（无机化学专业论文）烟草多酚氧化酶的分离纯化光谱性质反应机理和应用研究.pdf

摘要 多酚氧化酶是从真菌到哺乳动物广泛存在的一类铜蛋白，它们的共同特征 是能通过分子氧氧化多酚到醌。烟草中的多酚氧化酶在烟草的烘烤过程中起相 当大的作用，它可使多酚类物质氧化并生成与烟叶颜色和香味有关的物质。烟 草多酚氧化酶同时在植物的抗病虫害方面有重要的作用。所以烟草多酚氧化酶 对烟草行业来说是非常重要的一类蛋白酶。由于烟草中色素的干扰，烟草多酚 氧化酶系统的分离纯化至今没有报道过。我们首次从烟草中系统地分离纯化了 烟草中的多酚氧化酶，得到它们两种纯的同工酶，分别被命名为p p oi 和p p o i i 。 本文对他们 面进行了系 第一章 质，催化反应机理和潜在应用等方 结构特征，催化反应机理等方面进 行了较为系统的综述。 第二章通过丙酮干粉，硫酸铵分级沉淀，d e a e s e p h a d e xa 一5 0 c m s e p h a d e xc 一5 0 ，s e p h a d e xg - 7 5 柱分离，首次从烟草中分离纯化出p p oi 和p p o i i ，通过s d s p a g e ，p a g e 电泳，实验证明p p oi 和p p oi i 已经达到很高的纯 度。 第三章本章主要讨论了p p oi 和p p oi i 的酶学性质以及光谱学性质。通 过实验发现，p p oi 是具有与蘑菇p p o 相似的活性中心，而p p oi i 的活性中心 结构是未报道过的一种新结构。 第四章本章提出了烟草p p oi i 种新的催化氧化机理。主要有三点：一 是h y d r o g e ns u p e r o x i d e 与二铜反应形成h y d r o g e ns u p e r o x i d ep - 1 ，1 化合物；二是 同位素的取代氢相连键的断裂过程是氧分子催化还原速度的决定步骤；三是0 d i p h e n o l 到d q u i n o n e 的氧化过程应分为两步，分别是从d d i p h e n o l 到s e m i q u i n o n e 和从s e m i q u i n o n e 到q u i n o n e 的过程。p p oi i 具有抗菌的主要原因也可 能是由于p p oi i 能催化还原分子氧到超氧的过程，而超氧负离子具有抗菌的作 用。 第五章本章研究归纳为三点：a z i d e 能够作为p p oi i 的激活剂；a z i d e 与 p p oi i 结合后由于a z i d e 的推电子作用，可能使p p oi i 的活性中心从c u o ，c u 形成c u 0 2 2 - c u 的中心结构：a z i d e 对p p oi i 的激活作用可能是a z i d e 诱导产生 了c u 0 2 2 - c u ，其中0 2 ”是真正的激活剂。 第六章实验表明s d s 在底物溶液中时，增加了氧反应液中的氧的的浓度， 导致p p o 的活性增强：当p p o 和s d s 形成复合物后，其构象的改变是造成活 性增强的主要原因。 第七章通过f t i r 和c d 的方法研究了p p oi i 在不同条件下的二级结构， 发现p p oi i 的二级结构在低p h 的条件下有一定的稳定性，而在高的p h 条件 下，p p oi i 的二级结构有很大的变化，d h e l i x 几乎完全消失。但是在p h 低和 高的条件下，p p oi i 的活性中心都发生了变化。在低的p h 条件下，活性中心 的酚羟基桥联变为两分子的水分别与两个铜相配位。而在高的p h 条件下，活 性中心的酚羟基桥联被打破，而一分子的羟基取代酚羟基与断裂的那个铜配位。 第八章阐述了p p 0i i 能催化还原分子氧到超氧负离子，而不是直接催化 分子氧到过氧或水的过程。在p p 0i i n a f i o i l 电极上有大约3 3 0m v 过电位的降 低和强的峰电流的增加，峰电流和氧电极的线性关 况明p p 0i i n a f i o n 电极可以作为氧的生物传感器 a b s t r a c t p o l y p h e n o lo x i d a s e s ( p p o s ) a v et h ec o p p e rp r o t e i n sd i s t r i b u t e dw i d e l yf r o m b a c t e r i at om a m m a l si nt h ew h o l ep h y l o g e n e t i cp r o c e s s ( 1 ) t h e yc a nc a t a l y z et h e o x i d a t i o nf r o mt h e h y d r o x y p h e n o l s t o q u i n o n e d e r i v a t i v e s ，a n d t h e nt ob e p o l y m e r i z e ds p o n t a n e o u s l y p o l y p h e n o lo x i d a s ef r o m t o