（微生物学专业论文）棕色固氮菌固氮酶催化n2和h还原机制研究.pdf

中文摘要 生物固氮主要是由钼铁固氮酶催化，固氮酶由铝铁蛋白和铁蛋白两个组分组成。在固氮酶的 诸多底物中，生理底物为n 2 和h + 已知n 2 和 i + 是在固氮酶活性中- , f e m o - e o 上被还原，但其络合 和还原的确切位点尚未确定此外，在固氮酶反应计量式中，每合成一分子氨究竟释放几分子氢 气也无定论。在本论文中，通过定点突变棕色固氮菌固氮酶f e m o - c o 附近关键氨基酸和高柠檬酸， 分析突变固氮酶催化n 2 和i i + 还原能力的变化，就固氮酶f e m o - c o 上的底物还原位点和电子传递通 路两个问题展开讨论，探索固氮酶的催化反应机制。 以棕色固氮菌( a z o t o b a c t e r v i n e l a n d i i ) 为研究对象，利用体外定点突变和染色体基因置换技 术，构建a v 单突变菌株( 1 9 1 伽) 和双突变菌株( a - 1 9 1 哆压啊和c 1 9 5 0 吣i f 旷) 。对a v 和k p 的突变株和野生型菌株分别发酵培养，利用柱层析，凝胶过滤层析和制备电泳纯化其钼铁蛋白和 铁蛋白分析比较野生型和突变株固氮酶对n 2 、i l + 和q h 2 还原活性的变化。 通过分析突变株固氮酶催化底物还原活性特征发现：a - 1 9 5 “突变后几乎丧失固氮活性，而 对总电子流没有影响；a - 1 9 1 。或高柠檬酸发生改变对总电子流影响很大。结合固氮酶三维结构 分析，高柠檬酸和1 9 1 “可能是电子从p - c l u s t e r 进) k f e m o - c o 的关键部位，电子可以通过高柠檬 酸的长臂进入钼位，n 发生突变后，高柠檬酸的长臂变短。电子从长臂进入铝位的通路阻断， 表现出总电子流下降；a - 1 9 1 。在电子传递链上起着枢纽的作用，它和a - 1 9 5 “形成氢键，也可以 与高柠檬酸的短臂以氢键相连，从p - c l w t 传递过来的电子经榭y s ，a - 6 1 钟到达a - 1 9 1 “后在此 分流，经a - 1 9 5 “及a 1 9 5 “与f e m o c o 上s 2 b 的氢键进入n 2 络合还原的铁位，也可以通过高柠檬 酸的短臂进入铝位。1 9 5 h ”咪唑基上的- n 可以与f e m o - c o 上s 2 b 形成氢键，用于还原n 2 的电子从 a - 1 9 5 “进入铁位。 由此本文提出假设：1 ) ，n 2 可能在f e m o - c o 靠近s 2 b 的f e 2 和f e 6 原子上被还原，n 2 络合到铁 原子上形成铁氢化物时置换放氢，此处的放氢反应依赖于n 2 ，对c o 敏感。钼原子是一个独立的 放氢位点，此处的放氢反应受n 2 非竞争性抑制，对c o 不敏感；2 ) ， a p m l u s t 胡j f e m o - g o 之间可 能存在两条电子传递通路，其中一条为p - c l u s t e r - - - , “2 c y 叼- 6 1 0 k d 1 9 1 0 - a 1 9 5 “，最后通过 a - 1 9 5 “与s 2 b 形成氢键进入f e 2 - f e 6 - l n 2 还原位点另一条可能由p - c h b t 日和f e m o 之间的某个 螺旋或多个氨基酸残基介导，通过高柠檬酸的长臂进入f e m o 上的钼原子。 关键词：棕色固氮菌，固氮酶，电子传递，催化机制 a b s t r a c t b i o l o g i c a ln i t r o g e nf i x a t i o ni sm a i n l yc a t a l y z e db yt h em o - d e p e n d a n tn i t r o g e n a s ew h i c hc o n s i s t s o ft w op r o t e i nc o m p o n e n t s ：m o f ep r o t e i na n df ep r o t e i n d i n i t r o g e n ( n 2 ) a n dp r o t o n ( r r 3a r et h et w o p h y s i o l o g i c a ls u b s t r a t e sf o rn i t r o g a n a s e a n di ti sw e l lk n o w nt h a tt h e ya r er e d u c e do nt h ef c m o - e oo f d i n i t r o g a n a s e , b u tt h ee x a c ts i t e s f o rt h e i rr e d u c t i o na r es t i l lu n c e r t a i n i na d d i t i o n , t h eo v e r a l l s t o i c h i o m e t r i ce q u a t i o no fn