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河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙学位 文题目 醇全糖发酵高产菌株级别 硕士 学生 张建 学科 导师 陈红歌副教授 姓名专业 微生物学 姓名宋安东副教授 学位论文 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 研究生签名：乡长建导师签名：搠 一 ，、 日期：9 年6 月日 日期：口7 年易月厂。日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解 ，其中第十六条“国家鼓励清洁、高效 地开发利用生物质燃料，鼓励发展能源作物将符合国家标准的生物液体燃料纳入其燃料 销售体系一2 0 0 6 年3 月在 图6 酶解时间对d - 1 2 原生质体形成率的影响田7 酶解时间对i ) - 1 2 原生质体再生率的影响 f i g6t h ee f f e c to fa n z y m a t i ct i mt of i l7t h ee f f e o to fe n z y m a t i ct i mt o f o r m a t i o nr a t e s o f s c o r e r i s i a ed - 1 2r e g e n e r a t i o nr a t e s o fs c e r e v i s i a ed - 1 2 由图6 可以看出，随着酶解时间的延长，原生质体的形成率增加，酶解至1 5 h 时，原 生质体的形成率最高，达9 7 5 6 随着时间的延长，原生质体的形成率下降可能是因为 1 8 们 o 弓瓣谩龄 河南农业大学硕士学位论文 利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株 酶液对酵母细胞的作用时间过长，造成细胞溶解而死亡。 从图7 可以看出，随着酶解时间的延长，原生质体的再生率先升高，酶解至l h 时，再 生率最高，达3 4 ，延长酶解时问，再生率反而下降。这与高年发和周婉冰等人的研究结果 相似旧“艄1 。 综合考虑酶解时间对原生质体制备和再生的影响以及原生质体融合的需要，我们确定 1 5 h 作为最佳酶解时间。 2 6p - 0 1 原生质体的制备和再生 参照d 1 2 原生质体制备和再生条件的探讨，我们直接采用d 1 2 原生质体制备和再生的 最佳条件，即取大约1 9 处于对数生长期的p 一0 l 菌体，先采用l o m l o 1 b 一巯基乙醇，2 8 ，1 2 0 r p m 震荡处理3 0 m i n ，然后用c p b 离心洗涤3 次，加入4 m l4 m g m l 的蜗牛酶和4 m g m l 的纤维素酶混合酶液，2 8 。c ，1 2 0 r p m 震荡酶解1 5 h 。结果表明，原生质体的形成率和再生 率分别达到9 7 7 和9 9 ，已基本满足融合的要求，故没有对p 一0 l 原生质体形成和再生条 件进行深入地探讨。d 一1 2 和p 一0 1 的原生质体见图8 所示。d - 1 2 的细胞个体较大，所以其原 生质体为球状的较大的个体( 见图8 左) ；p 一0 1 的细胞个体不太匀称，有大有小，所以其原 生质体的大小差别也比较大，总体来说，其原生质体为小的圆球状个体( 见图8 右) 。 囝81 3 - 1 2 ( = 左) 和p - ( ) 1 ( 石) 的原芏质体 f i g8 t h ep r o t o p ia s t so fs t r a i nd 一1 2 ( i e f t ) a n dp - 0 1 ( r i g h t ) 3 本章小节 本文没有从影响酵母菌原生质体制备和再生的所有因素进行全方面的考虑，仅从预处理 剂的选用、酶系的选择、酶浓度和酶解时间等儿个重要冈素考虑对d 1 2 原生质体制备和再 生的影响进行了研究。而嗜鞣管囊酵母则直接采用d 一1 2 原生质体制备的最佳条件，也得到 了较为理想的原生质体形成率和再生率。 1 9 河南农业大学硕士学位论文 利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株 两种酵母菌破壁时都采用0 1 b 一巯基乙醇进行预处理3 0 m i n ，然后再用4 m l 浓度为 4 m g m l 的蜗牛酶和4 m g m l 的纤维素酶混合酶液，2 8 c ，1 2 x ) t p m 振荡酶解1 5 h 。d 1 2 和p - 0 1 的原生质体形成率和再生率分别可达到9 3 6 、1 5 9 和9 7 7 、9 9 ，基本可以满足原生质 体融合的需求，可以进行下一步的研究。 