（动物遗传育种与繁殖专业论文）猪srpk1及srpk3基因的克隆、表达及多态性研究.pdf

目录 丫iii11111h17$81iif7ih1hiif2iii11ii 目录 中文摘要i 英文摘要i i i 1 引言1 1 1 骨骼肌的发生和发育l 1 1 1 骨骼肌的发生过程一l 1 1 2 骨骼肌发育过程”l 1 1 3 骨骼肌发生和发育过程中的调控因子2 1 2s r 激酶3 1 2 1r n a 剪接和细胞周期调控的联系因子3 1 2 2 磷酸化s r 蛋白的其他激酶4 1 2 3s r p k 研究进展5 1 2 4 选择性剪接作用原理及作用网子的研究进展6 1 3 骨骼肌损伤8 1 3 1 骨骼肌损伤的实验动物模型“9 1 3 2e i m d 变化阶段1 0 1 3 2 肌卫星细胞激活与成肌分化的调控l l 1 3 3 骨骼肌损伤后的炎症反应及修复1 2 1 4 本研究的目的和意义1 4 2 材料与方法1 6 2 1 实验材料1 6 2 1 1 实验动物1 6 2 1 2 菌株和克隆载体1 6 2 1 3 主要仪器设备1 6 2 1 4 主要药品和酶1 7 2 1 5 缓冲液及主要溶液的配制1 7 2 1 6 工具酶及试剂盒l8 2 2 实验方法l8 2 2 1 耳组织样d n a 的提取1 8 2 2 2 组织样总r n a 的提取与检测”1 9 2 2 3 引物设计与合成2 0 2 2 4 大白猪s r p k l 、s r p k 3 基因克隆”2 2 2 2 5p c r s s c p 检测2 6 2 2 6 基因多态性的统计方法2 8 2 2 7r e a lt i m ep c r 反j 立“2 9 2 2 8 石蜡切片及h e 染色2 9 东北农业人学农学硕卜学位论文 2 2 9 主要分子生物学软件及统计分析软件3 0 3 结果与分析3 2 3 1 大白猪s r p k l 、s r p k 3 基因的克隆3 2 3 1 1 猪s r p k l 基因c d s 区及部分5 u t r 序列克隆测序“3 2 3 1 2 反向克隆s r p k l 部分5 u t r ”3 2 3 1 3 猪s r p k 3 基因c d s 区克隆“3 3 3 2 猪s r p k l 、s r p k 3 序列结构分析3 4 3 2 1 猪s r p k l 、s r p k 3 一级结构分析3 4 3 2 2 猪s r p k l 、s r p k 3 二级结构分析3 5 3 2 3 猪s r p k i 、s r p k 3 的功能结构域分析3 7 3 2 4 猪s r p k l 、s r p k 3 基冈分子进化分析3 8 3 2 5s r p k l 转录结合位点预测4 0 3 3p c r s s c p 分析结果4 1 3 4 组织表达谱构建一4 3 3 4 1 扩增曲线和溶解曲线的绘制4 3 3 4 2 定量分析4 5 3 5 骨骼肌损伤及肌分化过程中s r p k l 、s r p k 3 的表达4 8 3 5 1 病理症状4 8 3 5 2 病理性结果4 8 3 6 构建骨骼肌修复发育过程中s r p k i 、s r p k 3 与骨骼发育相关因子相关性分析”5 0 3 6 1m y o d 、f o x o l 、m e f 2 a 、m e f 2 b 、m e f 2 d 在骨骼肌损伤修复过程中的表达 情况5 0 3 6 2 成肌因子相关性分析5 5 4 讨论5 7 4 1s r p k l 、s r p k 3 基因的克隆与生物信息学分析5 7 4 2s r p k l 、s r p k 3 基因的多态性分析5 7 4 3 猪的s r p k l 、s r p k 3 基因的组织表达特性分析5 9 4 4 猪的s r p k l 、s r p k 3 基因在骨骼肌损伤修复的表达5 9 4 5 骨骼肌发育相关因子相关性分析6 0 5 结论6 2 致澍6 3 参考文献6 4 附蜀鼍7 0 攻读硕士学位期间发表的学术论文“7 5 i i c o n t e n t s c o n t e n t s c h i n e s ea b s t r a c t i e n g l i s ha b s t r a c t i l l 1i n t r o d u c t i o n l 1 1t h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to fs k e l e t a lm u s c l e l 1 1 1t h eo c c u r r e n c eo f t h ep r o c e s so f s k e l e t a lm u s c l e l 1 1 2d e v e l o p m e n to fs k e l e t a lm u s c l e l 1 1 3t h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to fs k e l e t a lm u s c l er e g u l a t o r yf a c t o r s 2 1 2s rk i n a s e 3 1 2 1r n as p l i c i n ga n dc e l lc y c l er e g u l a t i o no f t h ec o n t a c t f a c t o r s “3 1 2 2s r p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o