（微生物学专业论文）n糖酰胺酶f的性质及脱糖基化作用的研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名： 岛趟出 e t 期：堕! ! ：塑 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：壶宣些导师签名：皇鹦e t 期：查! 监 山东大学硕士学位论文 摘要 n - 糖酰胺酶f ( p e p t i d e - n 4 - ( n a c e t y l - b - d - g l u c o s a m i n y l ) a s p a r i g i n ea m i d a s e ；p n g a s e re c3 5 1 5 2 ) 能够在温和的条件下从糖肤、糖蛋白上面完整切下n 连接的寡糖链 ( n 糖苷) ，将寡糖链和蛋白部分分开糖酰胺酶f 具有广泛的底物专性，对所有 类型的n 寡糖链都有作用。这些特性使糖酰胺酶f 在糖链结构分析、糖链在生物体 内的作用和糖链对糖蛋白的作用的研究中起到了重要的作用。现在商业化的n 一糖酰 胺酶f 主要从脑膜炎脓杆菌( f l a v o b a c t e r i u mm e n i n g o s e p t i c u m ) 中提取。提取和纯化 n 糖酰胺酶f 是一个十分耗费和耗时的工作，因此市场价格十分昂贵，这大大限制 了n 糖酰胺酶的广泛利用和n 糖链大规模制各。 为了获得大量廉价的n 糖酰胺酶f ，本论文研究的主要内容为根据目的基因n - 糖酰胺酶f 的e d n a 序列设计引物，以em e n i n g o s e p t i c u m 菌株的基因组为模板，进 行p c r 扩增反应；将所得的d n a 片段经双酶切后与载体p y d l 质粒进行连接，然后 导入大肠杆菌d h s c t ，用a m p 7 筛选阳性克隆并用双酶切和p c r 鉴定重组质粒 p y d l p n g a s ef 。转化酿酒酵母e b y l o o ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) ，n 糖酰胺酶f 将通过酵母菌的分泌系统和a g a l - a g a 2 融合蛋白自动连接到酵母菌细胞壁上，实现 n 糖酰胺酶f 的表达一纯化一固定一步化通过免疫荧光试验证明m 糖酰胺酶f 已 经成功的锚定在e b y l 0 0 酵母细胞表面。经流式细胞仪( f a c s ) 检测，n 糖酰胺酶f 细胞表面锚定率最大达到4 7 。通过摸索培养和诱导条件的优化试验，发现首先在包 含2 葡萄糖的y n b c a a ( o 6 7 y n b ；0 5 c a s a m i n oa c i d s ) 培养基中培养，当菌 体浓度达到o d 6 0 0 = 2 2 时，转接到含有2 半乳糖的y n b c a a 培养基中，使 o o 甜- - 0 8 ；2 0 0 c 诱导培养3 6 h 离心收集菌体，每升发酵液可获得1 3 9 锚定有n 一糖酰 胺酶f 的菌体。以糖蛋白r n a s eb 、i g g 、人转铁蛋白为酶反应底物对表面锚定有n 糖酰胺酶f 酵母细胞进行酶活专一性试验，证明该固定化酶对三种类型的糖蛋白都有 作用。以糖蛋白r n a s eb 为酶反应底物对该固定化酶的最优温度、p h 、诱导条件进 行测定，确定最优酶反应条件为p h 5 5 ，温度为3 7 0 c ，最佳诱导条件3 6 h 。 为了得到可溶性的n 糖酰胺酶f ，将n 糖酰胺酶f 基因重组到p e t 2 8 a 载体上， 在大肠杆菌中进行诱导表达，表达量在3 0 以上。经s d s p a g e 电泳检测，在3 4 k d 有一条目的带。经n i - n a t 纯化，纯度达到9 0 以上 实验结果表明我们已经获得了锚定有n 糖酰胺酶f 的酵母细胞，该固定化的n 糖酰胺酶f 纯化步骤简便，可重复利用，极大的降低了该酶的生产成本。 关键词：n 塘酰胺酶f 、细胞表面表达，酿酒酵母，大肠杆菌 4 山东大学硬士学位论文 a b s t r a c t p e p t i d e - 一心一a c e t y l - p g h c o s a m i n y l ) a s p 盯a g i n ea m i d a s ef0 n g a s ef ，e c3 5 1 5 2 ) r e m o v e sg l y c a nm o i e t i e sf r o mg l y c o p r o t e i n su n d e rr e l a t i v e l ym i l dc o n d i t i o n s p n g a s ef h a st h eb r o a d e s ts u b s t r a t es p e c i f i c i t ya n dc a nh y d r o l y z a sa l lt y p g so f n l i n k e dc a r b o h y d r a t e c h a i n s i th a sb e