（有机化学专业论文）作为基因载体的阳离子脂质体的设计、合成及其应用研究.pdfVIP

中国科学技术大学博士学位论文 表格目录 表1已知主要的阳离子脂质体 6 表2 溴代正己烷，溴代正辛烷，溴代正癸烷，溴代正十二烷，溴代正十四烷， 溴代正十六烷，溴代正十八烷的物理参数4 0 表3 双正己基丙二酸二乙酯，双正辛基丙二酸二乙酯，双正癸基丙二酸二乙酯， 双正十二烷基丙二酸二乙酯，双正十四烷基丙二酸二乙酯，双正十六烷基 丙二酸二乙酯，双正十八烷基丙二酸二乙酯的分析数据4 3 表4 2 , 2 双正己基一1 ，3 一丙二醇，2 ，2 一双正辛基- l ，3 一丙二醇，2 ，2 双正癸基1 ，3 丙 二醇，2 ，2 - 双正十二烷基一1 ，3 一丙二醇，2 ，2 一双正十四烷基一l ，3 丙二醇，2 ，2 双正 十六烷基一1 ，3 丙二醇，2 ，2 一双正十八烷基一l ，3 一丙二醇的分析数据 4 4 表55 ，5 ，双正己基2 ( 2 一溴乙基) 一1 ，3 二氧六环，5 ，5 双正辛基2 ( 2 一溴乙基) 1 ，3 二氧六环，5 ，5 一双正癸基一2 ( 2 一溴乙基) 一1 ，3 二氧六环，5 ，5 一双正十二 烷基2 一( 2 一溴乙基) 一1 ，3 一二氧六环，5 ，5 一双正十四烷基一2 ( 2 - 溴乙基) 1 ，3 一 二氧六环，5 ，5 双正十六烷基一2 ( 2 - 溴乙基) 1 ，3 一二氧六环，5 ，5 双正十八 烷基2 ( 2 溴乙基) 1 ，3 二氧六环的分析数据 4 5 表6 溴化一2 一( 4 ，4 - 双正己基2 ，6 - 二氧六环基) 乙基三甲铵盐，溴化- 2 ( 4 ，4 双 正辛基2 ，6 - 二氧六环基) 乙基三甲铵盐，溴化2 一( 4 ，4 - 双正癸基2 ，6 - 二氧 六环基) 乙基三甲铵盐，溴化2 ( 4 ，4 - 双正十二烷基2 ，6 - 二氧六环基) 乙 基三甲铵盐，溴化一2 一( 4 ，4 - 双正十四烷基一2 ，6 - 二氧六环基) 乙基三甲铵 盐，溴化一2 一( 4 ，4 - 双正十六烷基一2 ，6 - 二氧六环基) 乙基三甲铵盐，溴化一2 一 ( 4 ，4 - 双正十八烷基2 ，6 - 二氧六环基) 乙基三甲铵盐的分析数据 4 6 表72 ( 4 。4 - 双正己基2 ，6 二氧六环基) 乙基三甲铵盐酸盐，2 一( 4 ，4 - 双正辛 基一2 t 6 - 二氧六环基) 乙基三甲铵盐酸盐，2 一( 4 ，4 - 双正癸基一2 ，6 - 二氧六 环基) 乙基三甲铵盐酸盐，2 ( 4 ，4 - 双正十二烷基- 2 ，6 - 二氧六环基) 乙基 三甲铵盐酸盐，2 ( 4 ，4 双正十四烷基，2 ，6 - 二氧六环基) 乙基三甲铵盐酸 盐，2 ( 4 ，4 t 一双正十六烷基一2 ，6 二氧六环基) 乙基三甲铵盐酸盐，2 一( 4 ，4 一 双正十八烷基2 ，6 - 二氧六环基) 乙基三甲铵盐酸盐的分析数据 4 8 表8 所合成部分化合物在b l 6 细胞株中的转染结果 6 7 表9 所合成部分化合物在b l 6 细胞株中的蛋白总量 6 8 中国科学技术大学博士学位论文 表1 0 所合成部分化合物在3 l l 细胞株中的转染结果 表1 l 所合成部分化合物在3 l l 细胞株中的蛋白总量 表1 2 所合成部分化合物在2 9 3 细胞株中的转染结果 表1 3 所合成部分化合物在2 9 3 细胞株中的蛋白总量 表1 4 所合成部分化合物在3 t 3 细胞株中的转染结果 表1 5 所合成部分化合物在3 t 3 细胞株中的蛋白总量 表1 6 所合成部分化合物在h e l a 细胞株中的转染结果 表1 7 所合成部分化合物在h e l a 细胞株中的蛋白总量 v 阳 ” 记 乃 弭 乃 中国科学技术大学博士学位论文 l i s to f f i g u r e s f i g u r e1 t h el e v e lo fl u c i f e r a s eg e n ee x p r e s s i o ni nb l - 6c e l l st r a n s f e c t e dw i t h c a t i o n i cl i p i d s 6 9 f i g u r e2t h e t o t a lp r o t e m r e c o v e r yi nb l 一6c e l l st r a n s f e c t e dw i t hc a t i o n i cl i p i d s 6 9 f i g u r e3t h el e v e lo fl u c i f e r a s eg e n ee x p r e s s i o ni n3 l lc e l l st r a n s f e c t e dw i t h c a t i o n i cl i p i d s 7 0 f i g u r e4 t h et o t a lp r o t e i nr e c o v e r yi n3 l lc e l l st r a n s f e c t e dw i t hc a t i o n i cl i p i d s7 