（微生物学专业论文）大肠杆菌k12+glcnac1p尿苷转移酶的研究.pdf

l lj 东人学博i j 学位论文 摘要 以寡糖和糖复合物( 糖脂、糖蛋白等) 形式存在的糖类化合物是发现于所有 生命体的重要生物聚合物，它们在众多复杂生物过程中发挥着不可替代的重要作 用。糖链结构形式的特定改变与特定的病理状态( 如癌症和炎症) 机密相关，这 显示了糖链在临床诊断中的应用潜力，以及作为药物开发靶点的可能性。 自然界中糖链的生物合成是由糖基转移酶催化进行的，它们将相应的糖核苷 酸上特定的单糖转移到一个糖基受体的特定羟基基团上，形成糖苷键的共价连 接。由于其在高效合成高度空间特异性和立体化学特异性的糖苷键方面展现出的 优势，利用糖基转移酶催化糖链合成已经成为利用有机化学手段合成糖链的有效 替代途径。有机合成手段可以为天然化合物提供多样性的衍生物，为药物丌发研 究提供更多选择性靶点。将生物酶法和化学法结合的化学酶法合成，是近年来 广泛应用于糖生物学研究领域的一个重要手段，有机合成和生物酶法优势互补 成为目前糖生物学和糖化学研究领域的一个充满生机活力的研究方法和手段。 糖核苷酸( n u c l e o t i d es u g a r s ) 亦称为活性糖( a c t i v es u g a r s ) ，在化学结构 上是单糖的还原端和核苷一磷酸或二磷酸的末端磷酸基团结合形成的化合物。糖 核苷酸的生理意义主要包括：1 通过糖核苷酸之间的相互转化，产生一系列糖基 转移酶催化反应所必须的活性糖；2 在糖苷和多糖的生物合成过程中，作为糖的 供体，是糖单元合成的前体。 u d p g l c n a c 是细胞内的一种重要的氨基糖供体，是细胞内多种细胞分子合 成的前体物质。这些细胞内分子主要包括细胞壁肽聚糖、脂多糖、肠杆菌科细菌 表面共同抗原、几丁寡糖、g p i 锚、糖胺聚糖和糖蛋白等。 生物体内u d p g i c n a c 的合成，都以己糖代谢途径的中间产物果糖6 一磷酸 ( f r u c t o s e 6 p ) 为起始底物，在多种酶的协同催化作用下，最终合成u d p g l c n a c 。 根据合成过程中催化反应的顺序及合成途径所涉及酶的来源不同，分为真核 u d p g l c n a c 合成途径和原核u d p g l c n a c 合成途径。两种合成途径的主要区别 在于氨基葡萄糖6 磷酸( g l c n 6 p ) 的乙酰化和异构化反应的先后顺序不同。真 山东人学博f 学位论文 核合成途径中，g l c n 6 p 先在乙酰转移酶的作用下，生成乙酰氨基葡萄糖6 磷 酸( g i c n a c 6 p ) ，然后再由异构酶作用，生成乙酰氨基葡萄糖1 磷酸 ( g l c n a e 1 p ) ；而原核合成途径中，g l e n 6 p 先异构化为氨基葡萄糖1 磷酸 ( g l e n 1 p ) ，然后再在乙酰转移酶催化下生成g l c n a c 1 p 。 本论文以大肠杆菌k 1 2 来源的g l m u 为研究对象，对g l m u 和g l m u 的n 端结构域g l m u t r 2 2 9 的底物广泛性进行了系统研究。除了以揭示它们的底物适 应性、酶的动力学性质和催化机理为目的的生化研究，本论文还通过体外小量合 成反应验证了g l m u 在氨基糖核苷酸合成中的潜在应用价值；本论文还就g l m u 突变体进行了初步研究，取得了一定的成果。 论文第二章我们克隆了来自e s c h e r i c h i ac o l ik 1 2 的g l c n a e 1 p 尿苷转移 酶( g l m u ) ，i p t g 诱导g i m u 蛋白在ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 中表达，带有n 一端h i s 标签的g l m u 蛋白经过n i - n t a 纯化，s d s p a g e 电泳结果显示，g l m u 纯度达 到9 0 以上，g i m u 单体分子的表观分子量约为5 0k d a ，与理论推导值基本一致。 论文研究了底物g l c n a c 1 p 的c2 位化学修饰对g l m u 催化反应的影响。 分别使用了c 2 位是羟基( g l c ) ，c 2 位为乙酰氨基( g l c n a c ) 和c 2 位为有叠 氮基修饰( g l c n a c z ) 的三种不同糖1 磷酸衍生物。实验结果发现，g l m u 对 三种糖1 磷酸有不同的催化活性，以u t p 为核苷三磷酸供体的反应，使用 g l c n a c z 1 p 和g l c 一1 一p 的反应得率分别是以g l c n a c 1 p 为底物时反应得率的 8 6 和3 0 。以前的相关研究表明，g i c n a c 1 p 的乙酰氨基与酶分子t h r 8 2 和 g l u l 5 4 残基以氢键相互作用。g l c 1 p 反应转化率的降低进一步证明了t h r 8 2 和 g l u l 5 4 残基在糖1 磷酸识别中的重要作用。相反，g l c n a c z 1 p 反应转化率没 有显著变化的结果表明g i m u 能够耐受乙酰氨基上的修饰。 第三章结合ec o l i 来源的g i m u 已有晶体结构，克隆并构建了来自ec o l ik 1 2 的g l m u 的n 端结构域( g i c n a c 1 p 尿苷转移酶结构域，g l m u t r 2 2 9 ) ，蛋白 表达水平为5 5m g l 。为系统研究g l m u t r 2 2 9 对不同核苷三磷酸的底物耐受性， 研究中使用了g l c n a c 1 p 做催化反应底物，使用了1 2 种不同的核苷三磷酸 ( n t p ) ，利用毛细管电泳检测n d p g l c n a c 的合成情况。