（免疫学专业论文）类杆菌的pcr鉴定及其生物信息学.pdf

郑州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 研究生王国戗 导师罗予 郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室，郑州，4 5 0 0 5 2 中文摘要 目的 设计通用引物和通用探针，使用聚合酶链反应技术( 普通p c r ，实时荧光 定量p c r ) 快速鉴定类杆菌属细菌，并测定该菌属的1 6 sr r n a 基因序列，建 立基因进化树，分析不同来源分离菌株之间的进化差异、分离菌株和标准菌株之 间的进化差异。 研究方法 1 根据临床上常见类杆菌的标准1 6 sr r n a 基因序列，在其序列保守区设 计通用引物和通用探针，并验证引物和探针的特异性。2 使用脆弱类杆菌、多 形类杆菌、普通类杆菌、卵圆类杆菌为阳性对照株( 共1 3 株) ，以肠道需氧菌、 g + 球菌、梭杆菌、长双歧杆菌d q 2 5 9 0 3 4 、大肠埃希菌a t c c 2 5 9 2 2 ( 共4 5 株) ，及 人类单个核细胞基因组d n a 、h b v d n a 等为阴性对照，建立普通p c r 和实时荧光 定量p c r 的方法，快速鉴定类杆菌。3 普通p c r 产物基因测序，所测序列之 间以及和相应的标准株1 6 sr r n a 基因序列之间做比对，构建基因进化树。4 采 用细菌直接计数法制作标准品建立实时荧光定量p c r 方法，同时和p c r 产物作 为标准品的定量检测同一标本的结果比较。5 类杆菌的p c r 鉴定结果和表型鉴 定结果对比分析。 结果 1 建立了普通p c r 和实时荧光定量p c r 反应体系。普通p c r 和实时荧光 定量p c r 能特异的检测脆弱类杆菌，多形类杆菌，普通类杆菌，卵圆形类杆菌。 而4 0 株肠道需氧菌、g + 球菌、梭杆菌、长双歧杆菌d q 2 5 9 0 3 4 、大肠埃希菌 a t c c 2 5 9 2 2 、人类单个核细胞基因组d n a 、h b v d n a 等无电泳条带和检测信号出 现。 2 普通p c r 能检测到1 0 0 个细菌的基因组d n a i ，实时荧光定量p c r 能 检测到1 0 个细菌的基因组d n a i u l 。 郑州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 3 做了实时荧光定量p c r 检测类杆菌的批内和批间重复性实验。用细菌 浓度分别为1 0 4 、1 0 5 个细菌基因组伽，做批内，批间重复性实验，每个浓度测 5 次，使用c t ( 循环域值) 值的变异系数表示实验的重复性。1 0 4 个细菌基因组 山的批内重复性：c v ( 变异系数) 值为o 7 0 4 ，批间重复性c v 值为3 4 9 ； 1 0 5 个细菌基因组仙的批内重复性：c v 值为o 7 4 ，批问重复性c v 值为1 1 9 。 4 用细菌直接计数法制作标准品和p c r 产物制作标准品分别建立荧光定量 p c r 反应体系，以1 0 3 个细菌m 为检测标本，做实时荧光定量p c r 。细菌直接 计数法制作标准品的检测结果为为7 6 3 8 个细菌仙，p c r 产物制作标准品的检测 结果为1 1 2 9 个细菌仙。 5 有三株细菌表型鉴定和p c r 鉴定结果不一致。 6 基因进化树和b l a s t 结果表明，同种分离株的1 6 sr n a 基因序列之间以 及和相应的标准的1 6 sr n a 基因序列之间的遗传学距离有一定的差异。 结论 i 建立的普通p c r 和实时荧光定量p c r 体系能特异性地检测类杆菌，普 通p c r 的检测灵敏性达到了1 0 0 个细菌基因组仙，实时荧光定量p c r 能检测 到1 0 个细菌的基因组d n a p l 。 2 建立的实时荧光定量p c r 体系有很好的重复性，批内，批间变异系数 都在5 以内。 3 细菌直接计数法制作标准品做实时荧光定量p c r 检测标本比使用p c r 产物制作标准品做实时荧光定量p c r 检测标本的结果更接近实际结果。 4 表型鉴定与分子生物学鉴定相比存在一定的误差。 5 同种但不同来源的菌株之间的1 6 sr r n a 基因并不完全相同。 关键词：聚合酶链反应( p c r ) ；普通p c r ；实时荧光定量p c r ：1 6 sr r n a ；类 杆菌 i i 塑丝盔堂! 竺! 星堡圭塑塞生堂堡丝塞 耋堑堕塑! ! 