e nu s e da sap o w e r f u lt o o l i na n a l y z i n gt h es t r u c t u a la n db i o l o g i c a l f i m c t i o n so fn - l i n k e dg l y c a ng l y c o p r o t e i n s c u r r e n t l y , c o m m e r c i a lp n g a s efi sm a i n l y e x t r a c t e df r o mf l a v o b a c t e r i u mm e n i n g o s e p t i c u m p u r i f i c a t i o no fn a t i v ep n g a s efi sa f i m e - c o n s u m i n g ，m u l f i s t e pp r o c e s s ，w h i c hl i m i t si t su t i l i z a t i o na n dl a r g e - s c a l ep r e p a r a t i o n g r e a t l y t h eg e n eo fp n g a s eff r o mem e n i n g o s e p t i c u mw a sc l o n e di n t op l a s m i dp y d l ， w h i c ha l l o w e dr e g u l a t e de x p r e s s i o n , s e c r e t i o na n dd e t e c t i o n t h ef a c tt h a tt h ee x p r e s s i o n o fp n g a s efg e n ew i t hi t ss e c r e t i o ns i g n a lp e p t i d ea tt h ec t e r n l i n a lo fa - a g g h t i n i ni n s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a el e dt ot h ed i s p l a yo f t h ep r o t e i no nt h ee x t r a c e l l u l a rs u r f a c eo f s c e r e v i s i a ew a sc o n f i r m e db yi m m u n o f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y f l u o r e s c e n c ea c t i v a t e d c e l ls o r t e r ( f a c s ) a n a l y s i si n d i c a t e dt h a t , a f t e r3 6h o u r sc u l t i v a t i o n , 4 7 6 o ft h ec e l l s u r f a c ew a sc o v e r e dw i t ht h ef u s i o np r o t e i n s a c t i v i t ym e 髂m e m e mi n d i c a t e dt h a t t h e e n z y m ew a sa c t i v ea n dt h ee n z y m ea c t i v i t yr e a c h e dt h eh i g l l e s tl e v e la f t e rb e e ni n d u c e d 3 6 hb y2 g a l a c t o s e t h eo p t i m u ma c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z e de n z y m ew a so b t a i n e di n t h ea c e t a t eb u f f e r ( p h 5 5 ) 砒3 7 t h i si n d i c a t e dt h a tt h ei m m o b i l i z e de l l z y l n eo 1 y e a s t c e l ls u r f a c ec o u l db eu s e da saw h o l ec e l lb i o e a t a l y s tf o rp r o d u c i n gc o m p l e xc a r b o h ) r d r a t e s f r o mn a t u r a lg l y c o p r o t e i n s i no r d e rt oo b t a i n l u b l ep n g a s ef t h eg e n eo fp n g a s efw a sc o n