n d p g i c n a c 产率结果 显示，g l m u t r 2 2 9 对不同核苷三磷酸具有一个底物耐受顺序： 2 山东人学博t 学位论文 u t p d u t p 泖p c t p d a t p d m 6 a t p ，这结果表明g l m u 对嘧啶核苷酸的利 用程度要优于对嘌呤核苷酸的利用。 g i m u 蛋白晶体研究结果已经阐明g l m un 。端催化结构域被两个突出结构 包围：第一个突出结构( a s n 3 v a i l l l 及h i s 2 1 6 2 2 7 ) ，主要参与识别和结合 u d p g l c n a e 的核苷部分；第二个突出结构( g l u l1 2 v a l 2 1 5 ) 则主要是与糖核苷 酸中的糖结构相互作用有关。尿嘧啶通过尿嘧啶环n 3 与g i n 7 6 之间及4 位羰基 氧与g l n 7 6 、g l y 8 1 之间形成的氢键被识别和结合。核苷中的核糖结构，主要是 通过核糖2 位的o h 基团与g l y l 4 之问的氢键作用。我们对g i m u t r 2 2 9 的研究 结果表明，g l m un 端催化结构域有非常显著的底物耐受性，对核糖2 位的修饰 ( d u t p ) 或者是对尿嘧啶环c 5 修饰( d t t p ) 都不会显著影响n 端催化结构域 的活性。这些结果表明，核糖2 位o h 与g l y l 4 之间的氢键在底物识别过程中 不是必需的。 为验证利用重组g l m u t r 2 2 9 合成u d p g l c n a c 衍生物的应用前景，我们在 毫克水平上合成了u d p g l c n a c 的两种衍生物：d u d p g l c n a c 和 u d p g l c n a c z 。并使用m o n oq 离子交换层析和p 2 分子筛凝胶对糖核苷酸产物 进行分离纯化，最终使用e s i m s 和n m r 对得到的d u d p g i c n a c ( 5 1m g ，5 7 6 ) 和u d p g i c n a c z ( 4 3m g ，4 4 4 ) 进行了定性分析。 本论文对g l m u t r 2 2 9 生化性质进行了细致的研究，阐述了g l m u t r 2 2 9 催 化反应需要依赖金属离子做辅助因子，g l m u - t r 2 2 9 对金属离子的依赖性为：c 0 2 + m n 2 + m g + z n 2 十c u 2 + n i 2 + e d t a ；在以m 孑+ 为辅助因子的催化反应体系 中，5m mm 孑+ 是最适的金属离子浓度，研究了p h 对g i m u t r 2 2 9 催化活性的 影响，g l m u t r 2 2 9 最适p h 是7 5 ，p h 6 5 8 5 范围内都能够催化反应的进行。 我们还对催化反应中副产物焦磷酸的反馈抑制作用进行了研究，通过在反应体系 中加入焦磷酸水解酶，将反应体系中累积的焦磷酸水解为无机磷酸根，以u t p 和g l c n a c 1 p 为底物的催化反应，转化率由原来的6 5 提高到9 5 。 第四章中，我们利用一种六碳糖激酶( n a h k ) ，以a t p 和g l c n a c 为底物， 体外酶促反应合成并分离纯化获得g i c n a c 1 p 。探索了一条体外利用n a h k 合 成g i m u 反应前体物质g l c n a c 1 p 的新途径，解决了g l m u 酶学研究底物供给 3 l i j 东人学博f j 学化论文 不足的瓶颈。同时，为深入研究g l m u t r 2 2 9 底物特异性，我们对g l m u 1 r 2 2 9 的g i n 7 6 和g l y 8 1 氨基酸位点进行了定点突变研究，并对其中一个突变体q 7 6 e 进行了酶学性质的研究。通过毛细管电泳检测发现q 7 6 e 的突变引起了 g l m u t r 2 2 9 对n t p 底物利用情况的改变，天然底物u t p 利用率大幅降低，而 非天然底物c t p 的反应转化率达5 0 以上，这部分工作正在进行中。 总之，本工作提供了一条切实可行的合成u d p g l c n a c 类似物的途径，可 以用于乙酰氨基葡萄糖转移酶和细胞内多种细胞组分的合成途径研究。对大肠杆 菌k 1 2 来源的g l m u 和g l m u t r 2 2 9 底物广泛性的系统研究有助于我们提高对 氨基糖核苷酸合成基础知识的认识。 关键词：乙酰氨基葡萄糖尿苷二磷酸；g l c n a c 1 p 尿苷转移酶；底物特异性； 定点突变 4 a b s t r a c t g l y c a n si nt h ef o r mo fo l i g o s a c c h a r i d e sa n dg l y c o c o n j u g a t e s ( g l y c o l i p i d s ，g l y c o p r o t e i n s ，e t c ) a r ev i t a lb i o p o l y m e r sf o u n di no r g a n i s m sa c r o s sa l ld o m a i n so fl i f e t h e yp l a yc r i t i c a lr o l e si n m e d i a t i o no f n u m e r o u sc o m p l e xb i o l o g i c a lp r o c e s s e s s p e c i f i cc h a n g e si ng l y c a np r o f i l e sh a v e b e e na s s o c i a t e dw i t hc e r t a i nd i s e a s es t a t e ss u c ha sc a n c e ra n d i n f l a m m a t i o n ，i l l u s t r a t i n gt h e p o t e n