i t r o g e n a s ei sa l s on o ta s c e r t a i n e d o n em a j o ru n r e s o l v e dp r o b l e mi st h e r a t i oo fh ee v o l v e dp e rn 2r e d u c e d i nt h i sd i s s e r t i o n , b yc o n s t r u c t i n gs e v e r a lm u t a n t si nw h i c hs o m e i m p o r t a n tr e s i d u e so r a n do r g a n i ca c i da r o u n dt h ef e m o - - e oh a db e e nr e p l a c e d , a n da n a l y z i n gt h en 2a n d 旷c a t a l y t i cp r o p e r t i e so ft h e s ea l t e r e dd i n i t r o g e n a s e s , t h em e c h a n i s t i cd e t a i l so fa i t r o g e n a s ew i l lb e e x p l o r e d i nt h i sp a p e r , u s i n gt h es i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i sa n dg e n er e p l a c e m e n tp r o c e d u r e s ，o n es i n g l e m u t a n t ( a - 1 9 1 b 1a n dt w od o u b l em u t a n t s ( a - 1 9 1 跏，n i f 旷a n dc t - 1 9 5 0 “n i t v ) o fa z o t o b a c t e r v i n e l a n d i iw c r ec o n s t r u c t e d 1 1 1 es i n g l em u t a n t so fc t - 1 9 5 0 。a n dn i f v a r eg m e df r o mo t h e rl a b a b r o a d t h e s e m u t a n t s o f a z o t o b a c t e r v i n e l a n d i ia n d r e l e v a n t m u t a n t so f k l e b s i a l l a p n e u m o n i a e w c i e f e r m e n t e dr e s p e c t i v e l y , a n du s i n gc h r o m a t o g r a p h ye n dp r e p a r a t i v ee l e e t r o p h o r e s i st h e n i t r o g e n a s e so f t h e s es r a i l 丝w e r ed e r e p r e s s u da n dp u r i f i e ds u c c e s s f u l l y t h e nt h ea c t i v i t i e so fn 2 ，i l 十a n dc 2 h 2 r e d u c t i o no f t h e s en i t r o g e n a s e sw e r ea s s a y e d t h er e s u l t sf o r mt h ea c t i v i t i e so f a n b s t r a t e sr e d u c t i o nc a t a l y 乃e db ym u t a t e dn i t r o g e n a s e ss h o w e d t h a tt h e 1 9 5 “s u b s t i t u t i o n sh a dal i u l ea f f e c to nt h et o t a le l e c t r o nf l u x b u ta h n o s tl o s tt h en 2 r e d u c t i o na b i l i t y e a c ho ft h ec t - 1 9 1 0 “o rn i vw a l tm u t a t e d , t h et o t a le l e c t r o n sw o u l dd e c r e a s e d i s t i n c t l y c o m b i n i n gw i t ht h et h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f n i t r o g e n