垦鳖塞墨基生塑笪皇堂 i d e n t i f i c a t i o no fb a c t e r o i d e sb yp c ra n ds t u d yo ft h e i r b i o i n f o r m a t i o n p o s t g r a d u a t ew a n gg u a n g q i a n g t u t o rl u oy u d e p a r t m e n to fm i c r o b i o l o g ya n di m m u n o l o g y , b a s km e d i c a lc o l l e g e , z h e n g z h o u u n i v e r s i t y , z h e n g z h o uc h i n a , 4 5 0 0 5 2 a b s t r a c t o b j e c t i v e ： t h eo b j e c t i v eo ft h i ss t u d yi st od e s i g nu n i v e r s a lp r i m e r sa n dp r o b et oi d e n t i f y b a c t e r o i d e sb yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) t e c h n o l o g y ，a n de s t a b l i s hg e n e e v o l v e m e n tt r e e so fb a c t e r o i d e st h r o u g hm u l t i p l ec o m p a r i n gs e q u e n c e so f16 sr r n a g e n eo fb a c t e r o i d e sb yc l u s t a l w l 8 3a n dt r e e v i e ws o f t w a r ei no r d e rt oa n a l y s et h e e v o l v e m e n td i f f e r e n c e m e n ti nd i f f e r e n to r i g i nb a c t e r o i d e sa n db e t w e e ni s o l a t e ds t r a i n s a n ds t a n d a r ds t r a i n s m e t h o d s ： 1 u n i v e r s a lp r i m e r sa n dp r o b ew e r ed e s i g n e db a s e do nt h ec o n s e r v a t i v ed o m a i no f 1 6 sr r n ag e n es e q u e n c e so fb a c t e r o i d e st ob eo f t e nf o u n di np a i e n t s 2 r o u t i n e p c ra n df q p c rw e r e d e v e l o p e d t o i d e n t i f y b a c t e r o i d e sw i t h b f r a g i l i s , b t h e t a i o t a o m i c r o n ，b v u t g a t u s ，b o v a t u s ( 1 3s t r a i n s ) a sp o s i t i v ec o n t r o la n da e r o b e s o f4 0s t r a i n s ，e s c h e r i c h i ac o l i , b 1 0 n g u m ，f u s o b a e t e r i u m , g + c o c c i ，g + b a c i l l u s ， h b v - d n ag e n o m ea n dm o n o c y t ea sn e g a t i v ec o n t r 0 1 3 g e n ee v o l v e m e n tt r e e w a se s t a b l i s h e db a s e do nt h ed e t e c t e d16 sr r n ag e n es e q u e n c e sa n dc o r r e s p o n d i n g s t a n d a r d1 6 sr r n ag e n es e q u e n c e s 4 b e t t e rm e t h o dt om a k es t a n d a r ds a m p l ew a s s e a r c h e df o rb yc o m p a r i n gt h ed e t e c t e dr e s u l t so ff q - p c rw i t hd i f f e r e n ts t a n d a r d s a m p l e s 5 t h er e s u l t so fi d e n t i f i c a t i o np c ra n dp h e n o t y p ef o rb a c t e r o i d e sw e r e a n a l y s e d r e s u l t s ： 1 b f r a g i l i s , k t h e t a i o t a o m i c r o n , b v u l g a t u s , b o v a t u s w r ec a nb ed e t e c t e db y t h i s r o u t i n ep c ra n dt h i