（植物学专业论文）亚硒酸盐对植物遗传毒性作用的研究.pdf

摘要 摘要 硒是人体和动物必需的微量元素。植物是自然界硒循环生态链中的 关键环节，是人体获得硒的直接或间接来源。随着现代工业的快速发展， 硒已经成为潜在的有风险的环境污染元素。那些生长在硒污染环境中的 植物会在体内聚集高浓度的硒，并有可能被人和动物食用。同时，随着 越来越多富硒产品的出现，亚硒酸盐被大量用作补硒添加剂。但人体若 长期接触或摄入过量的硒，就会引起硒中毒。因此，研究硒化合物的毒 性效应非常重要。 运用植物根尖细胞监测环境有毒物质的遗传毒性是一种简便、有效 的实验技术。因此，我们选用蚕豆作为实验材料，研究皿硒酸盐对植物 的遗传毒性效应。 运用蚕豆根尖微核试验和姊妹染色单体交换试验，分别研究亚硒酸 钠( 0 0 0 1 1 0 0m g l ) 和亚硒酸氢钠( 0 0 0 1 5 0 0m g l ) 对蚕豆根尖细 胞的遗传损伤作用。结果表明，经一定浓度的亚硒酸钠或亚硒酸氢钠处 理后，蚕豆体细胞的遗传稳定性受到破坏，根尖细胞微核率和姊妹染色 单体交换频率显著增加；亚硒酸钠表现出了较亚硒酸氢钠更强的毒性作 用。与此同时，亚硒酸盐能阻滞根尖细胞分裂，降低分裂指数。对微核 的诱导与分裂抑制效应呈现对处理浓度的剂量依赖。 较高浓度亚硒酸钠处理能抑制蚕豆幼苗生长，幼根和幼芽的生长速 度随处理浓度的增加和作用时间的延长而减慢，表现剂量效应和时间效 应。 亚硒酸盐对植物遗传毒性作用的研究 以植物细胞内抗氧化酶活性和丙二醛( m d a ) 含量作为研究指标，研 究0 0 1 1 0 0m g l 亚硒酸钠对蚕豆幼根中超氧化物歧化酶( s o d ) 、过 氧化氢酶( c a t ) 和过氧化物酶( p o d ) 活性及m d a 含量的影响。结果表明， 较低浓度的亚硒酸钠引起蚕豆细胞内s o d 、c a t 和p o d 活性的降低，但浓度 增高时，s o d 、c a t 和p o d 活性有所提高。胞内m d a 含量的增加具有剂量依 赖性，说明高浓度的亚硒酸盐能够诱导蚕豆幼根细胞的氧化损伤。 本文还研究了二氧化硫衍生物( 0 o l o 5m m o l l ) 和亚硒酸钠 ( 0 o lm g l ) 共同作用对蚕豆根尖细胞的遗传毒性效应。结果显示，亚硒 酸钠和二氧化硫衍生物复合作用可显著诱导蚕豆根尖细胞微核和姊妹染 色单体交换发生，使有丝分裂指数下降。亚硒酸钠对较低浓度的二氧化 硫衍生物诱发的遗传损伤有协同效应，而对高浓度二氧化硫衍生物的毒 性作用则表现为拮抗效应。 研究结果提示：较低浓度的亚硒酸盐即可诱发植物根尖细胞的遗传损 伤。因此，可以利用简便、经济的植物检测系统监测环境中的硒污染。 同时提醒人们，在长期接触或补硒过程中应预防硒对人类带来的遗传损 伤和诱变效应。 关键词：亚硒酸盐；蚕豆；遗传损伤；氧化损伤； a b s t r a c t g e n o t o x i c i t yo fs e l e n i t eo np l a n t s s il i a n g y a n ( b o t a n y ) d i r e c t e db yp r o f y ih u i l a n a b s t r a c t s e l e n i u m ( s e ) i sa ni m p o r t a n tm e t a l l o i do fi n d u s t r i a l ，e n v i r o n m e n t a l ， b i o l o g i c a l a n dt o x i c o l o g i c a ls i g n i f i c a n c e i ti se s s e n t i a l f o ra n i m a l sa n d h u m a n sa n dv e r yi m p o r t a n tf o rp l a n tg r o w t h p l a n t sc a n p l a yap i v o t a lr o l ei n t h eb i o g e o c h e m i c a lc y c l i n go fs e l e n i u m s e l e n i u mi sa b s o r b e db yp l a n t sa n d s u b s e q u e n t l yb yp e o p l ea n da n i m a l sw h oe a tt h e m t h ee x c e s sd i s t r i b u t i o no f s e l e n i u ma r o u n dt h es o i l ，w a t e ra n da i ri ns o m er e g i o n sc a u s e se n v i r o n m e n t a l s e l e n i u mp o l l u t i o n h o w e v e r , s o m ep l a n ts p e c i e sg r o w i n go nt h e p o l l u t e d s o i l sc o u l da c c u m u l a t