（动物学专业论文）稀有鮈鲫和泥鳅部分基因的克隆及其表达模式.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i $ 中文摘要 本项目以稀有绚鲫和泥鳅为对象，克隆了稀有的鲫和泥鳅的肌肉生长抑制素 ( m y o s t a t n ，m s t n ) 基因，并对其表达模式进行了初步研究；同时，克隆了稀有 的鲫b 肌动蛋白基因，为进一步研究鱼类肌肉生长发育调节机制打下了基础。 肌肉生长抑制素是转化生长因子b 家族成员之一，是动物肌肉生长发育的负调 控因子，抑制肌肉的发育和生长。鱼类m s t n 的研究将有助于了解肌肉发育及其调 控机理，促进渔业生产和发展。 1 以稀有筋鲫为主要研究对象，通过r t - p c r 和r a c e 的方法，从稀有绚鲫 肌肉组织的s m a r t e d n a 文库中克隆出腻孵全长基因。与其它已知的m s t n 比 对，同源性非常高，达5 4 9 r 7 ，并基于已知的m s t n 氨基酸系列构建了进化树。 稀有胸鲫的m s t n 基因的c d n a 全长2 1 8 4 b p ，含有1 1 2 8 b p 的开放阅读框，编码3 7 5 个氨基酸。分析表明，其蛋白质具有两个典型的t g f - p 蛋白结构域，一个是t g f b 前肽结构域；从第9 9 位到第2 5 5 位，共1 5 7 个氨基酸。另一个是t g f - b 结构域， 是t g f - p 家族基因的活性结构域，从第2 8 1 位至第3 7 5 位，共9 5 个氨基酸。稀有 韵鲫的m s t n 蛋白具有典型的r x x r 蛋白酶水解位点( r i r r ) ，位于第2 6 3 - 2 6 6 位； 另有9 个保守的半胱氨酸残基。信号肽预测发现该蛋白属于分泌性蛋白。采用 r t - p c r 方法进行了稀有觞鲫m s t n 基因的时空表达模式特征分析，结果表明，稀 有鲍鲫m s t n 在肌肉和眼睛中表达；而在其他被检测的部位如：脑、鳃、心脏、肠、 卵巢、肝、精巢中未检测到。说明鱼类m s t n 基因可能除了抑制肌肉生长发育以外， 对眼的发育也有一定的作用。 2 以泥鳅肌肉e d n a 为模板，采用r t - p c r 方法克隆了泥鳅m s t n 基因的主 要片段；其长度为8 1 5 b p ，编码2 7 1 个氨基酸残基。克隆的泥鳅t d s t n 基因已近完 整的阅读框架( 0 i 沛) ，包含了m s t i q 前肽结构域、m s t n 功能结构域、保守的蛋 白酶水解位点r i r r 和7 个保守的半胱氨酸残基等主要功能片段。泥鳅m s t n 与鲤 m s t n 同源性高达9 4 ，与斑马鱼m s t n 同源性达9 2 。不同组织的r t - p c r 分析 表明该基因在肌肉中强烈表达，在眼中也有微弱表达，而在其他所检测组织( 脑、 鳃、心脏、肝脏、肠、精巢、卵巢) 中未见表达。与稀有的鲫m s t n 的表达模式一 致。 3 p - a c 矗n 基因是真核生物中普遍存在。是进化中高度保守的蛋白质家族，与一 些管家基因一样，在物种内持续恒量表达，因而在很多需量化的实验技术，如 r t - p c r 、p c r 、n o r t h e m 杂交中被当作内参照。本研究采用r t - p c r 方法从稀有筋 硕士擘位论文 m a s t e r s t h e $ i s 鲫肌肉组织中分离和克隆出争肌动蛋白基因c d n a 部分序列，长度为1 0 2 9 b p ，编码 3 4 3 个氨基酸残基。序列分析表明，该c d n a 序列与其他物种b 肌动蛋白基因同源 性非常高。r t - p c r 能够检出该基因在稀有约鲫肌肉、眼、脑、心脏、肝，肠、鳃、 睥、卵巢等组织中广谱表达，在胚胎不同发育时期持续恒量表达。 关键词：稀有的鲫；泥鳅；m s t n 基因；1 3 - a c t i n 基因；克隆；时空表达 a b s t r a c t m y o s t a t i n s t n ) ，a m e m b e ro ft r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rc i g f ) - ps u p e r f a m i l y ， i san e g a t i v er e g u l a t o ro fm u s c l ed e v e l o p m e n t , i ts u p p r e s s e st h ed e v e l o p m e n ta n dg r o w t h o fm u s c l e t os t u d ym s t no ff i s hi sh e l p f u lt ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s mo fr e g u l a t i o n a n dd e v e l o p m e n to fm u s l eo ff i s h ；a n di ti sa l s ob e n e n i t i c a lf o ra q u a c u