no fo t h e rk i n a s e s 4 1 2 3r e s e a r c ho fs r p k “5 1 2 4t h et h e o r ya n dt h er o l eo f a l t e r n a t i v es p l i c i n gf a c t o rp r o g r e s s 6 1 3s k e l e t a li n j u r y 8 1 3 1e x p e r i m e n t a la n i m a lm o d e lo fs k e l e t a lm u s c l ei n j u r y 9 1 3 2e i m d c h a n g e dp h a s e 1 0 1 3 3m u s c l es a t e l l i t ec e i la c t i v a t i o na n dr e g u l a t i o no fm y o b l a s td i f f e r e n t i a t i o n “1 1 1 4o b j e c t sa n ds i g n i f i c a t i o n so f t h i sr e s e a r c h 1 2 2m a t e r i a la n dm e t h o d s 1 4 2 1m a t e r i a l s 1 6 2 1 1s a m p l i n g 1 6 2 1 2s t r a i na n dt h ec l o n i n gv e c t o r 1 6 2 1 3m a i na p p a r a t u s ”1 6 2 1 4r e a g e n t s 1 7 2 1 5b u f f e ra n dt h em a i ns o l u t i o np r e p a r a t i o n 17 2 1 6e n z y m e sa n dk i t s ”1 8 2 2m e t h o d s 1 8 2 2 1d n ae x t r a c t i o n 1 8 2 2 2t b t a lr n ae x t r a c t i o n ”1 9 2 2 3p r i m e rd e s i g na n ds y n t h e s i s 2 0 2 2 4c l o n i n go f y o r k s h i r es r p k ia n ds r p k 3 g e n e 2 2 2 2 5p c r s s c p 2 6 2 2 6s t a t i s t i c a lm e t h o d s 2 8 2 2 7r e a lt i m ep c r ”2 9 2 。2 8p a r a m ns e c t i o na n dh es t a i n i n g 2 9 2 2 9m a j o rm o l e c u l a rb i o l o g ys o f t w a r et a t i s t i c a la n a l y s i ss o f t w a r e “3 0 3r e s u l ta n d a n a l y s i s 3 2 i i i 东北农业大学农学硕l j 学位论文 3 1c l o n i n go f y b r k s h i r es r p k la n ds r p k 3g e n e 3 2 3 1 1c l o n i n ga n ds e q u e n c i n go f s r p k lg e n e5 u t rc d sa r e a 3 2 3 1 2c l o n i n go f 5 u t ri ns r p k lb yi n v e r s ep c r 3 2 3 1 3c l o n i n go f c d s g e n ei ns r p k 3 3 3 3 2p i gs r p k l s r p k 3s e q u e n c ea n a l y s i s 3 4 3 2 1s t r u c t u r a la n a l y s i so f p i gs r p k l s r p k 3i nf i r s tl e v e l 3 4 3 2 2s t r u c t u r a la n a l y s i so f p i gs r p k i 。s r p k 3i ns e c o n dl e v e l 3 5 3 2 3c o n s t r u c t i o na n df u n c t i o no f s r p k la n ds r p k 3 ”3 7 3 2 4p h y l o g e n t i ct r e eo f s r p k la n ds r p k 3 3 8 3 2 5t r a n s c r i p t i o nb i n d i n gs i t e sp r e d i c t e do f s r p k i 4 0 3 3p c r s s c p 4 1 3 。4c o n s t r u c t i o no f t i s s u ee x p r e s s i o n 4 3 3 4 1a m p l i f i c a t i o nc u r v ea n dd i s s o l v e dc u r v e 4 3 3 4 2q u a n t i t a t i v ea n a l y s i sa n t i t a t i v ea n a l y s i s 4 5 3 5e x p r e s s i o no f s k e l e t a lm u s c l ei n j u r ya n dm u s c l ed i f f e r e n t i a t i o ni ns r p k i s r p k 3 4 8 3 5 。