（作物遗传育种专业论文）紫玉米植株茎叶色素的分离、纯化与理化性质研究.pdf

山东农业大学硕士学位论文 摘要 “健康”成为人们日益关注的话题。对天然植物生理活性成分进行研 究，开发为入类健康造福的天然植物功能产品，具有深远的现实意义和广 阔的应用前景。天然食用色素因为安全、无毒且具有一定的营养和药理作 用，同益受到食品、化妆品、医药等行业及消费者青睐，具有很大的应用 潜力，所以对植物花色苷色素的开发与利用越来越受到人们的关注。 国外已将植物花色苷色素应用到食品、化妆品、药品等多个领域，我 国也有着十分广阔的应用市场，但是，目前我国生产和使用的色素品种单 一，生产成本高，色素性质不稳定。因而开发具有商业价值的色素资源以 及稳定性好的天然食用色素迫在眉睫。紫玉米植株色素含量高，生产成本 低，色素稳定性好，是一种理想的色素提取材料。对紫玉米植株色素丌展 系统的研究，有助于该植物资源得到迅速、合理、有效、全面的开发与利 用；有助于这一优良品种的进一步推广种植；有助于改善当地农业生产结 构，增加农民收入。 本研究以一种紫玉米杂交种“齐3 1 9 l x 5 3 0 植株为材料，对该玉米植 株色素的提取工艺、初步纯化、理化性质等进行了较为系统的研究分析， 为紫玉米的进一步开发和利用提供理论依据及参考。 主要研究结论如下： 1 、该紫玉米植株色素在可见光范围内的最大吸收波长为5 1 9 9 n m ， 据此判断该色素是一种花色苷类色素。 2 、通过四因素三水平1 9 ( 3 4 ) 正交试验，确定各因素对色素提取率的 影响程度依次为：料液比 浸提温度 浸提时间 p h 值：确定该玉米色 素的最佳提取工艺条件为：料液比1 ：4 0 、浸提温度8 0 c 、浸提时间1h 、 浸提溶液p h 4 0 。 3 、浸提级数( x ) 与浸提量( y ) 成y = 4 5 5 2 6 e 1 3 5 5 6 。函数关系，确定浸 提级数为2 级。 4 、该色素的主要理化性质如下：色素溶液p hl 7 时颜色基本没有 变化，p h 8 时色素吸收峰和颜色发生变化；f e ”、c u 2 + 可使其生成黑色 絮状沉淀；在葡萄糖溶液、蔗糖溶液、光照条件下均稳定存在；对高温、 紫玉米植株茎叶色素的分离、纯化与理化性质研究 抗坏血酸、氧化剂( h 2 0 2 ) 、还原剂( n a 2 s 0 3 ) 均较敏感。 5 、采用硅胶柱层析纯化色素粗产品，选用乙醇：水= 7 ：3 ( 甲酸调节 p h 4 o ) 作为洗脱剂，纯化效果理想。 6 、通过紫外光谱分析，推测该紫玉米植株色素是矢车菊色素或飞燕 草色素中的一种或者是二者混合物。该色素基本结构是： 7 、该玉米整个植株的色素得率为1 0 2 ，色素含量高，有一定的市 场前景。 关键词：紫玉米；色素；提取；理化性质；纯化；硅胶柱层析 2 山东农业大学硕士学位论文 s t u d i e so nt h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nt e c h n o l o l z y o fp i g m e n tl - r o mt h e p u r p l em a i z ea n di t s p h y s i c o c h e m i c a ic h a r a c t e r i s t i c s a b s t r a c t ”h e a l t h ”i sb e c o m i n gt h em o s tp o p u l a rc o n c e r n s ot h e r ei sf a r - r e a c h i n gr e a l i s t i c s i g n i f i c a n c ea n de x p a n s i v ef o r e g r o u n di nd e v e l o p i n gf u n c t i o n a lp r o d u c t sf r o mb o t a n i c a l r e s o u r c e sf o rh u m a nb e i n g sh e a l t ht h r o u g ht h es t u d y i n go np h y s i o l o g i c a l l ya c t i v e i n g r e d i e n ti nn a t u r a lp l a n t s b e c a u s eo fi t ss a f e t y , n o n t o x i c i t y 笛w e l l 觞n u t r i t i o n a la n d t h ep h a r m a c o l o g i c a lf u n c t i o n s ，a n t h o c y a n i ni sd r a w i n gm o r ea n dm o r ea t t e n t i o nf r o m f o o di n d u s t r y , m e d i c a li n d u s t r ya n dc o n s u m e r s ，t h u si th a sh u g ep o t e n t i a li na p p l i c a t i o