1 f i g u r e5t h e l e v e lo fl u c i f e r a s eg e n ee x p r e s s i o ni n2 9 3c e l l st r a n s f e c t e dw i t h c a t i o n i cl i p i d s7 2 f i g u r e6 t h et o t a lp r o t e i nr e c o v e r yi n2 9 3c e l l st r a n s f e c t e dw i t hc a t i o n i cl i p i d s7 3 f i g u r e7t h e l e v e lo fl u c i f e r a s eg e n ee x p r e s s i o ni n3 t 3c e l l st r a n s f e c t e dw i t h c a t i o n i cl i p i d s7 4 f i g u r e8t h e t o t a lp r o t e m r e c o v e r yi n3 t 3c e l l st r a n s f e c t e dw i t hc a t i o n i cl i p i d s 7 5 f i g u r e9t h e l e v e lo fl u c i f e r a s eg e n ee x p r e s s i o ni nh e l ac e l l st r a n s f e c t e dw i t h c a t i o n i cl i p i d s 7 6 f i g u r e1 0 t h et o t a lp r o t e i nr e c o v e r yi nh e l ac e l l st r a n s f e c t e dw i t hc a t i o n i cl i p i d s 7 7 f i g u r e11 v a r i a t i o no f e m i s s i o ni n t e n s i t yo fc t a bi n d u c e du n c o i l i n go fb s a 8 6 f i g u r e1 2v a r i a t i o n o f e m i s s i o ni n t e n s i t yo f 2 一( 4 ，4 d i h e x a n y l 一，2 ，6 一d i o x a n y l ) e t h y l t r i - m e t h y la n u n o n i u mb r o m i d e ( c o m p o u n d1 ) i n d u c e du n c o i l i n go f b s a8 6 f i g u r e13v a r i a t i o n o fe m i s s i o ni n t e n s i t yo f 2 - ( 4 ，4 d i d e c a n y l 一2 ，6 一d i o x a n y l ) e t h y l t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e ( c o m p o u n d2 ) i n d u c e du n c o i l i n g o fb s a8 7 f i g u r e1 4 v a r i a t i o no f e m i s s i o ni n t e n s i t yo f 2 - ( 4 ，4 d i t e t r a d e c a n y l 一2 ，6 d i o x a n y l ) e t h y l t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e ( c o m p o u n d3 ) i n d u c e du n c o i l i n g o fb s a 8 7 f i g u r e1 5s c h e m a t i cp r e s e n t a t i o n o f s d si n d u c e d u n c o i l i n go f b s a 8 9 f i g u r e1 6s c h e m a t i cp r e s e n t a t i o n o fc a t i o n i cl i p o s o m ec o m p l e x e dw i t hu n c o i l i n g b s a 9 0 中国科学技术大学博士学位论文 中文摘要 论文由阳离子脂质体作为基因载体研究进展的综述和另外三部分研究工作 组成。 综述部分概述了自1 9 8 7 年第一例阳离子脂质体作为基因载体以来该领域的 研究进展。 堕童王目勘醛作为基旦勤的设计与金盛：( 1 ) 一系列以双脂肪链为尾， 以缩醛为连接键，不同氨基为头的系列阳离子脂质体的合成：( 2 ) 以胆固醇为 尾，以五元缩酮为连接键，不同氨基为头的系列阳离子脂质体的合成；( 3 ) 以 胆固醇为尾，以碳酸双酯为连接键，核苷为头的系列脂质体的合成。