（动物遗传育种与繁殖专业论文）鹅SREBP2基因的克隆及禽HLH转录因子的分类和进化分析.pdf

四川农业史学9 0 0 7 届硕士学位论文 摘要 s r e b p s 属于碱性螺旋一环一螺旋亮氨酸拉链( b a s i ch e l i x - l o o p - h d i xl e u c i n e - z i p p e r ， b h l h z i p ) 转录因子家族，是真核细胞内调节脂质合成的关键核转录因子。本研究 测定了朗德鹅( a n s e ra n s e r ) 与天府肉鹅( a n s e rc y g n o i d e s ) s r e b p 2 基因的部分 m r n a 序列，得n tb h l h - z i p 基序的氨基酸序列，以此为基础研究了生物体内h l h 蛋白家族的特点和分类；以鸡的基因组为代表，研究了鸟类基因组内h l h 转录因 子的分类和进化。 序列提交到g e n b a n k 数据库中，登陆号为e f 5 7 9 7 5 4 和e f 5 7 9 7 5 5 。经比对，两 品种鹅序列的相似性1 0 0 。 s r e b p - 2 基因b h l h z i p 基序在不同物种间保持高度的相似性，通过和其他物 种的比较，发现发现5 、1 4 、2 3 、2 5 、2 8 、3 2 、5 4 位点存在氨基酸多态位点。在和 其它h l h 转录因子比较时，发现鹅s r e b p - 2 的b h l h z i p 基序是一个不含脯氨酸 ( p ) 的h l h 结构，这种现象还有待进一步研究。 利用鹅s r e b p - 2b h l h - z i p 基序为基础，对h l h 蛋白进行分类。结果在基因组 中搜索到1 8 种相关结构域，它们和h l h 蛋白的功能密切相关，在进化中又保持了 相对的独立性。这是基因组进化过程中存在的一种“结构域洗排”的机制。 以鸡的基因组为代表，研究了鸟类基因组中h l h 转录因子的分类和进化。发 现在鸡的基因组中，h l h 转录因子包含2 8 个蛋白家族，可以分为a 、b 、c 、d 、 e 五类。在进化上a 和d 接近，c 和e 比较接近，而a 、c 、d 、e 和b 类的分歧 时间早。同哺乳动物相比，鸡的基因组缺少f 类，h l h 转录因子的种类和数目也较 少。 关键词：鹅；s r e b p 一2 ；b h l h ：z i p 基序；h l h 转录因子；基因组进化 四川农业太学黝7 届硕士学位论文 a b s t r a c t s r e b p sb e l o n g st ot h et r a n s c r i p t i o nf a c t o rf a m i l yo fb a s i ch e l i x - l o o p - h e l i x l e u c i n e - z i p p e rc o h l h - z i p ) i ti st h ek e yn u c l e a rt r a n s c r i p t i o n a lf a c t o ri ne u k a r y o t i cc e l l w m c hr e g u l a t e sl i p i dm e t a b o l i s m t h i sp a p e ra c q u i r e dt h ep a r t i a lm r n as e q u e n c eo f s r e b p - 2g e n eo ft w ob r e e dg e e s e ：l a n d e sg o o s e ( a n s e ra n s e r ) a n dm a n f um e a tg o o s e ( a n s e rc y g n o i d e s ) f o rt h i sr e a s o n , t h eb h l h - z i pm o t i fo fs r e b p - 2w a r eo b t a i n e d ，a n d w h a tw es t u d i e dw a sm a i n l yb u i l do nt h i sm o t i f u s i n gc h i c k e ng e n o m ea sam o d e l ，w e i n v e s t i g a t e dt h ec l a s s i f i c a t i o na n de v o l u t i o no f h l ht r a n s c r i p t i o n f a c t o r s s e q u e n c e sw e r es u b m i t t e dt og e n b a n ka n dt h ea c c e s s i o nn u m b e rw a r ee f 5 7 9 7 5 4 a n de f 5 7 9 7 5 5r e s p e c t i v e l y t h er e s u l to fa l i g n m e n ts h o w e dt h a tt h es i m i l a