es e l e n i u mt oh i g hd o s e i tm a yb et o x i ct oh u m a n s t h r o u g hf o o d c h a i nc o n t a m i n a t i o n s e l e n i t ei so n eo ft h em o s tt o x i cf o r m so f s e l e n i u ma n di ss t i l lc o m m o n l yu s e da st h ea d d i t i v eo fs e l e n i u ms u p p l e m e n t f o o d s s e l e n i u mb e c o m e st o x i ca tc o n c e n t r a t i o n s h i g h e r t h a nt h o s eo f n e c e s s a r yf o rn u t r i t i o n ，a n di t st o x i cl e v e li sr e l a t i v e l yc l o s et ot h a tr e q u i r e d f o rh e a l t h s o ，h u m a nh e a l t hw i l lb ea f f e c t e db yt a k i n ge x c e s s i v es e l e n i u m c o n s e q u e n t l y , i th a sb e c o m ei m p o r t a n tt os t u d yt h et o x i ce f f e c t so fs e l e n i u m t op l a n t s t h ep l a n tr o o tt i pc e l l sa s s a y s ，w h i c ha r ec o n s i d e r a b l yl e s se x p e n s i v e a n ds i m p l e ，h a v eb e e nv a l i d a t e di nt h ei n t e r n a t i o n a lc o l l a b o r a t i v es t u d ya n d 亚硒酸盐对植物遗传毒性作用的研究 p r o v e nt o b ee f f i c i e n tt e s t sf o rg e n o t o x i c i t ym o n i t o r i n go fe n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t s f o rt h e s er e a s o n s ，t h ec y t o g e n e t i cd a m a g ei n d u c e db ys e l e n i t ei n h c i a f a b aw a si n v e s t i g a t e d m i c r o n u c l e u st e s ta n ds i s t e rc h r o m a t i de x c h a n g ea s s a yw e r eu s e dt o s t u d yt h ec y t o g e n e t i cd a m a g e so fs o d i u ms e l e n i t e ( o 0 01t o10 0m g r c ) a n d s o d i u md i s e l e n i t e ( 0 0 0 1t o5 0 0m g l ) t ot h er o o t t i p c e l l so fe 力b a r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts o d i u ms e l e n i t e ，a tc o n c e n t r a t i o n so f 0 0 1t o1 0 0 m g l ，i n d u c e dt h ei n c r e a s e so fm i c r o n u c l e i ( m n ) a n ds i s t e r c h r o m a t i de x c h a n g e s ( s c e ) f o r m a t i o n ，s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s f r o mt h ec o n t r o lf p 叶 茎，而 开花结实期植株各部位的硒积累顺序则为：根 果实 花 茎 口t 。a s h e r 等“”认为植物 体内转移的硒是硒酸根形态，以亚硒酸盐供给植物，在根部被吸收并转化为硒酸盐 和其它硒化物向地上部运输至叶片，在那里由无机硒转化为有机硒，这一过程较根 部吸收过程慢，因此，在根部常积累大量的硒。 2 1 ，3 硒在植物体内的存在形态 硒能以低分子量化合物( 包括游离s e ) 和高分子量化合物形式存在于生物体内。 