lp a t h o l o g i c a l 4 8 3 5 2f i n d i n g s 4 8 3 6c o n s t r u c t i o no f s k e l e t a lm u s c l ed u r i n gt h ed e v e l o p m e n to f s r p k l s r p k 3 - 5 0 3 6 1e x p r e s s i o no fm y o d ，f o x o i ，m e f 2 a ，m e f 2 b ，m e f 2 d 5 0 3 6 。2c o r r e l a t i o na n a l y s i so fm y o g e n i cf a c t o r s 5 5 4d i s e u s s i o n s 5 7 4 1c l o n i n ga n db i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i so f s r p k l s r p k 3 5 7 4 2p o l y m o r p h i s mo fs r p k i s r p k 3g e n e 一5 7 4 3e x p r e s s i o na n a l y s i so f t h eo r g a n i z a t i o ni np i gs r p k ia n ds r p k 3 5 9 4 4e x p r e s s i o ni ns k e l e t a lm u s c l ei n j u r ya n dr e p a i ro fp i gs r p k la n ds r p k 3 5 9 4 5c o r r e l a t i o na n a l y s i so fs k e l e t a lm u s c l ed e v e l o p m e n ta s s o c i a t e df a c t o r s 6 0 5c o n c l u s i o n s 6 2 a c k n o l e d g e m e n t 6 3 r e f e r e n c e - - 6 4 a p p e n d i x 7 0 a c a d e m i cp a p e rp u b l i s h e dd u r i n gt h em a s t e rd e g r e e 7 5 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 注；如遗直墓丝益要鳖别直明的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名渐 日期：2 0 l o 年6 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：稻氏 导师签名： 日期：2 0 10 年，月7 日 日期：2 a l q 年月7 日 摘要 摘要 精氨酸丝氨酸蛋白激酶( s r p k ) 基因是s r 蛋白特异磷酸化激酶基因家族成员之一。其中 s r p k l 被定位于一段控制脂肪性状的q t l 区域，而s r p k 3 的过量和减少表达都会导致肌卫 星细胞出现病变或导致生物个体死亡。因此，应用现代分子生物学技术研究猪s r p k l 、s r p k 3 基因的分子遗传结构和作用模式，对研究猪肉质性状有十分重要的理论意义，并为分子标记 辅助选择和转基因猪打下基础。 本研究以大白猪为研究对象，克隆了大白猪s r p k i 基因和s r p k 3 基因，对其结构和功 能及分子进化进行了分析，并对1 日龄和3 0 日龄的大白猪和杜洛克猪的心、肝、脾、胃、肾、 肺、大肠、小肠、脑、肌肉的表达情况进行了比较分析。检测了s r p k l 和s r p k 3 基因部分 外显子的多态性；构建了猪骨骼肌损伤模型，检测s r p k i 、s r p k 3 在骨骼肌损伤修复过程 中的表达情况，并通过该模型研究s r p k l 、s r p k 3 、m y o d 、f o x o i 、m e f 2 a 、m e f 2 b 和 m e f 2 d 基因的相关性。主要研究结果如下： ( 1 ) 利用r t - p c r 和i - p c r 技术克隆了s r p k l 基因的m r n a 序列2 4 9 9 b p 其中包括 1 9 6 8 b p 完整的c d s 区域和3 2 5 b p 的5 u t r 序列，编码6 5 6 个氨基酸；获得s r p k 3 基因的 1 7 0 8 b p 核苷酸片段涵盖s r p k 3 的全长c d s 区域，共编码5 6 7 氨基酸。 ( 2 ) 利用生物信息学方法分析s r p k i 、s r p k 3 基因核酸序列及编码蛋白序列的结构特 点发现各自都包括1 个pk c 和1 个a t p b i n d i n g 结构域，猪s r p k l 蛋白序列与人和黑猩猩 的相似性较高。