r i t yo ft w o s e q u e n c e s ，b o t ho f w h i c h c o n t a i n e dat y p i c a lb h l h z i pm o t i f , w o l f eu pt o1 0 0 ， t h eb h l h - z i pm o t i fo fs r e b p 一2i nd i f f e r e n ts p e c i e sw e r eh i g h l yc o n s e r v e d c o m p a r e dw i t ho t h e rs p e c i e s ，t h er e s u l to f a l i a n m e n ts h o w e dt h a tt h e r ew e r e7a m i n oa c i d p o l y m o r p h i cs i t e sa t5 ，1 4 ，2 3 ，2 5 ，2 8 ，3 2 ，5 4p o s i t i o n m o r e o v e r , w h e nc o m p a r e dw i t h o t h e rf a m i l i e so fh l h t r a n s c r i p t i o nf a c t o r , i tw a ss u r p r i s i n gt h a tt h eb h l h - z i pm o t i fo f s r e b p - 2g e n ed i dn o tc o n t a i np ，w h i c hd e s e r v e sf t l l t h e ri n v e s t i g a t i o n h l hp r o t e i n s 、 撇c l a s s i f i e db yt h es e q u c eo fb h l h - z i pm o t i fo fs r e b p - 2 。t h e r e s u l ts h o w st h a tt h e r ew e r e18k i n d so fr e l a t e dd o m a i n s ，w h i c hw e r ec l o s e l yr e l a t e dt o t h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no fh l h ，a n dm a i n t a i n e di n d e p e n d e n c yi ne v o l u t i o n w e s u g g e s t e dt h a tt h e r ei s d o m a i ns h u f f l i n g m e c h a n i s mi n v o l v e di ng e n o m e e v o l u t i o n t h es t u d ya b o u tc h i c k e ng e n o m es h o w e dt h a th l h t r a n s c d p t i o nf a c t o rc o n t a i n s2 8 g r o u p so fp r o t e i nf a m i l i e s ，w h i c hc a nb ed i v i d e di n t oa ，b ，c ，da n de c l a s s e s i n e v o l u t i o n , ai sc l o s et od ，a n dci sr e l a t i v e l yc l o s et oe i tw a ss u p p o s e dt h a ta ，b ，ca n d d m i g h tb ee v o l v e df r o mb c o m p a r e dw i t ht h es t a n d a r do fm a m m a l s c l a s s i f i c a t i o n , c l a s sfw a s a b s e n ti nt h e c h i c k e ng e n o m e m o r e o v e r , t h ef a m i l i e sa n dn u m b e ro fh l ht r a n s c r i p t i o nf a c t o r si n c h i c k e ng e n o m ew e r el e s s k e y w o r d s ：g o o s e ，s r e b p - 2 ，b h l h - z i pm o t i f , h l ht r a n s c r i p t i o nf a c t o r , g e n o m e e v o l u t i o n i i 口川农业文学g 0 0 7 届硕士学位论文 符号说明 i 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得 的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它 