟( y o s h i d ae ta 1 ，1 9 9 2 ) 。在成熟液中添加l o p f f 显著提高猪卵母细胞的核成熟率、正常受精率和卵裂率( 卢晟盛等，2 0 0 5 ) 。r a t h 等( 1 9 9 5 ) 发现在成熟液中添加1 0 p f f 可显著提高猪卵母细胞的核成熟率。控制其使用浓度，一方面消除了对核成熟的抑制作用，另一方面又显示了对胞质成熟的促进作用。( 5 ) 生长因子的影响生长因子对卵母细胞成熟的作用是正向的。e g f 是一种卵母细胞成熟的诱导剂，能促进( c u m u l u s o o c y t ec o m p l e x e s ，c o c s ) 的体外成熟。已经证实，在动物和人类的c o c s 上均有e g f 受体，且随着卵泡的发育表达增强，在排卵前达到高峰( e i n s p a n i e re ta 1 ，2 0 0 2 ) 。e g f 在不同哺乳动物物种中影响卵母细胞的发育潜能及减数分裂成熟、诱导冠丘扩张、启动核成熟己在很多物种中得到证实。g a l l 等( 2 0 0 4 ) 研究发现，可以在颗粒细胞及卵母细胞上观察到e g f 受体的免疫活性，这是卵泡细胞及卵母细胞有发育能力的表现。另有研究报道，e g f 对猪雌性原核形成有积极作用，e g f 不但能促进卵母细胞减数分裂，也间接调节卵母细胞浆的成熟。e g f 促进卵母细胞体外成熟，其机制可能为e g f 作用于卵丘细胞后，卵丘细胞释放成熟刺激信号阻断卵丘卵母细胞间的信息交流，颗粒细胞合成的卵母细胞成熟抑制物对卵母细胞作用减弱，卵母细胞成熟时分泌卵丘细胞扩张因子，加上细胞外基质中粘性物质沉积均可促进卵丘细胞扩散。卵丘细胞扩散可阻碍细胞间信息沟通，使卵母细胞减数分裂抑制作用解除，并能响应促性腺激素作用，加快自身发育成熟( d e w i te ta 1 ，2 0 0 0 ) 。至今，已有8 个国家2 3 个实验室研制出了克隆猪，包括日本、韩国、中国、美国、英国、德国、丹麦以及加拿大，对比实验体系，有8 个实验室用n c s u 2 3 辅助i o p f f 作为了基础的培养基、4 个用了n c s u 3 7 + 1 0 p f f 、5 个用t c m l 9 9 + 1 0 p f f 、1 个用了t c m l 9 9 + 0 i p v a ( c a m p b e l lp fa 1 ，2 0 0 7 ) ，我们试验中采用的是n c s u 2 3 + l o p f f + 1 0 i u m l p m s g + 1 0 i u m l h c g + 1 0 n g m l e g f3巾同农、i p 科学甍硕l 二学伊论文第+ 学引言作为成熟培养基。1 2 2 供体细胞的影响1 9 9 7 年，克隆绵羊“多莉”诞生，证实了利用体细胞核移植技术产生克隆动物的可行性。目前，在不同哺乳动物中，已有多种不同类型的体细胞用于克隆，并得到了后代( k a s i n a t h a ne t a l ，2 0 0 l ；p o l e j a e v ae ta 1 ，2 0 0 0 ；o g u r ae ta 1 ，2 0 0 0 ；s h i ne ta 1 ，2 0 0 2 ；c h e s n ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。究竟哪些细胞的克隆效率最高呢? 以下将从供体细胞来源、细胞周期、传代次数几个方面进行论述。供体细胞具有组织特异性，供体细胞类型的选择对克隆效率有重要影响。