l t u r et op r o m o t e t h ef i s hp r o d u c t i o nb yi n h i b i t i o no fm y o s t a t i na c t i v i t y g o b i o c y p r i s r a r l l sa n d m i s g u r n u sa n g u i l l i c a u d a t u sw e r ec h o s e na st h es u b j e c t st o c l o n em y o s t a t i ng e n e s , a n dt h ee x p r e s s i o np a t t e r n so ft h eg e n e sw e r es t u d i e d t h ep - a c t i n g e n eo fg o b i o c y p r i sr a r i 雌w a sa l s oc l o n e d 1 1 碥f i n i s ho fc l o n i n gt h em y o s t a t i na n d 1 3 - a c t i nw i l lb eu s e f u lf o rr u i n e rs t u d i e so fr e g u l a t i o na n dd e v e l o p m e n to fm u s c l ei nt h e s e f i s h e s 曲ef u l l - l e n g t he d n ao fm y o s t a t i n 删) o fg o b i o c y p 由r a t m w a sc l o n e df r o m m u s c l es m a r te d n a l i b r a r yb yt h em e t h o do fr a c e m s t no fg o b w c y p r i sr a l t a $ i s 2 1 8 4b p ，i th a sa no p e nr e a d i n g - f r a d m e ( o r p ) o f1 1 2 8b pw h i c he n c o d e sap r o t e i no f3 7 5 a m i n oa c i d s m u l t i p l ea l i g n m e n ta n dp h y l o g e n e t i ca n a l y s ew e r ec o n d u c t e dw i t hm s t n p r o t e i n s , t h em s i no fo o b i o c y p r i 塔r a 删e 5h a sh i g hi d e n t i t y ( 5 4 一9 7 ) t ot h em s t n s o fo t h e ra n i m a l s m s t no fg o b i o c y p r i sr a r l l 熔h a st h et y p i c a lc h a r a c t e r so fm s t n , a p r e d o m a i n ( p o s i t i o n9 9t o2 5 5 ) , am a t u r em s t nd o m a i n ( p o s i t i o n2 8 1t 03 7 5 ) a c o n s e r v a t i v eh y d r o l y t i cs i t e 皿m rp o s i t i o n2 6 3 幻2 6 6 ) a n d9c y s t e i n er e s i d u e s s e q u e n c ea n a l y s i sp r e d i c t e dt h a tm s t no fg o b i o c y p r i sr a r u 5h a sap u t a t i v es i g n a l p e p t i d ea sc h a r a c t e ro fas e c r e t o r yp r o t e i n 1 kt e m p o r a la n ds p a t i a le x p r e s s i o np a t t e r no f m 矾翻o fg o b i o c y p r i sy a r l l 5w e r ea n a l y z e db y 姗c r t h er u s u l t ss h o w e dm 髓n m r n a w a sc o n f i n e dt om u s c l ea n de y e ，t h eo t h e rt e s t e dt i s s u e s , s u c ha sb r a i n , g i n ，h e a r t , i n t e s t i n e , o v a r y , l i v e r , t e s t i s , h a dn o ta n yd e t e c t a b l ee x p r