教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 躲l 伽) 关于论文使用授权的声明 年( 日叫e 1 u | 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名：扔侈0 7 a d )年6 日 州年7 月一日 四川农业大学黝卯届硕士学位论文 1 文献综述 1 1s r e b p s 对脂质合成的调节 转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ) 也称为反式作用因子( t r a m a c t i n gf a c t o r ) ，是指能够 与真核基因启动子区顺式作用因子特异性结合的d n a 结合蛋白。固醇调节元件结合 蛋白( s t e r o lr e g u l a t o r ye l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n s ，s r e b p s ) 是真核细胞内调节脂质代谢 的关键核转录因子，广泛地调节一系列基因的转录。 s r e b p s 属于碱性螺旋环螺旋亮氨酸拉链( b a s i ch e l i x 1 0 0 p - h e l i xl c u c i n c - z i p p c r ， b h l h - z i p ) 转录因子家族【n ，有三种同型异构体( i s o f o r m s ) z , 3 l ：s r e b p - i a 、s r e b p 1 c 和s r e b p - 2 。其中s r e b p 1 a 和1 c 由同一个基因s r e b p 1 产生，在人类染色体上 定位于1 7 p 1 l 2 ；s r e b p 2 由另外一个不同基因s r e b p - 2 产生【4 1 ，在人类染色体上定 位于2 2 p ”。s r e b p 1 a 和1 c 是通过利用可变的转录起始点产生，使得产生的第一 个外显子不同( 1 a 和l c ) ，而这两种异构体的其它外显予均相同三种异构体 s r e b p - l a , s r e b p - l c 和s r e b p - 2 在脂质合成中扮演不同的角色l 锕。其中 s r e b p 1 c 主要调节脂肪酸合成，s r e b p 1 a 对脂肪酸和胆固醇等脂质合成都起作 用；而s r e b p 2 主要起维持细胞内胆固醇稳态的作用r 玎，它通过对其靶基因的转录 调节来控制胆固醇的吸收和分泌 脂质在动物体内起着多重的作用。它们是一种能量来源，是细胞膜和多种前体分 予的组成部分i s ，如类固醇激素、维生素、胆汁酸等。我们对脂质的需求由食物和内 源合成途径来满足，除了那些在肝、脂肪组织和专门用来输送或储存脂质的器官中起 特别重要途径的细胞外，胆固醇和脂肪酸的合成能发生在任何细胞。胆固醇具有多种 生理功能，可组成生物膜及神经髓鞘、构成细胞表面的特殊物质，并可转化为具有生 物活性的物质( 如胆汁酸、类固醇激素、维生素d 3 等) ，当细胞内胆固醇的量超过生 理范围时，会造成细胞膜功能受损，形成晶体沉淀在细胞中杀死细胞，甚至进入血液 造成动脉粥样硬化研。由于s r e b p - 2 对于细胞内胆固醇维持稳定状态具有重要作用， 因此认识s r e b p 2 对胆固醇代谢调控的分子机制，不仅对于指导生产低胆固醇动物产 品具有十分重要的意义，而且对于阐明高胆固醇血症、冠心病( c h d ) 、动脉粥样硬化 ( a s ) 等的发病机制和指导临床治疗都有深远的影响。 s r e b p s 能转录激活内源性胆固醇、脂肪酸、t o 、磷脂合成所必须的一系列酶基 因的表达。虽然s r e b p s 在转录激活靶基因上有功能上的重叠，但是几个研究证明了 四川农业土学黝7 届硕士学位论文 这几个异构体确切的功能 1 0 , t 1 1 。其中在转基因小鼠肝脏中表达的核s r e b p s ( n s r e b p s ) 已经被显著的证明了各自异构体的功能。当肝脏中过度表达n s r e b p 1 a 时明显的增加 了胆固醇合成以及脂肪酸合成基因的表达，相应的导致了胆固醇和三酰甘油的聚集。 n s r e b p 1 c 过度表达时，选择性的激活脂肪合成基因的表达，但是对胆固醇的合成没 有影响。和n s r e b p ，1 a 过度表达时相比，这种对脂肪合成基因的诱导比较缓和，这反 映了两种s r e b p 1 异构体转录活性的差异。用腺病毒转染技术，在隔离的肝实质细胞 中过度的表达i l s r e b p 1 a 时，不仅诱导脂肪合成基因，而且诱导葡萄糖激酶( 这是在 转录水平上胰岛素调节利用葡萄糖所必需的) 。当过度表达_ n s r e b p - 2 时，主要诱导胆 固醇合成基因，但也观察到对脂肪酸合成基因轻度地诱导。 最近的研究已经证实s r e b p s 广泛地调节一系列基因的转录。重要的是，除了那 些编码合成途径的酶之外，s r e b p s 还增加产生n a d p h 基因的表达。