a s e ，w et h i n kt h a th o m o c i t r a t e a n da - 1 9 1 “m a yb et h ek e yp o s i t i o n so fe l e c t r o n s 缸a n s f e r r e df r o mp - c l u s t e rt of e m o - e o o n c et h e l o n ga mc a r b o x y l a t eo fh o m o c i t r a t eb e c a m es h o r t e r0 a n m o c i t r a t er e p l a c e db yc i t r a t e ) e l e c t r o n s p a t h w a yf l u x e dt om os i t ew i l lb ei n t e r r u p t e d t h eo - 1 9 1 。m a yb ep r o b a b l yl o c a t e da tt h e h i n g e p o s i t i o n i nt h ee l e c t r o nc h a n n e lc o n n e c t i o n n ”s 2 bo ff e m o - c oi n t e r a c t e dw i t ha 1 9 5 n m a yb e t h ee n t r ys i t ef o rp r o t o n su s e df o rs u b s t r a t er e d u c t i o n b a s e do nt h i sw o r ka n dp r e v i o u ss t u d i e s ，w es u g g e s tt h a t ：( i ) t h em oa t o ms i t eo f f e m o - c oi st h e s i t ef o ri - rr e d u c t i o nt oe v o l v eh 2 ，a n dt h a ti ti sc o - i n s e n s i t i v ea n dn o n e n m p e t i t i v e l yi n h i b i t e db y n 2 t h e f e 2a n d f e 6a t o m sc l o s e t o t h e c e n t r a ls u l f u r a t o n l ( s 2 b ) o f f e m o - c os e e m t o b e t h es i t e s f o r n 2 b i n d i n ga n dr e d u c t i o n h 2m a ya l s ob ee v o l v e db yr e p l a c e m e n to fn 2f r o mt h e s et w of e - h y d r i d e s , r e s u l t i n gi nn 2r e d u c t i o na n dh 2e v o l u t i o na tf es i t e st h a ta r cs e n s i t i v et oc o ；( i i ) t w op a r a l l e le l e c t r o n c h a n n e l sm a ye x i s tb e t w e e nt h ep - c l u s t e ra n df e m o - c o t h ef i r s tc h a n n e li sf r o mc t 4 1 2 。”b o u n dw i t h p - c l u s t e rt oc t - 1 9 5 “v i a 1 9 l “t h a ti sh y d r o g e nb o n d e dw i t ht h es h o r ta r mo f h o m o c i w a t ei na v l t h es e c o n dc h a n n e lm a yb es o l n eu n c e r t a i nr e s i d u e so rh e l i x e sj o i n e dw i l hp - c l u s t e ra n ds t r e t c h e dt o t h el o n ga n no f h o m o e i t r a t e k e ”v o r d s ：a z o t o b a c t e rv i n e l a n d i i , n i t r o g a n a s u , e l e c t r o nt r a n s f e r , c a t a l y t i cm e c h a n i s m 缩略词 a v l ：m o f ep r o t e i no rd i n i t r o g e n a s eo f a z o t o b a