e s s i o n l o a c h ( m s g u r n u sa n g u i l l i c a u d a t u s ) h a sb e e naf i s h e r ys p e c i e sr e c e n t l y , s ot h e 岱掰o fl o a c hw a sa l s oc l o n e da n dc h a r a t c r i z e d 1 1 璩p a r t i a ls e q u e n c eo fm 洲o fl o a c h w a sc l o n e db yr t - p c rw i t hp r i m e r sb a s e do nc o n s e r v a t i v es e q u e n c e t h es e g m e n to f l o a c hm s l ：ne d n ai s8 1 5b a s ep a i r sw h i c he n c o d e s2 7 1a m i n oa c i dr e s i d u e s m c l o n e dm s t no fl o a c hi sn e a r l yt h ew h o l e s e q u e n c eo fo p e nr e a d i n gf r a g m e n t , i n c l u d i n g ap r e - d o m a i n , m a t u r em s i nd o m a i n , c o n s e r v a t i v eh y d r o l y t i cs i t e ( r i p r ) ，a n d7 c o n s e r v a t i v ec y s t e i n er e s i d u e s h o m o l o g ya n a l y s i sw a sc o n d u c t e du s i n ga m i n oa c i d s e q u e n c e so fm s t no fl o a c h , 例l p l tz e b r a f i h , a n dr a i n b o wn d u l ：t h em s t no fl o a c h s h a r e s9 4 9 2 i d e n t i f i e st om s i n so fc a r pa n dz e b r a f i h , r e s p e c t i v e l y t h ee x p r e s s i o n p a t t e r no fm s t no fl o a c hw d sd l e c k e db vm 二p c r t h er e s u l t ss h o w st h a tt h em s i n i s m e x p r e s s e ds t r o n g l yi nm u s c l ea n dw e a k l yi ne y e s ，b u tt h e r ew e r en o ta n yd e t e c t a b l e e x p r e s s i o ni no t h e r t i s s u e sl i k eb r a i n , g i n ，h e a r t , l i v e r , i n t e s t i n e ，t e s t e s , a n do v a r y b a s e d0 1 1t h ee x p r e s s i o np a t t e r n , i ti sp r e s u m e dt h a tm s t n m a yp l a ys o m er o l e si n d e v e l o p m e n to fe y ee x c e p to fs u p p r e s s i o no fg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to fm u s c l ei n a o b i o c y m 由r a n i sa n dm i s g u r n u sa n g u i l l i c a u d a t u s 。 b - a c t i ni sam e m b e ro ft h ea c t i nf a m i l yw h i c hi sa l le x t r e m e l yw e l lc o n s e r v e df a m i l y o fp r o t e i n si nv m i o u s 删鼯t h r o u g h o u te v o l u t i o n l i k eo t h e rh o u s e - k e e p i n gg e n e s ， e x p r e s s i o no fb - a e t i ni su b i q u i t o u sa n dc o n s t a n td u r i n ga l ld e v e l o p m e n ts t a