很多植物，尤其是非积聚硒植物中，硒大都以硒代氨基酸形式结合于蛋白质。其在 植物体内的小分子形式有硒代氨基酸及其衍生物( 表1 一1 ) 。以大分子形式存在的 硒则包括硒蛋白、含硒核糖核酸、硒多糖等。如蛋白质硒是茶叶中硒的主要成分， 占8 0 左右，其中d n a 、r n a 核蛋白硒分别占6 7 ，6 5 。富硒大蒜中含有s e r n a 和硒多糖”。吴应亮等”2 1 在恩施富硒植物如烟草、大豆、油菜籽中提取出硒蛋白， 在黄芪、绞股蓝中提取出硒皂甙，在黄芪、魔芋和螺旋藻中提取到硒多糖，在茶叶 中提取到硒茶多酚。可见，植物中的有机硒形式是多种多样的。 第一章文献综述 s e l e n o c y s t e i n e s e l e n o c y s t i n e s e - m e t h y l - s e l e n o c y s t e i n e s e - a c r y i - s e l e n o c y s t e i n e y - g l u t a m y l - s e m e t h y s e l e n o c y s t e i n e s e l e n o h o m o c y s t e i n e s e l e n o m e t h i o n i n e s e m e t h y l s e l e n o m e t h i o n i n e d i m e t h y ls e l e n i d e d i m e t h y ld i s e l e n i d e 硒代半胱氨酸 硒代胱氨酸 硒一甲基硒代半胱氨酸 硒一丙烯基硒代半胱氨酸 氧化硒 y 一谷氨酰基一硒甲基硒 代半胱氨酸 硒代高胱氨酸 硒代蛋氨酸 硒甲基硒代蛋氨酸 二甲基硒化物 二甲基二硒化物 h s e c h 2 c h n h 2 c o o h ( s e c h ：c h n h 。c o o h ) 。 c h a s e c h 2 c h n h ，c o o h c h 3 c h = c h s e o c h 2 c h n h z c o o h h o o c c h z c h z c h ：c o n h c h ( c o o h ) 一c h 2 s e c h ， ( s e c h 2 c h 2 c h n h 。c o o h ) 2 c m s e c h 2 c h 2 c h n h 2 c o o h ( c i i ，) ：s e c h 2 c t l 2 c h n h 2 c o o h a 3 - - s e c m c i l 3 - - s e s e c t l 3 2 2 硒对植物生长发育的影响 早期研究表明，极少量的硒就能刺激硒积聚植物的生长，而强烈抑制硒非积聚 植物的生长。一般认为，硒在低浓度( 0 0 0 1 0 0 5 牦g ) 时能够促进农作物的生长， 但硒过量则对植物生长产生毒害作用。w a n g 等“”在陕西大骨节病区施硒，发现小 麦谷子粒重提高。施和平”水培番茄实验发现，水培液含硒低于0 1m g l 时，促 进幼苗生长，而高于o 5m g l 时，则抑制幼苗生长。 在较高硒浓度下，大部分植物出现中毒症状，生长及生理活动受抑制。不同作 物表现的中毒症状不同。草类表现为叶片白绿病，根组织呈粉红色，其它植物则出 现生长障碍，黄绿病和叶脉粉红或叶面发暗绿色，浓度更高时作物呈白色，发生缺 绿病及早熟死亡”。番茄幼苗的硒中毒症为根细长，根冠黑褐色并腐烂，茎杆纤细， 茎叶及顶端嫩叶缺绿，茎、叶柄和叶脉呈紫红色“。尚庆茂通过电子显微镜观察到， 生长在高浓度亚硒酸钠下的生菜叶片叶绿体被膜受损，基粒结构解体，从原来致密、 有序排列的状态变成松散的匀质状态。w a l k e r 和t i n g 还发现硒使大麦减数分裂期 亚硒酸盐对植物遗传毒性作用的研究 染色质松驰，染色体交换率下降1 。 硒对植物生长的作用符合一般必需营养元素对生物体效应的b e r t r a n d 生物剂 量规律，即低浓度时，对植物的生长有促进效应，过量则对植物构成毒害。因此， 它有可能是植物生长必需的营养元素。 2 3 硒与其他元素共同作用对植物的影响 矿质营养元素对植物体各有其特殊作用，缺乏或过多会影响植物的生长发育。 由于这些营养元素之间在生理代谢上相互制约、相互依赖，某种元素缺乏或过量会 引起整个营养元素间的不平衡，从而导致植物生长受阻。 2 3 1 硒与硫 硒和硫有相似的化学性质，关于硒和硫的相互作用有大量报道。两者之间的关 系体现为既有拮抗作用，又有协同作用。m i k k e i s e n 和w a n 。7 1 通过大麦和水稻的水 培试验发现，植株体内的硒浓度随s o 。2 的加入而降低，即使是加入低量s o 。，水稻 茎中硒浓度也几乎降低半。同时，他也观察到，在低硫营养液中，大麦和水稻茎 的硫浓度随培养液中硒浓度的提高而显著提高。b a i l e y 等”观察刮不论硫酸盐浓度 高或低时，川蔓藻对硒蛋氨酸的吸收高于弧硒酸盐或硒酸盐，低浓度硫酸盐比高浓 度下吸收亚硒酸盐高。马友华等盆栽烟草时发现，在烟草前期和成熟期，低硒低 硫或高硒高硫均表现拮抗作用，而在低硫高硒或低硒高硫时，硒、硫对烟草的吸收 则表现出协同作用。 