（微生物学专业论文）rtpcr技术检测贝类中诺瓦克样病毒的研究.pdf

摘要 灌瓦克榉癃霉楚 | 起菲蓥喾蠹急槛嚣瑟受熬爨甏瘸蘸之一，蕊内羚由诺琵毙释瘸毒 发的食耱 中撩髅屡发生。引越食物中毒的食晶多为贝类、蔬菜、沙拉、熟食等。本研究针对食品中( 豫类) 诺瓦克样病毒r t - p c r 检测的特殊性，建立了快速检测贝类中诺瓦克样病毒的r t - p c r 方法，消 除r t - p c r 反应抑制因子，缩短食晶中诺瓦克样瘸毒豹检测时闯，提高检测方法的灵敏性，为诺 瓦巍徉病毒；l 起静食源往疾病豹袄遮诊断撬攥技术支持。 本研究以诺瓦克样病毒的依赖r n a 的r n a 聚合酶区为靶基因，选择特异性g f 物，谶行 r t - p c r 扩增，检测贝类中的诺瓦毙样病毒。对p c r 反应体系中镁离子浓度、引物量、退火濑废 秘镄环数进行优化，戳确定适寰r t - p c r 反应体系和r t - p c r 扩增程序，其遁寰反应体系为；反 转袋菠应体系：慈爱应体系为2 0 x l 。毽括a m y ( 5 u 聱己l ) 1 a l ，5 x r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e b u f f e r 4 汪， r n a s ei n h i b i t o r ( 4 0 u ) 0 5 l x l ，d n t p s 混合物( 1 0 m m o l l 。e a c h ) 2 k t l ，下游引物( 1 0 f | m o l l “) 3 5 h l ，模板4 b t l ，水5 p l ：p c r 魇成体系：总反成体系为5 0 1 a l 。包括r t - m i x m r e2 0 t 1 l ，1 0 p c r b u f f e r5 难，t a q ( 5 u l - i ) 1 a l ，d n t p s 混合物( 2 。5m m o l o e a c h ) 5 西，上澈$ | 耱( 1 0 p m o l ) 2 a l ，m 9 2 * ( 2 5m m o l l f 曲，承1 0 t l 。其适纛r t - p c r 扩增糕牟为：反转永道程为4 2 c ，l h ； p c r 反应过程为，9 4 * ( 2 预变性3 m i n ；变性9 4 o 5 m i n ，退火4 6 9 1 5 m i n ，娥伸7 2 1 o m i n ， 进行4 0 个循环，煅艏7 2 延伸5 r a i n 。p c r 反威产物在2 的璩脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像 系缝疆察结果。对r t - p c r 扩增产糖避抒了d n a 溯痔，r t - p c r 扩增产物d n a 磐残与靶基嚣撵列 的同源性达9 9 。飙而证实r t - p c r 扩增产物确为目的扩增产物。r t - p c r 方法的检测灵敏魔为 7 9r t - p c r s 0 。 本研究对富熟贝类中诺瓦克样病毒的4 种方法进行了比较，确定了一种可肖效从贝类中浓缩 落嚣尧撵病毒懿方法；该穷法慰炎类孛戆痍毒靛予霹选择沉淀，较大程凄豹蠹狳灵类撂晶审食 有的r t - p c r 反成批制因子。同时对4 种诺瓦克样病毒r n a 的提取方法进行了e b 较，确定了 种有效的r n a 提取方法。该方法能提取完整且纯度较高的诺瓦兜样病毒r n a ，提高了反应的灵 敏瘦。贝类中该病毒的检出陨为8 1 1 0 2r t - p c r 5 c s g 贝肉，哪谯1 l h 内完成对贝类中诺瓦毙样 瘸簿弱富集| 冀及检测。 本研究利用试验得到的检测方法对保定市市荫的贝类进行了实际检测，熬检测了2 5 份实际 贝类样品，检出了3 份阳性样品，检出率为1 2 ，阳性样品的r t - p c r 产物进 亍测序，测序缡果 与溅萼亍撩d q 3 6 9 7 9 7 1 静周源性运到9 2 9 4 ，涟一步证明检测劐的阳性样赫是诺瓦克撵瘸毒。 关键词：r t - p c r ；检测；贝类；诺瓦克样病毒 s t u d yo nr e v e r s e - t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na s s a yf o rd e t e c t i o no f n o r w a l k - l i k ev i r u si ns h e 珏爨s h z h a a g y m g ， m a j o r ：m i c m b i o l o g y ( s c h o o lo f f o o ds c i e n c e & t e c h n o l o g y , h e b e i a 萌c u l t m , a lu n i v e r s i t y ) s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o f 动a n gw e i a b s l r a c t n o r w a l k - l i k ev i r u sh a sb e e nc o n s i d e r e do n eo ft h em o s ti m p o r t a n tr e a s o n so f n o n b a c t e r i u ma c u t eg a s t r o e n t e r i t i s 。