( 其中( 1 ) ( 2 ) 的基本设计思路为：脂肪链与胆固醇易与细胞膜亲合，作为基因载体易于 进入细胞，同时，与d n a 形成的络合物在细胞外( p h = 7 ) 稳定，当进入细胞 后缩酮( 醛) 键在细胞内酸性环境( p h = 2 5 ) 中易分解，释放d n a ，从而有 望提高基因转移效率，降低细胞毒性。( 3 ) 的基本设计思路为：碳酸酯键在体 内有合适的酶分解，不会造成细胞毒性，核菅为头与d n a 可能有很好的亲合 阳离子脂质体作为基因载体的签丛塞坠研究：以胆固醇为尾，以五元缩酮 为连接键的脂质体和以胆固醇为尾，以碳酸双酯为连接键，核苷为头的系列脂 质体作为基因载体的i nv i t r o 实验结果。结果表明胆固醇为尾，以五元缩酮为连 接键的脂质体有很高的胁v i t r o 转染效率，是一类新型的作为基因载体的阳离子 、 脂质体。) 一” 阳离子脂质体与蛋白质的相互作用研究：通过荧光光谱方法对以双脂肪链 为尾，以缩醛为连接键的脂质体与b s a 作用变性进行研究，并根据荧光的变化 反映出双脂肪链为尾的阳离子脂质体与b s a 的相互作用。 中国科学技术大学博士学位论文 a b s t r a c t t h i st h e s i si n c l u d e sf o u rp a r t s ：( 1 ) ar e v i e wd e s c r i b e dt h ep r o g r e s si ns t u d i e so f c a t i o n i cl i p o s o m ea sg e n ev e c t o rs i n c et h ef i r s tr e p o r tb y f e g l n e ri n 19 8 7 ；( 2 ) d e s i g n a n ds y n t h e s e so fn o v e lc a t i o n i cl i p i d sa s g e n ev e c t o r s ；( 3 ) t h es y n t h e s i z e dc a t i o n i c l i p i d su s e di nt h eg e n ed e l i v e r yi nv i t r o ；( 4 ) s t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o n so fc a t i o n i c l i p i d sw i t hb s ab yf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y c o n s i d e r i n gt h ea c i d i ce n v i r o n m e n ti nc e l l s ( p h = 2 5 ) ，t h ek e t a l a c e t a ls h o u l db e e a s yt ob r e a ku pr e s u l t i n gl i t t l et o x i c i t y ，w h i l ei nt h en e u t r a le n v i r o n m e n to u t s i d et h e c e l l s ( p h 2 7 ) ，t h e ys h o u l db es t a b l ea sg e n ev e c t o r ，t h ec a t i o n i cl i p i d sw i t hk e t a lo r a c e t a lb o n d sw e r ed e s i g n e d t h r e ek i n d so fc a t i o n i cl i p i d s ：( i ) w i t ha c e t a la sl i n k e r b o n d ，h y d r o c a r b o nc h a i n a s h y d r o p h o b i ct a i l ，( i i ) w i t h k e t a la sl i n k e rb o n d ， c h o l e s t e r y lg r o u p sa sh y d r o p h o b i ct a i l ，a n d ( i i i ) w i t hn u c l e o s i d ea sh e a d ，c h o l e s t e r y l g r o u p sa sh y d r o p h o b i c t a i lh a v e b e e ns y n t h e s i z e d g e n ed e l i v e r y nv i t r oe x p e r i m e n t sw e r ep e r f o r m e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e c a t