2 3 2 硒与其他元素 一般认为硒和氮互为协同作用。而关于硒和磷则有两种看法，一种认为施磷会 增加植物对硒的吸收，另一种则完全相反。多数研究者发现，加磷于土壤会使植物 积累更多的硒，但另一方面施磷过多则会加快土壤硒的消耗，从长远来看这会加剧 土壤的缺硒。1 。a r v y 等。”证实在植物体内，硒和锰、锌、钴、磷、钼等元素的浓度 呈正相关，而与铁、铝、砷呈负相关。陈铭等研究结果表明，硒在生理浓度范围 内可以促进植物对磷、钾、钙、镁、硫、铁、锰、铜、锌和钼的吸收，而在硒毒情 况下则相反。硒和重金属元素之间多表现为拮抗关系。s h a n k 等。”3 在沙培实验中观 察到，硒能降低菜豆对镉的吸收，亚硒酸盐对镉的拮抗作用比硒酸盐更有效。杜式 华等。”发现汞抑制小麦幼苗过氧化氢酶活性，而硒能拮抗汞的毒性。 综上所述，生命元素硒，在生物体中具有其它元素不可替代的多种生物学功能， 硒缺乏或硒过量均能导致植物和人畜生长发育的各种病症。近几年来，研究的热点 6 第一章文献综述 逐渐转向硒与植物的关系。然而到目前为止，植物方面的研究，无论其广度和深度 都比对动物和人体的研究相距甚远，有待探求和揭示的问题甚多。 3 硒对植物细胞自由基代谢的影响 3 1 植物细胞中的活性氧和抗氧化酶系统 需氧生物在机体代谢过程中会产生具有很强氧化能力的活性氧( r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 。这些活性氧包括：超氧阴离子( o ：+ ) 、羟自由基( h o ) 、 单线态氧( 。o ：) 、过氧化氢( h ：o 。) 和脂质过氧化的中间产物r o - 、r 0 0 矛, h r o o h 等。 当植物体受到逆境胁迫时，如遭受强光、高温、低温、盐渍、干旱、环境污染、 病原物侵染等，植物体内就会产生大量的活性氧自由基，它们可以通过自由基链式 反应，氧化膜内类脂双分子层中含有的不饱和脂肪酸链，损伤重要的生物大分子如 核酸、蛋白质，最终影响机体正常的生理生化代谢，造成机体衰老死亡。 同时，与之相适应，植物体自身具有一套有效的抗氧化防御体系，用以调控细 胞内活性氧和自由基的产生与清除的动态平衡。植物体的抗氧化系统由酶性保护系 统和非酶性保护系统组成。植物体中的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶 ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 、过氧化物酶( p e r o x i d a s e ，p o d ) 、过氧化氢酶 ( c a t a l a s e ，c a t ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( g h t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，g s h p x ) 等。 s o d 是活性氧清除反应过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，催化超氧阴离子0 ：+ 歧化 反应生成h 。0 ：20 。+ 2 h + 一h 。o 。+ 0 ：。吼o 。会在随后的反应中被g s h p x 、c a t 、p o d 等系统清除。3 。 当植物受到一定强度的环境胁迫时，细胞内抗氧化系统会得到加强，从而在一 定程度上减少氧化损伤，增加对胁迫的抗性。但是细胞中活性氧生成过量或过快时， 活性氧不能及时有效地被防御系统所清除，最终导致细胞损伤直至死亡。 3 2 硒对植物细胞自由基代谢的双重作用 硒具有二重性，在植物体中既可以清除自由基又可以催化自由基生成。硒对自 由基的清除作用可以通过酶促系统和非酶促系统两种机制进行。 酶促系统是指硒诱导g s h p x 活性提高，进而清除自由基的过程。人们已经在 不同种类植物的不同组织中检测到g s h p x 活性。郭静成等“用不同浓度的亚硒酸 钠溶液，对小麦、水稻、丝瓜、黄瓜和大白菜进行浸种和苗期培养，结果表明，硒 处理增加所有作物幼芽和子叶中谷胱甘肽( g s h ) 含量、g s h p x 活性，降低小麦第 亚硒酸盐对植物遗传毒性作用的研究 一展开叶中丙二醛( m b a ) 的含量。人们推测硒极有可能是植物体内g s h _ p x 的诱导 物质或组成元素，可能作为一种诱发因子，启动了该酶合成有关的特异基因，通过 增加酶含量和提高酶活性，抵抗逆境因子的影响。 非酶促系统指无机硒或有机硒对自由基的清除作用。张罗平等首先运用电子自 旋共振( e s r ) 技术，直接观察到硒化合物对生物膜磷脂经紫外辐射产生的脂质过氧 自由基的清除作用啪1 。薛泰鳞等”1 运用化学模型，体外研究亚硒酸盐、硒酸盐、硒 代半胱氨酸对不同活性氧非酶促的清除作用结果表明：3 种形态的硒均可清除脂质 过氧自由基，其中，亚硒酸盐和有机硒的作用最大，硒酸盐的作用较小，但只有有 机硒才能清除超氧化物自由基和羟自由基，而3 种形态的硒均不能直接清除过氧化 氢。 尽管硒在清除自由基方面发挥重要作用，但同时，高浓度硒又会使自由基的生 成量增加，促进过氧化作用。陈春英等。”