i nt h ew o r d ，t h e r ea r em a n yc a s e s 镶越a l ec a u s e db y n l v s f o o d s 饿a ta r ef r e q u e n t l yi n c r i m i n a t e di nn l v sf o o dp o i s o n i n gi n c l u d e s h e l l f i s h e s ，v e g e t a b l e s ，s a l a da n ds oo n i nt h i ss t u d y ，ar a p i dm e t h o dh a sb e e ne s t a b l i s h e d t od e t e c tn l v si nf o o d i n c r e a s et h es e n s i t i v i t yo f m e t h o da n dp r o v i d eat e c h n i c a lh e l p i nt h i ss t u d y , m g c l 2c o n c e n t r a t i o n ，a n n e a l i n gt e m p e r a t u r e , p r i m e rc o n c e n t r a t i o na n d p c rc i r c l e sa r eo p t i m i z e dt od e t e r m i n et h eo p t i m a tp c r 秘博r e a c t i o nm i x t u r ec o n s i s t e do f r tm i x t u r ea n dp c rm i x t u r e r tm i x t u r ec o n s i s t e do fl lo fa m v ( s u “l ) 4 “o f 5 r e v e r s e t r a n s c r i p t a s eb u f f e r , o 5 弘l o f r n a s e i n h i b i t o r ( 4 0 u p l 4 ) ，2 p l o f m i x t u r eo f d n t p s ( t h e 1 0m m o l l - 1e a c h ) ，3 。5 9 lo fd o w n s t r e a mp r i m e r ( 1 0 t t m o l l - ) ；冀疽o fr n a , 5 # lo f d o u b l e - d i s t i l l e dd e p ch 2 0 ；p c rm i x t u r ec o n s i s t e do f2 0 r t lo fi u 二m i x t u r e ，5 此o fl0 x p c r b u f f e r s ，1 i i lo f t a q ( 5 u h l o ) ，5 p lo f m i x t u r eo f d n t p s ( t h e2 5m m o l l e a c h ) ，2 “l o fu p s t r e a mp r i m e r ( 1 0 t t m o l l - 1 ) ，3 ，5 皿o fm 9 2 + ( 2 5m m o l l a ) ，1 0 1 x lo fd o u b l e d i s t i l l e d w a t e r , t h er e a c t i o nw a sr u nu n d e rt h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：r e v e r s et r a n s c r i p t i o na t 救 f o rl h ；d n ap r e ，d e n a t u r a t i o na t9 4 f o r3 m i n ：d n ad e n a t u r a t i o na t9 4 f o r0 5 m i n p r i m e ra n n e a l i n ga t4 6 9 f o r1 5m i n ，a n dd n a e x t e n s i o na t7 2 cf o r1 0m i nf o r 4 0c y c l e s ；氆el a s te x t e n s i o nw a sp e r f o r m e da t7 2 f o r5m i n 。t h ep c rp r o d u c t sw e r e e x a m i n e db ye l e c t r o p h o r e s i s 谢氇2 a g a r o s eg e l 。