g e si n s p e c i e s , s oi ti so f t e nu s e da sa ni n t e r n a lc o n t r o li nm a n ye x p e r i m e n t , s u c h 舔k f p c q u a n t i t yp c r , n o r t h e r nb l o t , e t e h o w e v e r , t h es e q u e n c eo f 参船曲lo f g o b i o c y p r i sr a n t 8 h a sn o tb e e nr e p o r t e ds of a r , 8 0t h ep a r t i a ls e q u e n c eo f f l - a c a no fg o b i o c y p r i sr a r u 5w a s c l o n e db vr t - p c r n ep a p a ls e q u e n c eo ff l - a c a no fg o b i o c y p r 缸r q r l g si s1 0 2 9b a s e p a i r sw h i c he n c o d e s3 4 3 a m i n oa c i d s mi d e n t i t i e so ft h ec o r r e s p o n d i n gp a r t i a l x t u e n c e so fp - a c a nb e t w e e ng o b i o c y p r i sr 露，淞a n do t h e rf i s h e sw e r ev e r yh i 吐n e r e s u l t so fl m p c rs h o w e dt h a te x p r e s s i o no fp 川c a n0 fg o b i o c y p r 括r a r i 惦w e r e u b i q u i t a li nt i s s u e s , l i k em u s c l e , e y e ，b r a i n , h e a r t , l i v e r ，g u t ，g i l l s p l e e na n do v a r y , a n di t se x p r e s s i o ni sa l s oc o n t i n u o u sa n dc o n s t a n td u r i n ge m b r y o n i cd e v e l o p m e n t k e yw o r d s ：g o b i o c y p r i sr a r u s ；m i s g u r n g sa n g u i l l i c a u d a t u s ；m y o s t a t i n ； 1 3 一a c f i n ；c l o n i n g ；t e m p o r a la n ds p a t i a le x p r e s s i o n i v 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的研 究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过 的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法 律结果由本人承担 作者签名： 粥知 日期- 珈7 年月惭 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中师范大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录刭中 国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：吻知 日期：伽7 年月f 二日 导师签名：之撇 日期：1 ，；7 年二月fz ，日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。圃童论塞堡銮卮迸唇! 旦圭生 旦二生；旦三生筮查! 作者签名：钡? 纱 喊砷年f 月r z 日 导师签名：0 以( 凤 日期：7 叼年占月乙日 引言 随着社会发展和人民生活水平的提高。鱼需求量也越来越高。水产业为了提高 鱼产量，已经从养殖模式、疾病预防和饲养技术多方努力。分子水平的研究对于了 解鱼类生长发育机制和调控、促进渔业生产有重要作用。在肌肉增长发育中的一个 重要调控基因就是肌肉生长抑制素基因( m y o s t a t i n ，m s t n ) ，它是肌肉发育的负调 控因子，因此m s t n 的研究对于渔业生产十分必要和重要。 在我国，水产鱼类主要是鲤科鱼类如四大家鱼。稀有舸鲫( g o b i o c y p r i s ，们播) 是鲤科鱼类模型之一，它具有性成熟时间短、繁殖季节长、繁殖能力强、产卵频率 高、在人工饲养条件下可常年繁殖、体外产卵、体外受精和胚体透明有利于研究观 察等优点( 王剑伟，1 9 9 2 ；常剑波等，1 9 9 5 ；王剑伟和曹文宣，1 9 9 7 ) 。