b a c c op l a y si m p o r t a n tr o l ei n t h er o a s t i n ga n da g i n gp r o c e s so ft o b a c c ol e a v e s ，w h i c hc a nc a t a l y t i c a l l yo x i d i z e p o l y p h e n o lt of o r mc o m p l e xa f f e c t i n gt o b a c c os h r e d sc o l o ra n dt a s t e ，a l s op l a y s a k e y r o l ei nt o b a c c op l a n td e f e n s es y s t e m p p oi sv e r yi m p o r t a n te n z y m ei nt h et o b a c c o i n d u s t r y u pt on o w , n or e p o r t so n t h ep u r i f i c a t i o no f p o y p h e n o lo x i d a s ef r o mt o b a c c o l e a v e sh a sb e e nf o u n db e c a u s et h ed i s t u r b a n c eo fp o l y p h e n o l so nt h es y s t e m a t i c p u r i f i c a t i o no fp p o i nt o b a c c ol e a v e s i nt h i st h e s i s ，i ti st h ef i r s tt i m ef o rp o l y p h e n o l o x i d a s e st ob e s y s t e m i c a l l yp u r i f i e d f r o mf r e s h l e a v e s ，m e a n w h i l e t h e i rt w o i s o e m z y m e s a r eo b t a i n e da n dn a m e da sp p oia n dp p oi i r e s p e c t i v e l y t h e p u r i f i c a t i o n ，b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r s ，c a t a l y s i sm e c h a n i s ma n dp o s s i b l ea p p l i c a t i o no f p p oia n dp p oi ia r es t u d i e di nt h i sw o r k ，i nw h i c h e i g h tp a r t sa r ei n c l u d e d 1 ar e v i e wo nt h ec l a s s i f i c a t i o n ，t h es t r u c t u r ea n dr e a c t i o nm e c h a n i s me ta l f o r p p oh a v eb e e ni n t r o d u c e d 2 p p oia n dp p oi ih a v eb e e np u r i f i e df r o mt o b a c c o ( n i c o t i a n at o b a c u m ) b y u s i n g a c e t o n ep o w d e r ，a m m o n i u ms u l f a t e p r e c i p i t a t i o n a n dc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yo n d e a e s e p h a d e xa 一5 0 ，s e p h a d e xg - 7 5a n dc m s e p h a d e xc 一5 0 t h e i rp a g ea n d s d s p a g ea r e s i n g l eb a n d sf o r b o t ho fp p oia n dp p oi i 3 t h e e n z y m ep r o p e r t i e sa n ds p e c t r a lc h a r a c t e r so fp p o ia n dp p oi ia r ed i s c u s s e d i nt h i s p a r t p p o ih a st h es i m i l a ra c t i v es i t ea sm u s h r o o mp p o ，w h i l ean o v e l s t r u c t u r ef o rp p oi ia c t i v es i t