1 的研究结果表明，硒的生物效应明显依赖 于硒的浓度；机体中活性氧自由基的含量与硒的剂量密切相关。 亚硒酸盐被植物吸收后，在体内被谷胱甘肽( g s h ) 还原成低氧化态形式 ( 6 s s e s g ) ，低氧化态的硒被0 。、h 2 0 2 或其他形式的过氧化物氧化成较高氧化 态形式，同时产生活性氧自由基( 0 。一等) ，过量的g s h 又会将高氧化态硒化物还 原成低氧化形式，如此循环往复，不断催化产生活性氧自由基”3 。上述过程可简单 表示为： g s h y 一s e o 。2 一_ 、， g s s g g s s g g s _ s e s g 天- 0 舢 4 环境污染的生物监测 4 1 生物检测 随着人类社会的进步，经济和工业发展造成的环境污染日益严重。环境污染问 题已经引起了社会各界的重视，各国都相继制订了一些保护生态、保护环境、保护 人类健康的环境保护与监测的法规措施，并制定了各种环境质量标准，据此对环境 作出监测及评价鉴定。 当前对环境化学物检测和环境( 水、土、气) 污染的监测一般采用化学、物理 学、和生物学检测方法。采用化学方法，运用理化精密仪器监测有不少的优点。但 是对环境质量进行生物监测，特别是遗传毒性的检测，与化学方法检测单一化学成 分进行评价显然不同。生物监测既可对单一物质的效应进行检测，更重要的是对整 第一章文献综述 个环境中的混合物的生物学损伤后果进行监测与评价。因为，环境中的水、土、气 等都是混合物，可能由数十种乃至数百种物质组成，因此，对这些混合成分的评价， 具有更加全面和客观的评价效果。 随着毒理学的发展，利用植物来指示和监测环境质量，既灵敏可靠，又简单易 行。植物监测在2 0 世纪初就引起人们的注意，几十年来，这方面的研究工作取得 了较大的进展“1 ，制定了运用植物系统监测环境化学物遗传效应的国际程序1 。 我国从7 0 年代初就开展监测植物的选择和利用，积累了较多的经验，有的已经应 用于生产实践中。高等植物被认为是环境化学突变效应和细胞遗传效应的最好指 示，适于室内外对环境诱变剂的检测。1 9 7 8 年，由全美环境卫生科学学会( n i e h s ) 主持召开了用高等植物系统检测环境致突变物的专题讨论会，会议充分评价了高等 植物检测化学致突变物的潜力，多篇论文证明植物和动物之间对环境致突变物定性 反应的一致性可达9 9 以上，植物监测得到广泛应用”3 。“1 。随着研究工作的开展和 深入，人们对植物监测有了较为全面和深刻的认识。植物毒理检测系统有以下特点： ( 1 ) 就诱变形态学、解剖学及生理学的变化和细胞遗传学的变异等效应而言，一 般说来，植物比动物对环境中的诱变剂或断裂剂更为敏感： ( 2 ) 在实验室或在毒物释放的现场能较容易地获得较大群体的植物； ( 3 ) 在许多情况下，在现场或采样点的植物样品测定的毒理数据可直接用于该环 境污染物的毒性评价，因此，植物检测系统特别适合于现场监测； ( 4 ) 大多数植物的生物检测比动物测定费用低，又能更快提供毒性评价。 4 2 遗传毒理学检测 大量证据表明，环境污染能诱发多种疾病，导致生物体变异。生物体变异，一 是体细胞的变异，变异细胞失去了正常的生长分裂调控机制，细胞生长分裂失控， 形成肿瘤或死亡；二是生殖细胞变异，直接影响生殖过程和后代基因，导致异常子 代的产生，对人类来讲，则是产生遗传性疾病。细胞增殖和分化能力的调控与细胞 内的遗传稳定性相关。因此，对环境化学物的遗传毒性进行检测是减少和预防人类 疾病风险的一项有效的生物学措施。 细胞的遗传稳定性是维持细胞正常结构和功能的基础，遗传稳定性的破坏对细 胞乃至生物体的正常代谢和生存有着直接的影响。遗传毒理学检测系统的应用，目 的是检测某些环境化合物引起细胞遗传物质的损伤和导致遗传性状改变的能力，进 亚硒酸盐对植物遗传毒性作用的研究 而预测化学物质对哺乳动物的致突变性和致癌性。遗传毒物一旦通过细胞的物理性 屏障和生物化学性屏障，直接或活化后与d n a 作用，使d n a 某一结构水平引起损伤， 会造成多种不良结果，如d n a 完整性改变、d n a 交换或重排、d n a 碱基顺序改变、 染色体完整性改变和染色体分离改变等。遗传毒理学检测的是原发性的遗传学终 点，或检测导致某个终点的d n a 损伤过程所伴随的现象。这也正是遗传毒性检测所 独具的特点。 目前已建立的遗传毒性短期检测法已近2 0 0 种，其中较为完善、使用广泛的亦 有2 0 余种。常用的方法有：基因突变测定法，染色体畸变检测法，微核试验，姊 妹染色单体交换检测法，d n a 修复试验，细胞转化试验和彗星实验等等。 4 2 1 蚕豆根尖微核试验 细胞分裂中染色单体或染色体的无着丝粒断片或滞后染色体不能包被于主核 中，而是独立存在于细胞质中，类似细胞核，但体积小，称为微核( m i c r o n u c l e u s ， m n ) 。诱发细胞微核的物质有两类：染色体断裂剂和非整倍体诱发剂。微核是细胞 受遗传毒物作用后的一种遗传学终点。以观察细胞中微核的形成来检测遗传毒物， 称为微核试验( m nt e s t ) 。微核试验因其快速、简便，成为广泛使用的遗传毒理学 试验之一。 蚕豆( v i c f a 妇妇) 是一种很好的细胞遗传学研究材料。