（微生物学专业论文）假单胞菌表达载体的构建及金属硫蛋白的表面展示.pdf

华中农业大学硕士学位论文 摘要 本研究利用恶臭假单胞菌a b 9 2 0 1 9 的o p r l 基因启动子构建了一个假单胞菌 表达载体，并采用绿色荧光蛋白基因g f p 作为报告基因对该载体的表达性能和在 受体菌中的稳定性进行了考察；在此基础上，以冰核活性蛋白n 结构域为运载 蛋白，采用c 端融合的方法，分别将绿色荧光蛋白和金属硫蛋白成功展示在恶 臭假单胞菌a b 9 2 0 1 9 菌株的细胞表面，并分别对重组菌株展示g f p 的性能及其 对c d 2 + 、c u 2 + 、m n 2 + 等几种重金属离子的全细胞吸附性能进行- j n 定。 将p c r 扩增得到的恶臭假单胞菌a b 9 2 0 1 9 菌株中肽聚糖相关脂蛋白编码基 因的启动子p o p r l 片断和质粒载体p t r c h i s b 的多克隆位点片段插入到质粒载体 p u c p l 8 的e c o ri h i n d l i i 位点，获得了重组表达载体p y m b 0 3 。用咖作为标 记基因进行外源蛋白表达的结果表明，该载体能分别在恶臭假单胞菌a b 9 2 0 1 9 菌株和大肠杆菌d h 5 a 菌株中由p o p r l 启动组成型表达g f p 蛋白，并使细胞产 生可见荧光。经s d s p a g e 验证，所产生的g f p 蛋白分别占细胞总蛋白的1 2 5 和5 o 。重组菌株y m b 0 0 1 中g f p 表达量与菌体培养时间有关，在稳定期后期 其相对荧光强度达到最大值6 2 2 3 3 ，但与培养温度未见相关性。对携带该载体的 重组恶臭假单胞菌7 次1 6 8 h 继代培养测定，载体p y m b 0 3 的稳定性均为1 0 0 。 在构建的恶臭假单胞菌表达载体p y m b 0 3 的o p r l 启动子下游，通过插入冰 核活性蛋白n 末端结构基因( i n a k - n ) ，构建了以冰核活性蛋白n 端结构域作 为锚定模体的恶臭假单胞菌表面展示载体p y n ，然后将g y p 基因编码区插入展 示载体p y n 得到融合基因i n a k - n g f p , 将重组质粒电转化导入恶臭假单胞菌 a b 9 2 0 1 9 菌株，构建得到恶臭假单胞菌表面展示重组菌y n p 。对重组菌y n p 进行了细胞组分的分级分离，测定了细胞质、细胞内膜以及细胞外膜这三个组 分的荧光强度，并经w e s t e r n b l o t 证实融合蛋白i n a k n g f p 成功定位在恶臭假 单胞菌受体菌细胞外膜。 利用所构建的假单胞菌细胞表面展示载体，选择具有重金属吸附特性的金属 硫蛋白作为乘客蛋白，进一步构建了含融合基因i n a k - n 居m t a 、m a k - n ( s m t a ) 2 、 m a k - n ( s m t a ) 3 和i n a k - n ( s m t a ) 4 的系列重组质粒p y n s 、p y n 2 s 、p y n 3 s 和p y n 4 s ，经电转化恶臭假单胞菌a b 9 2 0 1 9 后，分别得到相应的重组菌株y n s 、 y n 2 s ，y n 3 s 和y n 4 s 。将这四株重组菌株分别在1 6 、2 0 、2 4 、2 8 华中农业大学硕士学位论文 和3 7 下培养，进而考察了他们对c d 2 + 、c u 2 + 、m n 2 + 三种重金属离子的吸附性 能。结果表明，表面展示2 个串连拷贝金属硫蛋白的重组菌y n 2 s 在2 4 培养 2 4h 后对这三个重金属的吸附效果最优，每毫克干重菌体的全细胞吸附量分别达 到6 2 1 0 + _ 6 7 0n m o lc d 2 + 、7 1 5 4 _ + 5 9 8n m o lc u 2 + 和8 9 8 6 1 0 5n m o lm n 2 + 。将重组 菌y n 、y n s 和y n 2 s 置于含有高浓度c d 2 + 、c u 2 + 和m n 2 + 三种重金属离子的 溶液环境中，考察其耐受性，结果显示，重组菌耐重金属性能均强于出发菌株， 其中以重组菌y n 2 s 的耐受能力最强。 关键词：细胞表面展示恶臭假单胞菌冰核活性蛋白n 结构域金属硫蛋白 l i 华中农业人学硕士学位论文 a b s t r a c t as t a b l ep s e u d o m o n a se x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t r u c t e dw i t ht h ep r o m o t e ro f o p r lg e n ec l o n e df r o mp s e u d o m o n a sp u t i d aa b 9 2 0 1 9 e x p r e s s i o ne f f i c i e n c yo ft h e v e c t o ri sd e t e r m i n a t e db ye m p l o y i n