ei sn o t r e p o r t e db e f o r e 4t h e c a t a l y s i s m e c h a n i s mo fd - d i p h e n o lo x i d a s e r e p o r t e d b e f o r ei st h a tt h e e n z y m ec a t a l y t i c a l l yr e d u c e sm o l e c u l a ro x y g e nt op e r o x i d et of o r mp e r o x i d e d i c o p p e r a c t i v es i t ea n dn op r o t o nt a k e sp a r ti nt h i s p r o c e s s i nt h i sw o r k ，an e wc a t a l y s i s m e c h a n i s mo fd d i p h e n o lo x i d a s ei sp r o p o s e db yo u rs t u d y i n gp p o i i ( p o l y p h e n o l o x i d a s ei i ) s e p a r a t e df r o mn i c o t i a n at o b a c u m i nt h i sm e c h a n i s m ，a p r o t o nt a k e sp a r t i nt h ec a t a l y t i cr e a c t i o np r o c e s s ，t h eb o n dt ot h ei s o t o p i c a l l ys u b s t i t u t e dh y d r o g e n a t o mi sb r o k e ni nt h er a t ed e t e r m i n i n gs t e pf r o mt h ep e a kp o t e n t i a ld e p e n d e n to np h a n dt h e i s o t o p ee f f e c t ( k h k o = 6 ) ，am o l e c u l a ro x y g e ni sc a t a l y t i c a l l y r e d u c e dt o h y d r o g e ns u p e r o x i d ea n i o na n dt h eo x i d a t i o no fc a t e c h o l c a l lb es e p a r a t e dt ot w o s t e p s ，fe f r o mc a t e c h o lt os e m i q u i n o n ea n dt h e nt oq u i n o n e t h i sm e c h a n i s mc a n e x p l a i nw e l l t h ep h e n o m e n o nt h a tp p oi ic a ni n h i b i tt h ec u l t u r eo fec o l i a n da c t sa s ak e yd e f e n s er o l ei np l a n td e f e n s es y s t e m 5a z i d ea l w a y sa c t sa sa ni n h i b i t o rf o rm e t a l e n z y m e se s p e c i a l l y f o r c o p p e r p r o t e i n s ，h o w e v e rt h ew o r ki nt h i sp a r te x h i b i t st h a ta z i d ec a n a c ta sa na c t i v a t o rf o r p p oi i c a t a l y s i so f t h eo x i d a t i o ne x c e p to ft h ee f f e c ta sa ni n h i b i t o r f r o mt h es q u a r e w a v ev o l t a m m e t r yo fn a t i v ep p oi i ，p e r o x i d ep p o1 i c o m p l e xa n da z i d ep p oi i c o m p l e x a n dt h ep e r o x i d ea c t i v a t i n gp p o 1 i ，i tc a nb ek n o w nt h a tt h eb i n d i n go fa z i d e t op p oi ii n d u c e st h ef o r m a t i o no fc u 0 2 2 - c ui nt h ea c t i v es i t eo fp p oi i t h r o u g h c u 0 2 。