目前，选用成年动物的皮肤成纤维、生殖腺细胞、肾脏细胞、心脏细胞、星型胶质细胞都得到了克隆猪的后代，但是由于猪胎儿成纤维细胞能在克隆前进行基因修饰，有足够的分裂能力以便在外源基因修饰后经加压筛选后增殖得到克隆群，并且胎儿成纤维细胞相比其他成体组织的细胞分化低，更容易在重构胚胞质作用下重编程，因此许多报道均以胎儿成纤维细胞作为供核体细胞( 阎新龙等，2 0 0 5 ) 。g a b 等比较了胎儿成纤维细胞、卵丘细胞和输卵管上皮细胞作为核供体的移植效果，证实用猪胎儿成纤维细胞做供体细胞是提高并产出克隆猪的最佳选择。第一个成功进行体细胞克隆的研究者将其成功的主要原因归结为使用血清饥饿的方法诱导供核体细胞进入休眠期g o 期，但经实验证实，血清饥饿至g o 期并不是取得克隆成功所必需的，人们利用g l 期( u r a k a w ae t a l ，2 0 0 4 ) ，g 2 m ( l a ie t a l ，2 0 0 2 ) ，m ( z h o ue t a l ，2 0 0 1 ) 期的体细胞也纷纷得到了克隆牛、猪、小鼠等的后代。另外，不用血清饥饿，而是随机选择正处于分裂期的细胞，或者利用接触抑制以及化学试剂诱导同期获得g 0 g 1 期细胞等也获得了克隆的后代。一般来说，因为g o 期细胞有利于核的重编程，能导致染色质结构改变，使基因表达的初始化容易进行。在实验中，仍推荐选择处于细胞周期中g o ( ；l 期或g 1 s 交界点的细胞供核。为获得这些时期的细胞，我们利用细胞贴壁生长接触抑制的特性将其调节到g 0 g 1 期，k u e s 等( 2 0 0 0 ) 对猪的成纤维细胞经不同方法进行同步化处理后的分析表明，猪的成纤维细胞用一般培养法培养汇合后，有6 6 6 7 3 7 的细胞停留在g 0 g 1 期。有实验表明，培养的猪胎儿成纤维细胞血清饥饿5 天后，大量细胞显示出凋亡特征，有约2 5 细胞的d n a 发生碎片化，而正常培养的细胞只有0 2 碎片化( 毕春明等，2 0 0 3 ) 。关于供体细胞在第几代最适合作为核供体，在研究者中还存在争论：e n r i g h t 等( 2 0 0 3 ) 认为细胞在体外培养可以减少外遗传修饰，另有研究也表明了体外培养后的细胞可以表达出培养前所不能表达的蛋白质，证实了体外培养去分化的能力。a r a t 等( 2 0 0 1 ) 在克隆转基因牛时发现，培养1 5 代的细胞核移植后，囊胚率高于培养l o 、1 1 、1 3 代的细胞。c h i k a r a 等( 2 0 0 0 ) 用培养5 、1 0 、1 5 代的牛耳皮肤成纤维细胞发现，第1 0 、1 5 代细胞核移植囊胚率高于第5 代细胞的囊胚率，并生出了核移植牛，但是张德福等报道猪耳皮成纤维细胞和颗粒细胞不同培养代数间的重构胚分裂率和囊胚率均没有显著差异( p 0 0 5 ) 。这与w e l l s 等( 1 9 9 9 ) 的研究结果相一致；而r o hs等研究了早期体细胞( 8 1 6 代) 和晚期( 1 7 3 2 代) 对核移植后囊胚发育率的影响( 1 8 9 0 0慨1 0 5 ) ，认为早期体细胞更易于重编程。本试验中用的是五代左右的细胞。4中用农、j j ! ? 学甍硕 j 学p 论文第一寺引言i iii ii i1 2 3 融合激活方法的研究进展细胞核移植有两种操作程序：一种是胞质内注射法，另一种是电融法，后一种方法是目前动物细胞核移植研究中普遍采用的操作程序，即把整个供体细胞放至去核的受体卵周隙内通以直流电脉冲使两者融合。因为这种方法具有操作简便、对卵母细胞损伤小等许多优点。电融合受到如融合液、融合仪等许多因素的影响，本实验室用的是美国的b t x e c m 2 0 0 1 电融合仪。