s r p k l 的5 u t r 含有多种转录结合位点：h s f i ，h s f 2 ，i k - l ，i k 2 ，s r y , s p l m y o d ，u s ee 4 7 ，p 3 0 0 ，c p 2 ，r r e b 1 ，e 2 f , a p 1 。猪s r p k l 及s r p k 3 蛋白序列与人和牛的相 似性较高。 ( 3 ) 利用p c r s s c p 技术对大白猪、民猪、野家杂交猪的s r p k l 基因的第8 、1 0 、1 1 、 1 6 外显子和s r p k 3 的第6 、9 外显子进行了多态性检验。结果显示s r p k l 所检测的外显子 区域无多态性，s r p k 3 的第6 外显子上有a 6 2 9 一g 6 2 9 ，t 6 5 3 - - t 6 5 3 的突变，氨基酸变化为 p r o h i s ，i l e t i l r ；第9 外显子处的g 1 0 5 9 一a 1 0 5 9 ，氨基酸无突变。 ( 4 ) 猪s r p k l 和s r p k 3 基因表达都具有组织和品种间特异性，s r p k l 主要在消化器 官处表达而s r p i ( 3 基因主要在肌肉和心肌内表达。 ( 5 ) s r p k i 基冈在骨骼肌损伤修复过程中出现升高和降低反复交替的现象，s r p k 3 的 表达持续升高。 ( 6 ) 检测了包括m y o d 、m e f 2 a 在内的其他几个成肌因子的骨骼肌上修复过程中的表达 情况，并分析了它们之间的相关性，结果显示仅s r p k l 与s r p k 3 相关极显著( p 0 0 1 ) ， s r p k i 与m e f 2 d 相关显著( p o 0 5 ) 。 关键词猪；精氦酸丝氨酸蛋向激酶基因：实时定量p c r ；反向p c r ；骨骼肌损伤 一 a b s t r a c t c l o n i n g ，e x p r e s s i n g a n dp o l y m o r p h i s m a n a l y s i s o fs r p k la n ds r p k 3i np i g a b s t r a c t a r g i n i n e - s e r i n ep r o t e i nk i n a s e ( s r p k ) i saf a m i l yo ft h es rp r o t e i nk i n a s e - s p e c i f i c p h o s p h o r y l a t i o n s o m es t u d i e ss h o wt h a ts r p k li sl o c a t e di na c o n t r o lf a tt r a i t sq t l r e g i o no ff a t , t h eh i g ho rl o wo fs r p k 3w h i l el e a dt om u s c l es a t e l l i t ec e l l sl e s i o n so rl e a dt od e a t ho fi n d i v i d u a l o r g a n i s m s t h e r e f o r e ，t h es t u d yo fm o l e c u l a rg e n e t i cs t r u c t u r ea n ds p a t i a l - t e m p o r a le x p r e s s i o nw i t h m o d e mm o l e c u l a rb i o l o g yt or e s e a r c hp i gs r p k l ，s r p k 3g e n e ，ac a n d i d a t eg e n ef o rm e a tq u a l i t y t r a i t sa r ev e r yi m p o r t a n ti nt h e o r e t i c a ls i g n i f i c a n c e i nt h i ss t u d y , y o r k s h i r e ，d u r o c ，n o r t h e a s tw i l db o a r , n o r t h e a s tc h i n ap i g s ，c r o s s b r e db o a r sa s t h er e s e a r c ho b j e c t c l o n i n go ft h es r p k lg e n ea n ds r p k 3g e n e s ，a n a l y z e di t ss t r u c t u r ea n d f u n c t i o ni nm o l e c u l a re v o l u t i o n a n dc o m p a r a t i v ea n a l y s i so ft h es i t u a t i o no ft h eh e a r t , l i v e r , s p l e e n ， s t o m a c h ，k i d n e y , l u n g ，l a r g ei n t e s t i n e ，s m a l li n t e s t i n e ，b r a i n ，m u s c l ee x p r e s s i o no ft h eo n em o n t h o l dy o r k s h i r ea n dd u r o c ，a n d1 - d a