c ui nn a t i v ep p oi i t h eo r i g i no f a z i d ea sa na c t i v a t o rc a nb er e g a r d e da sa z i d e c o m p l e x a t i o nw i t hp p oi i ，a n dt h e nt h ef o r m a t i o no fc u 0 2 2 c u ，w h i c hi st h ea c t i v e s i t eo f p e r o x i d ep p o i ic o m p l e xw h e n p e r o x i d ep l a y st h er o l eo f a c t i v a t i o n 6 t h eo x y g e nc o n c e n t r a t i o ni nt h es o l u t i o ni n c r e a s e sw h e ns d se x i s t si nt h e s u b s t r a t es o l u t i o n ，w h i c hi n c r e a s e sp p o1 1 a c t i v i t yf r o mt h ee x p e r i m e n t a ld a t a w h e n p p oi ia n ds d sf o r m sc o m p l e x ，t h ec o n f o r m a t i o n a lc h a n g e so ft h ee n z y m e m a yp l a y t h em a i nr o l ef o rt h ei n c r e a s eo ft h ea c t i v i t yo fp p o1 1 7 f r o mt h e a n a l y s i s o ff t i r s p e c t r a ，f o u r i e rs e l f - d e c o n v o l u t i o n s p e c t r a a n d s e c o n d d e r i v a t i v es p e c t r ao fp p oi ia td i f f e r e n tp ha n d p e r o x i d e p p oi ia d d u c t ，t h e s e c o n d a r ys t r u c t u r ef r a c t i o n sa r ea n a l y z e d p p oi ia tl o wp h ( p h = 3 0 ) a n dp e r o x i d e - p p 0i ia d d u c ta l m o s tk e e pt h es a m es e c o n d a r ys t r u c t u r ea st h en a t i v ep p oi lt h e p e r c e n t a g e so f - t u r n a n dr a n d o mc o i li n c r e a s er a p i d l ya n dt h ep e r c e n t a g e so f 0 【一h e l i x a n da n t i p a r a l l e lp - s h e e td e c r e a s er a p i d l ya th i g hp h ( p h = 1 0 0 ) c o m p a r i n gw i t ht h a t o fn a t i v ep p oi i a l lt h e s er e s u l t sc a nb e p r o v e db yt h es e c o n d a r ys t r u c t u r e c a l c u l a t i o n so fc i r c u l a rd i c h r o i s m s p e c t r a i nd i f f e r e n ts t a t e s a tl o w p h ，t h e c o o r d i n a t i o na b i l i t yo fp h e n o l a t e b x y g e nb e c o m e sw e a ka n dt w oh 2 0m o l e c u l a r r e p l a c e st h ep h e n o l a t eo x y g e nb r i d g ei nt h ea c t i v ec e n t e ra n dt h ea b s o r p t i o no f p p oi i 4 i sc h a n g e dt oan o v e ls t a t ea st h a to f m u s h r o o mp p o w h e nan e wp p o i ia c t i v es i t e i sf o r m e db e t w e e