融合液0 1 m m 的c a 计。在体细胞克隆过程中，胚胎的发育需要重构胚的充分激活。电激活是猪s c n t 中最常用的方法，其原理就是在瞬时高压直流电脉冲的作用下，细胞膜被击穿，使卵母细胞上生成可逆性的微小的孔洞，细胞内外的离子和大分子物质发生短暂性的流动，胞质内c a ：+ 升高( 田见晖等，2 0 0 4 ) ，升高的c a 2 + 一方面破坏了已存在的c s f ，使m p f 活性下降，另一方面引起对c a 2 + 敏感的周期蛋白的降解，从而导致m p f 水平下降或消失，引起卵子活化，促使卵母细胞离开m i i 期，完成减数分裂，从而激活卵母细胞。电脉冲引起的微孔大小受脉冲强度、时间和脉冲次数的影响( 张德福等，2 0 0 1 ；刘国世等，2 0 0 4 ) 。但是，采用单纯电刺激激活的卵母细胞孤雌胚胎大多为单倍体，发育能力不强。因此，为了提高孤雌激活胚胎的发育率，常常将电刺激与化学激活联合起来，i m 等研究电激活后辅助的化学激活降低了凋亡率而且提高了发育能力。t a o 等研究证实，以电脉冲结合6 d m a p 激活重构胚，可提高其发育至囊胚的能力。1 2 4 体细胞克隆胚胎的重新程序化虽然体细胞克隆在许多物种中获得了成功，但克隆的效率非常低。不论是用e s 细胞还是体细胞的克隆都可能出现一些表型方面的异常：包括呼吸和循环系统的问题；即使是健康存活的个体，也可能有免疫缺陷或肾、脑的功能缺损；大多数的克隆动物出生时有超重现象。克隆效率是影响体细胞克隆技术应用的最大障碍，核移植后几小时内发生的供体核的分子重排事件，则决定了克隆胚胎的命运( 李世杰等，2 0 0 4 ) 。目前认为：供体核的不完全重编程是导致克隆效率低的主要原因。在体细胞克隆中，供体核来自高度分化了的体细胞。在分化过程中，体细胞核获得了高度特异的d n a 和染色质的表观遗传修饰( e p i g e n e t i cm o d i f i c a t i o n ) ，这些修饰导致了分化状态的细胞记忆。由于供体核支持克隆胚胎的发育，所以当供体细胞核被移入去核的卵细胞后，供体核必须经过这些表观遗传修饰的重编程( r e p r o g r a m m i n g ) ，激活对胚胎早期发育有重要作用的基因，并抑制与分化相关基因的表达，从而获得发育的全能性( h u m p h e r y se t 讲，2 0 0 2 ) 。供体核的不完全重编程，导致在发育过程中有重要作用的基因没有表达或异常表达，是克隆效率低的主要原因( d a n i e l se t a l ，2 0 0 0 ) 。关于供体核的重编程，目前研究主要集中在d n a 甲基化( d n am e t h y l a t i o n ) 、组蛋白乙酰化( h i s t o n ea c e t y l a t i o n ) 。形成了一个新的热点表观遗传学( e p i g e n e t i c s ) ，它们对于早期胚胎和配子形成和发育、组织特异性基因的表达、大部分基因沉默都起着关键作用。表遗传修饰是指不可改变d n a 序列的可逆性修饰，是相对于遗传性修饰而言的。d n a 甲基化是基因组的主要表观遗传修饰方式，对基因转录起抑制作用，是调节基因组功能的重要手段。分化体细胞的甲基化形式是稳定的和可遗传的。然而在哺乳动物中，至少需要有5中用农、j k 科学院硕七学伊论文第一节引言两个发育阶段( 生殖细胞和植入前胚胎) ，其甲基化的形式在基因组范围内发生重编程，从而产生具有发育潜能的细胞( l ie t a l ，2 0 0 2 ) 。