y - o l dy o r k s h i r e t h ep o l y m o r p h i s mo fs o m ee x o n si ns r p k l a n ds r p k 3g e n ew a se x a m i n e d t ob u i l dp i gs k e l e t a lm u s c l ei n j u r ym o d e lt od e t e c tt h ee x p r e s s i o n o fs r p k l ，s r p k 3i nt h ep r o c e s so f o ft h es k e l e t a lm u s c l ei n j u r ya n dr e p a i r a n dt h r o u g ht h em o d e l t ob u i l tt h ei n t e r a c t i o nn e t w o r k so fs r p k l ，s r p k 3 ，m y o d ，f o x o i ，m e f 2 a ，m e f 2 ba n dm e f 2 d g e n e t h em a j o rf i n d i n g sa sf o l l o w s ： ( 1 ) t oy o r k s h i r ep i g sa st h es t u d yo b j e c t ，u s i n gr t - p c rc l o n i n gl o n g2 4 9 9 b py o r k s h i r e s r p k lg e n es e q u e n c e s ，c o v e r e d 1 9 6 8 b pc o m p l e t ec d sr e g i o n ，w h i c hi n c l u d e st h eu s eo f i n v e r s e - p c rc l o n i n go fp i g ss r p k lp a r to ft h e5 u t r r e s u l ts h o w e dt h a tt h ee n c o d e dp r o t e i n c o n t a i n s6 5 6a m i n oa c i d s ；g e ts r p k 3g e n e17 0 8 b pn u c l e o t i d ef r a g m e n t s ，c o v e r e df u l l l e n g t hg e n e c d s ( 1 7 0 1 b p ) o f s r p k 3 ( 2 ) u s et h eb i o i n f o r m a t i c st oa n a l y s i sn u c l e i ca c i ds e q u e n c e sa n ds t r u c t u r a lf e a t u r e so f p r o t e i n c o d i n gs e q u e n c e so fs r p k ia n ds r p k 3f o u n dt h a te a c hi n c l u d e sap k ca n d a n a t p b i n d i n gd o m a i n ，p i g ss r p k ip r o t e i ns e q u e n c eh a sh i g hs i m i l a r i t yw i t hh u m a n a n d c h i m p a n z e t h r o u g ht h eb i o i n f o r m a t i c sp r e d i c t i o nf o u n dt h ep a r to ft h e5 u t ro fs r p k lc o n t a i n sm u l t i p l e t r a n s c r i p t i o nb i n d i n gs i t e s ：h s f l ，h s f 2 ，i k 一1 ，i k 一2 ，s r y , s p lm y o d ，u s ee 4 7 ，p 3 0 0 ，c p 2 ， r r e b 一1 ，e 2 f , a p 一1 p i gs r p k 3p r o t e i ns e q u e n c eh a sh i g hs i m i l a r i t yw i t hh u m a na n db o v i n e ( 3 ) u s e d p c r s s c p t e c h n i q u e t o a n a l y s i s t h e8 t h ，1 0 t h ，1 1 t h ，1 6 t he x o n s o f s r p k lg e n ea n d 6 t h ，9 t he x o n so fs r p k 3o ny o r k s h i r e ，n o r t h e a s tm i np i g s ，n o r t h e a s ta n dc r o s s b r e db o a r s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a sn o ta n ys n p si ne x o n sr e g i o no fs r p k lt e s t e d ，b u tf o u n dm u t a t i o na