c t e rv i n e l a n d i i a v 2 ：f ep r o t e i no rd i n i t r o g e n a s er e d u c t a s eo f a z o t o b a c t e r 嘲p 缸月击f w t a v l ：w i l dt y p e a v l a - 1 9 5 6 1 a v l ：a v lw i t h g l u t a m i n e ( g i n ) s u b s t i t u t e d f o r a - 1 9 5 陆 a - 1 9 1 l a v l ：a v lw i t hl y s i n e ( l y s ) s u b s t i t u t e df o ra - 1 9 0 铀 n i f v - a v l ：a v lf r o mn j v m u t a n t a - 1 9 5 0 啉i f v a v l ：n i f v a v lw i t h g i ns u b s t i m t e d f o r a - 1 9 4 陆 a - 1 9 1 哆悄j f v a v l ：n i f v a v lw i t h l y s s u b s t i t u t e d f o r a - 1 9 0 国a f e m o - c o ：f e m o c o f a c t o r s i m i l a ra b b r e v i a t i o n sa ”u s e df o rn i t r o g e n a s ef r o mj 【p n e u m o m a e 甑e e p tt h a tr e s i d u ea - 1 9 1o r 1 9 5i na vi se q u i v a l e n tt oa - 1 9 0o r1 9 4i nk p i l l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名时间：) 司年仁月) op l 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 美锌 时间： ) 。0 7 年幺月如日 导师繇分锄 帆渊年匕月沁日 中国农业大学博i 一学位论文 第一章l 卉f 氯酶僻化机制研究进展 第一章固氮酶催化机制研究进展 前言 众所周知，所有的生物都需要一定的氮源用于生存和生长，而可利_ h j 的氮源主要是以n l - h + 和n o ，等形式存在。大气中的氮气不能直接被生物体吸收而转化为生命有机体所必需的氨基 酸。空气中的氮气只有通过“固定”( f i x a t i o n ) 过程才能转化为生物体可以利用的形式。 自然界氮的| 司定形式有自然l 司氮、生物问氮、人工同氮等。自然同氮这一过程并非生物转 化过程，它包括了闪电作用，自然分解等，其固氮总量可以占到全球同氮总量的l o 。而人类 通过高温高压条件下利用化学反应生成的n i - - 1 3 可以占到同氮总量的3 0 。通过化学法生产氮 肥需要消耗巨大的能源，对自然环境造成严重污染：一方面将过量的硝酸盐排放到地球的水层； 另一方面氨工业的发展，使氧化氮排放量增加，这也是破坏大气臭氧和加重温室效虑的重要 因素之一，而其余的6 0 是由生物i 司氮过程完成的。生物周氮不同于化学生产氮肥的是在常温 常压下进行。而研究生物嗣氮的意义也在于此，即通过研究生物 古| 氮的机制，为人类在常温常 压下合成氮肥提供理论依据及可能。 生物固氮是同氮酶催化将n 2 牢同的三键打断生成n i t 3 的过程。生物同氮是自然界氮元素 循环的重要环节之一( 图1 - 1 ) ，也是将n 2 转化供农业生产利用的重要因素。生物嘲氮反应是 在常温常压下由同氮酶来完成的。因此，对于嗣氮酶的研究就成为研究生物同氮的关键。 图卜i 自然舁中的氰素循环 f i g u r ei - ! s c h e m a t i cr q ”c s e a t a t i o ao f g l o b a ln i t r o g v nc y c l e 中国农业大学博十学位论文 第一章同氯酶催化机制研究进展 1 1 生物固氮研究进程 对于固氮酶的研究，大致经历了以下几个阶段 第一阶段：1 9 6 0 年以前，固氮酶的研究处于细胞水平。这一段时期的重要发现有：( 1 ) 固氮 生物的生长需要m o 。并需要增加f e ，c a 的供给；( 2 ) n i l 3 是固氮作用的产物；( 3 ) h 2 ，c o 和 n 2 0 是固氮反应的抑制剂。 第二阶段：6 0 年代初c a m a h a n 和m o r t e n s o n 等首次在体外分离出固氮酶，在加入m g a t p 和n a 2 s 2 0 4 ( 连二亚硫酸钠) 后，成功地进行了体外固氮实验( c a r n a h a nj e m o r t e n s o nl ee la l 1 9 6 0 ；m o r t c n s o n1 9 6 4 ) 。