sf q - p c r ，h o w e v e r , a e r o b e so f4 0s t r a i n s ，e s c h e r i c h i ac o l i , 1 1 1 郑州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 b 1 0 n g u m , f u s o b a c t e r i u m , g + c o c c i ，g + b a c i l l u s ，h b v - d n ag e n o m ea n dm o n o c y t e n o t t h er o u t i n ep c ra n df q - p c ra r es a t i s f i e dw i t hh i 曲s e n s i t i v i t y 1 0 0b a c t e r i a g e n o m ed n a 山c a nb ed e t e c t e db yt h i sr o u t i n ep c r ，1 0b a c t e r i ag e n o m ed n a r a c o u l db yt h i sf q p c r 2 c vv a l u e si nt h eg r o u pt oo b t a i nb yr e p e a t i n gt h es a m p l e so f1 0 4b a c t e r i ag c n o m e d n a g l , 1 0 5 b a c t e r i a g e n o m e d n a i a a r e 0 7 0 4 o 7 4 r e s p e c t i v e l y , c v v a l u e s o f d i f f e r e n tg r o u p sa r e3 4 9 1 1 9 3 t h et w of q - p c rs y s t e m sw e r ed e v e l o p e d o n eu s e dt h em e t h o do fd i r e c t l y c o u n t i n gb a c t e r i am a k es t a n d a r ds a m p l e ，t h eo t h e ru s e dp r o d u c eo fr o u t i n ep c r a s s t a n d a r ds a m p l e t h es a m p l eo f10 3 b a c t e r i ag e n o m ed n a w e r ed e t e c t e db yt h ea b o v e t w of q - p c rs y s t e m s 。t h er e s u l t sw e r e7 6 3 8b a c t e r i ag e n o m ed n a 止1 1 2 。9b a c t e r i a g e n o m ed n a 1r e s p e c t i v e l y 4 t h ep h e n o t y p er e s u l t so ft h r e es t r a i n sa r en o tc o n s e n t a n e o u sw i t h t h e i r i d e n t i f i c a t i o nr e s u l tb yp c ri nt h es t u d y 5 t h er e s u l t so f e s t a b l i s h e dg e n et r e ea n db l a s ts h o wt h a tt h e r ea l eaf e wd i f f e r e n c e s e a c ho t h e ra m o n gt h e s e1 6 sr r n ag e n es e q u e n c e so fi s o l a t e ds t a i n sa n di nb e t w e e n 16 sr r n ag e n es e q u e n c e so fi s o l a t e ds t a i n sa n dc o r r e s p o n d i n gs t a n d a r d1 6 sr r n a g e n es e q u e n c e sf r o mg e n b a n k c o n e l u s l o n ： 1 t h ed e v e l o p e dr o u t i n ep c ra n df q - p c rs y s t e m sa r es a t i s f i e dw i t hh i 曲 s e n s i t i v i t y ( r o u t i n ep c r c a l ld e t e c t1 0 0b a c t e r i ag e n o m # dea n df q p c rc a nd e t e c t 1 0b a c t e r i ag e n o m e i d ) a n ds p e c i