2 0 河南农业大学硕士学位论文利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株 第三章双亲原生质体的灭活、融合及融合子的检出 在常规的杂交育种中，两亲本必须要有选择性标记，以便进行有效的融合子的筛选常 用的标记是营养缺陷的突变株，但是营养缺陷型的筛选费时费力，并且不太容易得到理想的 结果。而采用双亲灭活的方法既可以省去遗传标记，又能提高筛选效率，于再生平板上生长 的茵落基本上都可以认为是融合株。 本文考虑到p - 0 1 的全能性( 指能够发酵戊糖和己糖生产酒精) ，以及紫外线的诱变效应， 对p - 0 1 的原生质体采用紫外线灭活的方法，而对d - 1 2 的原生质体则采用高温灭活的方法进 行灭活，可达到再生时排除亲株干扰的目的 微生物原生质体融合育种工作已经开展了很长时间，尤其是同种间的融合取得了丰硕的 成果，这给我们的工作增加了信心。通过双亲灭活的原生质体的融合和再生，t t c 平板初筛 和发酵复筛及同工酶谱的鉴定分析，以期得到具有双亲优良性能的融合子。 1 材料与方法 1 1 菌种 南阳酒精酵母1 3 0 8 单倍体d - 1 2 ：本实验室筛选。 嗜鞣管囊酵母p o l ：本实验室保存菌种。 1 2 培养基 ( 1 ) 粗木糖培养基：粗木糖2 0 9 l ，酵母膏3 9 l ，蛋白胨5 9 k ，琼脂2 0 9 l ，p h 值5 0 ( 2 ) y e p d 液体培养基：酵母膏1 0g l ，蛋白胨2 0g l ，葡萄糖2 0g l ，p h 值6 0 ， 分装于3 0 0 e l 三角瓶中，每瓶5 0 m 1 ( 3 ) t t c 培养基泓1 ： 上层gt t c0 5g l ，葡萄糖5 9 l ，琼脂1 5g l 下层：葡萄糖1 5g l ，木糖5g l ，蛋白胨2 0g l ，酵母膏1 0g l ，琼脂2 0g l ，p h 6 0 6 5 1 3 试剂与溶液 ( 1 ) 浓缩胶缓冲液：t r i s 3 6 6 9 加1 nh c l4 8 m l ，加t e m e d0 4 6 m l ，用重蒸水定容到 l o o m l 。 ( 2 ) 浓缩胶贮备液：丙烯酰胺2 8 9 ，加甲叉双丙烯酰胺0 7 5 3 9 ，用重蒸水定容到l o o m l ( 3 ) 0 2 8 过硫酸铵溶液：称0 2 8 9 过硫酸铵溶解于1 0 0 m 重蒸水中，即配即用 ( 4 ) 分离胶缓冲液：称t r i s5 9 8 9 ，加1 nh c l 4 8 m 1 ，加t e i l e d0 4 6 m l ，用重蒸水定 容到1 0 0 m 1 ( 5 ) 分离胶贮备液：丙烯酰胺l o g 加甲叉双丙烯酰胺2 5 9 ，用重蒸水定容到l o o m l 以上溶液，均需过滤后，置冰箱中保存 ( 6 ) 4 0 蔗糖溶液：称4 0 9 蔗糖溶解于l o o m l 重蒸水中 ( 7 ) 电极缓冲液：t r i s 6 9 加甘氨酸3 0 克，用重蒸水溶解后定容至1 0 0 0 m l ，用时稀释 2 1 河南农业大学硕士学位论文利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株 1 0 倍 ( 8 ) 染色液：称取坚牢蓝r r 盐3 0 m g ，溶于3 0 m l p h 值6 4 的磷酸缓冲液中，过滤后， 加2 m l1 a 一醋酸萘酯( 少许丙酮溶解后，用8 0 酒精配) ，l m l2 口醋酸萘酯( 同上) 于 滤液中。 ( 9 ) 0 1 的溴酚兰指示剂：称o 1 9 溴酚兰溶于l o o m l 重蒸水中。 ( 1 0 ) 考马斯亮韶f g 2 5 0 蛋白显色液的配制：将l o o m g 考马斯亮蓝g 2 2 5 0 溶于5 m l9 5 的乙 醇，加入l o m l 磷酸，然后补足水至l o o m l ，用滤纸过滤。于4 保存。 ( 1 1 ) 标准蛋白溶液：称取l o m g 牛血清蛋白( b s a ) ，溶于蒸馏水并定容至l o o m l ，制成 l o o p 咖l 溶液。 ( 1 2 ) 促融合剂：3 5 的聚乙二醇( p e g ，姗4 0 0 0 ) ，0 o l m o l lc a c l 2 ，用c p b 配制，并用 0 4 5 ) j m 微孔过滤器过滤除菌。 1 4 主要仪器设备 d y c z - 2 4 d 型迷你双垂直电泳槽北京市六一仪器厂 其他设备同2 1 4 。 1 。5 实验方法 1 5 1 嗜鞣管囊酵母h 1 原生质体的紫外灭活l 删 取p - o l 原生质体菌悬液3 m 1 于直径为6 c m 的无菌平皿( 内含大头针) 中，置于1 5 w 、 垂直距离为3 0 c m 的紫外灯下，打开皿盏，并开启磁力搅拌器开关，照射不同的时间，分别 取样稀释至1 0 、l o - 并涂布于y e p d s 平板上，2 8 c 培养3 5 天，观察其原生质体的灭活效 果。