a 玲n af r a g m e n to f3 2 7b pw 8 s a m p l i f i e d p c rp r o d u c t sw e r ec o n f i r m e db yd n as e q u e n c i n g t h es e n s i t i v i t yo f d e t e c t i o n w a s7 9k b p c r s o t h ee f f e c to f4m e t h o d so fc o n c e n t r a t i n gv i r u sf r o ms h e l 攮s hw e r ec o m p a r e d 。a e 撖c i e n tc o n c e n t r a t i o nm e t h o dw a sc o n f i n n e df o re x t r a c t i o no f n v sf r o ms h e l l f i s h 强辩 m e t h o dp r e c i f ：i i t a t e dv i r u st or e m o v er t - p c ri n h i b i t o r st h ee f f e c to f4m e t h o d so f e x t r a c t i n gr n a f r o mn i si ns h e l i f t s hw e r ec o m p a r e d ae f f i c i e n te x t r a c t i o np r o c e d u r e w a sc o n f i r m e df o re x t r a c t i o no fn l v sr x af r o ms h e l l f i s h ，t h a tm e t h o dc a ne x t r a c tt h e m o r ep u r e 砒a i m p r o v e dt h es e n s i t i v i t y ，t h el o w e rd e t e c t i o nl 妇i tw a s8 1x l 扩 r t - p c r 5 0 5 9s h e ；l l f i s h t h ew h o l ep r o c e d u r en e e d e d1 1h o u r s i nt h i ss t u d y ，3o f2 5s a m p l e sw e r ed e t e c t e dt h a tw e r ec o m a m i n a t e dw i t hn l v s t h e p r o d u c to f r t p c ro f t h ep o s i t i v es a m p l ew e r ec o n f i r m e db yd n a s e q u e n c i n g 。t h er e s u l t s o fb l a s t no f3i s o l a t e si nt h i ss t u d yi n d i c a t ea r ew i t hh i 曲h o m o l o g yp e r c e n tt ot h es t r a i n d q 3 6 9 7 9 7 1 9 2 9 4 t h ep o s i t i v es a m p l e 也a te x p l a i nt oe x a m i n ei st h en o r w a l k - l i k e v i r u s ，v e r i f y i n go r i g i n a l l ye x p e r i m e n tr e s u l to f m e t h o d k e y w o r d ：r t - p c r ；d e t e c t i o n ；s h e l l f i s h ；n o r w a l k l i k ev i r u s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑a 垦盛些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：；拉影t 签字日期： 砌年f 月，7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解赶j 垦盎些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑韭垒些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：j 耘粳 导师签名： 签字日期：细z 年歹月j7 日签字日期：彩年6 月，日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址：一 电话 邮编 r t - p c r 技术检测贝类中诺瓦克样瘸毒的研究 1 1 立题背景和意义 1 引言 诺瓦克样病毒( n o r w a | k - l i k ev i r u s e s ，n l v s ) 是世界范围内急性流行性胃肠炎( 即非菌性胃肠炎) 的重要病因，可以通过水源、食物以及人一人接触进行传播，是一种重要的食源性病毒。