s t r u c t e dt ot h e v e c t o rp e t 2 8 a a f t e rp n g a s efw 砸e x p r e s s e di nt h eh o s tc e l l s d s - p a g ea n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t h e m o l e c u l a r w e i g h o f e x p r e s s e d p r o d u c t o f p n g a s e f w a s a b o u t3 4 k d t h e e x p r e s s i o nl e v e lr e a c h e da b o u t3 0 i nec o i l t h i sr e c o m b i n a n tp n g a s efp r o t e i nw a s p u r i f i e db ym e t a la f f i n i t yr e s i na n dt h ep u r i t yi sa b o v e9 0 k e yw o r d s ：p n g a s cf ，p y d i ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，c e l ls u r f a c ee x p r e s s i o n , ec o i l 山东大学硕士学位论文 翮看 1 糖生物学研究意义 1 1 寡糖链的重要作用 1 1 1 寡糖链是许多糖缀合物发挥生物功能所必需的。 例如由a 和b 两种糖蛋白链组成的人绒毛膜促性腺激素( h c g ) 中a 链的a s 一2 和a s n 7 5 及b 链的a s h ”和a s h 3 0 位上分别连有糖链，m a t z u k 1 垮人利用突变技术研 究发现，只要a s n s 2 上糖链存在，其它糖链存在与否不影响h c g 的活性，而如果a s n 5 2 和a s n 傩上的糖链同时去掉，其活性将完全消失再如，用化学手段除去其它一些糖 蛋白激素如促黄体生成素( l h ) ，促滤泡激素( f s h ) 及促甲状腺激素( t s h ) 中的 寡糖链后( 甜，它们的生物活性也完全消失，但其与受体的结合能力不受影响，从而使 之分别成为原激素的竞争性拮抗剂。 i , i 2 糖缀合物通过寡糖链的识别作用决定着细胞的识别、集聚及受体作用f 3 i 。 例如，血型是由血细胞表面的糖蛋白和糖脂决定的，而不同的血型的根本区别仅 在于这些糖缀合物中寡糖非还原端糖的种类和结构；血凝也是由血细胞表面的凝集素 ( 1 e c t i n ) 与糖缀合物的寡糖链相互识别和结合而产生的。 1 1 3 寡糖链的识别作用决定着糖缀合物的组装、转运、消化失活及分类储藏等 寡糖链是多数糖缀合物在合成之后转运到细胞膜上或细胞膜外所必需的，其缺损 会阻断分子的正常转运。肝脏中动物凝集素对寡糖的识别和结合可以促进肝脏细胞对 糖蛋白等的消化失活，从而调节其在体内的浓度和作用强度。又如，在同一部位合成 的多种糖缀合物的分类储藏及它们在不同的生物信息作用时的选择释放也都由寡糖 链决定。 i i 4 病原细菌在哺乳动物组织细胞靶位上的黏附是感染的关键步骤，大多数微生物 在细胞表面的黏附是由糖链介导的。 如许多革兰氏阴性菌的黏附就是由细菌黏附素( a d h e s i n ) 同宿主糖链相互作用介 导的，并由此决定病原微生物的宿主范围和组织趋向。另外多种糖缀合物及糖链广泛 存在于生物体中，如细菌细胞壁中含有肽聚糖、胞壁周质糖链、脂多糖及荚膜多糖； 真菌细胞壁含有葡聚糖、几丁质、甘露聚糖等；病毒被膜中的蛋白也是糖蛋白。这些 糖链常在微生物与动植物的相互作用中起至关重要的作用，如病原微生物细胞外膜上 6 山东大学硕士学位论文 的糖链往往是引起感染的毒力因子因此，糖链在微生物感染中的作用也是糖生物学 研究的热点之一。 1 2 寡糖链对糖蛋白的作用 1 2 i 蛋自的糖基化影响蛋白质合成时的正确折叠及细胞内定位 这也是细菌不能有效表达大部分真核蛋白的主要原因。 1 2 2 蛋白的糖基化大大增强了蛋白质的体外，体内的稳定性 大量的实验证明，糖链分子上的酸性糖基( 如唾液酸、糖醛酸等) 对蛋白质具有 保护其稳定、延长半衰期的作用，在一定范围内可降低或免除水解酶对肽链的降解或 阻止抗体的识别1 4 1 。例如脊椎动物垂体前叶激素和灵长类胎盘细胞分泌的糖蛋白，均 由a 、1 3 两个亚基组成，其中a 亚基上的n 糖链末端被唾液酸酸化后，可有效地保护 激素分子不被肝脏中的凝集素识别，从而避免被清除出血清；唾液酸还是激素生物活 性得以完全表达的必需基团之一【5 l 。植物细胞壁在受到病原体侵袭时可产生一类特殊 的寡糖素，可专一性刺激并诱导相关基因表达不同特性的防卫分子，如植物抗毒素、 蛋白水解酶抑制物、甲壳质酶以及植物激素等【6 】，在不同层次上起到抗病、防病、愈 合保护等作用。 1 2 3 糖链在新生肽链折叠过程中的作用 糖蛋白的n 糖基化是在内质网腔与翻译同步的过程，翻译后的修饰在高尔基体内 腔。