i o n i cl i p i d so f c h o l e s t e r y ld e r i v a t i v e sw i t hk e t a la sl i n k e rb o n dw e r ee f f i c i e n ti nt h e t r a n s f e c t i n ga f e wk i n d so fc e l ll i n e s i ti se x p e c t e dt h a tt h e yw o u l db ep o t e n t i a li nt h e g e n et h e r a p ya f t e rf u r t h e rm o d i f i c a t i o n i n t e r a c t i o no fs o m ec a t i o n i c l i p i d s w i t hb s aw a ss t u d i e d b y f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h eb i n d i n go ft h el i p i dm o l e c u l e so c c u r r e da t s p e c i f i c s i t eo ft h ep r o t e i nw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fl i p i d sw a sl o w , h o w e v er a t h i g h e rc o n c e n t r a t i o no f t h el i p i dc o m p o u n d s ，t h eu n c o i l i n g o f b s aw a so b s e r v e d 2 中国科学技术大学博士学位论文 第一章阳离子脂质体用于基因治疗的研究进展 1 1 引言 2 0 世纪9 0 年代以来，世界各国纷纷将人类基因组研究列为国家重大研究项 目，很多人认为这是当代，也可能是整个时代最重要的科学事业【l i 。随着人类基 因组研究的迅速进展，人们对人类生命基因基础的认识将达到一个新的水平。 除此之外，微生物，例如细菌m e t h a n o c o c u sj a r m a s c h i i 和酵母的基因密码现在 己被完全破译，更为复杂的有机体的基因密码也将很快得以阐释f 2 】。所有这些对 基因的新认识给医学研究提供了前所未有的机会，从而迅速推动人类疾病的d n a 诊断及基因治疗研究，导致在将来把基因治疗作为治愈疾病的一种整体策略的 实现吲。人类有十万个基因，基因病有四千多种，基因缺陷是造成2 5 的生理缺 陷，5 0 儿童死亡和6 0 成年人疾病的原因。因此，一旦基因治疗在临床上实 现，将改变医药界的面貌，开创基因作为药物的新纪元，对医药工业产生深远 的影响。 基因治疗的原理是：如果一位病人由于缺少某种已知基因而患病，那么把缺 少的基因通过一种特定的载体输送到病变细胞或组织内，使之表达，有可能会直 接纠正基因缺乏引起的症状，从而达到治愈疾病的目的；如果无法从基因的角度 确定病人的病因，但其病理研究已十分清楚，那么可以利用载体把适当的基因或 某些核酸类药物( 如a n t i s e n s eo l i g o n u c l e o t i d e s 或m r n a ) 输送到病变细胞，通 过其他途径破坏该病的机理。因此，基因治疗可以大致定义为“把基因作为药物 来治疗疾病”或“为达到治疗的目的，通过载体把核酸传送到病体”1 4 】。 基因治疗不能被看作是一项通过对人类基因的永久性控制，使后代免受基因 方匦或其他更为复杂疾病的折磨的技术。其实，基因和其他核酸类药物应该被看 成是小分子药物的替代品，它们一旦进入病体，有可能会真正根治疾病。如果基 因或其它核酸类替代品是“药物”的话 物传送方面的问题相类似的。换句话说 那么基因治疗所面临的首要困难是与药 基因治疗首先要解决如何才能把供治疗 中国科学技术大学博士学位论文 用的基因或核酸高效的传送到特定的病变细胞或组织中去。 把供治疗用的基因或核酸传送到特定的病变细胞或组织中去的过程被称为基 因转移或转染( t r a n s f e c t i o n ) 。基因转移可分为体内法( i nv i v o ) 和体外法f 啊v i v o ) 。 s m i t h 等口1 认为基因转移的效率是由转移载体，聚核苷酸及目标细胞的性质共同 决定的。磷酸钙沉淀法【6 】早在8 0 年代就被用于基因转移，但这种方法对细胞膜有 很大破坏作用，故不适用于体内法。一些物理方法如显微注射，电穿孔，基因枪 等 7 - 1 0 1 虽可将目的基因直接转入靶细胞，但却存在目的基因随机整合之弊，况且 人体只有少数几种细胞或组织可接收直接导入的裸露d n a ，其它细胞或组织对 这种方法具有抗性。于是帮助转移外源基因的载体被广泛研究。 1 2 用于基因转移的载体 理想的基因载体应具备：1 、靶向特异性，并且可被免疫系统识别；2 、高度 稳定，容易制各，可浓缩和纯化；3 、无毒性，对病人及环境安全无害；4 、有利 于基因高效转移和长期表达】。 