近年来， 非典型性肺炎和禽流感在世界范围内的相继暴发流行，明确警示我们人类杜会已进入病毒威胁的 高风险阶段。而食品市场的全球化、国际贸易、固际旅游业的快速增长，引发了食品的高风险性 并使食源性疾病有在全球蔓延的趋势。食品安全是一个永恒的话题，社会越发展，人民生活水平 越高，食品安全性问题就越被关注。 n l v s 通过粪口途径感染，一旦人们食用或接触到病原，病毒就会在人群中快速的传播开， 就会引发一系列疾病污染暴发事件。虽然该病毒暴发一般不会危及到生命，但是会导致呕吐、腹 泻、发烧等症状，对人体伤害较大。 n l v s 在世界范围内频繁暴发，在我国的感染暴发率也不断上升，引起了社会的广泛关注。 随着发达国家对n l v s 的日益关注和研究的日趋深入，国内对n l v s 的研究已开始重视自1 9 9 5 年方肇寅等人在河南急性腹泻患者粪便标本中发现n l v s 后，陆续有研究者对它进行调查研究， 相关报道显示我国n l v s 感染非常普遍1 2 4 ”，并且发生过数十起n l v s 暴发的案例f ”) ，引发该 病毒传播、暴发的主要原因是食用了污染n l v s 的食品，污染的贝类是其中的一个重要的病因。 目前n l v s 还不能进行体外人工培养，其基因型、血清型复杂多样，病毒基因变异较多，以致广 普预防的疫苗还未研制成功。因此从监测控制危度来看，探究一种能有效、快速检测贝类中的 n l v s 的方法是非常必要的。国外已出现一些检测n l v s 的方法i l “，而国内还没有相关检测方法 方面的研究报道。 在n l v s 捡瓤方蓬，广泛遥蠲 浆黪设诗、凑效特异戆痰毒浓维及缓黢豹纯纯技术迩巍嚣撩 强，只有解决了以上问膊，才能商望控制健选一威胁人类健康的病毒。本试验是就病毒浓缩及核 酸纯纯羿展研究的。 1 2 诺瓦克样病毒简介 1 2 1 病毒的分类 奄子最荦辩 趋慧缝篱酝炎瘸毒静势裘楚建立纛形态学磷袋上抟，掰戳n l v s 窝萁继形态学 类似盼病毒就被叫做小圆结构病毒( s m a l lr o u n ds t r u c t u r ev i r u s e s ，s r s v s ) 。国际病簿分类委员会于 1 9 9 5 每发表鹣第六敬瘸毒分类缀售土搜鲻癸隽喾壤动翱德枣( v e r t e b r a t ev i r ) 接竣瘸霉秘 ( c a l i c i v i r i d a e ) 诺瓦克样病毒属( n o r w a l k - l i k e v i r u s , n l v s ) 。诺瓦克瘸薄( n o r w a l k v i r u s ) 为其 拽袭莩申。 河北农业大学硕士学位论文 1 2 2 形态学特征和理化特性 n l v s 的直径约为2 7 - 4 0 a m ，无包膜，农壳由单一蛋白质组成，呈= 十面体对称。负染色电 镜照片显示n l v s 具有典型的羽状外缘和表面杯状凹陷结构，如图1 。在c s c l 密度梯度中的浮 力为1 3 6 1 4 1g c m 3 。在室温p h 2 7 的环境下3h 、2 0 的乙醚4 处理1 8 h 、6 0 。cg 爵育3 0 r a i n 后， 该病毒仍有感染性。n l v s 可耐受普通饮用水中3 7 5 - 62 5m g l 的氯离子浓度( 游离氯0 5 1 0 r a g l ) 但在1 0m g l 的高浓度氯离子( 处理污染水采用的氯离子浓度) 存在时可被灭活1 1 8 j 。 圈i 诺瓦克样瘸濑电镜照片a ：诺瓦蔸病毒，8 ：杆状耩毒衰达的诺瓦兜祥瞒毒样颗粒，c ：托幌病毒 f i g1 e l e c t r o n m i e m g r a p h s o f ( a ) n v ，( b ) b a c u l o v i r u s - e x p r c s s e d n v lp a r t i c l e s , a n d ( c ) s a p p o r ov i r u s b a r , 1 0 0 n m 、 1 2 ，3 蕊灌缝藜耱辍分类 从忠愿者粪便中掇纯的n l v s ，经过e d n a 克降。其全部序列已经获得。n l v s 基因组为7 6 4 2 个核薄酸( n u c i e o t i d e ，m ) 组成的单般难链p n a ，包括3 个开放阅读框( o p e nr e a d i n gf r a m e , o r f ) 。o r f i ( t 4 6 5 3 5 9a t ) 鹣考舞每小r n a 瘸毒黪2 c ( 攥旋酶) 、3 c ( 蛋皂酶) 秘3 d 区( r n a 依赖的r n a 聚合酶) 的序列同源。撼测其编码保守的具有r n a 多聚酶活性的非嫱构蛋白。o r f 2 ( 5 3 4 6 。6 9 3 5n t ) 可能编码一个含有5 3 0 个氨基酸，分子量为5 6 5 7 1 d 的衣壳蛋白，该蛋白质可良 动装配贱瘸毒群颡裁。