gg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( g f p ) g e n ea st h e r e p o r t e r , a n dt h es t a b i l i t yo ft h ev e c t o ri nt h eh o s ts t r a i ni sd e t e r m i n a t e da sw e l l f u r t h e rm o r e ，ac e l ls u r f a c ed i s p l a yv e c t o rf o rp s e u d o m o n a so nt h eb a s i so f e x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t r u c t e db yu s i n gi c en u c l e a t i o np r o t e i nn d o m a i n ( i n a k - n ) a sa n c h o r i n gm o t i f g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i na n dm e t a l l o t h i o n e i nw e r es u c c e s s f u l l y d i s p l a y e do nt h es u r f a c eo fp s e u d o m o n a sp u t i d a ，r e s p e c t i v e l y , b yt h ew a yo f c - t e r m i n a lf u s i o nt ot h en - d o m a i no fi c en u c l e m i o np r o t e i n ，a n dt h ea b i l i t i e so f b i o a d s o r p t i o no fs e v e r a lh e a v ym e t a li o n so fr e c o m b i n a n ts t r a i n sw e r ed e t e r m i n e d a 3 8 0 - b p so fp c r a m p l i f i e dp r o m o t e rs e q u e n c eo fp e p t i d o g l y c a n - - a s s o c i a t e d l i p o p r o t e i ne n c o d i n gg e n e ( e o p r l ) f r o m 只p u t i d aw i l d - t y p es t r a i na b 9 2 0 1 9 ，a n da m c sf r a g m e n tf r o me s c h e r i c h i ac o l ip l a s m i dv e c t o rp t r c h i s - b ，w e r ei n s e r t e di n t o e c o ri h i n d l i i s i t e so fp l a s m i dv e c t o rp u c p l 8t o g e n e r a t eap s e u d o m o n a ss h u t t l e e x p r e s s i o n v e c t o r p y m b 0 3 e x p r e s s i o n d e t e r m i n a t i o n b ye m p l o y i n gg r e e n f l u o r e s c e n c ep r o t e i n ( g f p ) a st h er e p o r t e r , s h o w e dt h a tg f pc a nb ec o n s t i t u t i o n a l l y e x p r e s s e de i t h e ri nr e c o m b i n a n tpp u t i d ay m b 0 0 1o rt r a n s f o r m e de c o l id h 5 a h a r b o r i n gt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp y m b p ,w h i c hi n i t i a t e db yt h ei n t r o d u c e d p r o m o t e r ( p o p r l ) o fp y m b 0 3 c o n s e q u e n t l y , t h eh o s t sa r ei l l u m i n a n tt h r o u g ht h e o p t i c a lf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p i ce x a m i n a t i o n s d s