其余灭活过的原生质体悬液置于暗环境中备用。 1 5 2d - 1 2 原生质体的高温灭活1 i 取南阳酒精酵母1 3 0 8 的原生质体菌悬液3 m l 于试管中，分别于5 0 、5 5 c 、8 0 、7 0 水浴维持3 0 r a i n 、3 5 m i n 和4 0 m i n ，取样稀释至1 0 。5 、1 0 并涂布于y e p d s 平板上，2 8 c 培 养3 - - - 5 天，观察d 一1 2 原生质体的灭活效果。其余灭活过的原生质体悬液于冰箱中保存备用 ( 保存时间不应超过4 h ) 1 5 3 双亲灭活原生质体的融合 取灭活的双亲株原生质体等量( 约1 0 个m l ) 混合，低速( 2 0 0 0 r p e ，5 r a i n ) 离心后， 加入8 m l p e g ，3 0 c 温育4 0 r a i n ，用c p b 离心洗涤( 2 5 0 0 r p m ，5 m i n ) 两次，并用c p b 稀释涂 布于y e p d s 上，2 8 培养5 - 7 d ，使融合子再生 1 5 4 融合子的初筛 t t c 法帆嘲：t t c ，即氯化三苯基四氮唑盐酸盐，本身为一种物色化合物，可接受脱氢酶 所脱下的氢，将其还原成一种红色化合物，这种红色化合物不会再被氧气所氧化，其颜色的 深浅直接与脱氢酶的活力相关，将t t c 显色剂覆盖在菌落上会显现不同颜色。产酒能力强的 酵母菌落成深红色，次之为粉红色将再生平板上长出的菌落采用点种法( 用无菌牙签一一 2 2 河南农业大学硕士学位论文 利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株 点接) 接种到t i c 下层平板上，2 8 1 3 培养待长出菌落，倒入1 0 = l 上层培养基，覆盖菌落， 2 8 避光保温2 - - 4 h ，比较各菌株问的颜色深浅，颜色深的菌株呼吸酶活力强，可能有较强 的产酒精能力从平板中记下颜色较深的菌株，转接入斜面试管中，以备下一步的发酵复筛 用。 1 5 5 融合子的复筛 将初筛到的菌株经二次活化后，按1 0 的接种量接种到混合糖发酵培养基( 6 ) 中，2 8 ，1 5 0 r l m 摇床发酵3 d 。发酵结束后，测定其酒精度、残糖含量等重要指标。 1 5 6 融合子的鉴定 融合子的酯酶同工酶分析峨啪：同工酶是指具有相同催化功能而蛋白质分子结构又不相 同的一类酶。同工酶普遍存在于微生物体中利用同工酶的差异对菌株进行分类、融合菌株 的鉴定及遗传分析已有许多报道( 陈伟群和张天宇，1 9 9 4 = 张长凯等，1 9 9 5 ；林红雨等，1 9 9 9 ) 。 对融合菌株进行同工酶分析能直接反映出融合菌株的遗传背景及与双亲株的关系( 陈五岭 等，1 9 9 8 ；孙剑秋等，2 0 0 2 ) 。 ( 1 ) 电泳样品的制备 将各菌株接种到y b p d 液体培养基中，2 8 摇床振荡培养4 8 h ，。收集培养液中的菌体约 1 9 置于离心管中，分别用蒸馏水和0 1 m 磷酸缓冲液( p h 7 0 ) 各洗涤一次，再加入此种磷 酸缓冲液2 0 = i 或少量石英砂于研钵中研磨( 在冰浴中，以避免酶失活) ，4 1 3 冷冻离心机 1 2 0 0 0 r p = 离心1 5 m i n ，取上清，测定蛋白浓度，保存于4 冰箱中，备用。 ( 2 ) 蛋白质的定量一一b r a d f o r d ( 1 9 7 6 ) 方法刚 标准曲线制作：按表8 的溶液配方，摇匀，放置2 = i n 后在5 9 5 n m 波长比色测定( 比色测定 在l h 内完成) 表8 标准曲线制作 t a b8t h ep r o t r a c to fs t a n d a r dc u r v e 样品测定：加入0 i = i 样品提取液再加入0 9 = 1 蒸馏水，5 = i 考马斯亮蓝g 一2 5 0 试剂， 充分混合，放置2 m i n 后，以标准曲线1 号管作参比，在5 9 5 n = 波长下比色记录吸光值。利用标 准曲线即可褥到样品中的蛋白质含量 2 3 河南农业大学硕士学位论文 利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株 0 5 0 4 趔0 3 呆 擎0 2 0 1 0 02 04 06 0 8 01 0 01 2 0 蛋白值含量( p g ) 田9 测定蛋白质含量的标准曲线 f i g9 t h es t a n d a r dc u f v oo fp r o t e i n ( 3 ) 凝胶制备 7 5 的分离胶的配制：按1 3 中的溶液( 1 ) ：( 2 ) ：重蒸水：( 3 ) = l ：2 ：1 ：3 的比例 配制。 