目前，在基因载体的设计上，大致可分为两大类：病毒类和非病毒类。在临 床治疗成为可能以前没有种是对基因转移的万能选择。两类载体都有许多问题 亟待解决，都不能够达到理想载体的标准( 能够准确转移核酸并无毒副作用) 。 病毒己进化了上亿年，它们有自己的一套侵染细胞并使自身的遗传信息表达的“策 略”。在复制缺陷型的逆转录病毒( r e t r o v i u s ) ，腺病毒( a d e n o v i r u s ) ，腺病毒伴随病 毒，疫苗病毒，e b 病毒等众多病毒载体中，逆转录病毒和腺病毒是两种较有前 途的载体。逆转录病毒载体可容纳9 k b 的外源信息，整合进入宿主细胞基因组， 长期表达外源基因，结合已经建立的与之相配套的包装细胞系统，可以产生高滴 度的病毒液，从而高效率地将外源性基因导入靶细胞，其不足之处是整合是非位 点特异的，而且只整合进入处于分裂期的细胞，由于包装细胞产生的病毒子非常 容易失活，不能经受浓缩过程，所以不能直接用于体内过程。腺病毒可以感染处 于非分裂期细胞，病毒稳定，又可经受浓缩纯化，但它可能引起免疫反应。总之 中国科学技术大学博士学位论文 病毒类载体具有：1 、在载体中可能产生有传染性，野型或辅助型病毒：2 、可能 随机整合于宿主基因组中，从而活化癌基因或使抑制癌基因失活；3 、其自身或 编码的基因产物过度表达等不安全因素。正是由于安全性问题及大量获得重组病 毒载体相对困难等原因，科学家正在寻找更安全，高效又易识别的非病毒类载体。 其中阳离子脂质体作为临床上一种有效的基因载体系统，因其理论上无毒，易制 备，可容纳很大外源基因而受到青睐，应用前景乐观i “】。对于那些力图将化学与 药物联系起来的有机化学、生物化学、物理化学家们来说，这无疑是件激动人 心的事情。 阳离子脂质体是一种单一的阳离子两亲化合物，或更为普遍的是正离子类脂 分子c y t o f c c t i n 和中性脂质体的混合物。它们控制核酸转移的原理为：带正电的 阳离子脂质体与带负电的核酸序列通过静电作用形成能够进入细胞的复合物。然 后，复合物缓慢释放出核酸序列并在细胞核中得已表达，或控制基因表达。这个 具有吸引力的简单原理还面临着许多尚未解决的问题，但阳离子脂质体作为基因 载体已经应用于动物实验及i i 缶床实验中。随着研究工作的进一步深入，问题将会 不断得到解决。现在已取得的进展使我们相信阳离子脂质体用于基因治疗已不是 痴人说梦，在不久的将来阳离子脂质体辅助基因治疗将会成为临床现实，真正造 福人类。 1 3 用于基因转移的阳离子脂质体 1 9 8 7 年，f e i g n e r 及其同事首先提出了阳离子脂质体在核酸转移方面的应用。 他们还发展了己商业化的阳离子脂质体l i p o f e c t i n ( g i b c o b r l ) 。l i p o f e c t i n 由 c y t o f e c t i nd o t m a ( 1 ) 和天然可得的中性脂质体二油酰磷酸乙醇胺d o p e ( 2 ) 按1 ：1 比例组成】。迄今为止，在基因转移方面已有3 0 余种新的阳离子脂质体问 世，其中一些已商业化生产( 见表1 ) 。这些脂质体通常由一种合成的正离子类脂 化台物和d o p e 或另一种中性脂质体组合而成。正离子类脂分子的设计和合成对 任何给定的阳离子脂质体的形成来说都很重要。因此，我们将介绍几种正离子类 脂化合物的结构，合成以及把这些两亲化合物制成阳离子脂质体的方法。 中国科学技术大学博士学位论文 己知主要的阳离子脂质体1 a 】 d o t m a l d o t a p 3 d o s p a 5 d o g s d i c l 4 a m i d i n e1 3 d d a b l 4 + d o t m a d o p el ：l t l i p o f e c t i n l g l r c ob r l ) d o t a p d o p e ( b o e h r i n g e rm a r m h e i m ) d o s r 如o p e3 ：l ( l i p o f e c t a m i n e g i b c ob g l ) d o g s ( t r a n s f e c t a m p r o m e g a ) d ic 1 4a m i d i n o p el ：1 ( c l o n f e c t l n c | o n t e c h ) d d a b ，d o p el ：25 ( l i p o f e c t a c e g i b c o b r l ) c h o | e s t e r y | s p e r m i d i n e 7 4 c h o l e s t e r y l s p e r m i c i i n e ( t r a n s f e c t a l l a p o l l o ni n c ) d m m e4 d o r i e 6 y k s - 2 2 09 1 4 d e a21 