p a g ea n a l y s i sc o n f i r m e dt h a t e x p r e s s e dg f p sc o m p r i s i n ga p p r o x i m a t e l y1 2 5 a n d5 o ft h et o t a lc e l l u l a rp r o t e i n s ， r e s p e c t i v e l y , i ny m b 0 0 1a n dt r a n s f o r m e de c o l id h 5 a g f p y i e l d i n gi ny m b 0 0 1 w a sm o d u l a t e db yt h ec u l t u r et i m e ，a n di tr e a c h e dt h em a x i m u ml e v e lw h e nc e l l s g r o w ni n t ot h es t a t i o n a r yp h a s e ，w h e r e a sr e l a t i v e l yl i t t l ei m p a c tw a sf o u n db yt h e c u l t u r e t e m p e r a t u r e a d d i t i o n a l l y , b yd e t e r m i n i n gt h es u c c e s s i v eg r o w t ho ft h e r e c o m b i n a n ts t r a i ny m b 0 0 1 y m b 0 0 2i nt h ea b s e n c eo ft h ea n t i b i o t i c ，i ts h o w e dt h a t t h es t a b i l i t yo ft h es h u t t l ee x p r e s s i o nv e c t o rp y m b 0 3w a s1 0 0 w h e ni n o c u l a t i n gi n s u c c e s s i o nf o r7t i m e sa n dc u l t u r i n gf o r16 8h i i i 华中农业大学硕士学位论文 ap s e u d o m o n a sc e l ls u r f a c ed i s p l a yv e c t o rp y nw a sc o n s t r u c t e db yi n s e r t i n g i n a k - ng e n ei n t ot h ed i r e c td o w n s t r e a mo fp o p r lo fp y m b 0 3 g f ps u c c e s s f u l l y d i s p l a y e do nt h ec e l ls u r f a c eo fpp u t i d ab yi n s e r t i n gg f g e n ei n t ot h ev e c t o rp y n ， c o n s e q u e n t l y , t r a n s f o r m i n gi n t ot h epp u t i d ah o s ts t r a i n t h el o c a t i o no ff u s i o n p r o t e i ni n a k n g f po nt h e c e l ls u r f a c ew a sp r o v e nb yc e l lf r a c t i o n a t i o na n dw e s t e r n - b 1 0 t a i m i n g a t a p p l i c a t i n g t h ec e l ls u r f a c ed i s p l a yv e c t o r m o r ew i d e l y , a m e t a l l o t h i o n e i n ( s m t a ) c a nb i o a c c u m u l a t ev a r i o u st o x i cm e t a li o n sw a s f u s e dw i t h t h ei n a k - n ，a n das e r i e so fr e c o m b i n a n tp l a s m i d s ( p v n s ，p y n 2 s ，p y n 3 s ，p y n 4 s ) ， 1t o4t a n d e mr e p e a t ss m t ag e n ew a sf u s e dw i t hi n a k - ng e n er e s p e c t i v e l y , w e r e c o n s t m c t e d w er e p o r ta b i l i t i e so fb i o a c c u m u l a t i o no fc d 2 + 