4 的隔层胶的配制：按4 1 3 中的溶液( 4 ) ：( 5 ) ：( 6 ) ：( 3 ) = 1 ：2 ：l ：3 的比例配制。 ( 4 ) 加样 用移液枪按每个点样孔进样量为2 0 p l ( 内含2 p l0 1 的溴酚兰指示剂) 加样。 ( 5 ) 电泳 采用p h 值8 3 的t r i s 甘氨酸缓冲液，电泳开始时采用8 0 v 的电压，待所有的样品都 进入分离胶后将电压调至l o o v ，待指示剂移动到离下层电泳液水平面i c m 处即可关闭电 源。停止电泳 ( 6 ) 染色 电泳完毕将脱去的凝胶立即转移至染色液中，3 7 1 2 避光染色3 0 m i n ，即可出现棕红色的 酯酶同工酶谱带，然后用水漂洗几次，置于7 醋酸中保存 1 5 7 融合子的遗传稳定性试验 在租木糖培养基上，采用连续传代的方法测试融合菌株的遗传稳定性，每代都测定其酒 精度，并与初代相比，判断其遗传稳定性 2 结果与分析 2 1p - 0 1 原生质体紫外灭活条件的研究 微生物原生质体紫外灭活的机理可能是因为紫外线对原生质体造成的致死损伤主要集 中在d n 上，而且在不同的原生质体细胞中作用为之可能存在很大差别嘲同时，紫外灭活 还可以将有诱变与杂交结合起来，可以达到更好的达到菌株改造的目的嘲 我们从p - o i 原生质体悬液中取3 m l 于直径为6 c m 的平皿中，置于1 5 w 、垂直距离为3 0 c n 2 4 河南农业大学硕士学位论文利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株 的紫外灯下照射一定时间。取出后稀释一定梯度，涂布y e p d s 平板，观察其灭活效果，如表 6 所示： 衰6 亲株p - 0 1 原生质体灭活结果 t a b6u y - i n a c t i v a t i o ( 1r e s u i t so ft h ep a r e n tp - 们p r o t o p i a s t 注：+ + 表示有较多菌落生长；+ 表示有较少葛落：一表示无菌落生长 从表6 可以看出，p - 0 1 的原生质体照射4 5 s 时即可灭活，为了保证p _ 0 1 的原生质体能 够彻底灭活，我们最后决定选用紫外照射6 0 s 作为p _ 0 1 最后的灭活条件。 2 2d - 12 原生质体高温灭活条件的研究 微生物原生质体高温灭活的机理主要是高温使细胞内的核糖体或核糖体r n a 受到损伤， 结果使细胞内的功能蛋白、酶蛋白的合成受到影响或使其变性失活，产生致死作用。 我们取d 1 2 菌株的原生质体菌悬液3 m l 于一定温度的水浴锅中维持一定时间，取出后 稀释一定梯度，涂布于y e p d s 平板，观察灭活效果，如表7 所示： 表7 亲株d 1 2 原生质体高温灭活结果 t a b7h e a t i n a o t i v a t i 0 1 1r e s u l t so ft h ep a r e n td - 1 2p r o t o o i a s t 注：+ + 爱示有大量百滔，+ 表示有菌滔，一表示无面滔 从表7 可以看出，d - 1 2 原生质体在7 0 水浴锅中维持3 5 m i n 以上时间，即可彻底将d 1 2 的原生质体彻底灭活，因此我们选用7 0 1 2 高温灭活3 5 m i n 作为d - 1 2 的最佳灭活条件 2 3t t o 平板初筛结果 t t c 可以接受脱氢酶所彳导的氢，将其由物色还原为红色化合物。脱氢酶的有无或多少， 直接影响红色的深浅或有无酒精酵母在给予充足葡萄糖时，发酵比较彻底，这是它的脱氢 酶的多少和酒精产率有正比关系产酒率越高的菌株脱氢酶一般越多，t t c 接受氢也就越 多，红色越深，反之越浅。 从再生平板上一共挑取了5 0 0 多个菌落进行t 1 1 c 平板的显色试验，结果显示有1 0 0 个菌 落的颜色较之p - 0 1 颜色深或与其相当( p - 0 1 的在t t c 平板上的颜色比d - 1 2 的颜色深) ，我 们对这1 0 0 多个菌落进行了发酵复筛试验 2 4 采用全糖发酵对融合子的复筛 通过t t c 平板得初筛，淘汰了大部分的产酒精的菌株，但仍然有较多的菌株有待比较， 况且由于平板的误差较大，因此要想筛出高产酒精的菌株，还需要经过准确度更高、更直接 2 5 河南农业人学硕一l ：学位论文利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇拿糖发酵高产菌株 的二角瓶发酵实验。本试验筛选的是能够发酵全糖生产乙醇的菌株，冈此选用全糖发酵培养 基。 