f i c i t y 2 t h e r ei se x c e l l e n tr e p r o d u c i b i l i t ya b o u tt h ef q p c r , t h e i rc vv a l u e sa r ei n5 3 t h ed e t e c t i o nr e s u l tb yt h ef q - p c rs y s t e mu s i n gb a c t e r i ag e n o m ea ss t a n d a r d s a m p l ei sc l o s e rt ot h ea c t u a lt h a nu s i n gp r o d u c eo f r o u t i n ep c r 5 i ns o m et i m e ，t h ep h e n o t y p er e s u l tw a sw r o n g 5 ，t h e r ea l eaf e wd i f f e r e n c e sf o r1 6 sr r n ag e n es e q u e n c e so ft h es a m es t r a i n sf r o m d i f f e r e n to r i g i n s 邦卅f 大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文类杆菌的f c r 鉴定及其生物信息学 k e y w o r d s ： p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) ；r o u t i n ep c r ；f q - p c r ；1 6 sr r n a ；b a c t e r o i d e s v 郑州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 研究生王国戗 导师罗予 郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室，郑州，4 5 0 0 5 2 刖舌 类杆菌是一群g - 无芽孢厌氧杆菌，是人体肠道重要的正常菌群，在维持人体 肠道微生态平衡方面起着重要的作用。但是，在某些情况下该菌可以成为条件致 病菌，导致内源性感染。在类杆菌属中，脆弱类杆菌、多形类杆菌、普通类杆菌、 卵圆形类杆菌、吉氏类杆菌、单形类杆菌常引起机体内源性感染。其中以脆弱类 杆菌引起的感染最为重要，占临床厌氧分离株的2 5 。，1 9 9 5 年的资料显示： 脆弱类杆菌、多形类杆菌、普通类杆菌、卵圆形类杆菌、吉氏类杆菌、单形类杆 菌引起的感染分别占类杆菌属感染中的5 4 、1 6 、1 1 、1 0 、6 、3 ”1 。目前没 有检索到新近的关于上述细菌分别的感染率。但是，有比较多的资料报告脆弱类 杆菌，多形类杆菌是临床上的重要致病菌“。”。类杆菌作为人体的正常菌群对 人体也有有益的一面，如，脆弱类杆菌可以促进免疫系统发育成熟“1 ，脆弱类杆 菌和多形类杆菌能将人肠道不能吸收的多聚糖，纤维素等降解成可利用的物质和 能量供人体利用“。无论类杆菌作为正常菌群与机体和平共处，并给机体带来 益处，还是成为条件致病菌给机体带来危害，及时准确的检测和鉴定这些细菌都 是非常重要的，特别是作为条件致病菌引起机体感染时，及时准确地检测和鉴定 非常重要。 目前，厌氧培养技术仍然是厌氧菌分离与鉴定的主要方法，类杆菌作为厌氧 茵也不例外。厌氧菌检测在我国开展非常不理想，2 0 0 2 年资料显示：我国从未 开展此项工作的实验室占7 7 ，9 0 的实验室无鉴定厌氧菌的设备。1 。厌氧培养 不能常规开展的主要原因是厌氧培养技术费时费力，且灵敏度相对较低，特异性 差，常出现鉴定失误，厌氧培养系统价格昂贵，不能及时指导临床治疗。1 。 随着分子生物学的发展，特别是上世纪八十年代p c r 技术的出现，以p c r 为 基础的检测技术检测病原微生物得到了迅速发展，在类杆菌的检测中p e r 技术也 得到了很好的应用，特别是脆弱类杆菌的p c r 检测，国内外研究人员以不同的基 因位置为靶点设计引物鉴定脆弱类杆菌，如以1 6 sr r n a 基因为靶基因鉴定脆弱 郑州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 类杆菌“。，以b 一异丙基苹果酸脱氢酶基因为靶基因鉴定脆弱类杆菌“”，1 6 s r r n a 基因为靶基因鉴定多形类杆菌“”，以肠毒素基因为靶基因检测脆弱类杆菌“” 等。在细菌的检测与鉴定中，以1 6 sr r n a 基因为靶基因进行鉴定的报道比较多 见。这是因为细菌1 6 sr r n a 基因核苷酸序列具有高度的保守性，但它的保守性 又是相对的，在保守区间存在9 1 0 个可变区，不同的属、科、种都有一定的变 异，基于这一特性，可对细菌进行鉴定“”。 利用1 6 sr r n a 基因为靶基因鉴定类杆菌中的某一个种，国内外已见报道， 但是，一次p c r 扩增检测一种细菌在临床上有点局限，一次能检测多种细菌在临 床上价值更大。可是，目前有关以1 6 sr r n a 基因为靶基因鉴定类杆菌属的相关 资料甚少。