位于基因掘3 端的o r f 3 ( 6 9 3 8 - 7 5 7 3n t ) 可鼹编码一个禽有2 1 2 个氨基醣。 势予鬟为2 2 4 7 9 d a 躲强碱往蛋鑫( i p = i o 。9 9 ) ，o r f 3 砖基嚣痒孛经舞疆鑫震熬亭弼都无相酝之照， 目前研究发现o r f s 3 表达的部分区域蛋白与衣壳援自发生交互作用，共同形成农壳口町。基因霸 构如图2 。 1a u g2 c3 c3 d 7 6 4 2 5 0 - _ 卜_ 卜- _ - - 一a n 3 1 4 61 7 3 8 a a5 3 5 9 6 9 3 82 1 2 a a7 5 7 3 _ l _ i ii i i i i ii i i i _ _ l 一7 6 4 2 a n 0 l t f l5 3 4 65 3 0 a a6 9 3 5o r f 3 一 o r f 2 黼2 n v 薛基鞠缀缝掏 f i g2 g c n o m es u c t u r eo f n v r t - p c r 技术检测贝类中诺瓦克样病毒的研究 根据相对保守的r n a 聚合酶区核苷酸和氨基酸序列的同源性比较，将n l v s 分为3 个基因 组 2 1 - 2 3 1 ，即基因组i 、i i 、1 1 1 基因i 组瞧e n o g r o u p i ，g i ) 其代表株为n o r w a l k v i r u s ( n v ) 包括 s o u t h a m p t o n ( s o v ) 、d e s e r ts h i e l dv i r u s ( d s v ) 等；基因i i 组( g e n o g r o u p i i ，gi i ) 其代表株为 s m v ( s n o wm o u n t a i nv i r u s ) ，包括h a w a i iv i m s ( h v ) 、m e x i c ov i r u s ( m x v ) 、l o r d s d a l ev i r u s ( l v ) 等；基因i i i 组( g e n o g r o u p i i i ，g i l l ) 其代表毒株包括j e n av i r u s ( j v ) ，n e w b u r ya g e n t - 2 ( n a 2 ) ，每一遗传组又分别包括5 、1 0 、2 个亚型8 ”。基因组1 和i i 是感染人群的主要病毒株口“， 其分类见表l 。 衷1 诺瓦克样病毒感染人群两基因组毒株分类 t a b l e ir c p r e s e n t a t i vs t r a i n si nt h et w on l v sg c n e g r o u p 基因组病毒名称简称 g e n o g r o u pi g e n o g r o u p1 i n o r w a l k v i r u s ( h u n l v n v 8 f l i a 1 9 6 8 ，u s l s o u t h a m p t o i lv i r u s ( h u n l v s w l 9 9 1 ，u k 、 d e s e r ts h i e l dv i r u s ( h u n l v d s v 3 9 5 1 1 9 9 0 s r ) c r u i s es h i pv i r u s ( h u m l w l 8 4 - 0 1 3 8 8 1 1 9 9 0 u s 、 s n o wm o u n t a i na g e n t ( h u n l v s m a 1 9 7 6 1 u s ) h a w a l iv i r u s ( h u n l v h v 1 9 7 1 ，u s l m e x i e ov i r u sf h u n l v m x 1 9 8 9 m x ) t o r o n t ov i r u s ( h u n l v t v t v 2 4 1 9 9 l ，c n 、 l o r d s d a l ev i r u s ( h u n l v l w l 9 9 3 u k ) g r i m s b yv i r u s ( h l l ，n l v g r v ，1 9 9 5 ，u k ) o w y n e d dv i r u sf h u n l v g v 1 9 9 3 u k ) n v s v d s v c s v s m a h v m x v t v l v l v g v w l l j t er i v e rv i r u sf h u n v l w r v 2 9 0 - 1 2 2 7 5 1 1 9 9 4 u s )w r v 根据利用病瓣阳性标本与感染者血清进行免艘的电镜结果，可以把n l v s 分为n o r w a l k 、 h a w a i i 、s n o wm o u n t a i n 以及t o r o n t o 莓凡个不嚣鹣斑溥型 2 6 - 2 7 。剽_ 鳟l 重组n v ( r n v ) 农蠢虽鑫秽 燕组m x v ( r m x ) 衣壳蛋自制备的免疫血清，以免疫酶法检铡粪便中的抗原，证嚼有很好的组特辩 瞧。