t i a lo fu s i n g g l y c a n si nc l i n i c a ld i a g n o s i sa n dp e r h a p sa st a r g e t st od e v e l o p t h e r a p e u t i c s t h eb i o s y n t h e s i so fs a c c h a r i d e si nn a t u r eu s e sg l y c o s y l t r a n s f e r a s e t h e yt r a n s f e ra g i v e n m o n o s a c c h a r i d ef r o mt h ec o r r e s p o n d i n gs u g a rn u c l e o t i d e ( s u g a rd o n o r ) t oa s p e c i f i ch y d r o x y l g r o u po fas u g a ra c c e p t o r w i t ho b v i o u sa d v a n t a g e so fa c h i e v i n g h i g hr e g i o a n ds t e r e o c h e m i s t r y o fg l y c o s i d i cb o n d s ，o f t e ni nah i g he f f i c i e n tm a n n e r , g l y c o s y l t r a n s f e r a s e - - c a t a l y z e de n z y m a t i c s y n t h e s i so fs a c c h a r i d e sb e c o m e sa na t t r a c t i v ea n dp o w e r f u la l t e r n a t i v et ot h ec h e m i c a ls y n t h e s i s o r a n i cs y n t h e s i sc o u l dg i v et a r g e t si nt h e r a p e u t i c sd e v e l o p m e n tb ys y n t h e s i z i n gc o m p l e xa n a l o g s u s i n gn a t u r ec o m p o u n d s c h e m - e n z y m es y n t h e s i sb e c o m e sa ni m p o r t a n tr e s e a r c hw a ya n dm e a n i nt h er e s e a r c hf i e l do fg l y c o b i o l o g ya n dg l c o c h e m i s t r yb yc o m b i n i n gb i o - e n z y m ea n d o r g a n i c m e t h o d se x p l o i t i n gt h e i ro w np a r r i c u l a ra d v a n t a g e sf o rm u t u a lb e n e f i t n u c l e o t i d es u g a r s ，a l s oc a l la c t i v es u g a r s ，a r ec o m p o u n d sw h i c ha r es y n t h e s i z e d u s i n g r e d u c i n ge n do fm o n o s a c c h a r i d e sa n dt h ee n d i n gp h o s p h a t eg r o u po fn u c l e o t i d em o n o p h o s p h a t e o rb i s p h o s p h a t e t h eb i o l o g i c a li m p o r t a n c ef o rt h o s ec o m p o u n d s ：1t op r o d u c tn e c e s s a r ya c t i v e s a c c h a r i d ef o rg l y c o s y l t r a n s f e r a s er e a c t i o nb yt r a n s f o r m a t i o na m o n gn u c l e o t i d es u g a r s ；2t oa c ta s g l y c o s y ld o n o r si ng l y c a na n dp o l y s a c c h a r i d e sb i o s y n t h e s i sp a t h w a y u r i d i n e5 - d i p h o s p h a t en - a c e t y l g l u c o s a m i n e ( u d p - g i c n a c ) ，t h ek e yc y t o p l a s m i ca m i n o n u c l e o t i d es u g a r , i sa ne s s e n t i a lp r e c u r s o ro ft h eb i o s y n t h e s i so fv a r i o u sc e l lc o m p o n e n t s i n c l u d i n g c e l lw a l l p e p t i d o g l y c a n ，l i p o p o l y s a c c h