而泥鳅也 是近年兴起的特种养殖对象，是群众喜食对象之一，它肉昧鲜美，营养丰富。 因此，本研究通过r a c e 方法，从稀有胸鲫肌肉s m a r t c d n a 文库中克隆出 m s t n 全长基因，采用r t - p c r 方法分析了稀有鲥鲫m s t n 基因的时空表达特征。 同时也克隆了泥鳅m s t n 基因c d n a 主要片段，包括前肽域和t g f b 功能域，并 作了组织表达分析。m s t n 基因的克隆为今后进一步研究鱼类肌肉生长分化及其调 节打下了基础，并为进行转基因动物育种和其它应用研究创造了条件。例如：通过 m s t n 作用机制的研究，有可能发现一些促进动物肌肉生长的小分子调节物质；这 些小分子物质就可以作为促进动物肉类生产的促进剂。通过被动免疫的方式，有可 能使动物鱼产量提高。通过转基因技术，在鱼肌肉中过量表达前肽( t h o m a s 等，2 0 0 0 ) ，或者特异的表达m s t n 的反义基因( b i g a 等，2 0 0 5 ) ，均可以增强转基 因鱼肌肉的发育。 本研究还克隆了稀有绚鲫b 一肌动蛋白基因( p - a c t n ) , 作为稀有绚鲫的分子生 物学研究的重要参照基因。 1 1 稀有晌鲫胚胎发育过程 1 文献综述 稀有鲷鲫是我国近年来发现并开始使用的一种优良实验鱼。中国科学院水生生 物研究所鱼类学研究室对它进行了大量的研究，为其作为我国标准的实验鱼奠定了 基础，迄今的研究结果表明，这种鱼个体小，对温度，溶氧等环境条件适应性强， 饲养方便，不易染病，而且还具有如下特点：繁殖季节长，养殖条件下可周年产卵； 性成熟快，在适宜的水温和充足的饵料等条件下孵出后四个月就可以繁殖产卵；产 卵批量多，同一雌鱼每隔数天就可以产卵一次，每次产卵数百粒；卵膜透明便于观 察胚胎( 王剑伟，1 9 9 2 ) 。 图l 稀有的舅的胚胎发育( 常剑波等，1 9 9 5 ) 隐1 e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t o r g o b o c y p d s 伽 l 分裂前；2 2 细胞；3 4 细胞；4 8 细胞；5 多细胞期；6 囊胚早期；7 囊胚中期；8 囊胚晚 期；9 原肠早期；1 0 原肠中期；1 1 原肠晚期；1 2 神经胚；1 3 胚孔封闭；1 4 肌节出现；1 5 眼基； 1 6 服囊；1 7 尾芽；1 8 尾泡：1 9 尾鳍；2 0 眼晶体形成；2 1 肌肉效应；2 2 耳石；2 3 心脏搏动； 2 4 胸鳍原基；2 5 眼灰；2 6 服黑；2 7 鳃弧；2 8 孵出 2 硕士擘住论文 m a s t e r st h e s i $ 1 e i 吲，f 肚d i ；2 2 - c e i i ；3 4 - c d i ；4 8 - c e l l ；5 m u l t l c e u u l a r ；6 e a r l yb l a s t u t a ；7 m i db l a s t u l a ；8 1 a t eb l a s t u l a ；9 e a r l yg a s t r u l a ；加m i dg a 蛐1 1 l a t e g a s t r u l a ；1 2 n e u r u l a ；1 3 c l c e u r eo f b l a s t o p o r e ； 1 4 p p c a r o fm y o m e r e ；1 5 o p e cr u d i m e n t ；1 6 o p t i cv e s i c l e ；1 7 t a i lb u d ；1 8 t a i lv e s i c l e ； 1 9 c a u d a lf i n ；2 0 f o r m a t i o no fe y e l e n s 2 1 m u s c u l a rc o n t r a c t l o n ；2 2 a p p c a r a n c eo fo t o l i t h e s ；2 3 h e a r t p u l s a t i o n 2 4 r u d i m e n to f p e c t o r a lf r o ；2 5 c n e y i s he y e s ；2 6 m e l a n o i de y e s 2 7 g i l la r c h 2 s h a t c h i n g 稀有筋鲫产粘性卵，卵子与精子相互作用产生合子受精卵，受精启动了卵子 胞质的重排，光学显微镜下可观察稀有蠹句鲫早期胚胎发育过程的形态特征变化，最 初透过卵壳可清晰的观察胚胎发育变化，随着发育过程的继续，卵壳硬度增加，其 表面亦因不断黏附水中的微尘杂质，透明度逐渐降低，须用解剖针将卵壳挑破，使 胚胎逸出后便于观察其发育特征( 常剑波等，1 9 9 5 ) 。稀有的鲫胚胎发育过程与多 数淡水硬骨鱼类相似，受精后，不久即在动物极形成胚盘并逐渐增高，卵裂局限在 动物极所在半球，分裂球及囊胚的高度约占整个卵垂径的1 3 以上，以内卷和下包 的方式形成原肠胚。