n i nt h i sc a s e ，t h ed e v e l o p m e n ta n du t i l i z a t i o no fn a t u r a lp i g m e n t s ，e s p e c i a l l ya n t h o c y a n i n p i g m e n t sf r o mp l a n t si sb e c o m i n go n e o ft h er e s e a r c hh o t s p o ta tp r e s e n t a n t h o c y a n i n h a sb e e nu s e di nf o o di n d u s t r y , c o s m e t i ci n d u s t r ya n dm e d i c a li n d u s t r y a b r o a d i ta l s oh a sc a p a c i o u sm a r k e t si no u rc o u n t r y b u tt h e r ea r es o m ed i s a d v a n t a g e si n t h ep r o d u c t i o na n du s eo fi t ，s u c ha ss i m p l e xv a r i e t y , h i g hc o s t ，a n di n s t a b i l i t y s oi ti s l l i g ht i m et oe m p o l d e rn e w r e s o u r c ew h i c hh a sb u s i n e s sv a l u ea n ds t a b i l i t y p u r p l em a i z e ， b e c a u s eo fi t sm o r ec o n t e n t ，l e s sc o s ta n ds t a b i l i t y , i sb e c o m i n gag o o dc h o i c e 1 1 1 e s y s t e m i cs t u d yo np u r p l em a i z ep i g m e n tw i l lb eh e l p f u ln o to n l yt od e v e l o pa n du t i l i z e t h i sr e s o u r c em o r et i m e l y , r e a s o n a b l y , e f f e c t i v e l ya n dt h o r o u g h l y , b u ta l s ot oe n l a r g et h e c u l t i v a t i o na n di m p r o v et h er e g i o n a la g r i c u l t u r es t r u c t u r ew h i c hr e s u l t si nt h ei n c r e a s eo f f a r m e r s i n c o m e c h o o s i n gap u r p l em a i z ep l a n t ( q i 31 9 l x 5 3 0 ) f o rr a wm a t e r i a l ，w ec o n d u c t e das t u d y t od e t e r m i n et h eb e s te x t r a c t i o nc o n d i t i o n ，s u p e r f i c i a lp u r i f i c a t i o na n dt h ep h y s i c a la n d c h e m i c a lp r o p e r t i e s ，w h i c hp r o v i d e dar e f e r e n c ef o rt h ed e v e l o p m e n ti nm a n yw a y so f p u r p l em a i z e d e t a i l sa b o u tt h i ss t u d yw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h em a x i m u ma b s o r p t i o ns p e c t r u mo ft h ep i g m e n tw a s51 9 9n ma tt h er a n g eo f v i s i b l e l i g h t ，s oi tw a s ak i n do fa n t h o c y a n i n s 。 