接着1 9 6 6 年，b u l e n 和l c e o m t e 从a v i n e l a n d i i 中成功分离并提纯出 固氮酶的两个组分：钼铁蛋白和铁蛋白，并初步确定了这两个组分蛋白的分子特性( 包括分子 量、氨基酸组成、亚基组成等) f b u l e na n dl c c o m t e1 9 6 6 ) 。这个工作被认为是固氮酶研究的第 一个重大突破，标志着固氮酶的研究进入到分子水平这一时期，也确定了固氮酶、电子供体 ( n a 2 s 2 0 4 ) 、a t p 发生系统和二价金属离子是在体外研究生物固氮的必要条件。 第三阶段：s h a h 和b r i l l 于1 9 7 7 年成功从钼铁蛋白中分离出铁铝辅因子- f e m o - o o f a e t o r ，初 步测出其化学组成中m o ：f e ：s 之比大约为l ：6 ：6 ，并发现分离出的f e m o - o o 能与缺失f e m o - c o 的钼铁蛋白重组而恢复其固氮能力( s h a ha n db r i l l1 9 7 7 ) 。而1 9 8 6 - 1 9 9 0 年间，h o o v e r 等利用基 因工程方法体外合成分别含高柠檬酸盐，柠檬酸盐及其同系物或衍生物的多种铁钼辅因子，分 别检测其固氮催化活性。发现这些结合不同羟基羧酸( 盐) 小分子的组合固氮酶体系的催化功 能有着明显差异。这些工作也间接证明了野生型固氮酶和n 2 r 突变株固氮酶的钼铁蛋白中分别 含有高柠檬酸盐和柠檬酸盐f f l o o v e r , s h a he la l1 9 8 6 ；h o o v e r , i m p e r i a le la l1 9 8 8 ；h o o v e r , i m p e r i a le l a l1 9 8 8 ；h o o v e r , i m p e r i a le l 口t1 9 8 9 ) 。 第四阶段：1 9 9 2 年r e e a 小组成功地测定出固氮酶铝铁蛋白( k i ma n dr e e s 。1 9 9 2 ) 和铁蛋白 ( g e o 晤a d i s ，k o m i y a e l a l1 9 9 2 ) 的三维结构。并提出固氮酶活性中心的k i m - r e e s 模型和p - c l u s t e r 的c h a n - k i m r e e s 模型( c h m ，k i me la l1 9 9 3 ) 以及铝铁蛋白与铁蛋白结合的嵌合模型( d o c k i n g m o d e l ) 。以此为固氮酶研究的新开端，随后科学家对不同来源。不同组分的固氮酶进行晶体衍 射。迄今为止已有8 种钼铁蛋白，l o 种铁蛋白和7 种铝铁蛋白铁蛋白复合物的晶体衍射获得 成功( 表1 1 ) 随着对固氮酶研究的不断深入和固氮酶精细结构的解析，人们对生物固氮的认识进入到原 子水平。而固氮酶活性中心结构与功能之间的关系也就成为当前国际上固氮酶研究的热点。 2 中国农业大学博十学位论文第一章同氨酶催化机制研究进展 表1 - 1 晶体结构已解析的固氮酶组分 t a b l ei - ln i t r o g e n a s cc h a r a c t e r i z e db yx - r a yd i f f r a c t i o n 啡 a d p a v 2 m g a d pb o i l d a v 2a 1 1f c 玎o u ss t a t e 1 2 固氮酶的分类 自然界中，已经得到公认的固氮酶有四种，其中三种固氮酶体系非常相似，差别在于其活性 中心原子簇含有钼，钒或仅含有铁这三种固氮酶分别被称作钼铁固氮酶，钒铁固氮酶和铁铁固 氮酶钒铁固氮酶和铁铁固氮酶也称为替代固氮酶( t h e a l t c r n a t i v c n i t r o g c n a s c s ) 。第四类固氮酶 是从嗜热自养链霉菌( s t r e p t o m y c e s t h e r m o a u t o t r o p h i c u s ) 分离得到的( r i b b e ，g a d k a r i e t a 1 9 9 7 ) 3 蛳 一 州 业 童 巡兰 茎蓉 删 一 中国农业大学博十学位论文第一章同氧酶催化机制研究进喂 1 2 1 钼铁固氮酶 在这四类固氮酶体系中，分布最广泛，研究也最为充分的是第套同氮酶体系钼铁固氮酶。 它由钼铁蛋白和铁蛋白组成，这两个蛋白单独存在时均不表现出固氮活性，只有二者形成复合体 才表现出固氮活性。 钼铁蛋白( m o f e p r o t e i n ) ，又称二氮酶( d i n i t r o g e n a s e ) 或组份i ，固氮酶的活性中心位于 其中；铁蛋白( f ep r o t e i n ) ，又称二氮酶还原酶( d i n i t r o g e n a s e 剃u c t a s e ) 或组份，是钼铁蛋 白的电子供体，其它电子供体提供的电子必须经过铁蛋白才能传递到钼铁蛋白并用于底物的还 原。