a m e m i y a - k u d o 等利用荧光素酶报告基因( 1 u c i f c r a s e - r e p o r t c rg e n e ) 对h e g 2 细胞分析，显示s r e b p 异构体对胆固醇和或脂质合成基因选择性，至少部分因为它们对靶基因d n a 不同一 致序列( v a r i o u sc o l q b e n s u ss e q m n c e s ) 的亲和力不同所造成的【1 2 1 。 此外，在禁食再饲喂的条件下，s r e b p 1 c 表达受抑制的小鼠中，脂肪合成基因 的表达被强烈的钝化；而s r e b p 1 两种异构体同时抑制的小鼠中，脂肪合成基因的表 达完全停止。有趣的是，s r e b p i c - 和s r e b p 1 1 l 都同时增加了肝脏s r e b p - 2m r n a 的水平，导致了相应编码胆固醇生物合成酶基因的表达，这或许是调节脂肪合成基因 的过程中由于缺少了s r e b p 1 异构体而进行的部分补偿作用。然而删除s 鼬b p 1 c 异 构体不能影响胚胎的发育，而同时删除s r e b p 1 异构体时，只有1 5 5 0 的胚胎能 够存活下来。尽管s r e b p 1 a 和s r e b p 2 在调控靶基因的功能上有重叠，但是删除 s r e b p - 2 基因后，1 0 0 的胚胎致死 1 3 j 4 l ，这暗示了s r e b p 2 在个体早期的发育阶段扮 演了一个关键的角色。 1 2s r e b p s 的结构、功能以及组织表达特异性 s r e b p s 属于含b h l h - z i p 基序转录因子，刚合成的s r e b p s 前体蛋自以一种没有活 性形式结合在内质网膜上【9 】。每种s r e b p 都可分为三个区域：1 ) n h 2 端转录区，包 含结合d n a 和发生二聚化的b h l h - z i p 基序，富含丝氨酸、脯氨酸；2 ) c o o h 端的调 节区：3 ) 连接区，s r e b p s 的n - 端和c 端伸向细胞液，中闯由两个疏水的跨膜螺旋以 及一个伸向内质网腔的的短环( 大约3 0 a a ) 相连。 2 四川农业土学黝7 届硕士学位论文 锚定在内质网上的s r e b p s 前体蛋白经过连续的两次裂解过程，释放出n 端有活 性的核s 冯p 导n s b p s 。h l h - z i p 基序含有核定位信号的奇异特征，它直接结合到 i m p o r t i n 蛋白上，从而可以u 把_ , n s r e b p s 转运到细胞核。一旦改变位置进入核中， n s r e b p s 促进许多有关胆固醇和脂质合成基因的表达【1 5 d 7 】。 s r e b p 1 a 由于拥有更长的n - 端【1 ，l 田，是比s i 通b p - 1 c 更有潜力的转录活化帮f 埘。 但是，s r e b p 1 c 异构体的表达在老鼠和人类体内处于支配地位，特别是在肝脏、白 色脂肪组织( w a t ) 、骨骼肌、肾上腺和脑中含量特别高。相反，s r e b p 1 a 名e c e l ll i n e s 和细胞增殖活跃的组织( 如脾和小肠) 中高水平的表达1 6 l 。 不像其它含h l h - z i p 基序的转录因子，在碱性区( b a s i cd o m a i n ) 有一个保持不变 的精氨酸残基，s r e b p s 上被一个酪氨酸取代。这种氨基酸的取代使s r e b p s 除了像其 它b h l h l z 转录因子一样结合到e - b o x e s ( 5 c a n n t g - 3 ) 1 9 】上之外。还能结合到固 醇调节元件s r e ( 5 - t c a c n c c a c - 3 ) _ l 2 0 2 4 1 。 1 3s 砌狙p s 的活化和加工 新合成的s 础b p s 前体蛋白没有活性，通过两个跨膜小螺旋结合在内质网上， 必须由内质网转运到高尔基体后，才能加工成有活性转录因子n s r e b p s 2 s l 。这个 过程受固醇水平的调节，并且必须有s r e b p s 裂解活化蛋白( s r e b p c l e a v a g e - a c t i v a t i n gp r o t e i n , s c a p ) t 2 6 】* n岛素诱导基因结合蛋白( i n s u l i n - i n d u c e d g o n er e t e n t i o np m t e i n s ，i n s i g ) l 2 7 j 的共同参与。s r e b p s 从内质网转运到高尔基体 是动物细胞内保持脂质平衡的关键环节，这个过程受细胞内固醇水平的反馈调节 【i ，2 5 瑚捌。 s c a p 是内质网上的另一种膜蛋白，对s r e b p s 起稳定作用，并护送s r e b p s 转移到高尔基体 3 t l 。s c a p 的n 端有8 个跨膜螺旋组成，可溶性c 端含有至少5 个w d 重复。s c a pn 端的第2 6 个螺旋( 2 8 0 4 4 8 氨基酸) 组成一个固醇敏感 区，是细胞内固醇水平的感受器，在i n s i g s c a p s r e b p 转运体系调节脂质合成 过程中发挥至关重要的作用。