本研究拟以1 6 sr r n 基因为靶基因，设计通用引物和探针，鉴定和 定量检测类杆菌属细菌，以克服在临床上一次p c r 扩增只能检测一种细菌的不 足。 本研究通过设计通用引物和通用探针，使用荧光定量p c r 技术( t a q m a n 探 针法) 定量检测类杆菌，使用普通p c r 法鉴定类杆菌。t a q m a n 探针法荧光定量 p c r 技术和使用荧光染料( s y b rg r e e n ) 的定量p c r 技术是在细菌的定量检测中 常用的两种方法。使用荧光染料的定量p c r 技术操作简便，费用较低，但其特异 性较差，因为荧光染料( s y b rg r e e n ) 可以和所有的双链结合而发出荧光。t a q m a n 探针法荧光定量p c r 特异性强，但价格相对较高。本文选用t a q m a n 探针法荧光 定量p c r 技术，建立类杆菌的定量检测方法，使用普通p c r 技术建立类杆菌的定 性检测方法。 2 郑州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 一临床菌株的分离 技术流程 二技术流程图见下图1 获取1 6 sr r n a 基因序列 上 引物和探针设计 誊普严嗽耳 + 彗册 弓f 灵严行 凳 篓 雾 曩 毳 异厂l 幛 + 盘 物 序 列 的 f 暑 比 较 基 因 进 化 树 的 构 建 基荧光定旱p c r 因 羹厂 t 几 取灵特 重 - v -用 蓁 篓曩囊 囊 莛 卖度性性 孥 种 验实实 实 差播 验验验 狸 准 图1 ：技术流程图 pc刃结果比较 郑州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 实验材料和方法 1 实验材料 1 1 实验用菌株及基因组见表1 表1 实验用菌株及基因组 序号菌名编号 来源 l脆弱类杆菌a t c c 2 5 2 8 5 2 脆弱类杆菌n t c t 8 5 6 0 3 多形类杆菌1 2 0 0 2 4普通类杆菌1 4 0 0 2 5 卵圆形类杆菌2 0 0 5 1 2 1 6 普通类杆菌事2 0 0 4 1 1 7脆弱类杆菌1 0 0 1 7 8脆弱类杆菌1 0 0 2 0 9脆弱类杆菌1 0 0 7 8 l o脆弱类杆菌1 0 0 1 9 1 l脆弱类杆菌2 0 0 5 1 2 2 1 2吉氏类杆菌宰1 1 0 0 2 1 3 吉氏类杆菌术2 0 0 5 ，1 2 3 其他需氧菌( 肠杆菌 科) 4 0 株 大肠埃希菌a t c c 2 5 9 2 2 长双歧杆菌d q 2 5 9 0 3 4 g + 球菌 g + 杆菌 梭杆菌 人类单个核细胞 基因组 h b v d n a 基因组 本研究室保存 本研究室保存 复旦大学微生物教研室 复旦大学微生物教研室 本研究室保存( 本研究室分离) 本研究室保存( 本研究室分离) 复旦大学微生物教研室 复旦大学微生物教研室 复旦大学微生物教研室 复旦大学微生物教研室 本研究室保存( 本研究室分离) 复旦大学微生物教研室 本研究室保存( 本研究室分离) 郑州大学第一，三附属医院检验科 微生物实验室 本研究室保存 本研究室保存 本研究室保存 本研究室保存 本研究室保存 郑州大学第一附属医院内分泌科 河南新乡传染病医院分子生物实验室 为表型鉴定结果和分子生生物学鉴定结果不一致菌株。卜2 号为标准株，3 - 1 3 号为表型株 4 郑州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 1 2 主要试剂 琼脂糖：p r o m e g av 3 1 2 1 。 m a r k e rd l 2 0 0 0 ：大连宝生物公司。 细菌基因组d n a 小量提取试剂盒d v 8 1 0 a ：大连宝生物公司。 d n a 凝胶回收试剂盒d v 8 0 5 a ：大连宝生物公司。 e x t a qd r r o o i a * i d n t p - 大连宝生物公司。 l 反应缓冲液j g o l d v i e w 核酸染料：大连宝生物公司。 引物，t a q m a n 探针：大连宝生物公司合成。 p r e m i xe xt a q “d r r 0 3 9 s ：大连宝生物公司。 1 3 主要仪器 高速台式离心机( 最高速2 0 0 0 0 转m i n ) ：上海安亭科学仪器公司产品。 电泳仪d y y - 6 l 型：北京六一仪器厂。 u - 2 0 0 1 紫外可见分光光度计：日本日立。 微量加样器( 2 0 0 p l 、5 0 一、0 5 1 0 p l ，o 1 & 0 皿) ：大龙医疗设备有限公司。 恒温水浴箱：上海精宏实验设备有限公司。 p c r 仪：b i o m e t r a 公司。 凝胶成像仪：b i o - r a d 。 荧光定量p c r 扩增仪及附带软件( a b i5 7 0 0 ) ：美国p e 公司生产。 