n 糖基化的共同前体寡塘g l c 3 m a n s g l c n a c 2 在合成新生肽链的同时被连接到肽 链a s n - x - t h r s e t ( x 为除p r o 夕b 的任意氨基酸) 序列中的a s h 残基上，然后由葡萄糖苷 酶i 和将末端的两个葡萄糖残基切去，最内部的一个葡萄糖残基是塘蛋白折叠为正 确构象的关键，由内质网中细胞内凝集素钙粘蛋白( c a l n c x i n ) 和钙网蛋白( c a l r e t i c u l i n ) 识别该糖链后使蛋白折叠，然后被葡萄糖苷酶i i 识别并将最后一个葡萄糖残基切下， 使糖肽从钙粘蛋白或钙网蛋白上释放，有正确构象的糖肽会被甘露糖识别蛋白 e r i g c 5 3 ( 也被称为p 5 8 ) 识别并转运到高尔基体：而未能正确折叠的糖肽则在葡萄 糖基转移酶的催化下加上葡萄糖，重新折叠：经此循环仍不能正确折叠的蛋白在甘露 糖苷酶i 的作用下去掉一个甘露糖，然后由葡萄糖基转移酶催化加上葡萄糖形成 g i c m a n s g i e n a c 2 ，该葡萄搪残基被钙粘蛋白识别，但由于葡萄塘苷酶i i 对 g i c m a n 8 g i c n a c 2 的活性非常低，该糖肽不被葡萄糖苷酶i i 识别并从钙粘蛋白上释 放，与钙粘蛋白的长期结合导致蛋白被钙粘蛋白转送到蛋白酶体中降解。通常在新生 山东大学硕士学位论文 肽链上前5 0 位氨基酸残基上的n 糖链与折叠有关在此机制中葡萄糖基转移酶起着 折叠传感器的作用，它只识别正确折叠的肽链。钙粘蛋白缺损的转基因鼠在胚胎发育 的第1 8 天即死亡【7 圳。 1 2 4 糖链对糖蛋白水溶性的影响 糖分子的水溶性极高，与蛋白质或脂肪大分子结合，可大大提高这类分子的亲水 性能并改善分子的疏水亲水平衡点，更重要的是改善蛋自质的功能以及其它理化性 能，如分子表面的电荷分布、酸碱性能、分子粘度和分子构型等。基因工程中原核细 胞所表达的蛋白质往往是非糖基化的，并且容易发生聚集沉淀作用，蛋白活性也大大 低于糖蛋白，而真核细胞的表达产物大多数都含有水溶性较好的糖链成分【1 0 】，由此 说明亲水性寡糖链有助于改善蛋白质溶解度和提高生物活性，这对改进基因表达产物 的功能和物化性质提供了富有创造性的新思路和重要手段。 1 3 糖蛋白的结构 糖复合物中最重要的一类是糖蛋白，糖与肽链以共价糖苷键连接，主要有n - 型 糖苷键和o 型糖苷键两类。n 型糖苷键为糖链与肽链上天冬酰胺的酰胺基连接，同 时对天冬酰胺要求有一特殊的三肽序列a s n - x - s c r f r h r ；o 型糖苷键是糖链与肽链上 的s c r 、t h r 的自由羟基连接。 1 3 1n 连接糖肽 n 连接糖肽是指g i c n a c 的异头碳与a s h 的y 位酰胺n 原子共价连接，其分布 相当广泛，结构研究也比较透彻。这是因为几乎所有的n 连接均有一个相同的核心， 称为三甘露五糖核心，依核心向外延伸的差异又可分为高甘露糖型、复杂型、杂合型 三种，分别表示如下( 图1 1 ) 8 山东大学硕士学位论文 图1 - 1n 糖蛋白结构图 1 3 2o 连接糖肽 与n - 连接相比，o 一连接的糖肽的研究缺乏系统性。它是由糖的异头碳与1 、 s e r 、4 - h y d r o x y p r o0 a y p ) 、5 - h y d r o x y l y s0 - i y l ) 等氨基酸的羟基缩水成键，常见的 有g a l n a c m 、g a l s 盯、x y l - s c r 、l - a r a - s e r 、l a m - t h r 及g a l h y l 、 a r a - 4 一h y d r o x y - p r o 、g a l - c y s 、f u e s e r 、m a n s e rf r i a r ) 等等。o 连接的糖链结构多种 多样，缺乏类似n 连接的规律。 此外，还有一种十分罕见的糖肽连接方式，仅在血红蛋白的糖蛋自中发现，它既 不同于n - 连接，也不同于o 一连接。它是肽键末端氨基酸的氨基与糖的醛基先形成 s c h 濉碱，然后重排而成。 1 4 糖蛋白的合成 1 4 1n 糖蛋白的合成 塘基化作用使多肽转变成糖蛋自。糖蛋白中的糖苷键有两类：一类是肽链上天 冬酰胺的氨基基团( n i - 1 2 - ) 与寡糖链相连，构成的n 糖苷键。另一类是肽链上丝氨 酸、苏氨酸和羟赖氨酸的羟基基团( o h - ) 与寡糖链相连，构成的o 糖苷键。 9 山东大学暖士学位论文 彳弓 刍 i ii 删驯l f f f i l | | f i f i f | f f i i f l 删fl f | f |l l | l | i | l |f i l | i f i |f i | l | f f f ff l f l i l f l l l 懒_ f f 0支 图l - 2 内质网的糖基化过程 图i - 3 高尔基体糖加工过程 n 糖基化过程发生在粗糙内质网( r o u g he r ) 上( 图1 - 2 ) ，得到的1 4 个残基 的g l c 3 m a n 9 ( g i c n a c ) 2 寡糖链结构中，g l c n a c 2 m a n 3 是核心区( c o r er e g i o n ) ，该 区在各种寡糖链中均是相同的，其余部分被称为末端区( t e r m i n a lr e g i o n ) 。