s c a p 的c 端通过和s r e b p s 作用，在内质网上形成 紧密的s c a p s r e b p 复合体 3 2 , 3 3 。另外在几种与胆固醇代谢和转运相关的蛋白质序 列中，也发现了具有和s c a p 相似固醇敏感区，如h m gc o a 还原酶等。s r e b p - 2 和s c a p 结构的完整对其行使功能是至关重要的，当s n p 出现在s r e b p - 2 - 5 9 5 a g 1 3 4 3 和s c a p 7 9 6 i v 1 3 4 1 时，导致具有遗传性的脂质代谢疾病。 3 四川农业太学黝7 届硕士学位论文 然而s c a p s r e b p 复合体在内质网上的保持力，是通过s c a p 结合i n s i g 来 实现的，并且这个过程受固醇的诱导。目前发现在人工培养的细胞中表达两种异构 体：i n s i g - 1 和i n s i g - 2 。人类的两种i n s i g 蛋白5 9 的相似性，它含有6 个跨膜 螺旋，处于一个疏水的环境中，并且具有相同的膜拓扑结构。当s r e b p s 前体蛋白 合成后，首先与s c a p 形成s c a p s r e b p 复合体【，5 l 。当细胞内固醇的含量较高时【3 6 j ， 固醇结合到s c a p 的跨膜固醇敏感区上。这种结合引起s c a p s r e b p 复合体构象改 变，并与内质网上的i n s i g 结合1 3 7 翊，三者形成烈s i g ，s a 蜊s r e b p 复合体保持 在内质网膜上，阻止了s r e b p s 的加工。相反，当细胞内固醇含量低的时候， s c a p s r e b p 复合体不再和i n s i g 蛋白发生作用，s r e b p s 在s c a p 的护送下从内 质网转运至高尔基体【3 9 】。s r e b p s 前体经历连续的两步裂解加工后，释放出有活性 的n 端进入核中( n s r e b p s ) 1 2 0 。催化第一次裂解的是s i p ，它在s r e b p s 两个跨 膜区在腔内环处剪切，产生膜结合中间体( i n t e r m e d i a t ef o r m ) 【2 l , 4 0 1 ，这是第二步裂 解的基础。由于裂解后每一部分都与一个跨膜的螺旋相连，因此裂解产物能停留在 高尔基体膜上。接着s 2 p 在紧靠s r e b p s 伸向细胞液第一个跨膜螺旋处进行第二次 剪切 4 1 1 ，最后释放出具有活性的可溶性n s r e b p s 。包含b h l h - z i p 结构的n s r e b p s 转移到细胞核中【期，以同型二聚体的形式结合到靶基因的s r e 或e b o x f 4 2 序列上， 激活脂质的合成。 其中s i p 是一种膜结合丝氨酸蛋白酶，n 端每3 个一组的a s p - s e t - h i s ( d s 田 残基是s i p 功能所必需的 4 3 j 。s 2 p 是一种异常的疏水性膜结合金属蛋白酶，包含一 个髓) o 田( h ：组氨酸，e ：谷氨酸，x ：任意氨基酸) 活性位点结构，这是其它 疏水性金属蛋白酶所没有的，并且组氨酸残基和谷氨酸残基都是s 2 p 发挥功能所必 需的。同样，在s 2 p 的另一个结构l d g 中，天门冬氨酸残基也是其功能所必需的。 这个残基位于s 2 p 蛋白质区段的疏水部分，被认为是向活化位点的金属原子提供了 额外的配合基 4 4 1 。另外，人们发现s 1 p 和s 2 p 蛋白水解酶不仅对s r e b p s 有专一性， 还可对其它一些跨膜蛋白进行裂解。 4 四川农业文学翻够届硕士学位论文 图1 s r e b p s 的转运和加工 f i 孚1 t r a n s p o r ta n dp r o c e s s i n go f s r e b p s 1 4 螺旋一环一螺旋( m m ) 基序的基本特征 同其它d n a 结合蛋白核转录因子一样，有活性的s r e b p sn h 2 端也包含三个功能 区d n a 结合区，修饰活化区，转录活化区。其中b h l h z i p 基序是s r e b p s 发生二 聚化并结合d n a 的部位，这是s r e b p s 的基本特征。 1 4 1 螺旋一环一螺旋( 玎二h ) 基序的结构和功能 h l h 基序是一类由在动物包括果蝇、线虫和脊椎动物生长发育中起重要作用的转 录因子组成的复杂多基因大家族。 h l h 基序是在在特异d n a 结合蛋白中发挥转录因子的作用，通常由6 0 1 0 0 个氨 基酸残基。两个碱性a 螺旋被非螺旋的环状可变结构隔开，位于d n a 结合域的之后。 h l h 基序可形成同源或异源二聚体。l e d e n t v 等嗍( 2 0 0 2 ) 鉴定了3 9 个不同的线 虫b h l h 基因、5 8 个黑腹果蝇b h l h 基因和1 2 5 个人类b h l h 基因，确定了4 4 个包含这 5 四川农业大学彩叼届硕士学位论文 些基因的直系同源家族。