、c u 2 + 、m n 2 + o ft h e r e c o m b i n a n tp p u t i d as t r a i n s ( y n s ，y n 2 s ，y n 3 s ，y n - 4 s ) h a r b o r i n gt h e s e p l a s m i d s ，r e s p e c t i v e l y , i nt h ed i f f e r e n tc u l t u r a lt e m p e r a t u r e i ts h o w s t h a ty n - 2 s ( t w o t a n d e mr e p e a t ss m t ac e l ls u r f a c ed i s p l a y e d ) c a nb i o a c c u m u l a t eb e s t ( e v e r ym gd r y w e i g h tc a nb i o a c c u m u l a t e6 2 1 0 + 6 7 0n m o lc d 2 + ，7 1 5 4 5 9 8n m o lc u 2 + ，8 9 8 6 _ + 1 0 5 n m o lm n 2 + ) w h e ni tw a sc u l t u r e da t2 4 ，a n di ts h o w sm u c hm o r et o l e r a n c et o e n v i r o n m e n tw i t hh i g l lc o n c e n t r a t i o no ft h e s e t o x i cm e t a l s k e yw o r d s ：c e l ls u r f a c ed i s p l a y ；p s e u d o m o n a sp u t i d a ；i c e n u c l e a t i o np r o t e i n n d o m a i n ；m e t a l l o t h i o n e i n l v a p b p c b c m c a s e c p e c s g f p g p i i m d 咿 m t s o d o m o m p c p a l p c r s d s s d s p a g e s t e 1 1 b t e m e d y m t k d a 缩略语表 a m p i c i l i n b a s ep a i r c a r b e n i c i l i n c a r b o x ym e t h y lc e l l u l a s e c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s y n t h e t i cp h y t o c h e l a t i n s g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n g l y c o s y lp h o s p h a t i d y l i n o s i t o l i n n e rm e m b r a n ef r a c t i o n i c en u c l e a t i o np r o t e i n m e t a l l o t h i o n e ：i n s o p t i c a l d e n s i t y o u t e rm e m b r a n ef r a c t i o n o u t e rm e m b r a n ep r o t e i nc p e p t i d o g l y c a na s s o c i a t e dl i p o p r o t e i n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s o d i u mc h l o r i d e1 i se d t a 7 矗se d 劢 t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e y e a s tm e t a u 0 t h i o n e i n k i l o d a l t o n v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密钐 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生鲐叶蛹 帆矽锣年，月习日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者鲐巾弱 锄签名砖秫 蜘期：加矽钏月咖 纵期：砷钏月弓日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之闻 1 前言 1 1 微生物细胞表面展示技术研究进展 1 1 1 微生物细胞表面展示技术简介 微生物细胞表面展示( m i c r o b i a lc e l l - s u r f a c ed i s p l a y ) 是指通过遗传操作手段 将外源功能蛋白表达并定位于特定微生物细胞的表面以达到一定的研究与应用 目的。