通常使用简称来指代某一种固氮微生物的钼铁蛋白或铁蛋白，命名规则为：以属名的头一个 字母( 大写) 和种名的头一个字母( 小写) 来指代微生物的种类，后面加阿拉伯数字l 或2 来指明 组份i ( 钼铁蛋白) 或组份i i ( 铁蛋白) 。如k p l 是指k l e b s i e l l ap n e u m o n i a e 的钼铁蛋白，a v 2 是 指a z o t o b a c t e r v i n e l a n d i i 的铁蛋白。本文中如非特别指出，所指均为铝铁固氮酶。 1 2 2 替代固氮酶 b i s h o p 等# a v i n e 肠n 出中己知的编码钼铁固氮酶的基因n i 钼的情况下，仍能进行固氮生长( b i s h o p ，h a w k i n se t a l 1 9 8 6 ) 。随后发现这是因为钒铁固氮酶( v i e n i t r o g e n a s e ) 的存在。而在培养基中缺少钼和钒时，c h i s n e l l 等发现了铁铁固氮酶体系( c h i s n e l l , p r e m a h m m r “a 1 9 8 8 ) 。并非所有的固氮生物都具有这三种固氮酶系统，并且这几种固氮酶体系 在微生物中分配的情况也无规则可言。例如：肺炎克氏杆菌( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 只有钼铁固 氮酶系统，褐球固氮菌( a z o t o b a c t e rc h r o o c o c c “m ) 具有钼铁和钒铁两套固氮酶系统，荚膜红细 菌( g h o d o b a c t e r c a p s u l a t u s ) 具有铝铁和铁铁固氮酶系统，而只有彳v i n e l a n d i i 同时拥有这三套 固氮酶系统。两种替代固氮酶的还原氮气能力也远小于钼铁固氮酶。 m o f e , - n 2 a s e ：n 2 + 1 6 m g a t p + 8 0 - + 8 h + 2 n h 3 + i 2 + 1 6 m g a d p + 1 6 p j v f e - n 2 a s e ：n 2 + 2 4 m g a t p + 1 2 0 + 1 2 h 2 n h 3 + 3 n z + 2 4 m g a d p + 2 4 p i f e f e - n # s e ：n 2 + x m g a t p + 2 1 0 + 2 1 旷一2 ：n h 3 + 7 5 1 - 1 2 + x m g a d p + x p i 1 2 - 3 钒铁固氦酶和铁铁固氮酶的生物合成 a v i n e l a n d i i 具有编码三种固氮酶的基因，这些基因分别属于以下三个基因簇：n i t , v n f 和a n f o a c o b s o a ，b r i g l ee t a 1 9 8 9 ；j o e r g e r , j a e o b s o ne t a 1 9 8 9 ) 。一些n 基因，如月0 曰，n , i t m , n s ，n f i e 和n j u , 对于这三种固氮酶的合成都是必需的。每个固氮酶系统都有自己的转录因子，分别为n i f a ， v n 执和a n f a 。删和口，基因的表达受钼元素的抑制，当有铝存在时，只有钼铁固氮酶表达；无钼 时，钒铁固氮酶表达；只有同时缺少钼和钒时，铁铁固氮酶才表达。 4 中国农业大学博十学位论文第一章嗣氮酶催化机制研究进展 1 2 4 钒铁固氮酶 从4 v i n e l a n d i i 1 a c h r o o c a c u m 中提取的钒铁固氮酶其铁蛋白的分子量为6 3k d ， 4 v e , - 4 s l 簇的氧化还原电势与钼铁固氮酶铁蛋白的 4 f e - 4 s l 相似( s m i t hb e1 9 9 9 ) 。与钼铁蛋白不同的是， 钒铁蛋白具有一个特殊的6 亚基，大小约为1 5k d ，褐球固氮苗固氮酶中中6 亚基与邮t 亚基的比例 为l ：i ，而在棕色固氮菌中6 亚基与其他亚基没有固定的比例。6 亚基由明船编码，对于钒铁蛋 白的活性也是必须的( e a d y , r o b s o ne ta l1 9 8 7 ；w a u g h ，p a u l s e ne ta l1 9 9 5 ；b l a n c h a r da n dh a l e s 1 9 9 6 ) 。除此以外，钒铁固氮酶的组成，各金属簇的组成和电势，保守氨基酸的组成等都与钼铁固 氮酶类似。、 1 , 2 5 铁铁固氦酶 铁铁固氮酶首先是从班啾失的棕色固氮菌中提取出来，随后在荚膜红细菌和深红红螺菌 中也提取出铁铁固氮酶。铁铁固氮酶中铁铁蛋白也是由啦艮6 2 组成( t _ e h m a na n dr o b e r t s1 9 9 1 ； s d m e i d c r , m u l l e r e t 矗1 9 9 1 ；d a v i s l e h m a ne t a 1 9 9 6 ) 1 2 6 第四类固氦酶 这类固氮酶体系由三种金属酶组成：( a ) 异三聚体的含钼固氮酶( s t l ) ；( ”同二聚体的含锰 超氧化物氧化还原酶( s t 2 ) ；( c ) 异三聚体的含钼一氧化碳脱氢酶( s t 3 ) ( r i b b e ，g a d k a r ie ta l1 9 9 7 ) 。 