2 b ym e a n so f1 - 9 ( 3 4 ) o r t h o g o n a lt e s t ，w ed e t e r m i n e dt h eo r d e r s ：e x t r a c t i v e p r o p o r t i o n e x t r a c t i v et e m p e r a t u r e e x t r a c t i v et i m e e x t r a c t i v ep h t h eb e s tc o n d i t i o n o ft h ee x t r a c t i o nw a sa sf o l l o w s ：p r o p o r t i o no fp l a n ta n de x t r a c t i v es o l u t i o nw a s1 ：4 0 e x t r a c t i v et e m p e r a t u r ew a s4 0 ，e x t r a c t i v et i m ew a sl h s u i t a b l ep hw a s4 0 3 t h ee q u a t i o no ft h ee x t r a c t i v es e r i e sw a s ：y - - 4 5 5 2 6 e 。1 3 5 5 6 。t h ee x t r a c t i v es e r i e s ： 2 4 t h em a i np h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t yo ft h ep i g m e n tw a s ：1 n l ep i g m e n t s o l u t i o nw a ss t e a d yr e di na c i d i cm e d i u m ；h o w e v e r , t h ec o l o ra n dt h e l l a xo ft h e p i g m e n tc h a n g e di na l k a l i n em e d i u m f e 3 + a n dc u 2 + l e tt h er e ds o l u t i o n f a d ea n dt h e 3 紫玉米植株茎叶色素的分离、纯化与理化性质研究 p i g m e n ts h o w e dh i g hs t a b i l i t yi ng l u c o s e ，s u c r o s ea n ds u n l i g h t i tw a ss e n s i t i v et oh i g h t e m p e r a t u r e ，v i t a m i nc ，o x i d a ( h 2 0 2 ) a n dr e d u c t a n c e ( n a 2 s 0 3 ) 5 t h es i l i c ag e lc h r o m a t o g r a p h yw a su s e dt op u r i f yt h ep i g m e n t i tw a sf e a s i b l et o u s et h es o l u t i o n ( a d j u s t e dt op h 4b yf o r m i ca c i d ) w h i c hw a sm a d eu po fa l c o h o la n d w a t e rw h o s ev o l u m er a t i ow a s7 ：3a st h ew a s h ei m p r e g n a n t 6 i tw a sp o s s i b l et oc o n j e c t u r et h r o u g hu va n a l y s i st h a tt h ep i g m e n to ft h ep u r p l e m a i z ew a sc y a n i d i no rd e l p h i n i d i n ，o rt h em i x t u r eo ft h e m t h eb a s i cs t r u c t u r eo ft h e p i g m e n tw a s ： 7 t h ea v e r a g eg a i nr a t eo ft h ew h o l ep l a n tp i g m e n t sw a s10 2 t h e r ew i l lb ea l l e x p a n s i v ef o r e g r o u n db e c a u s eo f t h i sh i g hc o n t e n t k e yw o r d s ：p u r p l em a i z e ；p i g m e n t ；e x t r a c t i o n ；p h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t y ； p u r i f i c a t i o n ；s i l i c ag e lc h r o m a t o g r a p h y 4 c d n a s s r 符号说明 c o m p l e m e n t a r yd n a s i m p l es e q u e n c er e p e a t s c 0 2 c a r b o nd i o x i d e h s c c c h p l c b s a u f g t w h o f a o t b h p c g o t