刚孵出的鱼苗眼睛全黑，体表黑色素密布，胸鳍大小和幼鱼的 接近，鳃弧形成，口裂出现，消化道贯通并出现鳔雏形图，稀有绚鲫胚胎发育过程 形态变化特征如( 图1 ：1 - 2 8 ) ( 常剑波等，1 9 9 5 ) 。 1 2 肌肉分化分子调控 肌肉的分化、生长和发育是动物生长发育的重要环节和过程，肌肉也是动物为 人类提供的食品的主要成分。肌肉的生长和发育在不同层次受许多因素的影响，如 环境( 气候、营养等因素) 、激素和分子水平的调控。在分子水平上，与肌肉分化 决定与发育有关的基因主要为m y o d 家族成员，包括m y o d ，m y o g e n i n ，m y f 5 和m r f 4 等，它们的基本作用是生肌细胞的决定和肌肉的分化，通过与肌肉特异基因启动子 上的b b o x 结合而激活肌肉特异蛋白的转录( r e s c a n 等，2 0 0 1 ) 。生肌节的形成受两 种信号的诱导，起源于体节中部的轴后肌细胞( 环绕体轴) 受背神经管细胞的w n t 家族因子的诱导( m i i n s t e c o c r g 等，1 9 9 5 ) ；轴下肌( 起源于体节中部，形成肢和体 壁肌肉系统) 可能受来自表皮的w n t 蛋白和来自侧板中胚层的b m p 4 蛋白的共同诱导 ( c o s s u 等，1 9 9 6 ) 。这些诱导因子促进生肌节细胞表达特定的转录因子( 如m y o d 和m y f s ) ，从而激活肌肉特异基因。肌肉的生长还受到一些负调控因子如m y o d 抑制 素( i n h i b i t o r o f m y o d f a m i l y ，i - m 0 ( c h e n 等，1 9 9 6 ) 和肌肉生长抑制素( m y o s t a t i n ， m s t n ) ( m c p h e r r o n 等，1 9 9 7 ) 的影响。i - m r 能抑制肌肉的形成，是m y o d 家族转录 因子的一个抑制子。肌肉生长抑制素m s t n 又称为g d f - 8 ( g r o w t hd i f f e r e n t i a t i o n 硕士学位论文 m a s t r st h e s i s f a c t o rs ) ，它是转化生长因子b ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 5 ，t g f - j j ) 家族成员， 是近年来发现的一类重要的肌细胞生长调控因子( 赵浩斌等，2 0 0 6 ) 。 1 3 m s t n 基因的研究进展与展望 1 3 1m s t n 的研究概况 肌肉生长抑制素又称生长分化因子8 ( g r o w t hd i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r8 ，g d f 8 ) ， 属转化生长因子p ( a a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rp ，t g f - i b ) 超家族成员，较为保守， 主要存在于肌肉中( m c p h e r r o n 和l e e ，1 9 9 7 ) 1 9 9 7 年m c p h e n - o n 等首次在小鼠 胚胎和成年肌细胞中发现了m s t n 基因的表达；m s t n 基因敲除后小鼠肌肉生长旺 盛，脚z 基因敲除鼠的体重是正常鼠的2 3 倍。m c p h e r r o n 和l e e ( m c p h e r r o n 等， 1 9 9 7 ) 又以小鼠m s t n c - 端保守序列为探针筛选不同物种的骨骼肌c d n a 文库，克 隆了大鼠、人、猪、牛、绵羊，鸡、火鸡、狒狒和斑马鱼的m s t n 基因。m s i n 非 常保守，都有一个信号肽和一个r x x r 蛋白水解加工位点。就d 端而言，小鼠、 大鼠、人、猪、鸡、火鸡同源性为1 0 0 ，狒狒、牛、绵羊仅有卜3 个氨基酸不同， 斑马鱼与上述其他动物的同源性为8 8 。随后，比利时蓝牛( b e l g i a nb l u e ) 和 p i c d m o n t c s c 牛m s t n 基因的自然缺失与变异被发现，确证m s t n 的突变是造成这 两种牛的双肌臀性状的主要原因( g r o b e t 等，1 9 9 7 ；k a m b a d u r 等，1 9 9 7 ；m c p h e r r o n 和l e e ，1 9 9 7 ) 。在m s t n 基因的第三外显子，比利时蓝牛因1 1 - b p 的缺失而产生移 码框移位突变，移位结果实际上导致分子活性部位成熟肽的缺失，p i e d m o n t c s e 牛发 生了错义突变，在第三外显子部位一个酪氨酸取代了保守的半胱氨酸，突变的结果 导致m s t n 基因活性消失，使肌肉增生。 鱼类埘删饷研究已有许多。目前，已经在多种鱼类克隆得到腻蹴因，包括 斑马鱼( d a n i or e r i o ) ( a m a f i 等，2 0 0 4 ) 、溪红点鲑( s a l v e l i n u s f o n t i n a l i s ) ( r o b e r t s 和g o e t z 。