但m x v 免疫照清著不韪检测蹴所有基因组麴病毒。n l v s 的统一分型述有毅于更多n l v s 的鉴定、基因纽序列分析以及更多不同抗原特异性袭壳蛋自的表达和免疫血清的获樽。 1 2 4 瘸毒静逡传变异 n l v s 是一炎蒜寿遗砖多撵蛙熬病毒群。是筹l 夸n v 梭歉彦翻发装戳来，越寒整多熬，j 、图继 构病毒( s m a l lr o u n ds l r u c t u r ev i r u s ，s r s v ) 毒株通过r t - p c r 得以鉴定，核酸序列的测定为同源 瞧毙较褥供了更为藕薅兹撅撂，n l v s 基嚣多变，激器不舄地区、不弼黠翔溅好妁n l v s 基因缎 的o r f i 的r n a 多聚酶醭相对保守，核苷酸、氨基陵序列阿源性一般商于6 0 ，有的商达9 0 以上，甚燕1 0 0 。基因缀其他区域变异髑对较多。在美国、日本、旖兰、台湾、澳大利亚等地 区己发生了由基因重组毒株g 发痰瘸的暴授p ”q 。 翌i ! 查些奎兰堡主堂垡丝苎 1 2 5 病毒的繁殖 目前n l v s 还未在培养细胞以及人胚胎小肠器官中繁殖成功。在多种动物，如小鼠、豚鼠、 兔、小猫、小牛、猩猩、恒河猴、狒狒、绒猴等，n v 均未能造成腹泻，然而猩猩接种n v 后有 血清学反应，在它们的粪便中i t i , - i 检测到3 3 k d 的可溶性n v 抗原1 1 8 】。 1 3 病毒的致病性和流行病学 1 3 i 致病机制 对n l v s 的致病机制目前了解的还比较少。对感染n v 或h a w a i i 病毒的志愿者进行十二指肠 活检发现，感染后一天出现上皮组织损伤，虽然黏膜本身是完整的，小肠近端的绒毛却变宽、变 平，还可见单核细胞浸润和胞浆内空泡形成；当小肠绒毛变短后5 - 6 天能观察到空隙增大现象【3 ”。 疾病恢复期以上部位活检正常。 1 3 2 临床症状 目前一般认为n l v s 的感染是继轮状病毒之后的人类非细菌性腹泻的第二大病因，广泛地分 布于全世界。该病毒常常可以引起各年龄人群急性胃肠炎的暴发与散发，主要发生在人群密集区， 如医院病房、饭店、军舰、集体宿舍等p 2 。”】。在感染病毒1 2 4 8 小时内，感染者均出现恶心、 呕吐、胃痉挛和腹泻等急性症状。在儿童中，呕吐比腹泻更常见，成人则相反。常常还伴有低烧、 头疼、寒颤和肌痛等临床表现。这些表现一般持续1 2 6 0 个小时。n l v s 引发的胃肠炎一般被认 为是较温和的，但是也能引发严重的病症甚至死亡j 。但在流行性暴发的情况下，其感染率高达 4 5 以上，而在荷兰的一次n l v s 引发的疾病中，2 0 的感染者症状更是持续了2 星期之久。 1 3 3 流行情况 据统计，1 9 7 6 年至1 9 8 1 年美国成人非菌性急性胃肠炎暴发流行中有4 2 是由n l v s 引起的。 在1 9 9 7 年7 月- - 2 0 0 0 年6 月美国发生的2 3 3 起非菌性急性胃肠炎暴发的病原学研究中确认其中 的9 3 是由n l v s 所致p “。在悉尼1 1 年收集到的住院患者腹泻病人粪便标本中n l v s 的阳性率 为1 6 9 。在荷兰、英国、日本、芬兰也都得到类似结果。2 0 0 5 年1 月加拿大安大略省西北部 的2 家医院相续宣布暴发了n l v s ，共有1 8 名患者和1 6 名医护人员表现急性胃肠炎症状。2 0 0 5 年1 月1 8 日，美国皇家加勒比海国际游轮公司l 艘返回佛罗里达州劳德戴尔港的游轮上共有1 0 8 名旅客及8 名船员感染了n l v s 。 我国发现的第一例n l v s 是1 9 9 5 年报道的方肇寅等人【l j ，在河南省收集的轮状病毒腹泻季节 急性腹泻患儿的粪便标本中检出的，随后他又在河北地区急性腹泻粪便标本中发现n l v s m i 。上 世纪9 0 年代后期，靖宇、钱渊等人【”】对山西省太原市、北京地区部分人群进行n l v s 血清抗体 水平调查，两种抗体( r n v 、r m x ) 阳性率在6 9 2 和1 0 0 之间；陈冬梅等人1 5 1 2 0 0 0 年在北京和 安徽两地2 3 3 名腹泻婴幼儿的粪便标本中检出5 8 份( 阳性率2 4 9 ) n l v s ，并且基因型复杂多样； 4 r t - p c r 技术检测贝类中诺瓦克样病毒的研究 吕红霞等【6 1 对1 9 9 9 - - 2 0 0 1 年阃河北卢龙县婴幼儿腹泻的粪便标本中检测n l v s 阳性率为3 1 6 ： 谢华萍等1 7 】对1 9 9 8 - - 2 0 0 1 年间长春儿童医院5 岁以下腹泻患几的1 2 6 4 份粪便标本中检出n l v s 2 0 2 份，阳性率为1 6 。2 0 0 3 年在广州儿童医院收集的2 2 份腹泻标本中检测出2 例n l v s l ”。陈 军林等人唧2 0 0 3 年在福州地区，刘满清等人肿1 2 0 0 4 年在武汉市分别在腹泻患者粪便标本中检测 到n l v s 金玉等人2 0 0 5 年在兰州市腹泻患者粪样标本中发现n l v s 。2 0 0 3 年1 0 月至2 0 0 4 年 1 0 月间，广州市越秀区，白云区、番禺区、花都区、天河区、海珠区。