g s t h i g hs p e e dc o u n t e rc u r r e n t c h r o m a t o g r a p h y h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y b u l k e ds e g r e g a t ea n a l y s i s u d p g l u c o s e ：f a l c o n o i d 3 0 - g l u c o s y l t r a n s f e r a s e w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n 互补d n a 简单序列重复 二氧化碳 高速逆流色谱 高效液相色谱 分离群体分组分析法 黄酮30 葡萄糖苷转移 酶 世界卫生组织 f o o da n da g r c u l t u r eo r g a n i z a t i o n 联合国粮食及农业组织 t e r t - b u t y l h y d r o p e r o x i d e g l u t a m i co x a l a c e l a t et r a n s m i n a s e g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e s 三丁基过氧化氢 谷氨酸草酰乙酸转氨酶 谷胱甘肽s 转移酶 aa b s o r b e n c e 吸光度 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学 研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出 重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责 任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的 规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文 纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编 本学术论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文 收录到中国学位论文全文数据库，并向社会公众提供信息 服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 食用色素是使食品着色或改善食品色调和色泽的食品添加剂。食品的 颜色是食品感官质量的重要指标，也是吸引消费者注意的重要因素，所以 尽管食品中色素含量甚微，但对食品质量和品质的影响却非常大。食用色 素不仅应用于食品工业，以全面改善食品的外观和色泽，还被广泛应用于 保健和化妆品等行业( 杨志娟，2 0 0 3 ) 。 1 1 食用色素发展概述 食用色素目前主要有食用合成色素和食用天然色素( 乐一鸣等， 2 0 0 5 ) 。天然色素很早就作为食用添加剂被利用，我国天然色素原料的种 植和制备及使用更是具有非常悠久的历史，据史记货殖传记载，公 元2 2 1 年前的东周时期就有“茜栀千亩，亦比千乘之家”之说，足见当时 种植天然色素原料茜草和栀子的规模之大。公元六世纪，我国农学家贾思 勰所著的齐民要术中就记载了从植物中提取色素的方法( 蔡建秀， 2 0 0 0 ) 。在1 9 世纪以前，人类一直都使用天然食用色素来为食品调色。 i8 5 6 年英国教授p e r k i n s 发明了世界上第一种合成有机色素“苯胺紫” ( m a u v e ) ( 李传欣等，2 0 0 1 ) ，之后，各种人工合成色素陆续问世并被投 入生产，由于人工合成色素具有色泽鲜艳、着色力强、易于溶解、稳定性 好、品质均匀、无嗅、无味，价格便宜等优点，很快就占领了食用色素市 场，几乎完全取代了天然食用色素。2 0 世纪6 0 年代以后，随着毒理学和生 物学的不断发展，人类对人工合成色素进入身体后的代谢机理有了进一步 的认识。m a r m i o nd m ( 1 9 8 4 ) 和c o l l i e rs w ( 1 9 9 3 ) 研究表明，绝大多数合 成色素的主要成分是偶氮化合物，系萘胺、硝酸、磺基、萘、萘酚、对氨 基苯磺酸等化合而成，会在人体内经代谢生成1 3 一萘酚、q 一氨基一卜萘酚 等具有强烈致癌性的物质。此外，合成色素产品中还可能混入色素中间体、 有毒副产物，如苯酚、苯胺等，对健康影响也极大。在认识到多数合成色 素对人体有极为严重的慢性毒性和致畸、致癌性之后，大部分合成色素的 使用受到了各国政府的限制，致使批准使用的合成色素种类从1 0 0 多个品 种大幅下降，美国仅剩7 种，日本1 2 种，英国2 2 种，丹麦、挪威等国则全 面禁止使用合成色素( 杨合超，2 0 0 7 ) 。我国于1 9 6 0 年和1 9 8 9 年对合成色素 进行了两次审定，现在我国批准使用的合成色素只有胭脂红、苋菜红、柠 5 紫玉米植株茎叶色素的分离、纯化与理化性质研究 檬黄、同落黄、靛蓝、亮兰等1 0 余种。 