2 0 0 1 ：r o b e r t s 等，2 0 0 3 ) 、虹鳟鱼( o n c o r h y n c h u s m y k i s s ) ( r e s c a n 等，2 0 0 1 ) 、 银大马哈鱼( o n c o r h y n c h u s k i s u t c h ) ( r o b e r t s 和g o e t z ，2 0 0 1 ：r o b e r t s 等，2 0 0 3 ) 、 大马哈鱼( s a t , n os a 缸r ) ( o s t b y e 等，2 0 0 1 ) 、金头鲷( s e a r u sa u r a t a ) ( m a c c a t r o z z o 等，2 0 0 1 ) 、罗非鱼( o r e o c h r o m i s m o s s a m b i c u s ) ( r o d g e r s 等，2 0 0 1 ) 、白鲈( m o r o n e c h r y s o p s ) ( r o d g e r s 等，2 0 0 1 ) 、斑点叉尾鲴( j c t a l u r u s p 肼c 缸觚) ( k o c a b a s 等，2 0 0 2 ) 、 条纹石鲳( m o r o n es a x a a l i s ) ( r o d g e r s 和w e b e r ，2 0 0 1 ) 、白石箱( m o r o n e a m e r i c a n a ) ( r o d g e r s 和w e b e r ，2 0 0 1 ) ，石首鱼( u m b a n ac i r r o s a ) ( m a c c a t r o z z o 等，2 0 0 2 ) 长 鳍叉尾鲴( t c t a u r u s f u r c a t u s ) ( g r e g o r y 等，2 0 0 4 ) 、白叉尾鲴( a m a u m , c a t i s ) 4 ( g r e g o r y 等，2 0 0 4 ) 和大鱼( p s e u d o s c i a e n ac r o c e a ) ( x u e 等，2 0 0 6 ) 等鱼类中 克隆得到腻嗍因，一些鱼类如鲑鳟鱼类在系统发生过程中，有基因重复发生， 其脚孙隋两个异构体。与其他动物类似，所有的鱼类m s t n 氨基酸序列都有信号肽 序列、保守的半胱氨酸残基和r x x r 蛋白水解位点等特征。 1 3 2m s t n 的时空表达特征 研究表明哺乳动物中m 呲要在骨骼肌中表达，而鱼类尬，z 产物在身体中的 分布比哺乳动物施蹴体内的分布广泛，除了在骨骼肌表达以外，还可以在多个 组织中表达。在胚胎发育过程中，a m a l i 等发现斑马鱼_ m s t n 的表达是母源性的，从 卜细胞就开始表达。在斑马鱼中，m s t n 的表达不仅仅局限于骨骼肌，它在所有检 测的组织中均有表达，如肝、心、胃、鳃、卵巢、精巢、肾、肌肉、眼和脑( a m a l i 等，2 0 0 3 ) 。v i a n e l l o 等也发现斑马鱼的聪s 掰转录子在1 一细胞中就出现，受精后8 小 时降低；在受精后1 6 j , 时，m 燃平再次增加，显示肌肉细胞分化的开始而由胚 胎转录。受精后2 4 - b 时，当体节发生几乎完成的时候，m s t n m r n a 轻微的降低。 在孵化开始和结束后，在典型的慢速生长鱼- 4 , 鱼的限制性肌肉增生生长期，m s t n 水平又一次增高，在成鱼，肌肉中m s t n 的m r n a 和蛋白质水平最高( v i a n e l l o 等， 2 0 0 3 ) 。斑点叉尾e l m s t n 在受精后第一天的胚胎中就开始表达( k o c a b a s 等，2 0 0 2 ) 。 在金头鲷稚鱼( 1 a r v a l ) 发育过程中，强烈的免疫活性可以在皮肤、脑、肌肉、咽、 鳃、胰和肝中检铡到。从变形开始，可以在食管、胃上皮的顶部、肠上皮和肾小管 中检测到( r i o s 和c a m e i r o ，2 0 0 2 ) 。各个组织及发育过程中的m 蹶达情况说明： 鱼类与哺乳动物的腻蹦比，有与哺乳动物不同的分布、表达方式；可能也有不 同的功能，除抑制肌肉生长外，还可能有其他的功能如影响神经系统等的发育。 1 3 3m 卵n 的作用与表达的调节 m s t n 作为肌肉生长发育的负调节因子，其主要功能是抑制肌肉的生长，例如， 长期使用m s i n 处理导致鸡肢翼肌肉的发育不良( 杨威等，2 0 0 3 ) 。给小鼠注射m s t n 抗体可以增加骨骼肌量并增加握力( w h i t t e m o r e 等，2 0 0 3 ) 。而过量表达l v l s t n 的转 基因小鼠表现为性别特异的肌肉量的降低( r i o s 和c a m e i r o ，2 0 0 2 ) ；但也有证据显 示m s t n 的过表达不会引起肌肉的减少( w e h l i n g 等，2 0 0 0 ) 。郴孤内央失除了影响骨 骼肌发育外，还对脂肪沉积起抑制作用。