np h8 5a n d9 0s u d d e n l nt h ep h e n o l a t eo x y g e nb r i d g eh a sb e e n b r o k e na n dt h eh y d r o x i d ec o o r d i n m i o nw i t ho n eo fc o p p e r sh a sb e e na l s of o r m e d ， w h i l et h eo t h e rc o p p e ri ss t i l lc o o r d i n a t e dw i t ht h ep h e n o l a t eo x y g e n t h ec d d a t a s h o w sa tt h ep h3 0a n dp h9 0t h es e c o n d a r ys t r u c t u r ek e e p ss t a b i l ea st h er e s t i n g p p oi ia n di sb r o k e na th i g hp h1 0 0 8 p o l y p h e n o lo x i d a s ei i ( p p oi i ，e c1 1 0 3 1 ) i sa n o v e le n z y m ep u r i f i e df r o m n i c o t i a n at o b a c u m ，w h i c ha c t s a sa k e y r o l ei n p l a n t d e f e n s e s y s t e m t h e e l e c t r o c a t a l y t i c m e c h a n i s mr e s e a r c ho ft h i se n z y m e ，w o r k e do u tb yu s i n gc y c l i c s q u a r e - w a v ev o l t a m m e t r y ，t h ea b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y a n de l e c t r o n p a r a r n a g n e t i c r e s o n a n c e ( e p r ) e x p e r i m e n t ，i n d i c a t e s t h a tp p oi ir e d u c e sm o l e c u l a ro x y g e nt o h y d r o g e ns u p e r o x i d e a d e c r e a s ea b o u t3 3 0m vi no v e r p o t e n t i a la n das t r o n g e n h a n c e m e n to fe l e c t r o n t r a n s f e r r e a c t i v i t y o fp p oi ic a nb e o b s e r v e di n c y c l i c v o l t a m m o g r a m ，w h i c h i n d i c a t et h a tt h ed i r e c t e l e c t r o c h e m i s t r y o fp p oi ii s a c c o r d i n g l yf e a s i b l e t a k i n g t h ea d v a n t a g e so ft h ed i r e c te l e c t r o n t r a n s f e rr e a c t i v i t yo f p p o1 1a n di t s s p e c i f i ce n z y m a t i cc a t a l y s i s f r o mm o l e c u l a ro x y g e nt oh y d r o g e n s u p e r o x i d ei n t e r m e d i a t e ，a na m p e r o m e t r i co x y g e n b i o s e n s o ri sc o n s t r u c t e d t h e d i f f u s i o nc o e f f i c i e n t ( d ) o f o x y g e ni sa l s od e t e c t e da s3 1 1 0 9m 2 s t e m p e r a t u r e ，p h s a l tc o n c e n t r a t i o na n dt h eb i o s e n s o rs t o r a g es t a b i l i t ya r ea l s os t u d i e dt oe v a l u a t ei t s q u a l i t y 5 中国科学技术大学博士学位论文 第一章多酚氧化酶的研究概况和进展 1 1 多酚氧化酶概述 多酚氧化酶是一类从真菌到哺乳动物广泛存在的一类铜蛋白 1 。