天然植物色素有以下显著特点( a l w a s o nd o w n h a m ，2 0 0 0 ：温广宇等， 2 0 0 3 ) ：( 1 ) 绝大多数天然植物色素无毒副作用、安全性高。( 2 ) 天然植物色 素大多为花色素类、黄酮类、类胡萝卜素类化合物，因此，食用天然色素 不但无毒、无害，而且很多天然色素还含有人体必须的营养物质或本身就 是维生素或具有维生素性质的物质。例如1 3 一胡萝卜素是维生素a 的前体， 可预防维生素a 缺乏症，提高机体的免疫功能。( 3 ) 天然植物色素具有增 强人体功能、保健防病等功效。例如花色苷能强烈吸收紫外光，在体内起 着紫外屏障作用，使细胞分化和其它生命过程j 下常进行，同时能预防冠心 病和心肌缺损，治疗循环紊乱和心绞痛，抑制癌细胞的生长：芸香苷天然 食用黄色素具有使人维持毛细管正常抵抗能力和防止动脉硬化等功能，在 医学上一直作为治疗一t l , r m 管系统疾病的辅助药物和营养增补剂；番茄红素 具有很强的清除自由基能力，能有效预防前列腺癌、消化道癌的发生，还 具有激活免疫细胞、防止一t l , 脑血管疾病发生的作用。( 4 ) 天然色素的着色 色调比较自然，更接近于天然物质的颜色。 现在天然色素在各国市场上的份额迅速扩大。随着人们对食品健康、 安全的关注，天然色素以其安全、绿色而备受青睐，充分利用价廉的天然 资源丌发天然食用色素已是大势所趋( 云智勉等，2 0 0 6 ) 。近几年来我国 在食用天然色素的研究方面做了大量的工作，并取得了可喜的成绩。我国 批准使用的食用天然色素现在已有4 7 种，具体品种有红曲红、甜菜红、辣 椒红、玉米黄、可可色素、高粱红、菊花黄、天然苋菜红等。我国已经成 为食用天然色素的生产大国，并形成了一个初具规模的产业化行业，2 0 0 4 年我国食用天然色素总产销量约为2 1 0 1 3 万吨，产量较大的品种有姜黄色 素、橘子黄素、辣椒红色素、红花黄色素、叶绿素铜钠、玫瑰茄色素、高 粱红色素等( 史小峰等，2 0 0 5 ) ，约有1 7 个食用天然色素品种出1 2 1 ，出口 金额达2 8 亿元。2 0 0 8 年我国的食用天然色素总产销量已增至3 2 4 万吨，销 售金额高达2 3 9 亿元，增长势头迅猛。 花色苷属类黄酮化合物，是一类重要的天然色素，广泛存在于植物的 花、叶、果皮中，为水溶性天然色素。 1 2 花色苷的结构和存在形式 6 山东农业大学硕士学位论文 m a r g u a r t 于1 8 3 5 年提出花色苷( a n t h o c y a n i n ) 的名称，m o l l s h 于1 9 0 5 年 纯化、结晶到了花色苷的结构晶体，1 9 5 8 年h a r b o n e j b 就撰文讨论了紫外 一可见光谱法在花色苷物质结构鉴定中的应用。花色苷的碳骨架结构为 c 6 c 3 c 6 ，因为与其他的黄酮类化合物有相同的生化合成来源而被认为是 黄酮类化合物，属于黄酮多酚类化合物，是由花色素在自然状态下与各种 糖形成的糖苷，因为苷元的不同，花色苷颜色有红色、紫色和蓝色等的区 分，天然花色苷糖苷配基的基本结构为3 ，5 ，7 一三羟基- 2 - 苯基苯并吡喃， 结构式如图l ： h 图1 花色苷糖苷配基的分子结构 f i g u r e1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fi n d i c a n to fa n t h o e y a n i n 花色苷以多羟基及( 或) 甲氧基衍生物的糖苷形式存在。不同花色苷 的区别在于以下几个方面( 王璋，1 9 9 9 ) ：( 1 ) 所存在的羟基及( 或) 甲氧 基的数量；( 2 ) 与分子相连接的糖基的类型、数量及位置：( 3 ) 连接在 分子中糖基上的脂肪酸或芳香族羧酸的类型及数量。最常见的糖基为葡萄 糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖和由同质或异质单糖形成的二糖及三糖。参 与糖基酰化最为常见的酸为咖啡酸、对羟基苯烯酸、芥子酸，对羟基苯甲 酸、阿魏酸、丙二酸、苹果酸、琥珀酸和乙酸。 当花色苷上的糖基部分被水解后，糖苷配基( 水解产物的非糖部分) 被称为花色素。花色苷和花色素的颜色是由于分子受到可见光激发而形成 的。分子受激发的难易程度取决于结构中的电子相对流动性。花色苷和花 色素中富含的双键极易受到激发，因而它们对成色致关重要。 目前，已知有2 0 多种花色素( 庞志申，2 0 0 0 ) ，天然存在的花色苷主 要有6 种，因37 位( r 1 ) 和57 位( r 2 ) 上取代基的不同，形成六种不同 7 紫玉米植株茎叶色素的分离、纯化与理化性质研究 的化学结构并呈现不同的花色素，分别是天竺葵色素( p e l a r g o n i d i n ) 、矢 车菊色素( c y a n i d i n ) 、飞燕草色素( d e l p h i n i d i n ) 、芍药色素( p e o n i d i n ) 、 牵牛花色素( p e t u n i d i n ) 和锦葵色素( m a l v i d i n ) ，其r 1 、r 2 等取代基见表l 。 