广东增城市、肇庆市、江 门市的家庭、学校、幼儿园、病房等地发生了数十起n l v s 感染暴发1 1 2 - i5 】。所有调查证明。n l v s 感染在我国是普遍存在的。 美国疾病控制中, g , ( c e n t e r sf o rd i s e a s ec o n t r o la n dp r e v e n t i o n ，c d c ) 调查报道，在美国每年 n l v s 感染发病达到2 3 0 0 万例，其中约有5 万例需住院治疗。并造成约3 0 0 例死亡f 1 2 】。在所有食 物传染病原体中n l v s 引起的病例占6 6 6 ，住院病例中占3 2 9 ，死亡病例占6 9 。n l v s 病 毒粒子能在粪便及呕吐物中保持感染力达1 0 天之久。且仅1 0 1 0 0 个病毒粒子就能引起感染p 2 1 。 n l v s 引起的急性胃肠炎夏季少发，秋、冬、春季相对较多i “1 。虽然从人的粪便中可以检测出 1 0 0 多种人的肠道病毒，但是仅有少数几种能通过贝类传播，n l v s 就是其中种且也是最为常 见的种类之一。 1 3 4 传播途径 n l v s 可通过多种途径传播，包括人一人直接接触传播、食物性传播( 生食产品尤为重要) 、水 源性传播。其中人一人传播又有两条途径：粪一口传播和呕吐物的气溶胶传播。这些特点使n l v s 非常容易发生家庭内传播，出现家庭聚集性感染4 1 。暴发多是通过食物引起，如贝类、蛋糕、 沙拉、三明治、水等【2 23 1 , ”。3 ”，而散发则主要通过接触传播【4 0 1 。表现为：各年龄组人群、任 何季节、任何地点均可发生 通过水源、食物或人一人接触传播；流行时间长短不一，平均 为7 天；发病后7 2 小时约半数病人可检测出病毒。 1 3 5 病毒通过贝类的传播 贝类依赖滤食水中浮游物生长，因此在过滤大量的水进行呼吸和觅食的同时能从水中迅速 聚集大量病毒使其浓度高出周围环境的几十到上千倍1 4 4 j ”。3 8 6 8 的肠道病毒附着在贝类 消化道粘膜上，以离子键特异地与粘多糖分子的硫酸根结合，并通过血细胞的吞噬和游走扩散至 血液、淋巴和外膜腔液中。贝类只能从环境中摄取和浓缩病毒，目前没有证据表明病毒在贝类体 内复制，并产生类似抗体的物质。此外贝类还能通过食物链间接传播肠道病毒。 当水中的病毒浓度为0 0 1 p f u m l 时，贝类对病毒的摄取一释放达到平衡。低于此浓度，集 聚可能无效，而高于此浓度时，贝类体内的病毒水平随水中病毒浓度的升高而升高，但摄取率逐 渐降低。牡蛎经流水净化7 2 小时后仍有l 的病毒存活，若在稳水中即使净化1 2 0 小时仍可检测 到1 6 - - 2 1 的病毒活性。 海水中的肠道病毒一般能存活2 1 3 0 天，比大肠杆菌的存活时间长。肠道病毒进入贝类和 其他海洋动物体内后可延长生存时间。l i n c o 等d ”报道了一起n o r w a l k 病毒性胃肠炎暴发，引起 涎l l 农监大学磷士学篷论文 这次爆发的牡蛎在食用前经冷冻贮藏了1 5 周乏久。集聚于贝类体肉的病毒对热的耐受性有所提 高，可能是由于病毒所处微环境的塌白质凝固形成隔热屏障，热力难以穿透。遮有助于解释为什 么食蠲经过处理的灵类仍有可能够致演毒蛙疾痪的暴发。 1 4 诺瓦克病毒性腹泻的预防与控制 黟格彗理传染源秘籀底渍豫污染繇壤仍是按锚溅褥弱主导接擒。n l v s 流好大多源于菜静食 物或承的污染，荐戮入一人传播两发展，鼓预防撼施需全蟊着手。袭现为：( 1 ) 食物传播方嚣： 鹿特别注意牡蛎、蛤、蚶等贝类水嫩物，这类生物通过滤食水中浮游物可将n l v s 大量的浓集在 体内，对污染的海水或养殖水体的控制是预防贝类引发n l v s 等多种接染病的瀚效措施。因带 病毒食燕燕工毒污染囊接食疆晶造戏暴发更为多藏，粪夔接毒鬟太帮感染薅毒鬟低是其辗本爨 困。由于n l v s 隐健感染和病后摊瘸毒期长，盛矮袋求食晶加工卷时刻保持良好的个人卫生；( 2 ) 水源传播方面：水日l 起的n l v s 暴发相对少见，但是己经涉及到市政供水网、井水、溪水、湖水、 游泳池水和市售商赫冰。一旦评估确认饮用或娱乐水体受污染，聚耀高浓度氯( 1 0 p p m ) 消毒3 0 r a i n 壤土；3 ) 入一天簧攒方覆：阻骜人一入砖撵鞍嚣赡，获翼雩孺裹瘸a 摄重要，鬏繁麓l l 皂洗手氇燕 有效措施，洗起肥崴泡后至少要持续1 0 s 再用流永冲洗。污染区域表物尽量不去蕊接手取或抖动， 用洗涤剂充分清洗腊机器甩干。污染物体表面用禽氯消毒剂擦拭消毒【4 ”。 1 5n l v s 检测方法研究瑷状 1 5 1 电镜法 对n l v s 菜一戒爨麴特异诊颧餮嚣镲在研究串，鑫予这缀瘸毒均苓戆在组织壤葬孛繁建戢诱 导实验动物发病程n l v s 被发现詹很长一段时间内，电镜一盛怒检测的主要葶段。 ( 1 ) 直接电镜法； 电镜具有直接、w 靠的优点。但幽予n l v s 缺惹媳型豹杯状瘸簿的形态学特性，且敏感性低， 电锾竣溺晒遭病毒簧浓瘫毒赘滚发麓少簧遮銎l 霉蕺舞粪霞串客l 妒个藏毒粒子，瓣粪蠖中n l v s 的含嫩极少，即使浓缩后也难以达鼙0 可检出的浓度，所以直接用电镜来确认n l v s 比较困难。