蚕豆的染色体组型为 六对相当大的染色体，而且根尖含有许多的分裂细胞，且细胞分生组织增殖周期短， 非常适合显微观察。早在1 9 5 9 年，放射生物学家已经用蚕豆的根尖细胞来进行x 射线的遗传损伤研究”“。到了7 0 年代，蚕豆根尖染色体畸变技术已发展得相当成 熟，作为检测化学品遗传学毒性的方法被广泛采用”6 。”。 蚕豆根尖的微核试验( w o i 矿m i c y o n u c l e u st e s t ，v a m c n ) 是1 9 8 2 年由d e g r a s s i 和r i z z o n i 正式介绍的，他们指出微核试验与染色体畸变试验同样具有准确、快速、 具剂量一效应关系等特点，操作更简便，也更适于大批量样品的检测”。美国国家 环保局也肯定了蚕豆根尖细胞学实验在环境致突变性检测中的作用，对许多环境致 癌物都作了标准化的试验，建立了庞大的数据库，并建议在全世界范围内推广。蚕 豆根尖微核试验的应用价值也引起了中国学者的注意，1 9 8 3 年陈光荣等利用此方法 检n t 农药和诱变剂对遗传物质的损伤，1 9 8 5 年发表了国内首篇用蚕豆根尖微核试 验直接检测淡水湖泊水质污染的论文“。1 9 8 6 年，蚕豆根尖微核实验技术已被中国 环保局列为水环境生物测试的规范方法“。 第一章文献综述 与其他遗传毒性测试技术相比，蚕豆根尖微核试验具有较高的可靠性和灵敏 性： ( 1 ) 蚕豆与小鼠在分类上属于同一个层次，蚕豆细胞染色体的损伤可以在一定程 度上反映同样暴露条件下高等动物遗传物质的损伤。植物系统与哺乳动物细胞 在对致突变物的反应上比果蝇和细菌要相似得多； ( 2 ) 1 9 8 8 年国际化学品安全委员会( i p c s ， i n t e r - n a t i o n a lp r o g r a m m eo n c h e m i c a ls a f e t y ) 组织了一次涉及世界六个国家i 7 个实验室的大型试验， 分别用几种不同的植物检测系统来鉴定未知样本的致突变性。结果表明，蚕 豆根尖染色体畸变试验的假阴性率最低，可以检出最多的阳性致突变物； ( 3 ) 蚕豆根尖微核试验的结果与a m e s 试验及小鼠骨髓细胞微核试验有显著的正相 关： ( 4 ) 蚕豆根尖微核试验具有本底低、成本低、操作简单等其他试验所不具备的优 点，通过对蚕豆根尖微核和染色体畸变的对应分析得出：微核试验结果和染 色体畸变率都有显著的剂量一效应关系，并可以代替后者应用于监测和研究， 克服了染色体畸变试验中观察和计数比较繁重的缺点。 4 2 2 姊妹染色单体交换( s o e ) 实验 1 9 3 8 年，m c c i i n t o c k 首次提出了姊妹染色单体交换( s i s t e r c h r o m a t i d e x c h a n g e ，s c e ) 的概念。s c e 是指来自一条染色体的两条姊妹染色单体之间同源片 段的互换。这种互换是完全的，对称的。1 9 5 8 年，t a y l o r 首次证实了植物细胞染 色体存在s c e 的现象。直到1 9 7 3 年l a t t 第一次用5 一溴脱氧尿嘧啶核苷 ( 5 _ b r o m o d e o x y u r i d i n e ，b r d u ) 加入细胞培养液中，当d n a 复制时，b r d u 代替d n a 中的胸腺嘧啶核苷( t h y m d if i e ，t ) 掺入新复制的核苷酸链中，经荧光染料染色后， 由于脱氧尿嘧啶( d e o x y u r i d i n e ，d u ) 结合荧光素的效应较小，使染色单体有色差， 互换处可见明暗交替现象，由此而引起了s c e 研究热潮。1 9 7 4 年，p e r r y 和 w o l f f ”。”建立了b r d u 加3 3 2 5 8 h o e c h s t 荧光素结合g i e m s a 染料的方法，这样制成 的色差姊妹染色单体标本能长期保存，并能在普通显微镜下观察。同年，k o r e n b e r g 和f r e a d l e n d e r r s 进一步简化了操作程序，不用荧光染料，只用b r d u 和g i e m s a 染 色，同样获得了有色差的染色单体，使该技术得到了推广应用。1 9 8 2 年，张自立等 5 ”建立了植物姊妹染色单体色差显示( s i s i t e r c h r o m a t i dd i f f e r e n t i a t i o n ，s c d ) 新方法，大大简化了标本后处理程序；接着又将改良后的去壁低渗标本制作技术应 亚硒酸盐对植物遗传毒性作用的研究 用与s c e 检测技术，克服了植物染色体标本制作方面的困难。s c d 方法的不断改进 推动了对s c e 研究的深入，同时也促进了s c e 检测技术的应用。 s c e 技术具有快速灵敏等优点，在检测d n a 损伤的几十种方法中，s c e 实验与 a m e s 氏实验同样有效，比微核实验灵敏几十到几百倍8 ”，目前在国内外环境诱变剂 和致癌剂检测中得到广泛应用。在遗传毒理学方面，通过s c e 检测技术对食品、药 物等产品的有效成分进行必要的遗传安全性评价。