它们的共 同特征是通过分子氧氧化多酚到醌的过程【2 】。根据国际酶学委员会的分类，有 以下三种蛋白具有多酚氧化酶的活性：儿茶酚酶或邻二酚类氧化酶( c a t e c h o l o x i d a s eo rd d i p h e n o l ：o x y g e n o x i d o r e d u c t a s e ，e c 1 1 0 3 1 ) ；漆酶或对二酚类氧化 酶( l a c c a s eo r p d i p h e n o l ：o x y g e n o x i d o r e d u c t a s e ，e c 1 1 0 3 2 ) ；甲苯酚酶或单酚 氧化酶( c r e s o l a s eo rm o n o p h e n o lm o n o o x y g e n a s e ，e c 1 1 8 1 4 1 ) 。 儿茶酚酶是黑素合成( m e l a n i ns y n t h e s i s ) 的主要酶，能催化氧化众多的邻二 酚类物质到它们的邻二醌的反应。在其活性中一i i , 有一对磁偶合的铜离子( 三型 铜) 。这类酶也显示单酚氧化酶的活性，它们能羟基化单酚到邻二酚 4 1 1 5 6 。 邻二酚类氧化酶和单酚氧化酶的中心结构基本上相似，其不同的是底物的不同。 一般在植物中邻二酚类习惯被称为儿茶酚酶，而在真菌，细菌，动物中被称为酪 氨酸酶。在高等动物和人类中酪氨酸酶的活性高低与黑色素的形成的速率有关， 缺乏此酶的活性将引起白化病。植物中的苹果，马铃薯，茶叶，荔枝果皮，蘑 菇，烟草叶片中都含有多酚氧化酶。它是水果，蔬菜采收后变色的主要原因。 漆酶含有一型，二型和三型四个铜离子，是一类结构较特殊的铜蛋白。其中一 型铜能通过6 0 0n n l 左右的电荷转移跃迁来辨认，而二型铜没有明显的特征，三 型铜在近紫外区有明显的吸收，并且没有铜的顺磁信号 2 7 。在植物中，主要 在叶绿体的类囊体膜上存在【8 9 儿1 0 】。但它不是一种能通过超声处理，较温和 的去垢剂处理，或蛋白酶从类囊体中释放出来的内在的膜蛋白 n 】。但从不同 的蔬菜的组织匀浆里也发现了这种特征的蛋白 1 2 1 3 1 4 】。 1 2 多酚氧化酶的分离纯化及活性研究 由于多酚氧化酶的主要作用是酶的棕色化反应而导致水果，蔬菜等的变昧， 以及营养物质的丧失，所以倍受植物，营养和生化学家的关注。在多酚氧化酶 的分离纯化工作中，主要也大量集中在水果，蔬菜等物质中。f a r i dk a d e r 从 h i g h b u s hb l u e b e r r yf r u i t ( v a c c i n i u mc o r y m b s u ml ) 中分离纯化出两种多酚氧化酶 中国科学技术大学博士学位论文 同工酶的混合蛋白 1 5 】，其最佳活力在p h = 4 0 。底物选择性表明咖啡酸是其最 佳底物，底物特异性研究表明b l u e b e r r y 多酚氧化酶属于儿茶酚酶。c h a n g k u i d i n 2 从l o q u a t 分离纯化出一种多酚氧化酶，其分子量为5 8 0 0 0d a ，最适p h 和 最适温度分别为4 5 和3 0 。c ，底物特异性研究表明l o q u a t 多酚氧化酶属于儿茶 酚酶 1 6 1 。o k t a ya r s l a n 从m a l a t y aa p r i c o t ( p r u n u s a r m e n i a c al ) 部分分离纯化 出一种多酚氧化酶，最适p h 和最适温度分别为8 5 和4 0 。c ，其最适的底物也 是儿茶酚 1 7 】。y e l e n ag s h e p t o v i t s k y 等的研究显示菠菜光学系统i i ( p h o t o s y s t e m i i ) 膜有多酚氧化酶的活性，通过凝胶过滤，离子交换柱分离出一种多酚氧化 酶4 8k d a 邻二酚酶( p o l y p h e n o lo x i d a s e ) ，并指出4 8k d a 的邻二酚酶可能是7 2 k d a 的蛋白脱去亚基而来的0 8 。邻二酚酶的最适p h 为8 0 左右，通过加热处 理可能激活其活性，其最适底物( k 。值最小) 为d o p a m i n e ，菠菜类囊体中的 多酚氧化酶分子量为4 2 5k d a ，具有潜在的多酚氧化酶活性，通过c ，。脂肪酸或 陈化处理( a g i n g ) 可激活其活性。它的最适p h 值为7 0 8 0 。最适底物为d o p a m i n e 1 9 。从m a m m a l i a nm e l a n o c y t e s 中分离出两种酪氨酸酶，其最适底物为l - d o p a ( 3 , 4 一d i h y d r o x y l l p h e n y l a l a n i n e ) 和l - t y r o s i n e 2 0 。p p o 的分离纯化有很多的报 道，这不一一列举，表1 1 显示了部分不同来源的多酚氧化酶及其一些性质。 