2 g $ 2 8 8 81 5 d c - c h o l1 6 c h o l i ca c i dh e x a m i n e1 9 l i p i d 6 7 2 2 c 1 a p2 3 b g t c2 s d p p e s2 8 1 - y s p a m 2 - g r o p e m2 9 d m r i e ，d o p e1 ：l d o r i e ，d o p el ：l y k s 一2 2 0 3 0 p e 1 4 d e a2 g2 8 8 8 d o p el ：l d c c h o l d o p e6 ：4 1 9 d o p ei ：l l i p i d6 7 d o p e1 2 c t a p d o p e1 ：2 b g t c ，d o p e3 ：2 d p p e s l y s p a m 2 0 r o p e t n c h o l e g g p c i 5 ：30 ：55 l o p e 2 9a l p e r e c 口a 4 6 6 ：4 2 c 1 2 l g l u p h c 2 - n + b r 3 12 c t l - l g l u p h - c 2 - n + 2 c 1 4 - l - g i u - c 2 - n | 3 2 2 ( 2 1 4 - l g l u c 2 - n + d o t i m3 3d o t i m c h o l1 ：1 ：d o t i m d o p e1 ：1 d i c - 1 4 ：0 i t v i t d 2d e r i v a t i v e s2 0 v i t d ) d e r i v a t i v e s2 1 o o c e l 0 d i c - 1 4 ：0 丌w e e n s 0 2 0 ，d o p e 2 l ，d o p e 0 0 c e c h o l 【a 】c h o l ：c h o l e s t e r y l ；e g g p c ：e g gp h o p h a t i d y b e t h a n o l a m i n e ；r a t i o s ：m o l a r r a t i o s 【b 】w e i g h tr a t i o s 1 3 1 正离子类脂分子的结构 正离子类脂分子由一个阳离子头部通过连接链与疏水部分相连。阳离子头部 起着脂质体与d n a 、脂质体d n a 复合物与细胞膜或细胞内其它组分相互结合的 作用。因此所有的正离子类脂分子都是带正电的两亲化合物。这是使表面看上去 具有不同结构的化合物归属于同一类型的原因。已经报道的正离子类脂化合物可 分为如下几类：d o t m a 类似物，复杂烷基胺，酰胺复合物，胆固醇衍生物，芳香 环衍生物，双棕榈酰基一l p 一磷酯酰乙醇胺、谷氨酸、咪唑、磷酸盐的衍生物等。 6 中国科学技术大学博士学位论文 d o t m a 类似物在阳离子脂质体的组成中已得到最为广泛的应用和研究。主 要类似物有d o t a p ( 3 ) 【“】，d m r i e ( 4 ) u s 和d o s p a ( 5 ) 。其它和d o t m a 相 似的结构还有d o r i e ( 6 ) u s 和其相应的酯d o r i ( 7 ) 1 5 - 1 7 1 ，另外，d m r i e ，d o r i e ， d o r i 的同系物也有报道1 ”。最近报道的该类型中最有效的化合物是g a p d l r i e ( 8 ) 1 1 3 1 o 此外还有y k s 2 2 0 ( 9 ) u g l ，肉碱衍生物o o c e ( 1 0 ) 及其同系物【2 0 1 。 在研究d o t m a 作为基因载体的构效关系时，还合成了一系列氨基上不同烷基的 正离子衍生物【2 l 】，不同长度连接链的二醚，醚酯，二酯衍生物【2 2 ，z ”。 c 蠢l s = 爻h 3 1 q i o 芬群搿 。 一u o 丌。、 d o t m al n o 曰 m i 朱磁v 、 i o d o t a p3 q 3 m e 2 驴 h o n n 、o r b r h 。书。r r 嘉v ， b r r = 辜飞 d o s p a5 肛辜飞h 。肛；啊肛辜飞。驴心v 飞 d o r i7 、，鼍夕 h 2 n 7 、n 、v o 、一、， ， g a p d l r i e8 b i 阻 晓 r n 烨 扣一 中国科学技术大学博士学位论文 r - 一o c o ( c h 2 ) 7 c h 3 c h ( c h 2 ) t c h 3 o o c 邮o ( c h 2 ) 。n 徘+ ( c 洲h 3 ) 3 毗f 删。 一 扩r l o c o ( c h 2 ) 7 c h = c h ( c h 2 ) 7 c h 3 。 u 孑、 y k s 一2 2 0 ( z ，z ) 9 r = ( c h 2 ) 7 c h = c h ( c h 2 ) 7 c h 3 0 0 c e1 0 复杂烷基胺酰胺复合物主要包括d o g s ( 1 1 ) 1 2 4 ，1 4 d e a 2 ( 1 2 ) 1 2 5 - 2 “， d i c l 4 a m i d i n e ( 1 3 ) 【2 7 ，2 ”，d d a b ( 1 4 ) 【2 9 】。