当穿过内 质网膜的多肽链出现天冬酰胺( a s n ) 残基时，在膜中寡糖蛋白转移酶的作用下，寡 糖链从磷酸多萜醇( d o l i c h o lp h o s p h a t e ) 转移并共价结合到多肽链的天冬酰胺残基上， 与天冬酰胺残基直接相连的第一个糖总是n 乙酰葡萄糖胺，且只有a s n - x s c r t h r 三 肽中的天冬酰胺残基是寡糖蛋白转移酶的识别底物。当内质网上合成的糖蛋白进入高 尔基潴泡后，其寡糖链末端区的寡糖残基将被不同的酶切除。糖蛋白被转运到顺面高 尔基网后，3 个m a n 残基被切除，随后进入高尔基体，在切除2 个m a n 的同时添加 山东大学硕士学位论文 3 个g i c n a e 和1 个岩藻糖( f u c ) 残基最后的修饰过程在反面高尔基网中完成( 图 1 3 ) 。3 个半乳糖( g a d 残基通过半乳糖基转移酶的作用被添加在糖链的末端，进而 在唾液酸转移酶的作用下，糖链的最末端添加唾液酸，致使糖蛋白的末端常常呈负电 性。高尔基复合体的各部潴泡在功能上有高度分区化，处于不同部位的高尔基潴泡所 含有的加工寡糖的糖基转移酶的种类不同，因此，从形成面到成熟面的潴泡是按照一 定顺序对寡糖链进行加工的先参与寡糖链加工的酶位置偏向子顺面( c i s ) ，后参与 加工的酶偏向于反面( t r a m ) 。这种顺序性加工可能有利于糖蛋白的分拣，从而使高 尔基复合体能对不同的糖蛋白进行分别包装，使其具有不同的命运，如有的成为分泌 物，有的成为质膜的整合膜蛋白，有的成为溶酶体酶。 1 4 2o 糖蛋白的合成 o 糖苷的生物合成是由g a l n a c 糖基转移酶多肽家族( u d p g a l n a e ：p o l y - p e p t i d en - a e e t y l g a l a e t o s a m i n y l t r a n s f e r a s e ，p o g a n t a s e ，e c2 4 1 4 1 ) 催化起始的。与蛋 白质n 糖基化不同，o 一糖苷直接与目的蛋白或多肽表面的s e r t h r 残基相连，o 糖基 化过程仅在高尔基复合体中完成，且在目的蛋白完全折叠后发生。粘液素型o - 糖苷 生物合成的第一步通常是将g a l n a c 由u d p g a l n a c 供体转移到目的多肽上，随后由 不同的糖基转移酶催化，每次加上一个单糖，最后一步是加上唾液酸残基，至此完成 了全部糖基的加工与修饰 1 5 糖蛋白的降解 + 在真核生物中，新合成的糖蛋白的正确折叠和安装是细胞功能的重要步骤l i t ：z 1 。 糖蛋白如果不能正确折叠，就会通过内质网偶联的降解途径”1 ( e n d o p l a s m i e r e t i c u l u m - a s s o c i a t e dd e g r a d a t i o n , e r a d ) 进行降解，包括糖链的切除和蛋白的水解【1 4 1 。 糖酰胺酶p n g i 切除非正确折叠的糖蛋白的糖链1 1 5 1 ，有证据显示，p n g i 在体内只对 非正确折叠的糖蛋白起作用，根据c h r i s t i a n h i r s e h 等人的实验所证，来自酵母的p n g i ( y p n g l p ) 在体外也可以区分正确与非正确的糖蛋白，但是其机制现在还不清楚1 1 6 1 。 目前，提出了两种假设来描述糖蛋白的脱糖基化过程。一种认为，糖酰胺酶存 在于细胞质内，在错误折叠的糖蛋白从内质网中分泌到细胞质之外后起作用，首先脱 糖基化，然后经泛素化后进入蛋白酶体降解：而另一种认为，糖酰胺酶存在于内质网 的膜上，在错误折叠的糖蛋白通过内质网膜分泌到细胞质的过程中发生作用，切除 n 糖链1 1 7 瑚。 i i 山东大学硕士学位论文 2 n 糖酰胺酶f 研究及应用 2 1n 糖酰胺酶研究现状 碳水化合物是自然界中最为丰富的有机化合物。细胞内的各种糖缀合物如糖蛋 白、糖脂和糖胺等在生物体内细胞一细胞问的识别、信号传导、免疫反应、细胞分化 和凋亡等许多生物过程中扮演着极其重要的角色1 1 9 - 2 1 】。不仅如此，碳水化合物在病原 微生物和宿主的相互反应中也起着重要作用。许多宿主细胞的受体含有糖缀合物。这 种糖缀合物的复杂性和宿主细胞的选择性在决定细菌感染的过程中起着决定性作用。 另一方面，细菌表面的多糖如夹膜和脂多糖( l p s ) 是其主要的抗原结构1 2 2 - 2 4 1 然而，由于细胞表面的糖成分极其复杂和其分离及纯化手段的严重不足，对细胞 表面糖成分的大规模分析一直无法顺利开展。 