表1 植物中主要的花色苷 t a b l e1t h em a i na n t h o e y a n d i n si np l a n t s 1 3 花色苷色素的提取与纯化 1 3 1 花色苷色素的提取 花色苷来源广泛，是重要的植物色素，近年来国内主要是将其作为食 用天然色素的形式进行开发利用。目前，花色苷色素的提取方法主要有溶 剂浸提法、超临界流体萃取法、微波提取法、酶法提取法和超声波提取法。 1 3 1 1 溶剂提取法 根据色素的性质和所用原料选择不同提取溶剂，常用的有水、酸碱 溶液、有机溶液( 如乙醇、丙酮、烷烯烃、苯、油脂类) 等。此法工艺简 单，设备投资少，提取操作方便，成本低，便于生产。 s e i c h h o m 等( 2 0 0 5 ) 利用盐酸水溶液( h 2 0 ：h c i = 1 9 ：1 ) 从富含色 素的马铃薯中提取花色苷，原料经蔬菜分切机切碎、漂烫处理，室温过夜 浸提，获得较好的提取效果。c a t of r q y t l o g 等( 1 9 9 8 ) 提取黑醋栗中的花 色苷色素时，利用酸化乙醇( 含0 1 三氟醋酸，t f a ) ，料液比l ：3 ，于4 浸提6 h ，重复三次可完全提取。n i c o l a sn i e m e n a k 等( 2 0 0 6 ) 提取可可 子叶中的花色苷，将冻干子叶粉碎过2 0 0 目，经乙烷去脂后，采用6 0 丙 酮作为提取剂，冰浴搅动浸提，重复三次，提取效果良好。c g a r c i a ( 1 9 9 8 ) 用丙酮提取花色素，与酸性甲醇相比，丙酮提取由于消除了果胶的影响， 效果更好。 山东农业大学硕士学位论文 国内科技工作者对植物花色苷色素的提取研究也取得了进展。余燕 影等( 2 0 0 4 ) 研究了川山紫薯色素的提取工艺条件，研究表明酸浓度2 o 的乙醇可获得最佳提取效果。王战勇等( 2 0 0 4 ) 用8 0 7 , 醇溶液和0 5 柠 檬酸溶液( 5 ：1 ) 的混合液作提取液，同时调整溶液的p h 值为2 - - 4 ，过滤、 减压浓缩、干燥，得到有较高提取率的葡萄皮色素。曾柏全等( 2 0 0 8 ) 用 9 5 的乙醇提取冰糖橙皮色素，提取条件为料液比l ：8 ( g m 1 ) 、6 0 c 恒温、 9 5 乙醇( p h 5 0 ) 浸提6 h ，色素提取率达3 5 7 6 。冯作山等( 2 0 0 4 ) 研究 表明枸杞色素的最佳提取溶剂是乙酸乙酯，提取工艺为5 5 c 下提取l h ，提 取3 次可得最大提取率6 9 。任顺成等( 2 0 0 9 ) 研究表明，提取枸杞色素 的最佳工艺条件为：在5 0 下，用无水乙醇，以l g ：1 2m l 的料液比，浸提 1 h 。 在用溶剂提取法提取色素时，国内外很多研究者选择有一定酸性的 溶剂作为浸提剂，由此看出一定的酸浓度有助于色素的浸提。 l - 3 1 2 超临界流体萃取法 超临界流体萃取( s f t ) 是一种较新型的萃取分离技术。起源于2 0 世 纪4 0 年代，7 0 年代投入工业应用，并取得成功。超临界流体萃取法利用液 体在超临界区域兼有气液两性( 即与气体相当的高渗透能力和低黏度及与 液体相当的密度和对物质优良的溶解力) 的特点和它对溶质溶解能力随压 力和温度改变而在相当宽的范围内变化这一特性而实现溶质溶解与分离 的一项技术。利用这种超临界流体可从多种液态或固态混合物中萃取出待 分离的组分，超临界流体萃取一般采用c 0 2 作为提取剂。 惠伯棣等( 2 0 0 7 ) 用超临界c 0 2 流体萃取番茄果皮中的番茄素，萃取 物中的总类胡萝卜素的含量比丙酮一乙醚萃取物的高3 1 ，其中番茄红素 占9 0 。孙中义等( 1 9 9 6 ) 研究了用超临界c 0 2 流体萃取溶剂法提取辣椒 色素的方法，确定最佳工艺参数是：萃取压力1 8 m p a ，萃取温度2 5 c ，萃 取剂流量2 o l m i n ，萃取时间3 h 。目前，超临界c 0 2 萃取天然色素研究比 较多的有咖啡因、胡萝卜素、辣椒红素、玉米黄色素、胭脂树橙、枸杞、 番茄红等。但实验结果差别较大，所以，超临界流体萃取技术在天然色素 研究方面的应用还很不成熟( 陈文伟，2 0 0 3 ) 。 1 3 1 3 微波提取法 微波是一种频率在3 0 0 m h z , 3 0 0 g h z 之间的电磁波，具有波动性、高 9 紫玉米植株茎叶色素的分离、纯化与理化性质研究 频性、热特性和非热特性四大基本特性。微波的频率与分子转动的频率相 关联，是一种由离子迁移和偶极子转动引起分子运动的非离子化辐射能。 当作用于分子上，促进了分子的转动运动，分子若此时具有一定的极性， 便在微波电磁场作用下产生瞬时极化，当频率为2 4 5 0 m h z 时，分子就以 2 4 5 亿次秒的速度做极性变换运动，从而产生键的振动、撕裂和粒子之 间的相互摩擦、碰撞，促进分子活性部分( 极性部分) 更好地接触和反应， 同时迅速生成大量的热能，引起温度升高。 由于微波对含极性分子的物质进行作用时，不需传热介质，不需经热 传导或热对流就可以使这些物质整体产生热效应而使温度迅速升高。