外源蛋白的这种定位表达不仅可以使所锚定的反应在细胞表面直接发生而 提高反应效率，并且可以克服某些大分子底物不能穿越细胞膜而进入胞内，以及 某些反应产物在细胞内不能进行特定的构型折叠等弊端，而且还可以使产物的提 取纯化过程简化( g e o r g i o ue ta 1 ，1 9 9 7 ；l e ee ta l ，2 0 0 3 ) ，因而在许多生物技术领域 展现出良好的应和用发展前景。细胞表面展示体系通常是以构建由运载蛋白 ( c a r r i e rp r o t e i n ) 与乘客蛋白( p a s s e n g e rp r o t e i n ) 所组成的融合蛋白的方式来实 现的，其中运载蛋白起着将乘客蛋白引导并锚定于细胞表面特定部位的作用。目 前，国外已报道了利用细胞表面展示技术来进行活体疫苗开发( s t e i d l e re ta 1 ， 2 0 0 0 ；m a u r i e u oe ta 1 ，2 0 0 4 ) 、蛋白质及多肽文库筛选( k i me ta 1 ，2 0 0 0 ；b o d e re ta 1 ， 1 9 9 7 ) 、抗体合成( f r a n c i s c oe ta 1 ，1 9 9 3 ) 、作为生物吸附剂来清除环境中有毒化 合物和重金属离子( m u l c h a n d a n ie t a l ，1 9 9 9 ；b a ee t a l ，2 0 0 0 ) 及作为生物反应器 ( s h i b a s a k ie t a l ，2 0 0 1 ) 等方面的尝试( 图1 - 1 ) ，新的应用途径仍在不断地发掘 之中。 瞢 a n 廿b 。d yp d u c n 。n ( ：二 臼 。：、 o r a iv 急c c i n e s 。+ 叠囝四留+ 饕 ； s c r e e n i n ”go fp e p t i d el i b r a r i e s ! c y t o s o l 四怪 ，；旧 m u t a t i o nd e t e c b o n 、 m o l e - c e l i b i o c a t a l y s tf o r b i o c o n v e r s i o n 目f o b i o s e n s o r 图1 - 1 微生物细胞表面展示的应用( l e ee t a l ，2 0 0 3 ) f i g 1 la p p l i c a t i o n so fm i c r o b i a lc e l ls u r f a c ed i s p l a y n u 台 、一 1 1 2 运载蛋白 细菌细胞表面展示所用的运载蛋白需要具备四个条件( l e ee ta 1 ，2 0 0 3 ) ：( 1 ) 含有能够使得蛋白前体穿过细胞内膜的信号肽或者转运信号；( 2 ) 含有使得融合 蛋白固定于细胞表面而不会被解析的较强的细胞膜锚定模体；( 3 ) 与乘客蛋白构 成融合蛋白后，性质稳定且其定位特性不会改变；( 4 ) 能够耐受细胞周质空间或 培养基中的蛋白酶作用。另外，确定运载蛋白上用于与乘客蛋白融合的位点也非 常重要，该位点会影响运载蛋白的定位、稳定性、以及翻译后修饰等特性，乘客 蛋白只有融合在运载蛋白位于细胞表面的区域，才能被成功的展示在细胞表面。 目前有多种方法来确定载体蛋白位于细胞表面的区域，包括与已知结构的蛋白进 行同源性的比较来确定或者利用计算机软件分析蛋白质序列亲疏水性确定其位 于细胞表面的区域( s u z u k ie ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 1 1 3 乘客蛋白 表面展示的乘客蛋白是根据应用的目的来选择的。不同的乘客蛋白与相同的 运载蛋白融合后可能在同宿主有不同的定位( s t a t h o p o u l o se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。乘客 蛋白的结构和氨基酸序列对融合蛋白的分泌和展示也有重要的影响，n g u y e n 等 ( 1 9 9 5 ) 报道当乘客蛋白含有四个苯丙氨酸时，因为不能有效分泌而不能在细胞表 面有效展示，但当这四个苯丙氨酸被去除或者用丝氨酸替代后，该乘客蛋白能被 成功的表面展示。但是这种替代氨基酸的办法应该慎用，因为氨基酸的改变可能 使得蛋白质的生物学功能完全丧失或改变。 1 1 4 微生物细胞表面展示体系的种类 1 1 4 1g 一细菌表面展示体系 g 一菌细胞包被结构复杂，由细胞质膜、间质空间、细胞外膜组成。乘客蛋 白要成功在细胞表面展示必须依次穿越细胞质膜、问质空间以及细胞外膜。