1 9 8 2 年，t a r e n t i n o 等报道了一个有望进行塘结构分析的多肽 2 5 1 p l u m m e t 发现 在从em e n i n g o s e p t i c u m 制各e n d o 1 3 a c c t y l g l u c o s a m i n i d a s ef ( e n d of ) 过程中，制备物 中含有一个具有n 糖酰胺酶活性的肽( n - 糖酰胺酶f ，p n g a s ef ) 口q 。n - 糖酰胺酶 f 能够从糖肽上面完整切下n - 连接的低聚糖( n 塘苷) 报道中的所有e n d of 制备物 经确认都是e n d of 和n 一糖酰胺酶的混合物。1 9 8 5 年，t a r e n t i n o 等用硫酸铵和凝胶柱 分离出纯净的n 糖酰胺酶f 活性产物。这对于进行细胞表面糖结构功能的分析和研 究具有重要意义f 2 7 1 h i r a n i 等在1 9 8 7 年报道，用n - 糖酰胺酶f 可以将天冬酰胺连接 的低聚糖释放出来并用高压液相色谱仪l c ) 进行检测捌随后，p l u m m e r 等发现 在小扁豆、豌豆、斑豆、利马豆、大麦和生麦芽中都含有n 糖酰胺酶f 活性成分， 为此t a r e n t i n o 等发表了一个对n - 糖酰胺酶f 进行分离和活性测定的标准方法f ，o l 。 不同于从fm e n i n g o s e p t i c u m 中提取的糖苷内切酶f t a ，来源于s t r e p t o m y c e s p l i c a t u s 的糖苷内切酶h t 3 2 1 和来源于d i p l o c o c c u sp n e u m o n i a e 的糖苷内切酶d t 3 3 】，分 离出的n 糖酰胺酶f 只能切断n - 乙酰葡糖胺残基和天冬酰胺问的连接( 图1 - 4 ) 【3 4 1 。 图1 - 4 n 一糖磁胺酶f 的酶切示意图 1 2 山东大学硕士学位论文 虽然如此，在实验中常常发现有一些糖基化位点对n 糖酰胺酶f 具有抗性。不 过，这些抗性都可以通过提高n 糖酰胺酶f 的浓度和用去垢剂或巯基乙醇使蛋白变 性解决迄今为止，在各种各样的糖苷内切酶( e n d o g l y c o s i d a s e ) 中，从f m e n i n g o s e p t i c u m 中提取出的n - 糖酰胺酶f 在从糖蛋白中提取n 糖苷的应用最为广 泛。 然而，由于n 糖酰胺酶f 的大规模制各仍然十分困难，使得糖酰胺酶f 的价格 十分昂贵，这种情况极大地限制了对细胞表面糖结构的大规模研究和分析。幸运的是， 糖肽能够十分有效地被n - 糖酰胺酶f 消化，因此可以首先把糖蛋白降解成糖肽，再 用少量的n 糖酰胺酶f 从糖肽中释放低聚塘3 5 1 尽管将糖蛋白进行降解后可以大大提高n 一糖酰胺酶f 的活性，然而对n 连接的 低聚糖的大规模制备仍然需要大量的n 糖酰胺酶f 现在商业化的n 糖酰胺酶f 主 要从em e n i n g o s e p t i c u m 中提取，而提取和纯化n - 糖酰胺酶f 是一项耗资和耗时都很 巨大的工作，因此其市场价格十分昂贵。目前，o l y k o 公司的标价为每1 0 0 m u2 2 4 美元( 1 单位的n - 糖酰胺酶f 定义为在p h 7 5 ，摄氏3 7 1 2 下作用l 小时催化6 0 t x m o l 的变性核糖核酸酶b 所需的酶量) 。因此许多科学家试图通过基因工程的方法大量生 产n - 糖酰胺酶f 。 1 9 9 0 年t a r e n t i n o 等在美国从fm e n i n g o s e p t i c u m 菌株中克隆出了一个含有n 糖 酰胺酶f 的d n a 片段，其中的一个阅读框中含有1 0 6 2 个碱基，编码一个3 5 4 个氨 基酸的蛋白质。前面的4 0 个氨基酸推测为信号肽，剩余的3 1 4 个氨基酸为一分子量 为3 4 7 7 9 d a 的蛋白该基因通过b l u e s e 啷t p l a s m i d v e c t o r 在大肠杆菌中实现了3 0 的 e m e n i n g o s e p t i c u m 表达水平不同的是，在大肠杆菌中表达的重组n - 糖酰胺酶f 无 法分泌到培养液中重组n 糖酰胺酶f 提取后，作者对表达产物的氨基酸序列进行 了测定和分析p 6 j 。 几乎同时，l e m p 等在德国从同样的fm e n i n g o s e p t i c u m 菌株中克隆出了重组n 糖酰胺酶f 并肯定了其活性的存在。和t a r e n t i n o 的结果一样，重组n 糖酰胺酶f 不 具有分泌功能f 3 7 】 在二十世纪九十年代，由于人们对人类基因组尚未完全认识，对细胞表面n 寡 糖的重要性认识也显不足，致使在2 0 世纪整个九十年代中关于重组n 糖酰胺酶f 的 研究处于停顿状态随着基因组工程的进展，人们对糖生物学认识的越来越深刻，从 而发现人们对糖生物学重要性认识的严重不足。因此，到了2 0 0 2 年，才有人重新开 山东大学硕士学位论文 始对重组n - 糖酰胺酶f 的大量表达表示关注1 3 8 i 。 在l o o 等的研究中，他们通过将n 糖酰胺酶f 基因重组到p b l u e s c r i p t k s ( ) t 7 启 动子的下游以提高n 糖酰胺酶f 的表达水平。