根据 爱因斯坦扩散系数方程，扩散系数的大小与温度成j 下比，温度升高，扩散 系数增大，这样，如果将微波应用于从固体中浸取有效成分，就会加速有 效成分从固体中的扩散效率，此外，在固液浸取过程中，固体表面的液膜 常常是由强极性分子溶剂所构成，而在微波辐射下，强极性溶剂分子会快 速摆动以跟上交变电场的变化，这就可能对液膜层产生一定的微观“扰动” 影响，使附在固相周围的液膜变薄，而且可能使溶剂与溶质之问的结合力， 如氢键等受到一定程度的削弱，从而使固液浸取的扩散过程所受到的阻力 减小，促进扩散过程的进行( 李巧玲，2 0 0 0 ) 。 唐课文等( 2 0 0 5 ) 采用微波辅助浸提法从姜黄中提取姜黄素，其提取 率最高的工艺条件为：体积分数7 5 的乙醇水溶液作为提取溶剂，溶剂与 物料比3 0m l ：l g ，微波辐射功率3 6 0 w ，辐射时间6 0 s 。林琪等( 2 0 0 5 ) 用微波萃取法提取福建产花生壳中黄色素，工艺条件为：以p h 3 ，体积分 数7 0 的乙醇水溶液作提取溶剂，溶剂与物料比为5m l ：1 9 ，微波辐射功 率为1 2 0 w ，辐射时间2 4 0 s 。许正虹等( 2 0 0 5 ) 确定了在微波萃取紫甘薯 粉中紫甘薯色素的最佳萃取工艺为：微波辐射功率7 0 0 w ，温度7 0 c ，辐 射时间3 9 7 s ，以浓度为0 3 的盐酸作萃取溶剂，溶剂与物料比1 5m l ：l g 。 高春燕等( 2 0 0 8 ) 确定了玫瑰花色素微波辅助提取的最佳工艺条件为：6 5 乙醇提取，料液比l ：1 2 0 ，微波功率4 8 0 w 、浸提4 5 s 。吴东兵等( 2 0 0 8 ) 研究微波法提取丁香中食用色素的最佳工艺条件：微波辐射功率为5 0 0 w ，辐射时间为1 2 0 s ，提取剂为2 0 乙醇溶液，料液比为1 9 ：8m l 。王耀 勇等( 2 0 0 8 ) 研究了微波辅助提取蓝、紫粒小麦麸皮中色素的方法，结果 l o 山东农业大学硕士学位论文 表明，微波辅助提取蓝、紫粒小麦色素的影响的大小顺序均为微波功率 提取时间 料液比 提取剂浓度；微波功率均为4 5 0 w ，加热时i 创均为9 0 s ( 间断加热，将最高加热温度控制在7 5 ) ，溶剂均为7 0 乙醇溶液，料 液比，蓝粒为l g ：l o m l ，紫粒为l g ：1 2 m l 。 1 3 1 4 酶法提取 对于一些被细胞壁包围不易提取的色素原料可用酶法提取，选用特定 的酶，通过酶催化定向反应，可显著提高天然植物色素的萃取率，如红花 黄色素。红花黄色素存在于红花管状花瓣中，此部位植物材料的化学成分 主要为纤维素类物质，它们构成了红花黄色素由植物材料向提取介质扩散 的屏障。应用纤维素酶作用于红花管状花，使其细胞壁及细胞问质中的纤 维素、半纤维素等物质降解，使细胞壁及细胞间质结构发生局部疏松、膨 胀、崩溃等变化，从而增大胞内有效成分( 即红花黄色素) 向提取介质扩散 的传质面积，减小传质阻力，从传质角度促进红花黄色素提取率的提高。 此过程的实质是利用与非有效成分纤维素作用的酶解反应强化有效成分 的传质，从而提高了红花黄色素的提取率。 s a t os h i n g o 等( 1 9 9 8 ) 在制备红花红色素时，依次加入不同的氧化一 还原酶，在一定的催化反应条件下使红花黄色素b 转变为红花红色素，产 品得率是未加酶时的2 5 - 1 0 倍。吴拾荆( 2 0 0 3 ) 在提取栀子黄色素后的 废液中加入1 3 一葡萄糖苷酶，得到了栀子蓝色素、栀子红色素和绿色素。 1 3 1 5 超声波提取法 超声波提取法是利用超声波产生的强烈振动、很高的加速度、强烈的 空化效应、搅拌等特殊作用来破坏植物的细胞，使溶媒渗透到被提取物的 细胞中，从而使被提取物的化学成分溶于液体之中。超声波提取的主要动 力是声空化，空化现象是指在超声波的作用下，液体中形成空腔的现象， 这些空腔随传播着的声波的频率而伸张和压缩。当足够强度的超声波通过 液体，声波负压半周期的声压值超过液体内部的静压强时，液体中的微小 气泡就会迅速增大，在相继而来的声波正压相中，气泡会突然绝热压缩。 压缩时，气泡的尺寸会变小，同时它所产生的巨大压力可能会使空腔完全。 消失，也就是气泡完全闭合。闭合之前的瞬间空腔及其周围微小的空间内 出现热点，形成高温高压区，伴有强大的冲击波和时速达4 0 0 k m 的射流。 在空腔完全闭合的瞬间，这种极端物理环境的改变使含有化学成分的细胞 紫玉米植株茎叶色素的分离、纯化与理化性质i j j f 究 在溶剂中瞬时产生的空化泡的崩溃而破裂，溶剂即渗透到细胞内部，从而 使细胞中的化学成分溶于溶剂之中。超声波产生的振动作用也加强了细胞 内物质的释放、扩散及溶解。 超声波破碎过程是一个物理过程，浸泡提取过程中无化学反应，被浸 泡的化学成分的结构和性质不会发生变化，超声波的振动作用提高了细胞 的破碎速度，缩短了破碎时间，促进了化学成分向溶剂中溶解。用超声波 提取化学成分可以大大的缩短提取时间，提高提取率，得到的色素产品的 结构和性质也不会改变( 朱杰，2 0 0 5 ) 。 1 3 1 6 花色苷提取方法的比较和发展趋势 传统的溶剂提取法设备简单、应用普遍，但能耗大、产品质量较差： 超声波提取技术虽已在天然色素的应用中进行了一些研究，但都仅在实验 室的小规模上，对超声波提取的机理一超声波空化效应的研究还处于初步 阶段。