g 一 细菌表面展示系统中用到的运载蛋白包括外膜蛋i 刍( f r e u d le ta 1 ，1 9 8 6 ；s c h o r re t a 1 ，1 9 9 1 ；c h a r b i te la 1 ，1 9 8 6 ) 、脂蛋( t a y l o re ta 1 ，1 9 9 0 ；c h a n ge ta 1 ，1 9 9 9 ；f u c h s e ta 1 ，1 9 9 1 ) 、附属结构蛋白( k u w a j i m ae ta 1 ，1 9 8 8 ) 、自我转运蛋白( k l a u s e re ta 1 ， 19 9 0 ；v a i l se ta 1 ，2 0 0 0 a ；m a u r e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 、s 层蛋i 刍( b i n g l ee ta 1 ，1 9 9 7 ) 等。 2 华中农业大学硕：t 学位论文 g 一细菌表面展示体系所采用的运载蛋白和乘客蛋白的融合方式分为n 一端 融合、c 端融合、三夹板式融合。 肽聚糖脂蛋白( p e p t i d o g l y c a na s s o c i a t e dl i p o p r o t e i n ，p a l ) 是典型的n 端融 合载体蛋白。一些定位序列在n 端的外膜蛋白通过c 端融合来构建表面展示系 统。l p p o m p a 杂合体蛋白就是典型的c 端融合运载蛋白。通常采用三夹板式融 合的运载蛋白有三类：外膜蛋白、胞外附属结构蛋白( 如鞭毛) 、表层蛋白。外 膜蛋白在外膜上形成跨膜的b 桶结构，其暴露在胞外的环状结构序列可以进行取 代、插入、缺失，因此可作为融合位点来展示乘客蛋白。 表1 1 g 一细菌内表达的表面展示体系( l e e 刃a 1 ，2 0 0 3 ) t a b l e1 - 1r e p r e s e n t a t i v ed i s p l a ys y s t e m sf o rt h ee x p r e s s i o ni n g r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a 3 华中农业大学硕士学位论文 4 华中农业大学硕士学位论文 缩写：a d x ，牛皮质铁氧还蛋白；c a b s ，流式吸附筛选；c t x b ，霍乱毒素b 亚基；e e t i i i ， e c b a l l i u me l a t e r u m 胰蛋白酶抑止剂i i ；p a l ，肽聚糖相关脂蛋白；c m c a s e ，羧甲基纤维素 酶；h b s a g ，乙肝病毒表面抗原；f n b p a ，纤维结合素结合蛋白a ；g f p ，绿色荧光蛋白； h m t ，人金属硫蛋白；y m t ，酵母金属硫蛋白；p ed i l l ，p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 外毒素 催化结构域i i i ：r h o ，蛇毒蛋白r h o d o s r h o d o s t o m i n 。 1 1 4 2g 十细菌表面展示体系 表面蛋白为了穿越细胞膜在细胞表面正确定位，一般来说，都具有n 末端 信号肽和c 末端细胞壁分拣信号( s c h n c c w i n de ta 1 ，1 9 9 2 ) 。分拣信号由( 1 ) 保 守的肽链模体l p x t g ；( 2 ) 一个1 5 - 2 2 个氨基酸残基的亲水链；( 3 ) 一个短的 6 - - 7 个氨基酸残基的带电链组成，总共有大概3 5 个氨基酸( s c h n e e w i n de ta 1 ， 1 9 9 2 ) 。目前g + 细菌用于表面展示的运载蛋白主要包括细胞壁锚定蛋白、细胞膜 锚定蛋白和细胞表面相关蛋白这三种表面蛋白。乘客蛋白与运载蛋白采用的融合 方式只有n 端融合和c 端融合两种。 1 1 4 3 酵母菌表面展示体系 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 是食品安全菌，酵母菌表面展示体系 在真核细胞的基因表面展示方面有着明显的优势。酿酒酵母中用于表面展示的载 体蛋白一般是定位于细胞表面的两类甘露糖蛋白：s d s 可提取甘露糖蛋白和葡聚 糖酶可提取甘露糖蛋白。融合的方式也主要分为n 端和c 端融合。 5 牛中女n 学顾i 学位论女 = 忑了i _ _ _ _ - j = = i _ r r ，多钒 ；一一一w 瓣。怒= 簿掣，b 一m 图1 - 2 革兰氏阳性细菌细胞表面展示的锚定单元模型( d e s v a u se t a l ，2 0 0 6 ) n g 1 - 2 a n c h o r i n g m o t i f s o f d l s p t a ys y s t e m s f o r t h ee x p r e s s i o n i n g r a r a - p o s i t i v e b a c t e r i a 1 1 5 微生物细胞表面展示技术的应用现状 微生物表面展示技术能够将目标蛋白直接铺定在重组苗细胞表面在生物技 术、生物医药等领域柏着广泛的应_ f j 前景，主要运用于制各活细胞疫苗、高通量 筛选多肽文库、构建全细胞吸附剂、伞细胞催化剂等方面。 