将重组质粒在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 进 行表达后，重组n 糖酰胺酶f 会分泌到细胞膜外和细胞壁之间，表达出的n 糖酰胺 酶f 用n i - n a t 纯化1 升的培养液中。可以得到8 毫克的n 糖酰胺酶f ，活性为 2 8 2 m u m g ( i m u 的n 糖酰胺酶f 定义为在p h 8 0 和3 7 ( 2 下每分钟水解1 i t m o l 的卵 青蛋白糖肽所需的酶量) 【3 s 】。这样，生产1 公斤的n 糖酰胺酶f 就需要1 2 5 吨的培 养液，但在实际上由于表达系统的稳定性问题，这样大规模的放大几乎是不可能的。 2 2n 糖酰胺酶f 的来源、分子结构、功能及其催化的分子机制 n 糖酰胺酶f 主要来源于脑膜炎脓秆菌，随后发现在小扁豆、豌豆、斑豆、利 马豆、大麦和生麦芽等植物种子中都含有n 糖酰胺酶f 活性成分，能够从糖肽、糖 蛋白上面完整切下n 连接的寡糖( n - 糖苷) ，其作用位点是n - 乙酰葡萄糖胺残基和 天冬酰胺之间的价键结构，同时将天冬酰胺转化成天冬氨酸，生成的氨基寡糖链，随 后水解成氨气和寡糖1 3 9 1 ( 图1 5 ) 图1 - 5n 糖酰胺酶f 的催化机理图 它具有广泛的底物专一性，但是天冬酰胺残基的氨基、羧基基团和寡糖链上的 n ，n 二乙酰壳聚糖核心( n ，n - d i a e e t y l c h i t o b i o s ec o r e ，g i c n a c l 1 - 4 g i c n a c ) 对n 糖 酰胺酶f 来说是必需的，并且n 一糖酰胺酶f 对这个核心微小的改变高度敏感1 4 0 1 。其 晶体结构显示n - 糖酰胺酶f 的高级结构由两个几乎相等的结构域组成，每个结构域 1 4 山东大学硕士学位论文 由八个反向平行的片层结构组成【4 1 - 4 2 1 ( 图1 - 6 ) 单从其晶体结构上看很难获得该酶的 活性中心和催化机理，由于其晶体结构与【广天冬酰胺酶的晶体结构极其相似，曾一 度怀疑与l 天冬酰胺酶的催化机理相同。但是定点诱变和晶体结构分析显示其活性 中心由a s i a 6 0 、g l u 2 0 6 和g l u - 1 1 8 三个酸性氨基酸残基组成：a s p - 6 0 直接与断裂位 点处的底物接触；g l u 2 0 6 通过水分子与底物作用；g l u 1 1 8 与第二个g i c n a c 的0 6 形成氢键。定点诱变结果显示如果把舢p - 6 0 诱变为a s h ，该酶将完全丧失活性；如 果把g l u - 2 0 6 和g l u - 1 1 8 诱变，n 糖酰胺酶f 的活性将减少到原来的0 1 1 4 3 1 ( 表1 1 ) 。 图1 - 6 n 糖酰胺酶f 晶体结构图 山东大学硕士学位论文 表1 - 1n 糖酰胺酶f 定点诱变与酶活 2 3 真核细胞中的n 糖酰胺酶 n 糖酰胺酶广泛存在于酵母和其它高等真核生物中，如哺乳动物细胞1 4 4 1 、鸡蛋 4 5 1 和芽殖酵母 4 6 1 等，这说明n - 糖酰胺酶在真核细胞中起到重要的作用。编码n 糖酰胺 酶的基因序列首先发现于酵母中1 4 7 1 ，通过序列比对发现n 糖酰胺酶在真核细胞具有 高度保守序列，有共同的活性中心和催化位点，最有趣的特征之一是n 糖酰胺酶的 活性中心和催化位点与转谷氨酰胺酶的活性中心和催化位点极度相似。其酶活性中心 都是由h i s 、c y s 、a s p 组成的催化三连体，这是转谷氨酰胺酶家族( t r a n s g l u m m i n a s e 1 i k e s u p e r f a m i l y ) 的特有标志【4 8 l 。所以，研究最广泛的n 糖酰胺酶是酵母中的p n g l ( y p n g l ) ，它由3 6 4 个氨基酸组成，分子量为4 2 5 k d a ，由c y s - 1 9 1 ，h i s - 2 1 8 和 a s p - 2 3 5 三个氨基酸组成其催化中心【唧p n g l 最适p h 为中性( p h 6 5 ) ，而且其酶 促反应需要d t t 参与 s 0 1 其反应机理是- s h 攻击a s n 与g l c n a c 之间的酰胺键。酰 胺键断裂生成寡糖链和蛋白链，且a s n 变为a s p 在真核生物中，新合成的糖蛋白的 正确折叠和安装是细胞功能的重要步骤，p n g l 在细胞内错误折叠的糖蛋白降解过程 中起到重要作用。其降解机制现在还不清楚，目前，提出两种假设来描述糖蛋白的脱 糖基化过程。一种假设是，糖酰胺酶存在于细胞质内，在错误折叠的糖蛋白从内质网 中分泌到细胞质之外后起作用。首先脱糖基化，然后经泛素化后进入蛋白酶体降解： 另一种假设是，糖酰胺酶存在于内质网的膜上，在错误折叠的糖蛋白通过内质网膜分 1 6 山东大学硕士学位论文 泌到细胞质的过程中发生作用，切除n 糖链。许多间接证据证明第二种假设是正确 的，但是还没有直接证据证明其正确性。 