由于多酚氧化酶在食品工业，环境保护方面和人类健康的应用前景，对多 酚氧化酶的活性研究有大量的文献报道，尤其集中在不同介质中多酚氧化酶的 活性表现，多酚氧化酶的抑制剂，激活剂等方面。s t e p h a n i egb u r t o n 研究了蘑 菇多酚氧化酶在有机介质c h c i ，中的活性影响，并讨论了其动力学常数等性质 【2 4 。有文献报道在三氯甲烷，甲苯，戊基乙酸，异丙基醚，乙醚等有机介质 中的酪氨酸酶的活性的影响【2 s 。通过反相微泡模拟细胞膜来研究多酚氧化酶 在此环境中酶学活力也有文献报道 2 6 2 7 1 。对激活剂，抑制剂的研究是多酚氧 化酶应用的前提，所以文献也较多。蘑菇多酚氧化酶被蘑菇中分离出的伞精氨 酸所抑$ 1 1 1 2 8 】。s o j om m 等研究了环糊精对b a n a n ap u l p 多酚氧化酶的激活和 抑制作用，并对其抑制和激活机理进行了详细的讨论 2 7 1 。茴香醛( 对甲氧基 苯甲醛) 对蘑菇多酚氧化酶也有很好的抑制作用 3 0 】，其i d 。为4 3u g m l 。抗坏 血酸，柠檬酸，亚硫酸钠对多酚氧化酶也有很好的抑制作用 3 1 】。通过研究蘑 菇多酚氧化酶的活性和温度，压力的影响，发现其活性对温度较敏感，而对压 2 中国科学技术大学博士学位论文 力并不敏感。大于5 0 。c 时蘑菇多酚氧化酶活性基本失去，而大于6k b a r 的压 力条件下酶仍有很高的活性 3 2 】。 表1 1 ：部分不同来源的多酚氧化酶及部分性质 来源分子量 最适p h 最适温度最适底物文献出 ( k d a )( o c )处 b l u e b e r r y 4 0 咖啡酸 1 5 l o q u a t 5 84 53 0 儿茶酚 1 6 】 m a l a t y aa p r i c o t 8 54 0 儿茶酚 1 7 s p i n a c h p si i4 88 o d o p a m i n e 1 8 s p i n a c h 类囊体 4 2 57 o 8 o d o p a m i n e 1 9 】 m a m m a l i a nl 。d o p a 【2 0 】 m e l a n o c y t e sl t y r o s i n e i c e b e r gl e t t u c e 5 o m o n p h e n o 2 1 】 la c t i v i t y 烟草 7 o3 5 2 2 l y c o p u s 3 9 86 ，5 7 5c a t e c h o l ( 2 3 e u r o p a e u s p o p u l u sn i g r a 5 6 0 58 0 c a t e c h o l 【2 3 】 烟草 3 5 7 57 04 0c a t e c h o lt h i s 3 5 6 36 54 0c a t e c h o lw o r k 1 3 多酚氧化酶在植物生理中的作用 植物有广泛和有效的抵御病原体和害虫的防御系统 3 3 】。防御系统的第一层 包含一些能抑制多数病原和害虫的组成因子；防御系统的第二层是在被侵染或 损伤的部位激活以期阻止病原体的扩散。这些在损伤部位的反应包括在植物细 胞壁的完整性被破坏以前快速的细胞壁的交联，一旦入侵的病原体或害虫克服 这些物理的防线。被损伤的细胞周围的细胞会由于过敏反应( h r ，h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e ) 被触发死亡。h r 总是与相关的侵害相连的植物系统本身诱导的一种 中国科学技术大学博士学位论文 防御系统。s a r ( s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t e n c e ) 提供了第三层也是最后一层的植物 对病虫害的防御 3 3 1 1 3 4 4 5 。 多酚氧化酶( e c1 1 4 1 8 1 或e c1 1 0 32 ) 通过分子氧催化酚到醌的氧化，其 间的活性中间体通过l ，4 加成反应和细胞的亲核物质进行共价修饰和交联，同 时这反应的副作用是导致棕色或黑色的斑点的形成，影响水果，蔬菜等的收成 3 5 3 6 。由于多酚氧化酶的催化反应的产物和损伤诱导酶的聚集，多酚氧化酶 被认为承担着抵御病虫害的侵害的重要角色【3 3 】3 4 【3 7 】 3 8 】【3 9 。多酚氧化酶的 活性能被机械损伤，霉菌和真菌感染和用寡糖，乙烯等有机活性无机活性的物 质所诱导产生【3 4 3 8 3 9 4 0 【4 l 】4 2 】。在纵多的l y c o p e r s i c o ns p p 和s o l a n u ms p p 的g l a n d u l a rt r i c h r o m e s 能够通过毛状体的流出物的氧化聚合物捕获较小个体的 害虫 4 3 4 4 。醌的直接毒性以及醌和氨基酸的共价修饰作用作为防御的重要手 段也被提出用来理解多酚氧化酶的防御机t 犟 4 5 1 。系统诱导多酚氧化酶的表达 也可能承担着一个附加的阻止损伤部位受到病原体和害虫的进一步攻击的能力 3 9 。 