1 4 d e a 2 和d i c l 4 a m i d i n e 的同系物也 有报道。”。最近报道的g s 2 8 8 8 ( i s ) m 3 也属该类型。到目前为止，该类化合物仅 d o g s 和d d a b 有较多的应用研究报道。 d o g s1 11 4d e a21 2 d ic 1 4a m i d i n e1 3d d a b 1 4 、。儿op n h 帧。啦 、。儿p 义且。啦 阽 d c c h o l 是最早报道的用作基因载体的胆固醇衍生物p ”。化合物1 7 和1 8 口2 1 及其同系物1 也有报道。与前面所述的头尾两亲性化合物不同，最近有文献报道 多胺胆固醇正离子“面型”( f a c e ) 两亲性化合物用作基因载体。它们是以自然存 在的三种胆固醇衍生物的胆酸化合物为基础合成得到的新的双葡萄糖取代的胆酸 六胺。1 9 在此类化合物中具有代表性p 3 】。甾体9 ，1 0 位碳碳键断裂的s e c o s t e r o i d 维生素d ，d ，衍生物2 0 ，2 l 用作基因载体也有报道f 3 4 】。迄今为止两个转移效率最 嘶 阼 v 。 f 叮 妙 中国科学技术大学博士学位论文 高的阳离子脂质体是胆固醇衍生物p o l y a m i n ea c i d6 7 ( 2 2 ) f 3 1 和c t a p ( 2 3 ) f 3 “。 其他多胺衍生物还有c h o l e s t e r y l s p e r m i d i n e ( 2 4 ) 和b g t c ( 2 5 ) 3 7 - 3 9 。另外含半乳 糖结构的胆固醇衍生物g a l c 。- c h o l ( 2 6 ) 及其同系物有较高的转染效率m i 。 h 憎r v k 坤i d 。，2 2 、 h c h o l s t e r y l s p e r m i d i n e2 4 毋p h b g t c2 5 9 热 中国科学技术大学博士学位论文 ，o h 罄耖 其它类型的基因载体主要有芳香环为连接链的衍生物d i c 1 4 ：0 ( 2 7 ) 及其同系物 1 4 1 1 ；双棕榈酰基一l p 一磷酯酰乙醇胺衍生物d p p e ( 2 8 ) 1 2 4 1 和l y s p a m 2 一g r o p e t n ( 2 9 ) 4 ”， l - p e ( 2 9 a ) 2 ，4 3 1 ；磷酯酰胆碱衍生物e d o p cf 3 0 ) 1 ：报道的转移效率最高的谷氨酸 衍生物2 g 1 2 一l g l u p h c 2 - n + b r - ( 3 1 ) ，2 g 1 4 一l - g l u - c 2 一n + c 1 。( 3 2 ) 2 6 ，4 ”；咪唑衍生物 d o t i m ( 3 3 ) 4 6 】；磷酸二酯衍生物g l b 4 3 ( 3 4 ) 和g l b 9 0 ( 3 5 ) 叫。 n + b r 。愈。 r 2 n c 1 4 h 2 9 2 7 篙r 。、0 黔h , 0 p 。西r 一 2 9 阽慨 l v s p a i l l g r 。p e m2 9 2 9 ar _ k 巧吖 r = k d p p e s2 8 r 1 c o o c h 27 “5 早h宁 c h 2 一r o c h 2 c h 2 n 。c h 曲3 0 3 0 哲广。铋，0 。喾- o 沙r 2 g 1 2 一l - o l u - p h - c 2 - n + b r 3 1 2 g 、4 l g l u 。c 2 - n + c i 3 2 凡晕一。 r 唾尸v d o t i m3 3 1 3 2 正离子类脂分子的合成 0 f 水 3 4 r 。氛疗弋钙 r ；c h a x = j r = c h 2 c o o m ex = b r g l b 4 3 3 4g l b 9 03 5 。丫基洲 r 中国科学技术大学博士学位论文 主要基因载体的有机合成一般路径较短，产率较高，使得它们可以被大量生产 和应用。d o t m a ( 1 ) 及其类似物d o t a p ( 3 ) ，d m r i e ( 4 ) ，d o r i e ( 6 ) 和d o r i ( 7 ) 的合成路线于s c h e m e l 所示。d o t m a 是以3 ( 二甲基氨基) 一1 ，2 丙二醇 ( 3 6 ) 通过两步反应制备而得的m 】。3 6 先油酰化，得到的三级胺用碘甲烷或2 一溴 乙醇烷基化，就分别得到3 和7 t “- 15 1 。用十四烷基或甲磺酸油醇酯接长链到3 6 ，然 后用2 溴一乙醇n 一烷基化，分别得到4 和6 5 1 。g a p d l r i e ( 8 ) 可通过和4 ，6 相 似的方式合成i l ”。