在这些家族中，4 3 个包含了人类、果蝇和( 或) 线虫基因， 说明这些基因已经在人类、果蝇和线虫最后的公共祖先中存在。只有两个家族包含了 酵母和动物基因，而没有一个家族同时包含植物和动物b h l h 基因。l e m e n tv 等嗍 ( 2 0 0 2 ) 认为，b h l h 基因的多样化与多细胞生物得起源有直接的关系，并且这种b h l h 基因的多样化不受动物或植物的限制。 h l h 基序具有d n a 结合蛋白的两个特征，即存在结合d n a 的螺旋区和形成蛋白 质二聚体的能力。螺旋一环一螺旋蛋白质同时具有这两个特征，且具有共同类型的序 列基序：一段4 0 5 0 氨基酸的序列中含有两个两亲性的a 螺旋，两螺旋被一个不同长 度的连接区( 环) 分开。这组蛋白通过两个螺旋相应表面的疏水残基的相互作用，可形 成同源二聚体和异源二聚体。螺旋区长1 5 1 6 个氨基酸，每个螺旋区都含有几个保守 残基。这些两亲性螺旋形成二聚体的能力是所有h l h 蛋白质都具有的。环的作用可 能仅仅使两个螺旋区自由独立的作用。 大多数h l h 基序附近有一个强碱性的、对d n a 结合非常重要的区域。大约是一 段1 5 个氨基酸的序列中约有6 个保守残基。含有这类区域的蛋白质称为b h l h 蛋白。两 个亚基都含有碱性区的二聚体能与d n a 结合，但现在还不清楚h l h 蛋白质是如何激 活转录的。 1 4 2 二聚体形成的作用力 h l h 基序属于两亲分子，组成舡螺旋的氨基酸残基一侧疏水，一侧亲水，其中疏 水性氨基酸位于蛋白质内部，h l h 基序就是利用氨基酸的疏水作用，在咖螺旋的一侧 形成了疏水的部分，保持蛋白质高级结构的稳定。 蛋白与蛋白之间相互作用形成二聚体，常见的特征性结构有：亮氨酸拉链( 1 e i l c i z i p p e r ) 和螺旋一环一螺旋( h l h ) 基序。二聚化基序形成过程中，可以是同源二聚 体，也可以是异源二聚体，而对于s r e b p s 目前只报道了同源二聚体的形式，而没有 异源二聚体的报道。 蛋白质之间的相互作用是建立转录复合体过程中的一个共同主题，在几种转录因 子( 和其它蛋白质) 中发现的基序参与了同源和异源化的相互作用。亮氨酸拉链由一段 富含亮氨酸残基的氨基酸组成，这些残基形成了一种二聚体化基序邮l 。二聚化基序形 成过程中，蛋白质作用的共同原则为：识别特异的d n a 序列。两亲性舡螺旋的结构是 一面是疏水基团( 包括亮氨酸) ，另一面是带电基团m 。一个亮氨酸拉链形成一个两 6 四川农业史学2 0 0 7 届硕士学位论文 亲性螺旋，其中一个蛋白质拉链的亮氨酸可从螺旋中伸出，并与另一个平行蛋白质拉 链的亮氨酸交错排列形成一个盘绕的卷曲4 9 。两个右手螺旋彼此盘绕，每圈3 6 个残 基，大约每7 个残基该基序重复一次【4 9 】。 1 5 玎二h 转录因子的功能和分类 螺旋一环一螺旋( h e l i x 1 0 0 p - h e l i x ，h l m 转录因子是调节细胞生长和分化的重要 因子。h l h 转录因子包括四百多种分子，广泛存在于从低等生物酵母到高等生物人类 的细胞中【熨”2 】，在细胞的增殖、分化方面起着主要的作用。 h l h 转录因子可通过两个螺旋区互相作用形成二聚体，调控基因表达【5 3 j 。大多 数h l h 转录因子属于碱性h l h c o h l h ) 家族成员，包括高度保守的h l h 结构域和碱性 d n a 结合区( b ) ，它直接与d n a 发生作用，识别并结合特定的d n a 序列，作为转录 激活因子调节转录嗍。b h l h 基序首先f l ：l m u r r e 5 5 1 和他的同事在鼠类转录因子e 1 2 4 7 中发现的。 从h l h 转录因子根据结构可分为三类：1 ) b h l h 蛋白；2 ) b h l h - z i p 蛋白；3 ) d n h l h 蛋白。b h l h 转录因子的n 端有一段碱性区，而d n h l h 蛋白不存在碱性区，因此不能 与d n a 直接结合，但可以与其它种类的h l h 蛋白结合形成二聚体，i d 蛋白就属于 d n h l h 蛋白，可与b h l h 转录因子结合形成无功能二聚体，以抑制b h l h 转录因子的 活性鲫。 随着h l h 转录因子不断的发现，这种根据结构划分的分组已经不能满足研究 的需要。另一种分类方法是利用系统进化方法建立的分类法把b h l h 蛋白分为a 、 b 、c 、d 四个同源组，婀： a 类蛋白结合c a g c t g 或者c a c c t g ，其特点是5 - 8 1 3 位符合x r x 的模式， l y l ，t w i s t , h e n , a t o n a l ，d e l i l a h , d h a n d , a c - s ，m y o d 和e 1 2 等基因属于这一组。b 类 蛋白结合c a c g t g 或者c a t g t t g ，其特点是5 8 1 3 位符合b x r 的模式【5 7 , 5 s 。c 组蛋白起源于b 组蛋白，含有p ：a s 结构域，能结合a c g t g 或者g c g t g 。