1 15 1 开发重组的活细胞疫苗 与传统疫苗相比，现在运用细胞表而展示技术将抗原决定簇展示在减毒菌株 的表面或食品绒安全细菌的表面，作为活细胞疫茁来免疫人体或动物。此项技术 有以下几个明显的优点：首先生产细胞展示型的活细胞疫苗更经济，省去了分 离纯化等步骤；其次，通过一次免疫反应可毗产生更氏效的免疫反应。 c h a r b i t 等1 9 8 7 年就将肝炎病毒表面抗原p r e s 2 区域与l a m b 外膜蛋白融合 后在大腑卡f 菌表面表达，静脉注射免疫兔子和q 、鼠后均可得到高效价的抗体反 应。s u 等( 1 9 9 2 ) 在鼠伤寒沙门氏菌( s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m ) a r o a 菌株表面， 运用i g a 蛋白酶表面展示志馏毒素b 、i e 基，井j 这种活细胞疫苗口服以及腔腔免 疫小鼠能够产生特异性的黏液和体液反应。s c h r e u d e r 等人( 1 9 9 6 ) 成功将乙月1 表面抗原( h b s a g ) 锚定在酿酒酵母细胞表血。将抗原或抗原决定簇展示在细胞 表面在活体疫苗开发上显示了良好的应用前景。 1 1 5 2 多肽文库的表面展示和筛选 细胞表面展示技术的另一个应用是构建和筛选多肽文库。最常见的是将随机 肽链文库展示在噬菌体表面，然后用于筛选抗原表位( d u n n ，1 9 9 6 ；s m i t ha n d p e t r e n k o ，1 9 9 7 ) 。利用同样的方法也可以将随机肽链展示在其他原核微生物和真 核生物的表面用于抗原表位的确定。例如h 等( 1 9 9 5 ) 将硫氧还蛋白表面环的 随机多肽链插入到大肠杆菌鞭毛的高度可变区后，运用该系统筛选得到了三种抗 体的抗原表位序列。l a n g 等( 2 0 0 0 ) 将各种p a p g 的片断与o m p s 融合筛选得到 了能与红细胞糖苷脂结合的黏附抗原表位。 1 1 5 3 全细胞催化剂 通常进行酶反应有两个策略，一是用纯化的蛋白直接或者固定化后进行酶反 应；二是直接运用表达该酶的微生物全细胞进行酶反应。后者减少了纯化这一步 骤更经济，但应用微生物细胞内表达的酶进行催化反应时，底物和产物难以大量 转运穿越细胞膜，催化效率比较低。酶与锚定模体融合后展示在细胞表面，可以 运用其作为全细胞生物催化剂直接催化底物进行酶反应，大大提高了酶反应效 率，更经济。 k o m a c k e r 等( 1 9 9 0 ) 用支链淀粉酶展示系统成功地在大肠杆菌外膜表面展 示了原来定位于周质空间的b 内酰氨酶。s t r a u s s 等( 1 9 9 6 ) 利用纤连蛋白结合 蛋白b 的c 端与脂肪酶和b 内酰氨酶融合后在金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u s a e r u e s ) 的表面成功地进行了展示。r i c h i n s 等( 1 9 9 7 ) 报道了表面展示有机磷水 解酶的重组大肠杆菌能够生物降解有机磷杀虫剂。这些酶类的成功展示为今后工 业酶类的应用提供了更好的选择。 1 1 5 4 全细胞吸附剂 随着工业的发展，环境污染越来越严重。重金属污染对人类健康的潜在威胁 被人们越来越关注( v e g l i oa n db e o l c h i n i ，1 9 9 6 ) 。重金属污染的主要来源是采矿、 冶金、电镀等行业，主要有毒重金属包括h g 、c d 、c r 、n i 、c u 、p b 等。这些 重金属被生物体吸收后在生物体内难以被代谢，经过食物链富集后，最终威胁人 类的健康( 高蓝和李浩明，2 0 0 5 ) 。人们对有效的、生态的去除工业废水中重金 7 华中农业大学硕士学位论文 属的要求越来越迫切，沉淀、离子交换、电化学方法、膜工程等方法在工业废水 重金属处理中经常使用。但是这些方法的应用经常受到技术或生态的限制。微生 物通过螯合、离子交换吸收、氧化还原等机理修复重金属污染，具有效率高、成 本低等优点。这方面的研究以往主要集中于污染环境中的重金属抗性微生物或吸 附重金属微生物的筛选。2 0 世纪末以来，人们试图尝试把天然金属螯合蛋白或 合成酶在细胞内表达并取得了一定的成果。 运用细胞表面展示技术将一类具有重金属吸附能力的天然蛋白或人工合成 短肽通过特定系统展示在微生物细胞表面的特定位置，可以提高微生物对重金属 的吸附能力( 路延笃等，2 0 0 6 ) 。目前已经成功实现细胞表面展示的有金属硫蛋 白、植物螯合素等。m a u r o 等( 2 0 0 0 ) 将来自于粗糙脉孢霉( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 的金属硫蛋白串联体在ec o l i 中表达，重组菌对c d 2 + 的吸附能力提高了6 5 倍。 酵母菌金属硫蛋白( y m t ) 串联体在酵母表面展示表达后，结果显示4 聚体对 重金属吸附能力提高5 9 倍，8 聚体吸附能力提高了8 7 倍( k u r o d aa n du e d a ， 2 0 0 6 ) 。