a r i d e s ， e n t e r o b a c t e r i a lc o m m o n a n t i g e n s ，c h i t i n ， g l y c o s y l p h o p h a t i d y l i n o s i t o la n c h o r s ，g l y c o s a m i n o g l y c a n sa n dg l y c o p r o t e i n s u d p - g i c n a cw a ss y n t h e s i z e db yam u l t i - e n z y m a t i cr e a c i t o nu s i n gf r u c t o s e 6 pw h i c h p r o d u c e dd u r i n gg l y c o l y s i sa c t sa ss t a r t i n gs u b s t r a t e si n i nv i v ou d p - g i c n a cs y n t h e s i sp a t h w a y t w ov a r i a t i o n so ft h i sp a t h w a ye x i s t ，o n ei n e u k a r y o t e sa n do n ei np r o k a r y o t e s t h em a i n d i f f e r e n c eb e t w e e nt w op a t h w a y si st h ea c e t y l a t i o na n di s o m e r i z a t i o no r d e rf o rg l u c o s a m i n e - 6 只 5 i i 东人学博i ? 学化论史 i nt h ee u k a r y o t i cp a t h w a y , f r u c t o s e - 6 - p h o s p h a t ep r o d u c e dd u r i n gg l y c o l y s i si st r a n s a m i n a t e da n d i s o m e r i z e dt o g l u c o s a m i n e 一6 - p h o s p h a t e ，f o l l o w e db ya c e t y l a t i o n t o g l c n a c - 6 - p h o s p h a t e ， i s o m e r i z a t i o nt og l c n a c 一1 一p h o s p h a t e i np r o k a r y o t e s ，g l u c o s a m i n e - 6 - p h o s p h a t ei si s o m e r i z e dt o g l u c o s a m i n e 一1 - p h o s p h a t e ，f o l l o w e db yi t sn a c e t y l a t i o nt on - a c e t y l - d - g l u c o s a m i n e 一1 - p h o s p h a t e t h ea i mo ft h i st h e s i si s e x p l o r i n g t h eb i f u n c t i o n a lg i c n a c - 1 - pu r i d y l t r a n s f e r a s e ( g i c n a c 一1 - pp y r o p h o s p h o r y l a s e ，g i m u ) a n di t su r i d y l t r a n s f e r a s ed o m a i n ( g i m u - t r 2 2 9 ) f r o m e s c h e r i c h ic o i lk 12f o rs y s t e m a t i cs t u d yo nb r o a ds u b s t r a t es p e c i f i c i t y i na d d i t i o nt ot h e b i o c h e m i c a ls t u d yt o w a r d st h ei l l u m i n a t i o no ft h e i rs u b s t r a t ea d a p t a b i l i t y , e n z y m a t i cd y n a m i c s a n dc a t a l y t i cm e c h a n i s m ，t h es y n t h e t i ca p p l i c a t i o no ft h i se n z y m ew a sa l s oe l u c i d a t e db yt h e s y n t h e s i so ft w oa m i n on u c l e o t i d es u g a r si ns m a l ls c a l e p i l o ts t u d yo nt h eg i m us i t e - d i r e c t e d m u a t i o nw e r ea l s oc a r r i e do u ta n dg o ts o m ep r o g r e s s i nc h a p t e r2 g i m uw a sc l o n e df r o mt h eg e n o m eo fe c o l ik12a n d w a so v e r - e x p r e s s e di ne c o l ib l 21 ( d e 3 ) t h