与上述三类固氮酶体系不同的是，这类固氮酶不能催化还原c 2 h 2 ，面且依赖0 2 或超氧负离子 自由基( 0 2 ) 发挥固氮活性。它催化n 2 还原的反应方程式如下： n 2 + 4 m g a t p + 8 d + 8 矿= 2 n i t 3 + h 2 + 4 m g a d p + 4 p i 反应首先通过s t 3 将c o 氧化，产生的电子传递给q 生成超氧负离子自由基0 2 随后s t 2 将0 2 “氧化成0 2 而获得电子，并传递给s t l 用于将n 2 还原成n h ，( 图1 - 2 ) 田i - 2 第四类固氯酶反应示意m ( r i b b e , c r 缸l k a t ia a 1 9 9 7 ) f i g u m l - 2 s d z m a t i c 代佛謦蚓吐鲥o n o f n 2 f l y * a t i o f l i s & 7 h e r m o a u t o t r o t r o p h a 廿 5 中国农业大学博十学位论文第审同氯酶催化机制研究进展 1 3 固氮酶基因 截止目前，功能已得到鉴定的固氮酶基因有3 0 多个，其功能各异，大致分为以下几种：结 构基因，参与固氮酶金属原子簇合成和组装的基因，固氮酶活性调控基因等( 表1 2 ) 。 表l - 2 固氦酶各基因功能 t a b l e1 - 2f u n c t i o no f g e n e si n v o l v i n gn i t r o g e n a s e 基因编码产物或相关功能 月对 铁蛋白结构基因。铁蛋白为钼铁蛋白提供电子。n i f h 同时也是合成f e m o - c o 所必需的，以 及为a p o - 钼铁蛋白合成所必需 月掣d 钼铁蛋白的a 亚基，底物还原位点f e m o - c o 位于a 亚基内 n t f r钼铁蛋白的b 亚基，p - c l u s t e r 位于a p 二聚体亚基的界面内 n i f r 功能未知 n 啦l 埘y印o _ 钼铁蛋白的伴侣蛋白，n a f y 同时也是f e m o - c o 的携带者，并可能与f e m o - c o 装配入a p o - 钼铁蛋白有关 月归与n i f i k l 共同作用，形成d 2 艮四聚体t 为f e m o - o n 的台成所必需。推测可能在f e m o - c o 的 合成过程中起支架作用 n i f n与f e m o - c o 合成相关，与n i l e 共同作用形成d 擅2 四聚体 n i 与f e m o - o a 合成相关，积累含f e s m o 的前体物 以，提供固氮酶组分中f e - sc l u s t e r 的形成的分子支架 脚雷 与f e - sc l u s t e r 的合成与修复过程的s 转移相关 畸v 编码高柠檬酸合成酶，与f e m o - c o 合成相关 n 扩矽与钼铁蛋白的稳定性相关 n j z 功能未知 。 月口穸黄索还原蛋白。为k p 铁蛋白的生理还原剂 n z f m为n i f h 的成熟所必需 删 负调控蛋白 n f a 正调控蛋白，n i l 基因的转录激活蛋白 n i f b与铁钼辅因子生物合成相关。它的代谢产物，n i f b - c o 是f e m o - o n 的特定的f e 和s 供体 f a x n铁还原蛋白，在荚膜红细菌中，作为固氮酶的电子供体 月q 与f e m o - c o 的合成相关， 推测在m 0 0 4 0 的合成过程中起作用 痧 丙酮酸，黄素氧还蛋白( 铁氧还蛋白) 的氧化还原酶，在k p 中作为铁蛋白的电子供体 m f a 正调控蛋白 幔腰推测与f e m o - c o 的生物合成相关，与n i l e 类似 明 推测与f e m o - c o 的生物合成相关，与n i f n 类似 v n f x与f e m o - c o 的生物合成相关，积累f e v - c o 合成的f e s v 前体物 啦珂v n f - f e 蛋白，v f e 蛋白的电子供体，也参与f e m o - c o 的生物合成 删 铁氧还蛋白的类似物，推测是v n f f l 的电子供体 归 钒铁蛋白的d 亚基 v n f g成熟钒铁蛋白的6 亚基。可能与f e v - o n 插入4 口o - 钒铁蛋白有关 吲譬钒铁蛋白的b 亚基 耐y 与f e v - c o 的生物合成或插入有关 6 中国农业大学博士学位论文第一章固氮酶催化机制研究进展 1 4 固氮酶的结构 1 4 1 钼铁蛋白 钼铁蛋白是一个oz b ：型四聚体分子量在2 2 0 k d a 亚基和b 亚基分别由n f d 和n x 编码( 图1 - 3 ) 这两个亚基的核苷酸组成，分子量大小，以及结构都比较类似( l a m m e n1 9 8 3 ； b r i g l e n e w t o ne ta 1 1 9 8 5 ；h o l l a n d , z i l b e r s t e i ne ta l1 9 8 7 ；p e t e r s , f i s h e fe ta l1 9 9 5 ) 。