此外，s c e 技术还可用于深入研 究染色体分子结构、d n a 复制、损伤和修复、染色体畸变和细胞周期等重要问题。 第二章亚硒酸盐对蚕豆幼苗生长的影响 第二章亚硒酸盐对蚕豆幼苗生长的影响 1前言 硒是人体和动物必须的一种微量营养元素，植物是食物链的中间环节，因此硒 对植物生长的影响和植物对硒的吸收利用已受到了极大的重视。 研究发现，在低硒土壤适量施硒肥，对农作物的生长和农产品品质的提高均有 促进作用，在低浓度范围( 0 0 0 1 n o 0 5 垤g “) 硒对作物生长有刺激效应。”。然而， 高浓度硒对植物产生毒害，使植物出现中毒症状，生长及生理活动受到抑制。对大 多数实验植物而言，硒对植物生长的作用符合一般必需营养元素对生物体效应的 b e r t r a n d 生物剂量规律。 植物的生长发育是个体发育和系统发育的重要组成部分，关系到众多方面。植 物能否正常生长发育是衡量植物是否感病的主要指标之一。我们咀蚕豆为试验材料， 研究硒对蚕豆幼苗生长状况的影响，旨在探讨硒污染与植物生长的关系，以期为生 物监测的研究提供一些实验依据。 2 材料与方法 2 1 实验材料 蚕豆( v i c i af a b a ) ，以本地产“晋美特”为实验材料。 2 2 实验方法 22 1 种子萌发和幼苗培养 蚕豆种子经1 0 f f 9 次氯酸钠浸泡消毒2 0m i n ，水冲洗；参照k a n a y a 等“”的方法， 将蚕豆在室温( 约2 5 ) 下蒸馏水中浸种3 6h ，湿纱布包裹催芽2 4h 。选萌发的 蚕豆放入垫有湿脱脂棉的培养皿中，2 5 恒温培养。其间每1 2h 换水一次。选根 长1 0 1 5 c m 的蚕豆随机分组，用于毒性试验。 22 2 药物处理 对照用蒸馏水培养。处理组采用亚硒酸钠( s o d i u ms e l e n i t e ，n a 。s e o ，) 溶液培 养，浓度分别为0 0 0 1 ，0 0 1 ，0 1 ，1 0 ，1 0 0m g l 。于2 5 恒温培养一周，处 理期间每1 2h 换一次处理液。 亚硒酸盐对植物遗传毒性作用的研究 2 2 3 生长指标的测量 在幼苗生长期间，间隔2 4 小时测量每组2 0 株蚕豆幼苗的根长和芽长，计算各 处理组的单株平均值，作为该组蚕豆幼根和幼芽的长度值。 2 2 4 实验数据的统计分析 对所得数据进行方差分析，采用t 检验，分析比较不同浓度处理组与对照组之 间的差异显著性。 3 结果与分析 31 亚硒酸钠对蚕豆幼根生长的影响 对幼根生长的测量的结果见表2 一l 。由表2 1 可以看出，低浓度0 0 0 1m g l 处 理组的根长在各个处理时间段内均长于对照组，但无差异显著性。其它处理组除 0 o l m g l 在短时间内( 2 4 4 8h ) 根长略长于对照外，都短于相应时间段内对照组 的根长。尤其是高浓度( 】0 ，0m g f l l ) 处理组在处理1 2 0h 后根长度与对照间的差异 显著，处理1 6 8h 时，差异极显著。根长( y ) 与处理浓度( x ) 之间具有负线性对 应( 处理1 6 8h 后根长与浓度的相关方程为：y = 0 1 0 3 3 x + 3 2 5 9 7 ，r = 一0 ，9 1 4 4 ) 。 表2 一ln a ：s e o ，对蚕豆幼根生长的影响 t a b l e2 - 1e f f e c to fs o d i t i ms e l e n i t eo i lt h er o o tg r o w t ho f vf a b a 注： 尸 0 0 5 ，# p 1 0m g l ) ，蚕豆根尖m i 开始逐渐 下降，有丝分裂指数与处理液浓度之间具有显著负线性相关( 表3 4 ) ，其中1 0 0m g l 处理组m i 显著低于对照；5 0 0m g l 处理组与对照间有极显著差异，此浓度下，通 过镜检可以观察到蚕豆根尖细胞多数处于问期，有很少的分裂细胞( 处于前期) 。产 生这种现象的原因是由于高浓度处理导致蚕豆幼苗根尖细胞周期延滞，使细胞分裂 停止或延滞，细胞分裂指数大幅度降低。 3 1 2n a h s e o 。诱导蚕豆根尖细胞微核 经n a h s e o 。溶液处理的蚕豆根尖，其间期细胞中可检测到微核( m n ) 。微核的大小 第三章亚硒酸盐对蚕豆根尖细胞的遗传损伤作用 是细胞核的1 3 1 5 ，着色与主核相当或稍浅并与主核分离，呈规则的圆形或椭圆 形。有的为不规则形态。多数微核细胞具1 个微核，部分有大小不同的2 3 个微核， 少数具有4 5 个微核。 从表3 - 2 可以看出，0 0 0 1 0 o lm g l 处理组的m n 干分率和对照间差异很小， 数值十分接近：而0 1 5 0 0m g l 的n a h s e o ，溶液处理组的蚕豆根尖中的微核细胞 率明显高于对照，且随着处理浓度的提高而增高，5 0 0m g g 组的微核细胞率最高。 统计分析结果显示( 表3 4 ) ，蚕豆根尖微核细胞率与处理浓度间呈显著正相关；微 核率与分裂指数间为负相关。 表3 - 2 亚硒酸氢钠对蚕豆根尖细胞微核的影响 t a b l e3 - 2e f f e c to fn a h s e o , o nm i c r o n u c l e if r e q u e n c yi np 角船r o o tt p s 3 1 3n a h s e o 。