er e c o m b i n a n th i s - t a g g e dg i m up r o t e i nw a sp u r i f i e db yn i - n t ac o l u m n s d s - p a g es h o w e dt h a tt h ep u r i t yo fg i m up r o t e i nw a sm o r et h a n9 0 ，t h ea p p a r e n tm o l e c u l a r w e i g h to ft h eg i m up r o t e i nw a sa b o u t5 0k d a ，c o n s i s t e n tw i t ht h ec a l c u l a t e dm a s s t h ee f f e c to fn a c e t y lg r o u pg l c n a co ng l m ue n z y m a t i cr e a c t i o nw a sw e l li n v e s t i g a t e d u s i n gg l c 一1 - p ( c 2g r o u po h ) g i c n a c 一1 - p ( c 2g r o u pn - a c e t y l ) a n dg i c n a c z - 1 - p ( c 2g r o u p n a d i z e - a c e t y lg r o u p ) g l m ue x h i b i t e da c t i v i t yf o ra l lt h r e es u g a r - l - p sw i t hd i v e r s ey i e l d s t h e y i e l d sf o rg i c n a c z - 1 一pd e c r e a s e dt o8 6 o ft h a tf o rg i c n a c - 1 - p 谢t 1 1u t p a sp y r o p h o s p h a t e d o n o r w h i l et h ec o n v e r s i o ne f f i c i e n c i e sf o rg l c - 1 - - pw h i c hl a c k st h ec 2n - a c e t y lg r o u pd r o p p e d t oa r o u n d3 0 o f t h i sf o rg l c n a c 1 - p p r e v i o u ss t u d ys u g g e s t e dt h a tg i c n a c - 1 一pi n t e r a c t e dw i t h t h ee r i z y m eb yh y d r o g e nb o n d sb e t 、) i r e e nt h en - a c e t y la r ma n dt h r 8 2a n dg l u15 4 t h es i g n i f i c a n t d e c l i n eo f g i m ua c t i v i t yf o rg l c 一1 一pc o m p a r e dw i t ht h a tf o rg i c n a c - 1 - pw a sc o n s i s t e n t 、析t ht h e s t r u c t u r es t u d y , w h i c hd e m o n s t r a t e dt h ei m p o r t a n tr o l eo ft h r 8 2a n dg l u15 4r e s i d u e si ns u g a r - 1 - p r e c o g n i t i o n i nc o n t r a s t ，g i m u - t r 2 2 9h a db e t t e rt o l e r a n c ef o rt h em o d i f i c a t i o n so nt h en - a c y l g r o u p ，a si n d i c a t e db yt h er e s u l tf o rg l c n a c z - 1 - p i nc h a p t e r3 ，b i f u n c t i o n a lg l m un t e r m i n a lu r i d y l t r a n s f e r a s ed o m a i n ( g l m u - t r 2 2 9 ) w a s c l o n e da n de x p r e s s e di ne c o l ib l 21 ( d e 3 ) a c c o r d i n gt ot h ec r y s t a ls t r u c t u r eo fg l m uw i n la5 5 6 山东人学博f ：学位论文 m gp e rl i t e rs o u b l ep r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e l t oi n v e s t i g a t et h es u b s t r a t es p e c i f i c i t yt o w a r d sn t p , g l c n a e 一1 一pw a su s e d 雒t h es u g a r - 1 一ps u b s t r a t e t w e l v en t p sw e r ei n c l u d e di n t ot h er e a c t i o n s y s t e m ，r e s p e c t i v e l y