d 组蛋 白包括i d , e m e , h e i r a 和h h l 4 6 2 等基因，最明显的特征是缺少d n a 结合区，当它 与其它b h l h 蛋白结合时能阻止它们发挥作用。最近发现，i d 蛋白调节肿瘤细胞增 生、分化和侵袭等，并与肿瘤进展和不良预后有关 5 9 1 。 这种分类方法主要考虑对e - b o x 的结合能力，其它基序的保守性，以及是否出 现附加结构域。由于对新的基因组的研究，发现了另外两类b h l h 家族( e ，f ) 【4 5 】。 7 四川农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 e 类结合序列c a c g c g 或者c a c g a g ，位于基因启动子的n 盒【删。f 类含有c o e 结构域，该结构域有二聚化和结合d n a 的功能。 这种分类方法是目前最常用的方法，特别是在对基因组进行分类时。 1 6s r e b p 2 相关结构域的进化 生物进化是生命科学最基本的问题，是生命科学中的最高理论【6 ”。不同生物的各 种蛋白质成分在进化上表现并不一样，有的高度保守，有的出现很大的异化现象。在 进化过程中，蛋白质序列可能发生变化，但它的折叠模式更为保守，即使是7 0 的序 列发生变化，它的折叠模式也不会有很大的改变 6 2 1 。蛋白质分子的结构比较与蛋白质 一级序列比较法相比，具有更高的优越性【6 3 】。 生物进化过程的本质是分子进化，蛋白质的进化在这一过程中起了中心作用。 理论计算表明由个别氨基酸的随意选择决定蛋白质的演变过程是不可能的。类似的 结构域( 基序) 出现在不同的蛋白质分子中使人们有理由相信它们来源于共同的祖 先基因，通过编码结构单位的基因片段的融合的蛋白质分子进化，是阐明蛋白质多 样性产生的一种可能而有吸引力的假设 6 4 1 。并且在研究物种进化和基因组内基因进 化时，以氨基酸的序列为基础有独特的优势，因为大量的d n a 信息位点并不能保 证一定能产生正确的树，产生错误拓扑结构的原因看起来是因为第三个密码子上核 苷酸的变化已经达到饱和，它们构建的系统数产生了“噪音”，在这种情况下，蛋 白质的序列比d n a 更好嘲。 结构相似性比较研究表明，结构域可能作为一种遗传单位在蛋白质分子进化过程 中起着中心作用。相似的结构域可能出现在同一分子中，亦可能出现于不同的分子中， 表明这种进化过程可能是通过基因复制，融合或缺失完成。需要阐明的是这种进化过 程的机制：真核生物基因的内含子纱 显子结构为实现这一过程提供一种合理的模式， 而深入研究外显子与结构域的内在联系，将有助于进一步阐明蛋白质的进化机制嗍。 1 7 实验的目的和意义 近年来，分子生物学研究领域的重点已经逐渐从功能基因转到启动子的顺式作用 元件和转录因子及其调控机理上，对转录因子的结构与功能的分析鉴定，是阐明在各 种条件下基因表达调控机理的重要内容之一，揭示转录因子之间及其与d n a 2 间相 互作用的机制，将是研究特定基因表达的有效途经。s r e b p 2 属于b h l h 洳转录因子 家族成员s r e b p s 的一个变构体，是调节体内胆固醇代谢的关键基因，由于b h l h 转录 8 四川农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 因子在生物体内存在的广泛性和保守性，已有一些人利用其功能和相似性进行分类。 目前对基因组内h l h 蛋白分类的研究主要集中在人类、小鼠、果蝇等物种，而对于鸟 类的研究还很少。因此，本研究的目的以得到鹅s r e b p - 2 基因的序列，研究其结构特 征和功能，提供s r e b p - 2 的表达调控机理获得更多更精确的结构信息，这对于研究体 内的脂质代谢这将是一个有益的探索；同时以鹅b h l h - z i p 基序序列为基础，充分利用 蛋白质数据库的资源，对存在于鸡基因组的h l h 蛋白进行分析和归类，探讨禽类基因 组内h l h 蛋白的分类及进化关系，对基因组内结构域进化提供理论支持。 9 四川农业大学黝7 届硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 实验材料 来源本实验材料朗德鹅( l a n d e sg o o s e ，a 出唧a u s e r ) 来自四川广安朗德鹅有限公 司，天府肉鹅母本品系锄如m e a t g o o s e ，a n s e r c y g n o i d e s ) 鹅来源于四川农业大学家 禽育种实验场。 饲养至1 6 周龄的朗德鹅和天府肉鹅颈动脉放血致死后立即剖腹，取肝右叶尖部5 9 左右，用d e p c 处理水洗去表面血液，剪刀迅速剪成5 0 1 0 0 m g 大小的组织块，放入 2 m l 冻存管，作好标记后立即投入液氮速冻。速冻后的样品于一7 0 冰箱保存，以备 组织总r n a 的抽提。 