小鼠m t 展示于真养雷氏菌( r a l s t o n i ae u t r o p h a ) c h 3 4 ，重组菌对重金 属c d 2 + 吸附能力提高，将重组菌释放于c d 2 + 污染土壤中，缓解了c d 2 + 对烟草的 毒害，促进了烟草的生长( v a l l s 甜a 1 ，2 0 0 0 a ) 。x u 等( 1 9 9 9 ) 利用大肠杆菌外 膜蛋白c ( o m p c ) 将一系列多聚组氨酸多肽展示于大肠杆菌的细菌表面，提高了 重组菌对c d 2 + 的聚集能力，达到了3 2 眺干重菌体。可以作为吸附重金属离子 的全细胞吸附剂加以运用。 金属结合肽链对重金属的结合往往缺乏专一性，限制了其在特定重金属污染 环境中的应用。通过体外筛选得到比天然金属结合肽具有更强生物学功能的突变 体，用于污染环境修复将具有重要意义。m e j a r e 等( 1 9 9 8 ) 将通过噬菌体随机6 肽库筛选得到的1 个6 肽序列与外膜蛋白o m p a 融合表达后展示于大肠杆菌表 面，工程菌对c d 2 + 的结合能力和耐受性均增强。s c h e m b r i 等( 1 9 9 9 ) 将随机肽 库构建于大肠杆菌的表面菌毛蛋白f i m h 粘附素上，经筛选获得了对p b 0 2 、c o o 、 m n 0 2 、c r 2 0 3 和z n o 有较高专一结合性的多肽序列。 8 华中农业大学硕士学位论文 1 2 利用假单胞菌冰核蛋白作为运载蛋白的细胞表面展示体系 1 2 1 冰核活性蛋白( i c en u c l e a t i o np r o t e i n ) 纯水在过冷条件下，只有当温度达到- - 3 5 才能形成冰核，然后再结冰。 有一些g 一细菌( 代表茵属丁香假单胞菌( p s e u d o m o n a ss y r i n g a e ) 、欧文氏菌 ( e r w i n i as p p ) 、荧光假单胞菌( 只f l u o r e s c e n s ) ) 能够催化纯水在一2 条件下 就形成冰核( c o c h e ta n dw i d e h e m ，2 0 0 0 ) 。这些细菌被证明含有能聚集冰晶的冰核 活性蛋白( i n p ) 。i n p 具有良好的表达稳定性，不仅能克隆到大肠杆菌中，表达 出有活性的蛋白，而且在细菌进入生长稳定期后也能进行稳定的表达( j u n ge ta 1 ， 1 9 9 8 a ) 。 冰核活性蛋白一般有1 2 0 0 - - - 1 5 0 0 个氨基酸残基，由非重复的n 端结构域( 占 全序列的1 5 ) 、c 端结构域( 占全序列的4 ) 和中间结构单元( 占全序列的 8 1 ) 三个典型结构域组成。n 端结构域由1 7 5 个氨基酸残基组成，相对疏水， 包含3 4 个可能与转膜相关的结构域，该区域中的天冬氨酸残基通过糖基磷脂酰 肌醇的n 一糖苷键的方式与外膜蛋白的甘露糖相结合，从而将该蛋白固着在外膜 表面；c 末端区域富含碱性氨基酸残基、高度亲水，主要生理功能是参与冰晶的 形成；中间结构单元，通常由8 、1 6 、4 8 个氨基酸残基的重复区域组成，4 8 个氨基酸的重复单元由三个1 6 残基的重复小单元组成，小单元一般的序列为 a g y g s t x t a x x x s x l x 为不重复的残基。富含a l a 、t h r 、s e r 、g l y 等亲水性 氨基酸残基，在冰晶形成过程中起到“晶核”的作用。 a g y g s t x 俑c x x s x l _ x 1 、。 1 2 0 0 n 圆圆圆皿皿商皿衄皿皿c c e n t r a lr e p e a tr e g i o n 图1 3 丁香假单胞菌的冰核活性蛋白的结构域以及中间重复序歹l j ( g r a e t h e ra n d j i a ，2 0 0 1 ) f i g 1 - 3d o m a i ns t r u c t u r ea n ds e q u e n c er e p e a t si n 只s y r i n g a ei n p 9 华中农业人学硕上学位论文 1 2 2 已克隆的冰核蛋白基因 目前，已报道在丁香假单胞菌、黄单胞菌( x a n t h o m o n a s ) 、欧文氏菌中克隆 到了7 个冰核蛋白基因( 见表1 2 ) 。 表1 2已知序列的冰核活性蛋白基因 t a b l e1 - 2i c en u c l e a t i o np r o t e i n sw h o s en u c l e o t i d es e q u e n c e sa r ek n o w n 1 2 3 冰核蛋白在细胞表面展示方面的应用 丁香假单胞菌的冰核蛋白( 姗) 与细胞膜通过g p i 锚定序列锚定在细胞外 膜上，从而定位在细胞表面( c o c h e ta n dw i d e h e m ，2 0 0 0 ) 。这种g p i 锚定序列通 常只存在在真核细胞中，在原核细胞中这是唯一的特例。其c 端暴露在细胞外 膜上，使得融合到i n pc 端的外源蛋白能定位与细胞外膜，在表面展示方面有着 广泛的应用。目前，利用全长的冰核蛋白、去掉中间重复序列的串连n 端、c 端结构域的蛋白或只用