t s i x t he x o no fs r p k 3a sa 6 2 9 - g 6 2 9 ，t 6 5 3 一t 6 5 3 ，a m i n oa c i dc h a n g e sf o rt h ep r o h i s ，i l e - t h r ；t h en i n e t he x o nm u t a t i o na sg 10 5 9 - a10 5 9 a m i n oa c i dn om u t a t i o n ( 4 ) u s et h er e a l t i m e p c rs h o w e dt h a tt h ee x p r e s s i o no fp i gs r p k1a n ds r p k 3g e n eb o t h i i i 东北农业大学农学硕 学位论文 h a v eo r g a n i z a t i o n a la n ds p e c i e s - s p e c i f i c ，b u ts r p k lm o s t l yl o c a t e di nt h es t o m a c h ，l a r g ei n t e s t i n e a n ds m a l li n t e s t i n ea n do t h e rp a r t so ft h ed i g e s t i v es y s t e ma n dn u t r i t i o na b s o r p t i o n - r e l a t e d a n dt h e s r p k 3m a i n l ye x p r e s s e di nm u s c l ea n dh e a r t ( 5 ) c o n s t r u c t i o no fp i gs k e l e t a lm u s c l ei n j u r ym o d e lc o m b i n e dw i t ht h er e a l t i m et e c h n o l o g y t od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fs r p k1a n ds r p k 3s h o w e dt h a ts r p k1 g e n ei nt h ee x p r e s s i o no fi n ju r y a n dr e p a i rp r o c e s sa n dr e d u c et h er e c u r r i n gi n c r e a s e ，s r p k 3e x p r e s s i o nc o n t i n u e st or i s e ( 6 ) t h es t u d ya l s oe x a m i n e d ，i n c l u d i n gm y o d ，m e f 2 a ，i n c l u d i n gs e v e r a lo t h e rm y o g e n i c f a c t o r si ns k e l e t a lm u s c l ec o u n ti nt h ee x p r e s s i o no ft h er e p a i rp r o c e s s a n dt ob u i l dac r o s sd o i n g r e l a t e dr e s e a r c hr e s u l t ss h o w e dt h a to n l ys r p k la s s o c i a t e dw i t hs r p k 3s i g n i f i c a n t ( q o od ， s r p kia s s o c i a t e dw i t hm e f 2 ds i g n i f i c a n t ( q 0 0 5 ) k e yw o r d sp i g ；s e r i n e a r g i n i n e - r i c hs p e c i f i ck i n a s eg e n e ；r e a l t i m e p c r ；i n v e r s ep c r ；s k e l e t a l m u s c l ei n j u r y i v c a n d i d a t e ：eg u a n g x i n s p e c i a l i t y ：a n i m a lg e n e t i c sa n db r e e d i n g s u p e r v i s o r ：p r o f l i ud i 引言 1 引言 猪作为肉用家备，衡量其生产性能好坏的主要标准是能否生产大量优质的动物蛋白，而 具体指标就是瘦肉率、生长速度和肉质。从解剖学角度上讲这三项指标都与单位面积的肌纤 维数和肌纤维直径有关。单位面积上的肌纤维数越多、肌纤维直径越大猪的产肉量就越高； 但肌纤维直径的增加会影响肉质，肌纤维直径小的肌肉，其系水力强，肌肉嫩度好。所以肌 纤维的发育状况与动物的生产性能有最直接的关系。 哺乳动物的骨骼肌细胞主要来自轴旁中胚层的肌节间质细胞，这类细胞通过定向发育、 分化、融合等过程，从外部形态到内部结构都发生巨大变化，最终发育成不同类型的骨骼肌 细胞。 近年来，在脊椎动物与无脊椎动物组织特异性基因调控途径的研究上，骨骼肌的发生与 发育己被作为一个模式系统，成为研究的热点。陆续有多种在骨骼肌的发生与发育过程中起 关键作用的调节囚