a l e x a n d r a 等实验证明，m 蹴因突变纯 合体小鼠相比较于对照组平均体脂肪减少( a l e x a n d r a 和m c p h e r r o n ，2 0 0 2 ) 。 鱼类m s t n 可以在包括肌肉的许多组织中表达，但其主要功能与哺乳动物 m s t n 类似，在生肌过程和肌肉生长中起重要的抑制作用。m s t n 前体域( p r o d o m a i n ) 5 硕士擘位论文 m a s t e r sn i e s i s 在骨骼肌中为m s l ：n 的主要负调控因子，m s t n 前肤与m s l n 结合，抑制m s l n 的活 性。在斑马鱼胚胎发育过程中，用肌肉特异启动子驱动m s t n 前体域在转基因鱼中 过表达，转基因鱼骨骼肌肌纤维数目增加( x u 等，2 0 0 3 ) 。在斑马鱼的胚胎发育过 程中，当m s t n 的表达被反义酗j m o r p h o l i n o s 降低后，在受精后2 0 h 、第1 8 阶段，处 理和对照胚胎表型有明显差异，m o r p h o l i n o s 处理的胚胎体型大、生长快速( a m a l i 等，2 0 0 3 ) 。采用r n a i 途径，给斑马鱼受精卵注射m s t nc 末端d s r n a , 也能导致 斑马鱼早期胚胎的增生或肥大( a c o s t a 等，2 0 0 5 ) 。 环境、食物及激素等多种因素都可能影响m s t n 的表达。在长期过度拥挤环境 的压力下，鱼的生长受到抑制，同时成年鱼肌肉中的m s t nm r n a 水平也降低。 r o d g e r s 等对罗非鱼成鱼禁食后表明骨骼肌m s t nm r n a 表达水平无明显变化；相 反，幼鲍s t nm r n 水平在短期禁食后有所上升，而长期的禁食造成m s t n 水平 持续降低( r o d g e r s 等，2 0 0 3 ) ，同时发现可的松水平随着m s i n 水平的降低而升高； 给予可的松，m s t n 水平又以时间依赖的方式降低，表明可的松变化与m s t n 负相 关。斑点叉尾鲴的研究也得出同样结论，外源糖皮质激素处理后1 2 1 1 ，m s t n 的表达 下降( w e b e r 等，2 0 0 5 ) 。但b i g a 等对虹鳟进行生长激素处理后，处理鲰s t n lm r n a 水平与可的松水平正相关，m s t i v ：2m 】卧i a 才( 平与可的松水平无统计相关( b i g a 等， 2 0 0 4 ) 。生长激素( g h ) 有促进动物生长包括肌肉生长的作用。在溪红点鲑的卵巢型 m s t n ( o f 埘珊 z 钌】) 转录起始点的上游已发现了生长激素细胞特异顺序 ( g r o w t hh o r m o n ec e l l s p e c i f i ce l e m e n t , g h - c s e 2 ) ，表明g h 在删的表达中可能 也有调节作用。g h 处理对虹鳟不同腻钮异构体的影响有差异；m s t n lm r n a 水平 在处理后无显著变化，而磁跚v 2 加r n a 水平在处理后下降( b i g a 等，2 0 0 4 ) 。转g h 基因大麻哈鱼白肌组织也具有较高的m s t n 前体水平( r o t , e m 等。2 0 0 4 ) 。有研究表明， 小鼠m 咖被糖皮质激素正调节，m s t n 水平随糖皮质激素的增加而增高。在小鼠 郴硎转录启动位点上有一个糖皮质激素响应因子( g l u c o c o r t i e o i dr e s p o n s ee l e m e n t ， g r e ) ，糖皮质激素通过腻动子的g r e 促进腻蹴因的表达；在溪红点鲑的 脑一肌型b r am s t n 似s z a 仞的转录启动位点上游也发现一个类似的g r e ，可能糖皮 质激素对鱼类m s t n 的表达调节有类似机制( b i g a 等，2 0 0 4 ) 。糖皮质激素对鱼类 腻船表达的调节尚有歧义，还需进一步研究，以阐明糖皮质激素的调节作用。 1 3 4m s t n 基因的作用机理 m s t n 通过下调p a x - 3 ，m y f - 5 和m y o d 在成肌细胞里的表达而抑制肌肉的分化， m s t n 作为t g f - i ；家族成员，其作用通过与质膜上的转膜受体蛋白结合后，启动下 6 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 游的反应。其受体有i 和型。小鼠中的研究发现m s l n 在体内的行为是一种自分泌 方式( r i o s 等，2 0 0 4 ) 外源m s t n ( 重组m s t n 蛋白) 加入到成肌细胞培养液中， 不能诱导报告载体的表达；但过量表达的m s t n 能够引起报告载体的表达。r i o s 等 发现m s t n 过度表达，通过下调m y o d 、m y o g e n i n 的m r n a 水平和下游的肌酸激酶 ( m c k ) 的活性，可逆的抑制生肌的过程；而降低m s t n 的表达水平，则得出相反的 结果( r i o s 和c a m e i r o ，2 0 0 2 ) 。