5 郑州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 实验方法 1 临床类杆菌株的分离“” 挑取志愿者中段粪便绿豆大小一块放入l m l 无菌生理盐水，震荡3 0 秒使均 匀，无菌操作接种于b d 琼脂培养基平板，3 7 c 厌氧培养4 8 小时，挑取疑似类杆 菌菌落做耐氧实验、革兰氏染色、最后做生化鉴定，共分离到4 株细菌生化鉴定 结果符合类杆菌，分别是卵圆形类杆菌2 0 0 5 1 2 1 、普通类杆菌木2 0 0 4 i i 、脆 弱类杆菌2 0 0 5 1 2 2 ，吉氏类杆菌 2 0 0 5 1 2 3 。 2 实验用菌株的处理 2 i 将表i 中的类杆菌，梭杆菌分别接种于b d 液体培养基( 不加抗生素) ，长 双歧杆菌接种于b l 液体培养基，并做好标记，3 6 c 1 厌氧培养4 8 小时备用。 其他细菌接种于普通肉汤培养基，3 6 1 有氧培养2 4 小时备用。 2 2 实验用菌株的d n a 提取： ( 1 ) 取i m l 上述备用的液体培养液，1 2 0 0 0 r p m 离心2 分钟，弃上清。( 2 ) 用1 5 0 微升的s pb u f f e r 充分悬浮细菌沉淀。( 3 ) 加入2 0 微升的l y s o z y m e 溶液，均匀 混合后室温静置5 分钟。( 4 ) 加入3 0 微升的e d t ab u f f e r ，均匀混合后室温静 置5 分钟( 5 ) 加入2 0 0 微升的s o l u t i o na ，剧烈震荡后6 5 1 2 保温1 0 分钟。( 6 ) 加入4 0 0 微升的s o l u t i o nb ，激烈震荡1 5 秒。( 7 ) 加入6 5 0 微升的s o l u t i o nc ， 上下颠倒均匀混合，1 2 0 0 0 r p m 离心1 分钟。( 8 ) 先弃去上层有机相，然后将水 相溶液移入预先置于1 5 m l 离心管上的f i l t e rc u p 中1 2 0 0 0 p m 离心1 分钟。( 9 ) 弃f i l t e rc u p ，在滤液中加入4 5 0 微升的d bb u f f e r ，混合均匀。( 1 0 ) 将试剂盒 中的s p i nc o l u m n 安置于c o l l e c t i o nt u b e 上。( 1 1 ) 将上述操作步骤9 的混合 液转移到s p i nc o l u m n 中，1 2 0 0 0r p m 离心1 分钟，弃滤液。( 1 2 ) 将5 0 0 微升 的r i n s e a 加入s p i nc o l u m n 中1 2 0 0 0 r m p 离心一分钟，弃滤液。( 1 3 ) 将7 0 0 微 升的r i n s e b 加入s p i nc o l u m n 中1 2 0 0 0 r m p 离心一分钟，弃滤液。( 1 4 ) 重复操 作步骤1 3 ，然后1 2 0 0 0 r m p 离心1 分钟。( 1 5 ) 将s p i nc o l u m n 安置于新的1 5 m l 的离心管上，在s p i nc o l u m n 膜的中央处加入6 0 微升e l u t i o nb u f f e r 。室温静 置1 分钟。( 1 6 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心1 分钟，洗脱。将洗脱液( d n a ) 一2 0 保存备用。 2 3 细菌基因组d n a 提取率的计算 显微镜直接计数：脆弱类杆菌在b d 液体培养基中3 6 c i c 厌氧培养4 8 小时 6 郑州大学2 0 0 届硕士研究生学位论文 类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 后计数每m l 中细菌数，然后取l l n l 脆弱类杆菌细菌培养液，提取细菌基因组d n k ， 测定o d m 值及o d m 0 d m 比值，在网站竖韭；! ! ! 业：盟：婴业：血查出脆弱类杆 菌的碱基对数目，根据公式： 质量浓度按公式( t ) 计算 c ( 嵋m 1 ) = a 枷5 0 稀释倍数 ( 1 ) 单位体积中的拷贝数按公式( 2 ) i t 势 n ( c o p i c 咖1 ) ；丽丽c ( m p i d 型m s i l 圳) x l o 鬲6 丽6 0 2 x l 护l 扩 ( 2 ) ” 其中n 为母中质粒的拷贝数，c 为质粒的浓度( p 咖i ) k 为质粒的长度( b p ) ，6 6 0 指1 个b p 的分子基。6 0 2 xl 俨为阿佛加德罗常数 分子中的。i 旷”是将单位。l i g m 1 4 转化为。g m 1 , 公式最右端的“l o j ”楚将擎住“c o p i e s m l ”转化为。c o p i e s p l ”： 计算出提取的基因组d n a 相当于多少个细菌的基因组d n a ，最后计算出每m l 提 取液中相当于含多少个细菌，用此计算值除以直接计数值即为细菌基因组d n a 提取率。 