1 4 已知多酚氧化酶的结构 多酚氧化酶的研究由于其潜在的应用前景而有很多的报道。但多酚氧化酶 的晶体结构至今只有一例报道。e i c h e nc 等解析了从美国甜土豆_ ( s w e e tp o t a t 0 1 中分子量为3 9k d a 单体的儿茶酚酶( c o ) 的晶体结构。其一级结构组成如图 1 1 所示。 1a p i q a p e i s kc v v p p a d l p pg a v v d n c c p pv a s n i v d y k lp a v t t m k v r p g g gs s t tsssss s e es se e e 51a a h t m d k d a ia k f a k a v e l m k a l p a d d p r nf y q q a l v h c a y c n g g y d o v n b g g g h h h hh h h h h h h h h hh s st t t t t sh h h h h h h h h hh h t t bs s 1o1 f p d q e i q v h n s w l f f p f h r w y l y f y e r i l gk l i g d p s f g l p f w n w d n p g g t t s bs ss t h h h h h h h hh h h h h h h h h hh h t ss s b t t t g g g 151m v l p d f l n d s t s s l y d s n r n q s h l p p v v v d l g y n g a d t d v t d q q r i t d n l s bg g g g t tt t t tsst r r 兀v r s bt ts sh h h h h h h h h 2 0 1 a l m y k q m v t n a g l ：a e l f l g ka y ra g d a p s pg a g s i e t s p h 4 中国科学技术大学博士学位论文 i p i h r w v g d p h h h h h h h t t t t 2 5 1r n t n n e d m g n p r k r d y t d s d s s h h h h h t tsh h h h t t hh h h h h h h s f y s a g r d i a fy c h h s n v d r mw t l w q q l a g k t t t t t t t t tt t t g g g t h h hh h h h h h h h h h h h h h h t h h 3 0 1w l n a t f l f y de n g q a v k v r ig d s l d n q k m gy k y a k t p l p wl d s k p h h te e e e et t se e e e e gg g g sh h h h te e e t t 图1 1 儿茶酚酶的一级结构和二级结构 c o 的二级结构主要是由一螺旋组成。酶的活性中心由四股- 螺旋组成( o r 2 ， d 3 ，u 6 j t l c t 7 ) 。组成活性中心的四股a 一螺旋( c t 2 ，a 3 ，0 【6 年1 c t 7 ) 被两股0 【- 螺 旋( a 1 ，仅4 ) 和一些小的p 片断包围，起到调节酶的催化活性中心的作用。其 中有两个二硫键分别是c l l 到c 2 8 和c 2 7 到c 8 9 ( 见图1 2 ，1 3 ) 。活性中心 的两个铜分别与3 个组氨酸的氮配位，c u a 与在0 【2 区的h 8 8 ，和在c c 3 开始段 和中间的h 1 0 9 和h 1 1 8 配位。另一个催化中心的铜离子c u b 与分别来自c c 6 和 图1 2 儿茶酚酶的晶体结构 o 【7 片断的3 个组氨酸h 2 4 0 ，h 2 4 4 和h 2 7 4 配位。c o 的活性中心的一个主要特 征是c 9 2 和c u a 的一个配位残基h 1 0 9 之间的二硫键。除去此二硫舰对结构的 贡献，至今未发现其在化学功能上的作用。在氧化状态下，一分子的水与两个 活性中心的铜的桥联被观测到。加上六个组氨酸的配位，形成4 配位的三角锥 形的配位结构。这个水分子与c u a 的距离是1 9 a ，与c u b 的距离为1 8 a ( 见 图1 3 ) 。还原态的晶体结构显示，两个铜( c u ( i ) ) 的距离为4 4a ，而没有其 中国科学技术大学搏十学位论文 它明显的结构变化被发现。在还原状态下的c u b 的配位结构是平面妇方型的。 对c u a 而言，c u a 与水分子之间的距离为( c u a o ) 2 2a ，其配位构型是变 形的三角锥形结构( 见图1 3 ) 4 6 】。 通过e p r 结果显示，在活性中心的两个铜之间存在“羟基的桥联和两个铜 离子的反铁磁性耦合 4 7 1 。从晶体结构得到c u ( i i ) 的距离2 9a ，与用e x a f s 方 法从l e a r o p a e u