a 亚基和1 3 亚基都是由三个邮型结构域组成，每对邮亚单位包含一个f c m o - _ c o 和p - c l u s t e r ，可以认为是 一个功能单位，单独的邢亚单位从未被提取出来a 亚基的三个结构域之间形成一个浅沟， f c m o - c o 就位于这个浅沟的底部。而b 亚单位相应浅沟处则由数个氨基酸残基的侧链所占据 ( r i ma n dr e e s1 9 9 2 ) ，三个结构域之间的浅沟可能是钼铁蛋白与铁蛋白的结合部位。p - c l u s t e r 位于邮亚基二聚体的界面上，而a 和p 亚基则是由通过p - c l u s t e r 对的双折叠轴互相交联。与 铁蛋白类似，钼铁蛋白的a 和p 亚基的连接正是通过p - c l u s t e r 桥连，而p - c l u s t e r 周围的盐键， 范德华力，氢键也对邮亚基的稳定起了相当重要的作用。 图i - 3 钼铁蛋白结构示意图：( ) d 霸四聚体结构；( b ) a 亚基结构；( c ) p 亚基结构( k i m a n dr e e s1 9 9 2 ) f i g u r e1 - 3a ：a vn i t r o g e n a s em o f ep r o 蛹i i a - s u b t m i t sm b l u ea n dg r e e n , a n d 争b l l i bmr e da n d o r a n g e ； b ：r i b b o nr e p t e f l e n u n i o no f m o - n i l r o g e m s em o f ep d i e j no 摹棚蛐s t r u c t t m e d o m a i n c o l o r o o d e s ：d o m a i n l = d a r k b i i e d o m a i n i i = l i g h t b l u e ；, d o m a i n i n = r e a g e n t & c ：r i b b o n 坤p f 岱锄嘶咖o f m o - n i m 聊m e m o f c 珥岫e - s u b l m i t 蛐u c h h d o m a i n c o l o r c o d e d o m a i n r = u g 衄g r e e n ；d o m a i n i f = c y e n ；d o m a i n i i f = d a r k g r e e n 7 1 4 1 2p - c l u s t e r p - d u s t e r 位于d d 砸l 基二聚体的界面上，是电子从铁蛋白传递到钼铁蛋白的最初受体。每个 p - c l u s t e r 包含8 个铁原子和7 个硫原子，由两个 4 f e - 4 s 共用一个六配位的硫原子构成。从结构 上看，两个h f e - 4 s 簇可以看作分别与来t jd 和b 亚基的3 个半胱氨酸连接。其中四个半胱氨 酸残基，a c p s - 6 2 ，d c 弹一1 5 4 。p c y s j o 和p c y s - 1 5 3 各畎一个巯基与p - c l u s t e r 的一个铁原子相 连，而刚c ”8 8 和陴y 8 9 5 分别提供一个s h 与p - c l u s t e r 腰部的两个f c 原子相连( 1 ( i ma n dr e e s 1 9 9 2 ；h o w a r d a n d r e e s l 9 9 4 ；p e t e r s ，f i s h e r e t a l l 9 9 5 ；p e t e r s ，s t o w e l le t a l l 9 9 7 ；r e e s a n d h o w a r d 2 0 0 0 ) ， 研究发现，p - c l u s t e r 在氧化态( p “，图1 - 4 ) 时，结构发生重排，和p c y s 1 5 3 相连的铁原 子与 8 f e 7 s 6 e 间的硫原子解离，而p s e r - 1 8 8 与陴y s 1 5 3 共同与此铁原子相连。此时，由删c 捧8 8 提供主肽链上的氮原子与另一铁原子相连( p e t e r s ，s t o w e l le ta 1 1 9 9 7 ；m a y e r , l a w s o ne ta 1 1 9 9 9 ) 这种结构重排的功能未知，科学家推测与电子传递时伴随的质子摄取相关。 蹙篡。 q 湖人产 岛t 。o s f t i 2岛，豫s h 一3 辞4 p h 图i - 4p d u 蛐冒的两种氧化还原态( p e t e r s , s t o w e l l 甜a 1 9 9 7 ) f i g u r ei - 4 t w o d i f