c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) w a su s e dt o d e t e c t t h ef o r m a t i o no f i ( 4 d p g l c n a e s t h ey i e l d so fn d p g i c n a c si n d i c a t e das u b s t r a t et o l e r a n c eo fg i m u t r 2 2 9f o r n t p si nt h e f o l l o w i n go r d e r ：u t p d u t p d t t p c t p d a t p d m 6 a t p , s u g g e s t i n gt h a t g l m u - t r 2 2 9p r e f e r sp y r i m i d i n en u c l e o t i d et h a np u r i n en u c l e o t i d e t h ec r y s t a ls t r u c t u r eo fg i m us h o w e dt h a tt h ea c t i v es i t ep o c k e to ft h ep y r o p h o s p h o r y l a s e d o m a i nw a sb o u n db yt w ol o b e s t h ef i r s tl o b e ( r e s i d u e sa s n 3 一v a ll 11a n dh i s 216 - 2 2 7 ) i n c l u d e d s t r a n d s1 3 1 - 阱，w h i c hi n t e r a c t e dp r i m a r i l yw i t ht h en u c l e o t i d em o i e t yo f u d p - g i c n a c t h es e c o n d l o b e ( r e s i d u e sg l u l1 2 - v a l 2 1 5 ) i n c l u d e ds t r a n d s1 3 5 1 3 7 ，w h i c hi n t e r a c t e dp r i m a r i l yw i t hg i c n a c p o r t i o no ft h es u g a rn u c l e o t i d e u r a c i lb a s ew a sr e c o g n i z e db yah y d r o g e nb o n db e t w e e ni t sr i n g n 3a n dg l n 7 6r e s i d u e ，a n db yt w oh y d r o g e nb o n d sb e t w e e ni t se x o c y c l i co x y g e n0 4a n dg i y 81 a n dg i n 7 6 ，r e s p e c t i v e l y t h er i b o s eg r o u pw a sr e c o g n i z e db yah y d r o g e nb o n db e t w e e ni t s 2 - h y d r o x y lg r o u pa n dg l y l 4 o u rr e s u l t si n d i c a t e dt h a tp y r o p h o s p h o r y l a s ed o m a i no fg i m uh a d an o t a b l es u b s t r a t et o l e r a n c e ，s m a l lc h a n g e so nr i b o s e2 - h y d r o x y lg r o u p ( d u t p ) o ru r a c i lb a s ec 5 ( d t t p ) d on o ta f f e c tt h ep y r o p h o s p h o r y l a s ea c t i v i t y t h eh y d r o g e nb o n db e t w e e nr i b o s eg r o u p 2 - h y d r o x y lg r o u pa n dg l y l 4w a sn o tc r i t i c a lf o rs u b s t r a t er e c o g n i t i o n t h ef i r s tl o b ew h i c h c o n t a i n e dt h ep y r o p h o s p h o r y l a s ea c t i v es i t ew a ss u i t a b l et ob e a rt h ee x i s t e n c eo fam e t h y lg r o u pi n u r a c i lb a s ec 5 t od e m o n s t r a t et h ea p p l i c a t i o no ft h er e c o m b i n a n tg l m u - t r 2 2 9f o rt h es y n t h e s i so f u d p g i c n a ca n a l o g s ，w ep e r f o r m e das y n t h e t i cr e a c t i o ni nm u l t i p l em gs c a l ef o rd u d p - g i c n a c a n du d p - g l c n a c z m o n oqi o n - e x c h a n g ec o