对声能量与物质间相互作用及其产生的附加效应，还需继续进行大 量的研究工作；与溶剂提取法相比，微波萃取具有：( 1 ) 质量高，可有效地 保护食品中的功能成分；( 2 ) 回收率高；( 3 ) 对萃取物具有高选择性；( 4 ) 省时( 3 0 s - 1 0 m i n ) ；( 5 ) 溶剂用量少( 可较常规方法少5 0 一- - 9 0 ) ：( 6 ) 低 耗能；( 7 ) 加热速度快、易于控温。但应用范围相对受限：采用超临界c 0 2 流体萃取技术生产的产品无溶剂残留、无污染，可避免萃取物在高温下的 热劣化，保护生理活性物质的活性，保持萃取物的天然风味等。但受溶剂 极性限制、设备投资大；酶法提取条件温和、低温、中性，但目前的研究 不够深入。相信随着这些技术的成熟，多种提取方法的联合使用将是一种 发展趋势。 1 3 2 花色苷色素的纯化 采取一般的提取工艺浓缩得到的流体产品或由此经干燥得到的固体 产品都是粗制天然色素。由于没有精制，杂质含量高，有的原料本身带有 特殊的异味，有的则具有强烈的吸水性，无法使用。这些都将直接影响到 天然色素的稳定性和着色能力，限制了它的应用。所以应在天然色素生产 工艺中引入先进的分离纯化技术进行色素的精制，从而可以改善食用天然 色素的性能，扩大其应用范围。花色素属黄酮多酚类化合物，由于结构和 存在的状态不同，其溶解度存在很大差异。一般游离苷元难溶于水，易溶 1 2 山东农业大学硕士学位论义 于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱溶液中。因而，使得花 色素的纯化有很大的困难。目前花色苷物质的纯化主要采用吸附沈脱法、 高效逆流色谱法、超滤法、膜分离技术和吸附柱层析法等方法。 1 3 2 1 吸附洗脱法 吸附树脂是一类以吸附为特点，对有机物具有浓缩、分离作用的高分 子聚合物，在有机物分离、制备和提纯方面有广泛应用，吸附树脂对物质 的吸附特性主要取决于吸附材料表面的化学性质、比表面积和孔径。按照 树脂的表面性质，吸附树脂一般分为非极性、中极性和极性三类。非极性 吸附树脂适用于从极性溶剂中吸附非极性物质，中极性吸附树脂适用于从 极性溶剂中吸附非极性物质，也可以从非极性溶剂中吸附一定极性物质。 极性吸附树脂适用于从非极性溶剂中吸附极性物质。吸附树脂的操作一般 包括吸附、洗脱、再生、冲洗等过程。根据不同色素的性质选择合适的吸 附树脂材料和特定的吸附剂、洗脱剂，采用吸附、解吸可达到纯化色素的 目的。吸附法以其有机溶剂用量少、耗能少、吸附量大、吸附速度快、易 于解吸附、可重复使用等特性，在色素纯化上的应用越来越广泛。 大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构人工合成的聚合物吸附剂，是 依靠它和被吸附的分子之间的范德华引力，通过它巨大的比表面进行物理 吸附而工作的。在实际应用中对一些与其骨架结构相近的分子如芳香族环 状化合物具有很强的吸附能力。纯化过程易于控制，并且树脂吸附洗脱后 可以反复使用。大孔树脂具有物理化学稳定性高，吸附选择性强，不受无 机物存在的影响，再生简便，解析条件温和，使用周期长，易于构成闭路 循环，节省费用等优点。 目前，很多花色素都采取大孔吸附树脂来进行纯化。试验中需要考虑 选择适宜的大孔树脂，洗脱液的p h 和配比选择、柱压、沈脱液流速等因 素。一般来说，经过适宜的大孔树脂的纯化，花色素浓度可以提高1 0 - 2 0 倍。 毕红霞等( 2 0 0 4 ) 用a b 一8 吸附树脂对欧李红色素进行纯化，得到的 色素晶体回收率为6 1 8 。张卓( 2 0 0 8 ) 用d 1 0 1 型大孔树脂纯化玉米紫色 植株花色苷色素，当上样液浓度为o 4 9 1 0 0 m l 、流速为0 6 m l m i n 时，吸附 率达7 3 3 ；用5 倍树脂体积的5 0 e , 醇洗脱，解吸率达8 9 7 。贺菊萍等 紫玉米植株茎叶色素的分离、纯化与理化性质研究 ( 2 0 0 7 ) 研究了五种大孔吸附树脂( d 4 0 2 0 、nk a 、nk a 9 、s - 8 、a b 8 ) 对紫甘蓝色素的纯化作用，确定五种树脂中，n k a 的性能是最好的，吸附 率约为9 8 1 ：吸附温度为3 0 c ，吸附时间为1 2 0 - 1 4 0 m i n ：9 5 乙醇沈脱， 解吸温度为5 0 c 。胡晓丹等( 2 0 0 8 ) 比较了8 种大孔吸附树脂( n i c a 2 2 9 、 删2i i 、a b 2 2 8 、x 2 2 5 、d 3 5 2 0 、$ 2 2 8 、d 4 0 0 6 、x a d 2 2 7 ) 对紫苏叶 花色素苷粗提物的静态吸附和解吸性能，结果表n j j x a d 2 2 7 的纯化效果最 好，得到的精制品中花色素苷的含量为7 8 1 8 ，树脂富集倍数为2 6 6 。徐 怀德等( 2 0 0 7 ) 从1 5 种大孔吸附树脂( l s a 1 0 、l s a 2 1 、l s a 4 0 、l s a 8 b 、 n k a i i 、n k a 9 、d - 3 9 2 、d - 3 8 0 、d - 4 0 2 0 、x d a 一1 、h p 一1 0 、d - 3 1 2 、c a d 4 0 、 c a d 4 5 、h p d 一8 0 、h p d 一1 0 0 、i - i p d 一1 0 0 a 、h p d 4 0 0 a ) 中选出h p d 一1 0 0 a 纯化黑莓色素效果较好。其最佳工艺参数为