3 通用引物和通用探针的设计 根据引物和探针设计原则，使用c l u s t a l w l 8 3 软件通过多序列比对1 6 s r r n a 基因( 脆弱类杆菌a t c c 2 5 2 8 5 t 、多形类杆菌m 8 9 5 2 0 5 、普通类杆菌m 5 8 7 6 2 、 单形类杆菌a t c c 8 4 9 2 、卵圆形类杆菌a t c c 8 4 8 3 t 、吉氏类杆菌憾6 6 9 5 、大肠杆 菌a t c c 2 5 9 2 2 、长双歧杆菌d q 2 9 5 0 3 4 ) 在类杆菌1 6 sr r n a 基因相对保守区共设 计6 对通用引物和一条通用探针，用叫a m a n 软件和p r i m e rp r e m i e r 5 0 软件分 析引物和探针，筛选出3 对引物和一条探针，并使用n c b i 中的b l a s t 项目验证 引物和探针的特异性。探针的5 末端用f a m 标记，3 末端用t r a m a 标记。引物和 探针基本情况见表2 ，用于引物设计的多序列比对结果见附录1 引物和探针由 大连宝生物公司合成。 7 郑州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 表2引物和探针基本情况 引物和探针引物序列 位置 长度t 珈值 r 上游弓i 物；57 一t a c g g a g g a t c c g a g c g t t a t 一3 5 0 5 5 2 5 2 1 b p 6 1 2 l l 下游弓i 物：5 - a c a t c t t a c g a c g g c a g t c t 一3 1 1 2 3 1 1 4 22 0 b p5 7 4 r 上游弓i 物5 一g g g a t g c g t t c c a t t a g 一3 2 0 7 2 2 3 1 7 b p 5 4 7 y ： 2 l 下游引物：5 。a c a t c t t a c g a c g g c a g t c t 一3 1 1 2 3 1 1 4 22 0 b p5 7 4 c r 上游弓l 物：5 - c g a t g a a t a c t c g c t g t t t g c g a t 一3 7 8 8 8 1 1 2 4 b p 5 3 7 3 下游引物：5 - t g c a a t t t a a g c c c g g g t a a - 3 。 9 4 9 - 9 6 8 2 0 b p 6 0 9 l l 探针： 5 。f a m a a g c g g c c a a g c g a a a g c - t r h m h 38 1 9 8 3 61 8 b p 6 3 7 指在脆弱娄杆菌的1 6 sr r m 基因的位置 4 梯度浓度d n a 的制备 各挑取一个脆弱类杆菌( t c c 2 5 2 8 5 ) ，普通类杆菌( 1 4 0 0 2 ) ，多形类杆 ( 1 2 0 0 2 ) ，卵圆形类杆菌( 2 0 0 5 1 2 ) 的菌落，接种于4 m lb d 液体培养基中，3 7 c 厌氧培养4 8 小时。然后采用直接计数法“”计数细菌数r i d 培养液中，然后稀释 至6 1 0 8 个细菌m l 培养液。用i m l 这样的培养液按2 2 步骤提取细菌基因组 d n a ，最后得到i m l 细菌的基因组d n a 提取液( 6 0 5 ) ，这样每皿提取液中有1 1 0 7 个基因组，然后将其梯度稀释，使成l 1 0 “，1 l o 。，1 1 0 5 ，1 1 0 4 ，1 1 0 3 ，l 1 0 2 ，1 1 0 1 ，l 1 0 0 5 浓度梯度。4 冰箱保存备用。 5 类杆菌的普通p c r 鉴定 5 1 分别用上述三对引物对所有的备用d n a 基因组进行普通p c r 扩增。 5 2 普通p c r 条件优化：依次提高退火温度2 或3 ，提高普通p c r 反应的特异 性。 5 3 普通p c r 的灵敏度检测：普通p c r 扩增1 0 倍鼢斯静薛豹8 个梯度浓度( 1 0 7 1 0 0 个基因组5 ) 。普通p c r 反应体系见表3 郑州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 表3 ：p c r 反应体系 加入试剂加样量 待检样品 上游引物 下游引物 1 0 p c rb u f f e r d n t p s t a q 酶 d d b z o 2 0m 1 0 山 1 0 山 5 0m 4 0u 1 0 2 5 u 直至5 0m 反应的程序为9 5 预变性3 0 秒一次9 5 3 0 秒，5 5 2 3 0 秒，7 2 1 2 6 0 秒共4 0 个循环。 5 4 普通p c r 产物的回收 d n a 样品经琼脂糖凝胶电泳后，切取目的d n a 片段：将含有d n a 片段的胶块切碎 后，放入1 5 m l 的m i c r o t u b e 中：向装有胶块的m i c r o t u b e 中加入3 倍凝胶量的n a i ， 5 5 加热使胶完全融化：按每2 0 儿硅胶树脂结合约i p g d n a 的比例加入适量的硅胶树 脂，充分混合后，于室温放置2 0 m i n ；离心( 1 0 0 0 0r p m , i m i n ) 后除去上清液，如果 回收率较低时，可在此上清液中再次加入硅胶树脂液，重新吸附：在m l c r o t u b e 中加 入5 0 0 m 清洗液，振荡混匀后离心( 1 0 0 0 0 r p m ，l m i n ) ，除去上清液。重复操作上一步： 加入和硅胶等量( 体积比) 的t e 缓冲液后混匀，5 5 水浴l o m i n 。