（临床检验诊断学专业论文）辽宁msm人群hiv1感染早期病毒env准种演变与疾病进展关系的研究.pdf

中国医科大学研究生学位论文独创性声明f tyllltttlllltlttl7lii16lllt18ilttl6ltltl2lltlllt4tllll 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的 材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：磁魄 弘，o f 、2 ； 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间 论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文 工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国 医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文 被查阅和借阕。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影 印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 丛! ：丝 目录 一、论文摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要6 二、英文缩略语1 3 三、论文 前言1 4 刖舌 “1 4 材料与方法1 5 实验结果2 2 讨论“o oo ooo oo qoooom o 3 4 结论3 9 四、本研究创新性的自我评价 4 0 五、参考文献4 1 六、附录 综述”4 6 致谢5 6 个人简介5 7 中文论著摘要 辽宁m s m 人群h iv - 1 感染早期病毒e n v 准种演变与 疾病进展关系的研究 目的 人免疫缺陷病毒( h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s ，h ) 是一种逆转录病毒， 是引起获得性免疫缺陷综合征( a c q u i r e di m m u n o d e f i c i e n c ys y n d r o m e ，a i d s ) 的病 原体。目前全球有大约3 3 4 0 万h i v 感染者，2 0 0 9 年新增感染者2 7 0 万人。截至2 0 0 9 年底，估计中国存活艾滋病感染者和病人约7 4 万人，2 0 0 9 年新发艾滋病感染者4 8 万人，其 3 2 5 的新感染者是男男性行为者【l 】。 变异性是h i v 的重要特征之一。h i v - 1 基因组中以膜蛋白编码基因的变异程度 最高，在同一亚型中e n v 基因差异为7 2 0 ，不同亚型间e n v 基因差异可达2 0 - 3 5 f 2 】。目前研究认为当病毒感染新的个体时，大约8 0 是单一病毒株 3 】传播，在新宿 主体内，病毒的高突变率以及宿主的免疫压力使得病毒得以快速变异【4 】。在e n v 基 因区域，突变率每年高达1 【5 1 。在整个病程中，个体内h i v - 1 进化由病毒的多样 性决定，除了基因漂移和纯化选择每刀外，h i v - 1 的进化也受中和抗体和c t l s 的阳 性选择【8 】。研究发现h i v - 1 感染2 1 2 8 天后病毒载量达到峰值，随后病毒水平迅速 降低达到稳定的状态即病毒调定点( s e t p o i n t ) 【9 】，目前国际公认将病毒调定点的 高低作为判断感染者生存期长短及预后的关键指标【悱1 1 】。由于s c t p o i n t 的重要性， 学者们格外关注在s c t p o i n t 之前到底发生了什么，为什么有些相同或相似的病毒感 染不同的宿主却形成不同的s e t p o i n t 和预后。但是由于急性期感染者队列建立和维 持非常困难，目前关于这方面的研究资料尚很有限。 本研究以h i v - 1 原发感染患者为研究对象，以前瞻性队列研究的方式，高密度 随访观察感染早期病毒复制水平的动态变化，以h i v - 1 基因组中膜蛋白编码区 g p l 6 0 为研究目标，经t a 克隆的方法获取感染后最早时间点和病毒调定点时期的 准种序列，进行个体内病毒n 糖基化位点、辅助受体、遗传多样性、趋异性、特 征性氨基酸变异及不同时间点的上述病毒特征演变分析，并分析上述各项指标与 病毒调定点高低的关系，以期从分子水平探讨h i v - 1 患者病毒调定点的形成机制， 揭示h w - 1 感染早期病毒的生物学特征、寻找保护性免疫应答的相关因素，为h i v 感染的治疗和疫苗设计提供新的思路。 方法 l 、研究对象 1 2 例未经抗病毒治疗原发感染病例，分析并比对每例原发感染者最早时间点 及s e t p o i n t 点病毒e n v 基因的变化。并根据h w - 1 感染后4 2 4 月内，病毒载量相 对稳定，定义病毒载量调定点的时间。根据s e t p o i n t 点病毒载量水平分为高s e t - p o i n t 组( 4l o g l o c o p i e s m l ) 和低s e t p o i n t 组( “l o g l o c o p i e s m l ) 。 2 、c d 4 + t 淋巴细胞测定 2 0 1 x lc d 4 c d 8 c d 3t r i t e s t 试剂加入t r u c o u n t 管中，加入5 0 i - t l 抗凝血， 室温避光1 5 m i n ，加入免洗溶血素4 5 0 p l ，室温避光1 5 m i n ，用f a c sm m l t i s e t 软件检测并进行自动分析、计算c d 4 * 、c d 8 + 、c d 3 + t 淋巴细胞绝对值及相应比 值等。 3 、病毒载量测定 以2 0 0 肛1 血浆采用标准版模板制备法提取r n a ，采用r o c h e 公司h w - 1 m o n i t o r1 5c o m m e r c i a lk i t 在c o b a sa m p l i c o r 自动载量仪上以r t - p c r 方法测 定病毒载量。检测范围为4 0 0 - 7 5 0 ，0 0 0 c o p i e s m l 。 4 、病毒核酸提取、r t p c r 以抗凝1 4 0 1 x l 血浆提取病毒基因组r n a ，按照q i a a m pv i r a lr n a m i n ik i t 说明书步骤提取r n a ，提取物溶于6 0 1 x l 洗脱液中。