采用全糖发酵培养基对这1 0 0 多个融合子进行了发酵试验，部分融合子的发酵结果如表 8 所示： 表8 部分融合子的发酵结果 t a b8t h ef e r m e n t a t0 1 3r e s ut so fs e v e r af u s a n t s 从表8 可以看出，在t t c 平板上颜色深的菌落发酵性能并不都是很好。我们对其中的 2 0 几株发酵性能较p 一0 1 好的菌株又进行了重复发酵，只有f i o 的发酵液中酒精度一直稳定 在1 3 左右，比其亲株p 一0 1 高出了3 6 8 。这一株酵母菌很可能是我们所需要的能够同时 发酵葡萄糖和小糖高效产酒的融合子，但它是不是融合子，还有待进一步的鉴定。 2 5 融合子的酯酶同工酶电泳图谱 双亲株p 一0 1 和d 一1 2 及融合子f i o 的酯酶同t 酶图谱见图1 0 所示： ) ( ) 1d l2f1o 图1 0 融合子f i o 及亲株的酯酶同工酶电泳图谱 2 6 河南农业大学硕士学位论文 利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株 f i l1 1 t h ei s o z y l i - g r a p ho ft h ef u l a n tf i oa n di 阻r e n t ls t r a i n i l 从双亲株及融合株的酯酶同工酶条带可以看出，融合子f i o 具有其双亲的特征性条带， 表现为双亲酶带的组合，但是融合子所具有的沪1 2 的特征性条带明显很浅，说明融合菌株 同时具有来自双亲株的基因组。而且融合过程中双亲株的基因组发生了重组，引起同工酶基 因间的抑制表达发生变化，从而使降低了亲株p 1 2 酯酶基因的表达量。但是从酒精产量上 来看，融合子卜1 0 具有双亲的优良性状( 具有良好的发酵戊糖和己糖生产酒精的能力) 。 2 6 融合子的遗传稳定性试验 为了验证融合子的稳定性，以及排除异核体的干扰和回复突变的发生，将融合子f i o 在粗木糖培养基上传了8 代，并对各代进行发酵，测定其酒精度，结果见表1 0 所示。 裹1 0 融合子f 1 0 的传代发酵试验 t a b1 0t h ef e r m n t a t i o nr e s u i t so fs e v q r l l l ig e n e r a t i o n so ff u s a n tf i o 从表1 0 可以看出，f i o 的各代酒精度一直稳定在1 3 m l l o o m l ，残留总糖的量也稳定在 0 o t g l o o m l 左右，其发酵性能没有出现明显的下降或升高，这表明融合子f i o 在遗传上的 稳定性，有利于对其进行下一步的应用研究。 3 本章小节 通过对双亲原生质体灭活条件的研究，我们得到了较为理想的灭活条件沪1 2 原生质 体采用7 0 水浴处理3 s h i n 即可将其彻底灭活。p _ 0 1 的原生质体悬浮液采用紫外线照射6 0 s 也可彻底灭活。 大量的实验表明t t c 初筛平板( 常用于呼吸缺陷型的筛选) 可以有效的排除大部分产酒 能力差的菌株，同时，经过竹c 平板的初筛，全糖发酵的复筛和酯酶同工酶电泳图谱的鉴定 以及遗传稳定性实验，我们筛选到了一株能够高效利用葡萄糖和木糖生产乙醇且遗传学稳定 的融合子f i o 下一步准备将其直接用于发酵玉米秸秆的水解液，以测试其在实际生产中的 性能 - 2 7 河南农业大学硕士学位论文利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株 第四章融合子f i o 发酵秸秆水解液试验研究 通过原生质体融合得到了一株在纯糖培养基上发酵性能良好的菌株f i o ，但是我们的最 终目的是要将其应用到玉米秸秆水解液的发酵中去。因此我们又研究了融合子f i o 对玉米秸 秆水解液的发酵性能，获得了一些关键参数，包括糖的消耗和酒精度等。 1 材料与方法 1 1 菌种和原料 f i o 筛选得到的融合子 原料：玉米秸秆粉( 6 0 目) 1 2 培养基 ( 1 ) 菌种活化固体培养基：粗木糖2 0g l ，酵母浸汁3g l ，蛋白胨5g l ，琼脂2 5g l ， p h 5 0 。1 2 1 灭菌3 0 m i n 后，备用 ( 2 ) 菌种活化液体培养基：粗木糖2 0 9 l ，酵母膏3g l ，蛋白胨5g l ，p h 值5 5 3 0 0 r a l 三角瓶中，每瓶分装6 0 m l 。1 2 1 灭菌3 0 m i n 后，备用。 1 3 试剂 ( 1 ) 1 的稀硫酸：将5 5 5 m 1 9 8 9 6 的浓硫酸稀释至1 0 0 0 m l 即为1 的稀硫酸。 ( 2 ) 4 0 c a ( o h ) 2 ：称取6 6 6 7 9c a ( 傩) 2 溶于l o o m l 蒸馏水中 ( 3 ) 小麦纤维素酶( 4 0 0 i u m l ) ：无锡杰能科酶制剂有限公司。 ( 4 ) 小麦木聚糖酶( 2 0 0 0 i u m l ) ：无锡杰能科酶制剂有限公司。 1 4 主要仪器设备 u v 7 5 2 型紫外分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) p h s - 3 c 型精密p h 计( 上海雷磁仪器厂) 酒精度计( 浙江余姚黄家埠玻璃仪器厂) h z q - q 型振荡器( 东联电子技术开发有限公司) 1 5 实验方法 1 5 1 玉米秸秆糖化液的制备 准确称取6 0 目的玉米秸秆粉1 0 9 ，按l ：l o 的固液比加入l o o m l1 的稀硫酸，用封口 膜封口，1 2 1 c 高温预处理l h 取出后用4 0 的c 8 ( 傩) 2 调节p l i 值至4 8 ，按0 5 m l g 秸 秆加入小麦纤维素酶，按0 2 m l g 秸秆加入小麦木聚糖酶，4 5 ( 2 ，1 2 0 r p m 摇床振荡糖化4 8 h 糖化结束后用滤纸过滤，除去未糖化的秸秆残渣，按照3 9 l 的量添加酵母膏、5 9 l 添加蛋 白胨、0 2 9 l 添加尿素、0 1 9 l 添加磷酸氢二铵、0 1 m l 4 0 0 m l 添加土温8 0 、0 o l g 4 0 0 m l 添加聚乙二醇、0 2 5 9 4 0 0 m l 添加l 一谷氨酰胺，然后用4 0 5 的c a ( 伽) ：调节p h 值至5 5 ， 按每瓶装液量为9 0 m 1 分装到3 0 0 r a l 三角瓶中，封口后，1 2 1 灭菌1 5 - - - 2 0 r a i n 备用。同时 取过滤后的糖化液，稀释合适的倍数，分别用d n s 法和地衣酚法测定其总还原糖含量和木糖 含量。 2 8 河南农业大学硕士学位论文利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株 1 5 2f i o 发酵玉米秸秆水解液试验 ( 1 ) 菌种的一次活化 将保藏菌种f i o 接种于固体培养基斜面中，2 8 培养2 d ( 2 ) 菌种的二次活化 将培养后的斜面试管活化菌种接入向装有6 0 1 1 菌种活化液体培养基的3 0 0 m l 三角瓶内， 每瓶接种3 环，在1 5 0 r p m ，2 8 条件下摇床培养3 0 h 。 ( 3 ) 玉米秸秆糖化液的发酵 以1 0 的接种量将活化菌种培养液接入玉米秸秆糖化液中，2 8 ，1 2 0 r l 瑚条件下进行摇 床发酵1 2 0 h 每隔1 2 h 取样测定发酵体系中的关键参数，如菌体o d 锄、残留总糖含量、残 留木糖含量和酒精度。 2 结果与分析 2 1 发酵过程中糖消耗分析 在玉米秸秆的稀酸预处理后，采用双酶糖化得到总还原糖含量为4 5 9 l o o m l 的玉米秸 秆水解液。当液体活化菌种接入后，每1 2 h 取发酵液进行总还原糖和木糖含量测定，得到发 酵过程中木糖和葡萄糖的利用规律，如图1 1 所示 o 辱 毛 釜 隧 瞄 面 舳 髅 2 5 2 发酵时问f l l l 勰时伺t h ) 图1 1f io 在发酵玉米秸秆水解液过程囝12f io 在发酵玉米秸秆水解液过程 中残留总糖含量分析中残留木糖含量分析 f i g1 1a n a l y s et h er e s i d u a ls u g a rd u r i n gf i e1 2a n a l y s et h er e s i d u 8 lx y l o s ed u r i n l f e r m e n t a tio no fe a r ns t r a wh y d r oly z a t e 8 f e m e n t a tio no fe a r ns t r a wh y d r oiy z a t e s 对比图l l 、1 2 可以看出，p - 0 1 在开始发酵的3 6 h 之内，糖化液中残糖量已经下降到非 常低的水平( 0 5 9 1 0 0 1 ) ，而且随着发酵的继续，总糖含量基本上维持不变至发酵结束 时，p - 0 1 对总糖的利用率可达8 5 7 ，i 。d - 1 2 在发酵开始1 2 h 后，基本上已经不再消耗水解 液中的糖，至发酵结柬，其对总糖的利用率可达5 3 9 。而f i o 在开始发酵的2 4 h 之内，葡 萄糖已经基本被消耗完毕，2 4 h 之后葡萄糖的消耗速率逐渐减慢，至8 4 h 时葡萄糖利用率基 2 9 岱 ， 帖 。 奇；-ooi。)缸鼷擘长 s 5 5 3 5 2 5 l 5 o 4 3 2 l o 河南农业大学硕士学位论文利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙酵全糖发酵高产菌株 本不再变化，其最大利用率可达8 9 5 。