离心 ( 1 0 0 0 0 r p m i m i n ) 后吸取上清液，注意尽量不要吸取硅胶树脂。此回收上清液即为 d n a 回收溶液。将纯化后的d n a 交由大连宝生物公司作基因测序。 5 5 将测序结果分别和相应的1 6 sr r n a 基因序列及基因库进行b l a s t 比较，验 证引物和产物的特异性。 5 6 基因进化树的构建 将测序的结果和g e n b a n k 中类杆菌的标准1 6 sr r n a 基因序列，用系统进化树 分析软件构建进化树并分析其生物信息。 6 荧光定量p c r 检测类杆菌 6 1 实验原理：本课题的荧光定量p c r 采用t a q m a n 探针法，t a q m a n 探针的5 末端标记有荧光物质f a t ，3 。末端标记有荧光淬灭物质t a m r a ，当探针完整时，5 9 郑州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 末端的荧光物质受到3 末端的荧光淬灭物质的制约，不能发出光。当t a q m a n 探 针被分解后，5 末端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。当p c r 反应液中加入 荧光探针后，在退火过程中，荧光探针便会和模板杂交，在进一步的p c r 反应得 延伸过程中，t a q d n a 聚合酶的5 - 3 e x o n u c l e a s e ( 核酸外切酶) 活性可以分解与 模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度， 可达到定量检测的目的。具体原理见图2 。 图2t a q m a n 探针_ ；去荧光定量p c r 原理不慧图 6 2 标准品的制作 本研究采用两种标准品建立荧光定量p c r 反应体系。一种采用细菌直接计数 法制作标准品o ”，另一种使用普通p e r 纯化产物制作标准品。细菌直接计数法制 作标准品参见实验方法4 ，使用普通p c r 纯化产物制作标准品首先将实验方法5 4 的纯化产物测定o d 。值及o d 。o d 。比值，然后根据p c r 产物片段长度和0 d 值的 关系计算出p c r 产物的拷贝数，最后稀释至1 1 0 7 、i 1 0 6 、l 1 0 5 、l 1 0 4 、 1 1 0 3 、l 1 0 2 、l 1 0 1 ，1 1 0 0 拷贝枷浓度梯度。 6 3 荧光定量p c r 反应体系：见表4 。 1 0 郑州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 表4 ：荧光定量p c r 反应体系 试剂使用量 p r e m i xe xt a q “( 2 ) p c rf o r w a r dp r i m e r ( 1 0 u m ) p c rr e v e r s ep r i m e r ( 1 0 u m ) 荧光探针溶液( 5 u m ) r o xr e f e r e n c ed y e ( 5 0 x ) d n a 模板 灭菌蒸馏水 1 0 0 叫 0 4m 0 4 皿 0 8m 0 4 山 2 0 m 6 0 u l 总量 2 0 埘 9 5 预变性1 0 秒一次。9 5 c 5 秒，6 0 3 0 秒共计4 0 个循环。 6 4 荧光定量p c r 检测类杆菌的特异性实验 使用上游引物：5 - c g a t g a a t a c t c g c t g t t t g c g a t 一3 ， 下游引物：5 - t g c a a t t t a a g c c c g g g t a a - 3 探针：5 f a m a a g c g g c c a a g c g a a a g c t p m i a 3 按上述荧光定量p c r 反应体系扩增表l 中细菌的d n a 基因组及h b v - d n a ，人 类单个核细胞基因组，检测扩增信号的情况。 6 5 敏感性实验 用细菌直接计数法所得到的系列标准品( 1 x 1 0 7 、l x l 0 6 、1 l o s 、1 1 0 4 、 l x l 0 3 、l 1 0 2 、1 1 0 1 ，l 1 0 0 个细菌基因组p 1 ) 按上述荧光定量p c r 反应体 系进行扩增，检测扩增信号的情况。 6 6 重复性检测 6 6 1 批内重复性检测用两个浓度点( 1 1 0 5 ，1 l o 个细菌基因组仙) 做荧光 定量p c r 扩增，每个浓度点重复5 次，用所得到的c t 值的变异系数估计批内重 复性。 6 6 2 批间重复性检测用两个浓度点( 1 x 1 0 5 ，l 1 0 4 个细菌基因组仙) 不同批 次做荧光定量p c r 扩增所得到的c t 值，共选5 次，同样以c t 值的变异系数估 计批间重复性。 6 7 干扰实验 郑州大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文类杆菌的p c r 鉴定及其生物信息学 用2 山混合类杆菌( 1x1 0 4 个细菌基因组皿) 基因组，1 8 皿大肠埃希菌 a t c c 2 5 9 2 2