硪 且粪便中含有许多大小与n l v s 颗粒接近的小圆形物质，如果不结合其他试验，随接镜检很难作 出正确渗断。通常柱感染早期的病人粪便中比较释翳检测到病毒 4 7 , 4 9 1 。此外电镜价格昂贵、技术 条搏簧隶离，困藏不适于太鬟搂藏孬病学诱查。 ( 2 ) 免疫电镜法( i m m u n ee l e c t r o nm i c r o s c o p y ，i e m ) ： k a p i k i a n 是最早应用i e m 检测粪便滤过物中n l v s 存在情况的人。将病人的粪便悬液与其饿 复期熬受疫血清孵嵩l h ，然后3 5 ，0 0 0 x g 离心9 0 r a i n ，沉淀溶予永嚣用磷钨酸负染，在电镜下溉 察可j i 抗体在病毒颗粒表蟊形成一麓绒毛虢静膜，蔡些情况下抗体还可；l 莛褒舔籁粒的凝集，这 样更肖利于识别。尽辫对于体外非可培养的n i s 而言i e m 是一颈重要的检测警段，但是由于电 镜扫描的范围是1 x 1 0 6 m ，即平均每避升样品中瘸簿的浓度达到1 0 3 1 0 6 时才目棱出，而且由于 粪蠖巾鬻混畜一些嶷经较n l v s ，、数凝集鬏粒( 2 2 - - 2 5 n m ) ，镜检时蜜萎混淆，所班i e m 毂应用受 6 r t - p c r 技术检测贝类中诺瓦克样瘸蒋的研究 到一定的限制。对由于n l v s 感染引起的胃肠炎的患者的血清进行i e m 检测，结果仅能检测出 2 0 ，j c 寸于患者的粪便进行检验也只能检测出三分之一的期性率。因丽说1 e m 的检出率非常低， 嚣量常容器窭蘸锻蹋往结果，譬致漏检。 ( 3 ) 豳相免疫电镜法( s o i l d d h a s ei e m ，s h e m ) ： 对i e m 进行补充和优化发展出了s p i e m ，它是用病毒特异性的或广谱的免疫球蛋白“球骚 蠢) 包蠼检测叛，通避抗瘸毒静抗体搬瘸患粪硬拳渡申的病毒粒予糖获并固定在梭测援主扶丽大大 篱能了繇来的i e m 梭涮方法蕊量穗援离了病毒阳襁检出率。s p i e i v l 已经援焉镞避舒h u c v s 盘漪 型分燃的工具1 5 1 , 5 2 。 1 5 2 免疫法 ( 1 ) 免疫吸附凝集试验( i m m u n ea d h e r e n c eh e m a g g l u t i n a t i o na s s a y i a h a ) ： 棚对于费时、繁琐并且所需劳幼甓大的i e m 法，i a h a 是后来发展起来的梭测方法，它需骚 的抗缀繁少，适于大舰模熬流行瘸举检潮吲，键怒宝势不适翊于梭测粪便样本巾鳇病毒。 ( 2 ) 放射免疫试验( r a d i oi m m u n o a s s a y ，r i a ) ： i a h a 很快就被藏敏度更高，所 ；| 抗原量更少的r i a 法所取代。而且r i a 既w 以检钡0 病毒颗 粒也w 以检测可溶性的病毒抗原。它的灵敏度比i a h a 提高了1 0 - - 2 0 0 倍1 5 ”。但由于需要使用放 射性瓣拯素掭记试裁艟整个试验髑期较长西天左表) 使褥r t a 法检测n l v s 毫存一定疆铡。为了 篱纯该方法，美蕃c d c 建立了生物索- 亲和素免疫法i o t i n - a v i d i nl m m u n o a s s y ) ，利用生赣紊- 聚 和素代替放射性同位豢，其灵敏度垮r i a 法相当，目前该方法已成为美国c d c 检测诺瓦克病毒 抗原军口抗体的标准实验方法。 3 ) 魏联受疫试验爨妣v m el i n ki m m u n o n s s a v ，e l i s a ) ： 陡着非放射性间位素标记物的歼发，酶联免痰试验开始逐步取代r i a s 检测n l v s 感染。魄 起半袭期短的放射蚀同位素，生物索和辣根过氧化物酶的稳定时间更长可达数月之久。而且撼 个试验周期也缩短了一半的时间【s 4 s s 。n l v s 检测的另一重要进碰是，在杆状瘸簿一昆虫细胞表 达系统孛表这的n v 赣m x v 熬蛋是颓粒，箕撬琢热写鼙毒攮豹鬣囊一致，缝绽瓣蛋鑫鬏粒可纛 接用于e l i s a 检测n l v s 抗体，亦可用其制备超免疫血清进行e l t s a 检测其抗原p 6 5 ”。该方法 的灵敏度大大提高，但是由于n l v s 抗原的多样性，e l i s a 只能梭测到其同源瘸辩株及与其抗蹶 性非常接近的其它n l v s 毒抹，对予非同一基因缎的病毒戒员则不能捡出，对阍基因组内不阍 室剐躲藏毒捡窭率纛存在着差异，邃羧翻了萁在赣糍检测孛鹁痰麓”t ( 4 ) w e s t e r n 杂交法： w e s t e r n 杂交法鼹另一种估价抗体反应的方法在这个试验中盥接把从粪便中纯化出来的瘸 毒 # 为抗原，检测癍入的血清样本。该法能检测到犬羹i e m 法无法豫别的与瘸毒相关的抗体的抗 原狭愆簇”m 。程是出于该反癍翡鹜荣色赛，弄热乏瘸毒抗原熬采滁骞疆t 麓叛该方法也并不舞大 多数的实验室所应用。 7 河北农业大学硕士学位论文 1 5 3r