木糖在发酵初始阶段利用缓慢，在2 4 h 之后含量才 明显下降，其最大利用率达到9 0 8 ，总糖利用率最高可达9 0 1 这表明p - 0 1 可能在发酵 初期能够迅速利用糖化液中的还原糖进行菌体生长并产生乙醇，而f i o 消耗还原糖的速率较 慢，发酵产生乙醇将会持续较长时间。 2 2 发酵过程中酒精度的变化 在玉米秸秆水解液的发酵过程中，对酒精度随发酵时间的延长而变化的规律进行了初步 研究，试验结果如图1 3 所示： l 2 1 盆他 8 言 ：0 4 叠 心 0 2 o 越 发群时问h ) 田1 3 玉米穑秆水解液发酵过程中酒猜度的变化 f i g1 3t h ev a r i a t i o no fe t h a n o ip r o d u c t i o nd u r i n gf e m e n t a t i o no fo o r ns t r a wh y d r o l y z a t e s 从图1 3 可以看出，p - 0 1 随着发酵时间的延长，酒精度逐渐增加。至7 2 h ，达到最大值， 为0 6 m l l o o m l 。d 1 2 在发酵至2 4 3 6 h 时，酒精度已经达到最大值( 0 3 m l l o o m l ) 而 f i o 在发酵玉米秸秆水解液时，酒精度在0 1 2 h 内基本上为0 ，1 2 2 4 h 有大幅增长，而后 增长缓慢，到7 2 h 时酒精度达到最大值。为1 1 m l l o o m l 糖化液。而后酒精度逐渐下降。这 可能是由于在发酵后期，由于碳源的耗竭而使酵母菌开始利用乙醇作为碳源物质，从而使乙 醇产率下降。从整个过程来看，在发酵7 2 h 时酒精度达到最大值，1 1 m l 1 0 0 m l 。此时，应 该终止f i o 的酒精发酵。 3 本章小节 通过对融合子发酵玉米秸秆水解液试验研究，我们得出了以下结论：由于玉米秸秆水解 液中含有多种不同的单糖，融合子对它们利用的先后顺序不同，即葡萄糖先被利用，而后利 用木塘：融合子发酵玉米秸秆水解液时酒精度最高可达1 1 m l l o o m l ，远远高于其亲株p - 0 l ( 0 6 m l l o o m l ) 和d _ 1 2 ( 0 3 m l l o o m l ) 3 0 - 河南农业大学硕士学位论文利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株 第五章结论与讨论 1 结论 ( 1 ) 南阳酒精酵母1 3 0 8 单倍体d - 1 2 的原生质体制备和再生的最佳条件是：菌龄9 h 、 采用0 1 b 一巯基乙醇预处理3 0 r a i n ，4 m g i n k 的蜗牛酶和4 m g m l 的纤维素酶混和酶液酶解 1 5 h ，其原生质体的形成率和再生率分别为9 3 6 和1 5 9 ；嗜鞣管囊酵母p - 0 1 原生质体制 备和再生的条件是：菌龄2 1 h ，采用采用0 1 b 一巯基乙醇预处理3 0 m i n ，4 m g 珥l 的蜗牛酶 和4 m g m l 的纤维素酶混和酶液酶解1 5 h ，其原生质体的形成率和再生率分别为9 7 7 和 9 9 。 ( 2 ) 亲本菌株d - 1 2 原生质体的高温灭活条件为：7 0 水浴处理3 5 r a i n 即可彻底灭活； 亲本菌株p - 0 1 原生质体紫外灭活条件为：采用1 5 w 的紫外灯、垂直距离为3 0 c m 照射6 0 s 即可彻底灭活。 ( 3 ) 采用4 0 的p e g 4 0 0 0 作为融合剂诱导灭活的d - 1 2 和p - o i 原生质体融合，经过筛 选和鉴定，得到了一株发酵纯糖性能良好的融合子f i o 。发酵6 的全糖培养基时，酒精度达 到1 3 m 1 1 0 0 m 1 ( v v ) ，比亲株p - 0 1 高出了3 6 蹋。 ( 4 ) 对融合子f i o 发酵玉米秸秆水解液进行了试验研究，结果表明f i o 在发酵玉米秸 秆水解液时，优先利用葡萄糖，而后利用木糖；f i o 发酵玉米秸秆水解液( 糖含量为4 5 ) 时酒精度最高可达1 i m l 1 0 0 m l ( v v ) ，高于其亲株p - 0 1 的o 6 m l 1 0 0 m 1 和d - 1 2 的 0 3 m l l o o m l 2 讨论 ( 1 ) 我们采用不同的灭活方法对双亲原生质体进行灭活，不同的灭活方法对菌株的损 伤部位不同，不同的损伤部位融合后可以相互弥补各自的不足，从而使融合子能够在再生平 板上生长双亲灭活原生质体融合技术，省去了使出发菌株获得稳定遗传标记的过程，灭活 亲株原生质体的方法又易于掌握，而且可以在不利用选择培养基的情况下，排除双亲本类型 的再生产物，有利于选择重组融合子，提高了筛选效率。