r t 反应体系基于s u p e r s c r i p t i l l r e v e r s et r a n s c r i p t a s ek i t ( in vit r o g e n ) 5 、巢氏聚合酶链反应( n e s t p c r ) 以外侧引物对：a e o f ( 5 - t a g a g c c c t g g a a t c a t c c g g g a a g 3 i - i x b 2 5 8 5 3 5 8 7 7 n t ) 和a e o r ( 5 - t t a c t a c t t g t r a c t g c t c c a t g r - 3 h w - l n x b 2 8 9 3 6 8 913 n t ) ；内侧引物对：u i f ( 5 c a c c t r a g g c a t c t c c t a t g g c a g g a a g a a g 3 ，h 二1 h 2 7 8 5 0 - 7 8 7 9 n t ) 和a e i r ( 5 一a g c t g g a t c c g t c t t g a g a t a c t g c t c c t a c 3 h i v - l n x a 28 9 1 4 8 8 8 4 n t ) ，用于扩增h i v - 1g p l 6 0 序列。 6 、p c r 反应产物纯化 取终产物5 m 进行1 琼脂糖凝胶电泳，经u l t r a - v i o l e tp r o d u c t 凝胶成像后与 m a r k e r 比对，确认所需片段，用q i a q u i kg e le x t r a c t i o nk i t 试剂盒纯化基因片段。 7 、t a 克隆 扩增的g p l 6 0 基因3 0 0 0 b p 片段插入克隆载体p m d t m l 8 - ts i m p l ev e c t o r ，转入 化学感受态菌d h 5 a 扩大培养，然后提取质粒d n a 双脱氧终止法测序。 8 、序列分析 经p c r 扩增和测序得到h 二1g p 4 1 基因的基因序列片段，然后用c o n t i g 软件进 行拼接，用b i o e d i t 软件进行序列比对。用m e g a3 软件的进行系统树分析，并计 算基因离散率及趋异性。使用网上工具( h t t p ：w w w h i v 1 a n l g o v ) 分析同义替代及 非同义替代、h i g h l i g h t e r 、n - g l y c o s i t es i t e 。利用网络工具i e d ba n a l y s i sr e s o u r c e ， 根据本实验室前期获得的患者h l a i 等位基因分型信息，预测样本的h l a i 限制性 c t l 表位，选取i c 5 0 低于5 0 n m 的表位进行多肽特征和变异分析。使用s i m p l o t 软件 进行重组断点分析。使用g e n 0 2 p h e n o c o r e c e p t o r 软件，进行细胞嗜性的预测。 9 、统计学分析 用s p s s l 5 统计软件进行统计分析；数据使用均数标准差及中位数4 - 9 5 可 信区间；用n o n - p a r a m e t r i cw i l c o x o nr a n k - s u mt e s t 分析不同时间点毒株的p n g s 数 量和e l i v 区变异环长度的不同；用s p e a r m a n 秩相关进行相关性分析；p 0 0 5 为有 统计学意义。 结果 一、膜蛋白基本特征 1 、e n v 变异环的长度分析 在感染最早期，高病毒s e t p o i n t 组v 1 、v 2 、v 4 区长度有高于低病毒s e t p o i n t 组趋势，而v 5 区长度有低于低病毒s e t p o i n t 组趋势，但上述差异均未达显著性水 平；在s e t p o i n t 点，两组上述各区域的变化仍未发生显著性差异。 两组随着时间的推移各区的变化如下：在v 1 区，高病毒s e t p o i n t 组无明显变 化，低病毒s e t p o i n t 组v 1 有变短趋势；v 2 区与v 3 区两组均无明显变化；v 4 区 与v 5 区两组均有变短趋势，但差异均未达显著性水平。 2 、n 糖基化位点( p n g s ) 在感染最早期，高病毒s e t p o i n t 组v 1 、v 2 、v 5 区p n g s 数量有低于低病毒 s e t p o i n t 组趋势，而v 3 、v 4 区、g p 4 1 胞外区p n g s 数量有高于低病毒s e t p o i n t 组趋势，但上述差异均未达显著性水平；在s e t p o i n t 点，两组在上述各区域的p n g s 数量上仍无显著性差异。 两组随着时间的推移各区的变化如下：在高病毒s e t p o i n t 组与低病毒s e t p o i n t 组中v 1 区与v 4 区的p n g s 均有减少趋势；在v 2 区和g p 4 1 胞外区，高病毒s e t p o i n t 组p n g s 数量有增加趋势，低病毒s e t p o i n t 组则有减少趋势；在v 3 区，高病毒 s e t p o i n t 组的p n g s 数量无明显变化，低病毒s e t p o i n t 组则有增加趋势；在v 5 区， 高病毒s e t p o i n t 组的p n g s 数量有减少趋势，低病毒s e t p o i n t 组则有增加趋势，但 上述差异均未达显著性水平。 3 、细胞嗜性预测结果 1 2 例h i v - 1 原发感染者感染毒株在感染早期以c c r 5 嗜性的病毒株为主，占 8 3 3 ，高病毒病毒s e t p o i n t 组病毒准种全部为c c r 5 嗜性，低病毒s e t p o i n t 组5 0 的感染者准种为c x c r 5 。1 例经异性性传播感染者在感染早期病毒准种为c c r 5 嗜性，但其s e t p o i n t 时的病毒准种转变为c x c r 4 嗜性。 二、h lv - 1e n v 进化特征 l 、同一感染者个体内最早期和调定点的病毒多样性分析 按照f i e b i g 分期比较，i i 期时，高病毒s e t p o i n t 组多样性低于低病毒s e t p o i n t 组；而在与期，高病毒s e t p o i n t 组多样性高于低病毒s e t p o i n t 组。 2 、多样性率 高病毒s e t p o i n t 组多样性率与低病毒s e t p o i n t 组多样性率无显著性差异 ( p = o 4 5 8 ) 3 、核苷酸趋异性和氨基酸趋异性分析 高病毒s e t p o i n t 组趋异性有高于低病毒s e t p o i n t 组的趋势( p = 0 1 0 5 ) 。