l u m n ( g eh e a l t h c a r e ) w a su s e dt oi s o l a t et h e p r o d u c t sf r o mt h er e a c t i o nm i x t u r e t h ep r o d u c t sw e r ef u r t h e rd e s a l t e db yp 2g e lf i l t r a t i o nc o l u m n ( b i o - r a d ) t h ei s o l a t e dd u d p - g l c n a c ( 5 1m g ，5 7 6 ) a n du d p - g i c n a c z ( 4 3m g ，4 4 4 ) w e r e i d e n t i f i e db ye s i - m sa n dn m rs p e c t r o s c o p y w ea l s oi n v e s t i g a t e db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r so fg l m u - t r 2 2 9 o u rr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t d i v a l e n tm e t a lw a sn e c e s s a r yf o rg l c n a c - 1 - pu r i d y l t r a n s f e rr e a c t i o n ，w h i c hc o u l db eu s e da s g i m uc o f a c t o r t h ed e p e n d e n tr e l a t i o n s h i po fd i v a l e n tm e t a lr a n k e d ：c 0 2 + m n 2 + m 9 2 + z i l 2 + c u 2 + n i 2 + e d t a t h eo p t i m a ld i v a l e n tm e t a lc o c e n t r a t i o nf o rt h er e a c t i o nw a s5m mw h e n 7 东人学博f j 学位论文 m 9 2 + w a su s e da sc o f a c t o r g i m u - t r 2 2 9c a t a l y z e dg i c n a c 1 pu r i d y l t r a n s f e rr e a c t i o nu n d e r p h 6 5 8 5w i t ha no p t i m a lp h7 5 i na d d i t i o n ，t h ep r o d u c ti n h i b i t i o ne f f e c to ft h er e a c t i o n b y p r o d u c ti n o r g a n i cp y r o p h o s p h a t e ( i p p ) w a ss t u d i e d p y r o p h o s p h a t a s ew h i c hc a t a l y z e st h e h y d r o l y s i so fi p pt ot w oo r t h o p h o s p h a t e sw a so m i t t e dt ot h er e a c t i o nm i x m r e u d p - g i c n a c c o n v e r s i o nr a t i od e c r e a s e dt o6 5 i nc o n t r a s tw i t l l9 5 a tm a x i m u mw h e np y r o p h o s p h a t a s e e x i s t e di nt h er e a c t i o n t h er e s u l ts h o w e di n h i b i t i o no fi p pt ot h er e a c t i o na n dh y d r o l y s i so fi p p b yp y r o p h o s p h a t a s ec o u l df a c i l i t a t et h eu r i d y lt r a n s f e rr e a c t i o n i nc h a p e r4 ，g l c n a c - 1 - pw a ss y n t h e s i z e db yan - a c e t y l h e x o s a m i n e1 - k i n s ef r o m b i f i d o b a c t e r i u ml o n g u mu s i n ga t pa n dg i c n a ca ss u b s t r a t e si n i nv i t r or e a c t i o n t h ep r o d u c t g i c n a c i - pw a st h e ns e p a r a t e db yo r g a n i cm e t h o du s i n gas i a l i cg e lc o l u m n l a c ko f g i c n a c i - pc o u l db es e t t l e du s i n gt h i ss y n t h s i sp a t h w a yi ng i m ue n z y m a t i cs t u d y t of u r t h e r s t u d y o nn u c l e o t i d et r i p