对蚕豆根尖细胞s c e 的影响 植物姊妹染色单体交换( s c e ) 实验是种比微核实验更加灵敏、有效的技术， 用于检测环境胁迫因子对细胞d n a 分子的遗传损伤。 用不同浓度的n a h s e 0 3 溶液处理蚕豆根尖后，根尖细胞s c e 的观察结果见表3 3 。 从表中可以看出，0 1 1 0m g l 各不同浓度处理组根尖细胞中的s c e 均显著高于对 照组，但是5 0 0m g l 处理组蚕豆根尖标本中几乎观察不到s c e 。植物对s e ”的吸收 为被动吸收，环境中高浓度的s e “进入植物细胞后，以硒代氨基酸的形式结合入蛋 白质9 1 ，引起细胞内原有结构和功能的改变，导致d n a 修复错误或抑制，从而使s c e 增加。而5 0 0m g l 处理组可能因s e 4 + 浓度过高，对细胞产生很强的毒害作用，强 烈抑制细胞有丝分裂，使细胞难以进入分裂期，致使标本中几乎找不到中期染色体， 亚硒酸箍对植物遗传毒性作用的研究 从而无法统计s c e ，与有丝分裂指数( 表3 - 1 ) 一致。回归分析表明，s c e 频率与有 丝分裂指数间表现正相关，但与处理浓度、根尖微核率之间无明显的线性相关。 表3 - 3 亚硒酸氢钠对蚕豆根尖细胞s c e 的影响 t a b l e3 - 3e f f e c to f n a h s e 0 3o ns i s t e rc h r o m a t i de x c h a n g e si n 一，a 幻r o o tt i pc e l l s 表3 4 亚硒酸氢钠诱发蚕豆根尖遗传损伤的相关性分析 t a b l e3 - 4c o r r e l a t i o na m o n gc y t o g e n e t i cd a m a g ei nv f 曲ar o o tt i p s a n dn a h s e 0 3t r e a t m e n t s 实验结果表明，一定浓度的n a h s e o 。溶液( 0 1 5 0 0m g l ) 可诱发蚕豆根尖细 胞遗传损伤。导致蚕豆根尖细胞有丝分裂指数下降、间期具有微核的细胞数显著增 多，姊妹染色单体交换频率明显增高，这三项指标从不同侧面显示了n a h s e o ，对蚕豆 根尖细胞的遗传损伤效应。 3 2 亚硒酸钠诱导蚕豆根尖细胞遗传损伤 3 2 1n a 。s e o 。对蚕豆根尖细胞有丝分裂指数的影响 在n a ：s e o 。浓度为0 0 1 1 0 0 m g l 的各不同处理组中，蚕豆根尖细胞m l 均低于 对照( 表3 5 ) ，其中o 1 ，1 o 和1 0 0m g l 处理组m i 与对照组有极显著差异。但 是，在较低浓度( 0 0 0 1 和0 0 0 5m g l ) 作用下，蚕豆根尖细胞的m i 略高于对照， 2 2 第三章亚硒酸盐对蚕豆根尖细胞的遗传损伤作用 n a 。s e 0 3 表现出对根尖细胞分裂的促进效应，符合硒的b e r t r a n d 生物剂量规律。随着 处理浓度的增高，根尖m i 逐渐降低，两者之间呈剂量效应关系，统计分析表明( 表 3 8 ) ，蚕豆根尖m i 与处理浓度间呈显著负线性相关。 亚硒酸盐对蚕豆根尖细胞分裂的影响可能有两个方面：一是抑制细胞由间期进 入分裂态，使根尖分生区中分裂细胞的数目减少：二是延滞细胞分裂过程，从而使 细胞周期延长。这两方面的作用使细胞有丝分裂指数下降，外观表现为幼苗生长的 抑制( 见第二章) 。 表3 - 5 亚硒酸钠对蚕豆根尖细胞有丝分裂指数的影响 t a b l e3 - 5e f f e c to fn 如s e 凸o nm i t o t i ei n d e xo f t h er o o tt i dc e l l si n ”曲6 a 3 2 2n a 。s e o 。诱导蚕豆根尖细胞微核 从镜检结果( 表3 6 ) 可知：低浓度( 0 0 0 l 和0 0 0 5m g l ) 处理组的蚕豆根尖 细胞m n 与对照间无明显差异。而n a ：s e o 。浓度为0 0 1 1 0 o m g l 的各处理组的m n 均明显高于对照组；在一定浓度范围内( 0 0 0 1 1 0m g l ) ，m n 随着处理浓度的提 高而增加，两者之间呈正相关，而m i 与处理浓度问为负相关( 表3 - 8 ) ，表明n a ：s e o 。 诱导蚕豆幼苗根尖细胞微核形成具有定的剂量效应关系。但是，1 0 om g ln a 。s e o 。 处理组的m n 有所降低。其原因在于，高浓度n a ：s e o 。处理蚕豆根尖时，对细胞毒害作 用增强，强烈抑制植物细胞进入分裂态，延滞细胞周期和有丝分裂过程，细胞分裂 指数降低( 表3 - 5 ) ：并且浓度过高会导致蚕豆根尖细胞发生核固缩或核凝结，使这 些细胞分裂停止或延滞，根尖中参与分裂的细胞数目减少；同时那些遗传稳定性被 破坏，不能继续分裂的细胞中的染色体畸变不能形成微核，致使微核率降低。 亚硒酸盐对植物遗传毒性作用的研究 表3 - 6 亚硒酸钠对蚕豆根尖细胞微核的影响 t a b l e3 - 6m i c r o n u c l e ii n d u c e db yn a