d n a 甲基化是指d n a 序列中的c p g 岛中的胞嘧啶发生甲基化，从而决定基因的表达与否( r e i ke la 1 ，2 0 0 1 ) 。c p g 岛( c p gi s l a n d ) 是基因组中富含c g 的一段短的d n a 序列，在细胞分化的过程中，基因的甲基化状态将遗传给后代细胞。生物体通过这种形式实现了含有相同d n a序列的体细胞表达不同的基因，行使不同的功能( 毕春明等，2 0 0 3 ) 。甲基化的d n a 被特异性的抑制性蛋白识别，这些蛋白与转录共抑制因子通过对核小体中组蛋白n 末端的去乙酰化作用抑制转录活性，d n a 甲基化对印迹基因的稳定抑制及雌性哺乳动物x 染色体的失活均有重要作用( 肖文伍等，2 0 0 3 ) 。哺乳动物胚胎早期发生的重编程是非常保守的，而体细胞克隆所用的供体细胞，如胎儿和成年成纤维细胞、胚胎干细胞以及其他类型的高度分化的体细胞中，基因组具有较高的甲基化水平，具有体细胞的典型特征。在正常牛的胚胎中，基因组从受精卵开始发生主动去甲基化，甲基化水平在8 细胞胚胎进一步降低，一直持续到1 6 细胞的胚胎，这时胚胎发生重新从头甲基化。在克隆牛植入前的胚胎中，发现了基因组重复序列异常的甲基化状态。k a n g 等人( 2 0 0 2 ) 通过对单个着床前克隆胚胎分析发现，单拷贝序列去甲基化，而卫星序列未去甲基化，还发现i c m t e 比率与甲基化水平成反比，t e 上的甲基化紊乱造成胚外组织广泛的基因功能失调，致使胎盘结构异常。这是由于在克隆牛的胚胎中，当供体成纤维细胞核被移入去核的卵母细胞后，基因组发生了一些去甲基化( 主动去甲基化的影响) ，但是在随后的发育中没有发生进一步的去甲基化，而是过早的重新从头甲基化( d e a n e t a l ，2 0 0 1 ) 。克隆猪胚胎的遗传重编程与正常的小鼠胚胎相同，但与克隆牛胚胎不同，克隆猪胚胎移植前阶段，卫星d n a 序列和p r e i s i n e 序列表现为主动去甲基化的过程，与内源性去甲基化过程相似，而克隆牛胚胎整个囊胚时期都保持高甲基化状态。有研究似乎也表明：猪克隆囊胚不出现高度的异常甲基化模式，可能跟其胚胎在体外培养时间短有关( 一般在8 c e l l 期前移植) 。组蛋白在进化上十分保守。真核生物的染色体上主要含有5 种组蛋白，即核心组蛋白h 2 a 、h 2 b 、h 3 、h 4 及连接组蛋白h 1 。核心组蛋白八聚体( h 2 a ，h 2 b ，h 3 ，h 4 各两分子组成) 、连接组蛋白h l 和1 5 0b p 的d n a 共同组成了染色体的基本单位一核小体。d n a 与组蛋白是染色质的主要成分。染色质结构与基因活性密切相关，通过组蛋白乙酰化和去乙酰化来修饰染色质的结构。在d n a 复制、基因转录及细胞周期的调控等方面有重要作用。组蛋白乙酰化松弛染色质，与转录活化正相关；脱乙酰化则和转录抑制相关。在哺乳动物个体发育过程中，不同组织的细胞根据其功能的需要，只表达其基因组中的特定类型的基因，基因表达与否以及表达程度受到严格控制。动物机体内的每类细胞都具有自己不同的表观遗传修饰标记，对于大多类细胞来说，它们一旦分化成功，这些表观修饰就会变得稳定，将随d n a 的复制和细胞的分裂而稳定地遗传下去，称为“细胞记忆”，然而在正常胚胎发育早期或生理变化情况下，细胞基因组会发生大规模表观重序来抹除原来的修饰状态，从而建立一套新的修饰状态。克隆动物发育过程中，移植到卵母细胞内的高度分化体细胞必须发生大规模的表观重序从而转变成为全能性细胞。o l g a 等人研究了小鼠胚胎发育期间组蛋白修饰动态