有文献报道d o t m a 类似物的更为复杂的合成，包括化合物7 的精细合成( s c h e m e 2 ) 【1 “，这被证明可以很好地用于化合物7 的油酸类似物的合 成【”1 。y k s 2 2 0 ( 9 1 是通过甘油二酯与4 壕c 丁酰氯反应，n a i 交换，三甲胺成盐得 到的( s c h e m e 3 ) ( 1 9 1 。肉碱衍生物是通过分步酯化合成的( s c h e m e 4 ) ( 2 0 l 。不同长 度连接链的二醚，醚酯，二酯d o t m a 类似物的合成列于s c h e m e5 - 1 0 中 2 2 , 2 3 1 。 。j 邑。i 。j n m e 2 上 r 2 ：4 嗡 山 3 6山r o j 。j 哦凡气 3 6 上h 。、n m e ：山 l 、一， 3 6 上。o 已厶 n l 、 d o t m a d o r j e6 d 0 1 a p3 d o r i7 d m r j e4 g a p d l r i e8 s c h e m e 1 r e a g e n t sa n dc o n d i t i o n s ：a ) x y l e n e ，t b u o k ( 3 e q u i v ) o l e y | t o l u e n e s u l f o n a t e ( 3 e q u l v ) o ro l e y lm e s y l a t e ( 3e q u i v ) ，1 4 0 c ，3 h r s ；b ) m e c i ，7 0 c ，4 8 h r s ；c ) e t 2 0 ，p y r i d i n e ，o l e y lc h l o r i d e ， 4 0 h r s ，7 8 ；d ) c h c l 3 d m s o ( i i ) ，m e i ，6 3 ；e ) b r ( c h 2 ) 2 0 h ；f ) x y l e n e ，t b u o k ( 3e q u i v ) ，m y r i s t y i m e s y l s t e ( 3 e q i v ) ，7 0 。c ；g ) l t h f ( a n h y d r o u s ) ，n a i l ，r e f l u x ，2 4 h r s ；2 t h f ( a n h y d r o u s ) ，d o d e c y l m e s y l a t e ( 3e q u i v ) ，r e f l u x ，7 2 h r s ，6 5 ；h ) 1 d m f ( a n h y d r o u s ) ，n 一( 3 一b r o m o p r o p h y l ) p h t h a l i m i d e ( 2 e q u i v ) ，1 0 5 ，7 2 h r s ，6 i ；2 e t o h ，h y d r a z i n e ( 3 0 e q u i v ) ，r t ，1 8 h r s ，7 5 中国科学技术大学博士学位论文 1 b d p s o n h m e + 旷o t r 1 b d p s o 、n 、 o t r m e0 h 。刚，一一。上舻。 s c h e m e2 r e a g e n t sa n dc o n d i t i o n s ：a ) e t o h ，l i c l 0 4 ( 2 e q u i p ) ，6 5 。c ，7 2 ；b ) e t 2 0 ，8 5 h c 0 2 h ，7 1 - 7 5 ；c ) 1c h 2 c 1 2 ，o l e y lc h l o r i d e ( 2 2 e q u i p ) ，e t 3 n ，d m a p ( c a t ) ，0 0 c ，9 2 ；2 t h e t b a f ( 3 e q u i v ) ，0 。c ，8 8 - 9 1 ；3 m e l t b d p s = t e r t _ b u t y l d i p h e n y l s i l y l ，t r = t r i p h e n y l m e t h y l ， d m a p = 4 - d i m e t h y l a m i n o p y r i d i n e ，t b a f - - t e t r a b u t y l a m m o n i u m f l u o r i d e 爵一睡。c r o c o r b o c o ( c h 2 ) 3 i l y k 8 。2 2 0 9 l _ 0 c o r s c h e m e3 r e a g e n t sa n dc o n d i t i o n s ：a ) c i ( c h 2 ) 3 c o c i ，2 , 6 一l u t i d i n e ，c h 2 c 1 2 ，0 c ，1 7 h r s ，8 7 ；b ) n a l ，m e k ，r e f l u x ，2 4 h r s ，8 8 ；c ) n ( c h 3 ) * e t 2 0 ，0 c ，4 8 h r s ，6 8 。人。人o h l c r 。几。人o h