2 2 仪器和试剂 2 2 1 主要仪器 1 1 p c r 扩增仪：p t c 1 0 0 瑚p r o g r a m a b l et h e m m lc o n t r o l l e r ，m jr e s e a r c h ，k 2 ) 自动灭菌锅；a u t o c l a v es s 一3 2 5 ，t o m y ，i n c 3 ) 凝胶成像系统：b t s 2 0 m ，u v i t e e ，i n e 4 ) 水平电泳槽：d y y - i i i 型水平电泳槽，北京六一仪器厂 5 ) 低温冰箱：- - 2 0 ，s a n y o ，i n c 6 ) 低速离心机：m i n i s p i n ，e p p c n d o r f , i n c 乃超低温冰箱：- - 8 0 ，h a r r i s ，i n e 8 ) 高速冷冻离心机：c e n t r i f u g e 5 4 1 5 ，5 8 0 4 r ，m i l l i s p 试均为e p p e n d o r f , i n c ) 9 ) 循环水控制系统：m o d e le 4 8 6 0r e f i i g c r a t e a tr e c i r c u l a t o r ，b i o r a d ，i n c i o ) 普通家用微波炉：光波型，青岛海尔公司 1 1 ) 自动双重蒸馏水器：上海玻璃仪器一厂 1 2 ) 电子天平：o o o o l g ，b p 2 11 d ；0 0 1 9 ，b l 6 1 0 ，s a r t o r i a s ，i n c 1 3 ) 漩涡混合仪：g - 5 6 0 ev o r t e x - 2 ，s c i e n t i f i ci n d u s t r i e s ，i n c 1 4 ) 培养箱，振荡培养箱，烘箱，水浴锅等。 2 2 2 主要试剂 1 ) d e p c 处理水：用将高温烘烤的玻璃瓶( 1 8 0 2 小时) 装1 0 0 0 m l 去离子水， 然后加入1n l l 的d e p c ( 体积体积) ，剧烈震荡混匀，3 t c 处理过夜，高压灭菌后， 取部分分装成小份( 1 r n l 管) ，一2 0 保存，其余用于配制试剂； 1 0 四川农业大学g o y 届硕士学位论文 2 ) 乙醇：( 用d e p c 处理水配制7 5 乙醇) 7 5 0 m l 无水乙醇中加入2 5 0 m ld e p c 处理水，然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱； 3 ) 5 x t b e 电泳缓冲液：5 4 9t r i s 碱，2 7 5 硼酸，2 0 m lo 5 m o l le d t a ( p h 8 0 ) ， 定容到1 l ，常温保存； 4 ) t r i s - ( 2 1 贮存液( 1 m o l l ，p n8 o ) ：1 2 1 1 4 9t r i s 碱溶于8 0 0 m l 去离子水中， 用h c i 调节p h 值至8 0 ( 约需浓h c i4 2 m 1 ) ，定容到1 l ，高温高压灭菌，4 保存； 5 ) e d t a 贮存液( o 5m o l l ，p h8 o ) ：1 8 6 1 9e d t a - n a 2 2 h 2 0 加入$ 0 0 m l 去 离子水，剧烈搅拌，用n a o h 调节p h 至8 0 ( 约需2 0 9 n a o h 颗粒) ，定容到1 l ， 高温高压灭菌，4 保存； 6 ) 氯仿、异戊醇，无水乙醇、异丙醇、无水乙酸钠、盐酸、硝酸银、四硼酸钠、 氢氧化钠、甲醛溶液、氯化镁、氯化钙等药品均领自四川农业大学设备科，全部为国 产分析纯，液氮购自四川省雅安市氧气厂 。 2 2 3 注意事项 1 ) 实验过程中要求创造一个无r n a 酶污染的环境。主要包括两个方面的工作， 其一，极力避免来源于操作者的手及实验的器皿和试剂等外源性r n a 酶的污染；其 二，尽力抑制组织细胞中内源性r n a 酶的活力，并尽可能地去除。 2 ) 由于r n a 酶到处存在，不易失活，极易造成污染而导致r n a 的降解，造成 实验失败。因此建议所有用品均应严格按要求消毒，注明r n a 专用。严格按无菌操 作要求操作。通常用于r n a 抽提与保存的塑料制品用d e p c 水室温下浸泡过夜，再 高压消毒。注意，d e p c 处理的水和容器，必须高温灭活d e p c ，以免其日后抑制其 它酶的活性，导致实验失败。玻璃制品泡酸反复冲洗后，2 5 0 干烤3 h 以上。 3 ) 提取r n a 过程中吸取上清时，切不可将上清交界处的蛋白及下面吸起，造成 r n a 污染。因此，通常轻轻吸取上清，且留有部分上清，以免搅起紧邻着的裂解液。 4 ) 该实验使用的样品为r n a ，因此在反转录过程中，要特别注意防止r n a 酶 的污染。为此在反转录过程中除使用r n a 酶抑制剂外，所使用的枪头、试管，水等 均用d e p c 处理。 5 ) 在做2 个样品以上的实验时，不管是反转录反应还是p c r 反应都应先配置试 剂的共同混合物( 共同混合物包括r s a s e f l e ed h 2 0 ，b u f f e r ，d n t p ，t a q 酶，m g c h 等) ，然后分装到每个反应管中，以保证各试管不同试剂的用量一致，减少实验误差， 四川农业大学9 0 0 7 届硕士学位论文 同时还能减少试剂的损失。 取反转录酶等酶类时，要