同时，紫外线灭活还具有诱变效应， 进一步提高了菌株突变的效率。 虽然双亲灭活原生质体融合技术可显著缩短融合工序和时间，提高筛选效率，但是融合 的频率明显低于单亲株( 融合频率大约为1 0 1 0 - s ) 或双亲株原生质体全活( 融合频率大 约为1 0 - 。1 0 。3 ) 的情况，因此从某种意义上来说，需要大量的进行融合子的筛选。才能 得到比较理想的融合子 ( 2 ) 本试验由于时间的关系，对融合子的鉴定只进行了酯酶同工酶电泳图谱和发酵性 能的对比分析，而没有采用更多的鉴定方法对融合子进行鉴定，例如菌落形态的对比、d n a 含量的分析以及可溶性蛋白电泳图谱的分析等等因此，我们觉得下一步应该采用更多的方 法对融合子作深入地鉴定分析试验。 ( 3 3 我们通过双亲灭活原生质体融合的方法得到的融合子f i o ，在发酵玉米秸秆水解 3 l 河南农业大学硕士学位论文 利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株 液时，发酵醪中酒精度达到了1 1 m l l o o m l ，远远高于其双亲菌株。但是在总糖的利用上， f i o 与p - 0 1 相差不大，甚至p - 0 1 对木糖( 9 4 4 ) 的利用稍优于f i o ( 9 0 7 ) ，这可能是由 于p _ 0 1 利用糖生成了大量的菌体，而f i o 能高效的发酵全糖生成乙醇。当然，这还有待进 一步的茵体含量的验证。 尽管我们采用原生质体融合来构建菌种工作取得了一定进展，但是与真正的工业化应 用，还有相当大的差距。随着分子生物学、基因工程和蛋白质工程技术的不断发展，研究者 试图采用基因工程等新的手段来对目的菌株进行改造，而且在这方面也取得了很大的成功 下一步我们可以利用基因敲除对嗜鞣管囊酵母中的乙醇脱氢酶进行敲除，以提高该菌株产乙 醇的能力；通过代谢工程的手段来构建戊糖转化率高的菌株( 木糖醇脱氢酶和木糖还原酶活 力高) 等，早日获得性能更加优良的的纤维燃料乙醇全糖发酵菌种，为纤维燃料乙醇的产业 化提供技术保障。 3 2 河南农业大学硕士学位论文利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株 参考文献 1 3 张雷中国能源供应战略的调整中国能源，1 9 9 9 ，3 ：1 2 1 4 e 2 】闫长乐中国能源发展报告。北京：经济管理出版社，1 9 9 4 3 于旭波中粮集团中国生物质能源旗舰北京，中国生物质能源论坛。2 0 0 6 4 王述祥，谭文英生物质液化燃油的开发前景及可持续发展意义科技日报，2 0 0 0 ，6 ：5 2 5 5 5 余燕春利用农林纤维废弃物生产酒精的社会效益江西林业科技，1 9 9 6 ，6 ：1 8 2 0 6 余世袁林产资源的生物转化与利用南京林业大学学报，2 0 0 0 ，2 4 ( 2 ) ：1 - 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一 6 1 2 1 i n g r a i nl o ，xl a ie t i n ：b cs a h aa n dj w o o d w a r d ，e d s f u e l sa n dc h e m i c a l sf r o m b i o m a s s w a s h i n g t o nd c ：a m e r i c a nc h e m i c a ls o c i e t y ，1 9 9 7 ，5 7 7 3 - 3 3 河南农业大学硕士学位论文利用原生质体融合技术构建纤维燃料乙醇全糖发酵高产菌株 2 2 k r i s h n a nm s ，yx i a ，nw y h o e ta 1 i n ：b cs a h aa n dj w o o d w a r d ，e d s w a s h i n g t o n d c ：a m e r i c a nc h e m i c a ls o c i e t y ，1 9 9 7 ，7 4 9 2 2 3 陈驹声传统和最新的酒精生产技术北京：化学工业出版社，1 9 9 0 2 4 马晓建，陈银峰，祝春进，等以纤维素类物质为原料发酵生产燃料乙醇的研究进展食品 与发酵工业，2 0 0 4 ，3 0 ( 1 1 ) ，7 7 8 l 2 5 鲍晓明，高东，曲音波，等木糖代谢基因表达水平对酿酒酵母重组菌产物形成的影响生 物工程学报。1 9 9 7 ，1 3 ( 4 ) ：3 5 5 3 6 1 2 6 毛华，曲音波，高培基，等酵母属间原生质体融合改进木糖发酵性能生物工程学 报，1 9 9 6 ，1 2 ( 增) ：1 5 7 1 6 2 2 7 田沈，刘然，刘春燕，等固定化z y m o m o n a sm o b