2 4n - 糖酰胺酶：p n g a s ef 与p n g l 的比较 p n g a s cf 与p n g l 同属于糖酰胺酶，其作用结果相同，都能从糖蛋白或糖肽上 去除糖链，并且催化断裂位点是相同的，可以说是一对同工酶。但是，他们有着本质 的区别。首先，通过序列比较发现p n g a s ef 与p n g l 不存在共同的保守序列，其活 性中心和催化位点也不相同，p n g l 催化中心有一c y s 残基，故其催化反应需要d t t ， 而p n g a s ef 不需要。其次，p n g l 存在于真核生物细胞中，而p n g a s ef 则存在于细 菌及某些植物的种子中。最后，p n g a s cf 与p n g l 的酶活均可以被g l c n a e 2 所抑制， 而p n g l 的酶活还会被m a n 3 所抑制【5 l 】。 p n g l 与p n g a s ef 最大的区别是p n g l 只对错误折叠的糖蛋白起作用，而 p n g a s ef 则也可以作用于正确折叠的糖蛋白，只不过是酶活较低【s 2 l 。 3 细胞表面表达系统 3 1 酵母细胞表面表达系统介绍 酵母细胞表面表达系统是利用基因工程技术将外源蛋白的基因与酵母细胞壁蛋 白基因融合，经诱导表达在酵母细胞表面，如此表达的酶可看做一个整细胞催化器， 可以通过离心和过滤简单的从反应介质中除去，并且可以重复利用。经过十几年的研 究发展，已经有十几个膜蛋白被用于细胞表面表达，但应用最多的也只有a 凝集素、 a 凝集素和f l o l p 蛋白1 5 3 - 蜘迄今为止，许多不同大小的异源蛋白和酶已经被表达在 酵母细胞表面( 表1 - 2 ) 1 7 山东大学硕士学位论文 表l - 2 已经表达在细胞表面的蛋白 p r o t e i nn o dp e p 付d e s l p 】r o m o t e r s e c r e t i o ns i g n a lm o l e c u l e r s e q u e n c em n a k $ ( k d _ ) o - a g g l u t i n i ns y s t e m r h i z o f u so r y z a eg l u c o a m y l a s c g a p d h g l u e o a m y l a s e 6 2 b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u sa - a m y l a s eg a p d hm f 旺15 9 a s p e r g i l l u sa c u l e a t u s p - g i u c o s i d a s e g a p d h g l u e o a m y l a s e 1 3 6 t r i e h o d e r r a a r e e s e i c n d o g l u c a a a g a p d h g l u e o a m y l a s c 4 2 r h i z o p u so r y z a el i p a s e g a p d h m f a l3 0 a e q u o r e av i c t o r i ag f p g a p d h g l u e o a m y l a s e 2 7 b f pu p r - f c l g l u c o a m y l a s e 2 7 e c f pp h o s g l u c o a m y l a s e 2 7 e y f p 硅e p 2 g l u c o a m y l a s e 2 7 a p o a e q u o f i n g a p d h g l u c o a m y l a s e 2 l h e x a - h i sg a p d h g l u c o a m y l a s e o 9 3 z zu p l 0 i c l g l u c o a m y l a s e 1 4 la bf r a g m e n tn f a m i b o d yg a p d h g l u c o a m y l a s e 5 0 a - a g g l u t i n i ns y s t e m s i n g l e - c h a i na n t i b o d y g a j l a g a 2 2 7 3 0 s i n g l e - c h a i nt - c e l lr e c e p t o r g a i l a g a 2 2 每2 8 c - t e r m i n mr e g i o no f f i o l p r h i z o p m 口，g l u c o m n y l z l t e g a p d h 匝0 1 6 2 b g f pu p r i c lm f a l2 7 f l o c e u l a t i o nf u n c t i o n a ld o m a i no f f i o l p r h i z o p u so r y z a el i p a s e u