（微生物学专业论文）植酸酶基因工程菌e22的发酵工艺研究.pdf

西南大学硕士学位论文 摘要 植酸酶基因工程菌e - 2 2 的发酵工艺研究 微生物专业硕士研究生何锡杲 指导教师彭远义( 教授) 摘要 植酸酶( p h y t a s e ) 是一种新型食品与饲料添加剂，它能催化植酸( 盐) 水解为肌醇及无 机磷酸，促进微量元素及蛋白质等营养成分的吸收。植酸酶的研究开始于2 0 世纪6 0 年代。 现在对植酸酶的研究已进入到分子水平。多种微生物来源的植酸酶已得到分离纯化并进行了 较深入的生理生化研究，多种植酸酶编码基因已从不同的微生物中得到分离。目前，主要是 从分子水平上改造植酸酶，改变植酸酶的酶学活性如耐温性、适宜p h 、催化活性等，提高其 在饲料中的利用效率；通过基因工程的手段克隆植酸酶基因，然后在生物反应器中高效表达 植酸酶，以解决植酸酶在天然材料中含量太低而难以大量提取生产的问题。本实验室通过基 因工程已构建了一株植酸酶高产基因工程菌e - 2 2 ，其遗传稳定性及酶学性质等均能很好的满 足生产需要。本研究着重于植酸酶基因工程菌e - 2 2 的发酵工艺，为大规模发酵生产奠定基础。 研究结果如下： 1 植酸酶基因工程菌( e - 2 2 ) 发酵条件的研究：接种龄3 6 h ，接种量1 0 ，增萄时间7 2 h ，发 酵液p h 6 0 ，甲醇添加量1 5 ，装液量1 0 ，诱导表达1 2 0 h 能很好的提高产酶量，测得酶活 1 6 4 4 1 6 7u m l ，比优化前产酶提高1 5 。发酵培养基中添加青霉素、链霉索、t r i t o n 11 4 及 t w e e n 8 0 等对发酵产酶意义不大，反而有一定的抑制作t i = i j 。 2 适宜营养研究：适宜碳源及添加量研究表明，碳源为1 甘油时发酵酶活为9 6 0 6 7u m l ， 碳源为1 0 麦芽汁时发酵产酶为8 3 4 5 8u m l 。适宜氮源及添加量研究表明，添加量为5 鱼 粉时发酵产酶可达9 6 5 5 7u m l ，5 蛋白胨时产酶可达11 9 0 0 8u m l 。综合考虑营养物质来源、 成本等因素。以1 0 麦芽汁为碳源和5 左右的鱼粉为氮源，其他发酵因素不变，研究结果表 明，发酵产酶为1 0 3 2 7 5u m l ，取得了较好的效果。 3 发酵罐高密度发酵：参考了摇瓶条件下的最佳接种龄、接种量、发酵初始p h 、甲醇添加量 及优化的培养基进行高密度发酵。在发酵罐中进行了不补料、补料、间歇加甲醇，恒速流加 甲醇的发酵实验，间歇补料并恒速流加甲醇的方式产酶效果好。最高酶活可达2 3 5 2 9 0 u m l ， 比摇瓶发酵的1 0 3 2 7 5u m l 提高了1 2 8 倍。 关键词；植酸酶基因工程菌e - 2 2 毕赤酵母培养条件营养物质高密度发酵 s t u d yo nt h ef e r m e n t a t i o nt e c h n i c so fg e n e t i c e n g i n e e r i n gp h y t a s es t r a i ne - 2 2 d i s c i p l i n e ：m i c r o b i o l o g y s u p e r v i s o r ：p e n gy u a n - y i c a n d i d a t e ：h ex i - g a o a b s t r a c t ：p h y t a s ei sa k i n do f b i o l o g i c a le n z y m e ，w h i c hc a nd e c o m p o u n dp h y t i ca c i d ( p h y t a t e ) a n dt h e nr e l e a s et h ei n o r g a n i cp h o s p h o r u s ，i n o s i t o la n dp r o t e i n ，a m i n oa c i d ，m i e r o e l e m e n t ，c o m b i n e d w i t hp h y t i ca c i d ，e t c t h ep h y t a s er e s e a r c hs t a r t sf r o mt h e2 0 t hc e n t u r y6 0 s ，a n dn o we n t e r e dt ot h e m o l e c u l a rl e v e l m a n yk i n d so fm i c r o b i a ls o u r c eo fp h y t a s eh a v ea l r e a d ys e p a r a t e da n dp u r i f i e d m o r ea n dm o r ep h y t a s eg e n e sw e r ec l o n e df o r md i f f e r e n tm i c r o o r g a n i s m s a tp r e s e n t ，s t u d i e so n p h y t a s em a i n l yf o c u s o nr e c o n s t r u c t i n gp h y t a s eg e n e ，c h a n g ep h y t a s ec h a r a c t e rs u c ha sh e a t r e s i s t a n c e ，s u i t a b l ep h ，c a t a l y z ea c t i v i t y ，e t c ，a n di m p m v ei t su t i l i z a t i o ne f f i c i e n c yi nf e e d o t h e r i m p o r t a n tt l i i n gi st oc l o n ep h y t a s eg e n e ，t h e nh i g h l ye f f e c t i v ee x p r e s s i o ni nb i o l o g i c a lr e a c t o r s oi t c a l ls o l v et h ec o n t e n to ft h ep h y t a s ei st o ol o wi nt h en a t u r a lm a t e r i a lt ob em a s s i v e l ye x t r a c t o u r l a b o r a t o r yh a sc o n s t r u c t e dag e n e t i ce n g i n e e r i n gp h y t a s es t r a i ne - 2 2 i t sh e r e d i t a r ys t a b i l i t ya n d e n z y m ec h a r a c t e rc a i lw e l lm e e tp r o d u c t i o n sn e e d o nt h eb a s i so fs t u d i e si no u rl a b o r a t o r y f o l l o w i n gw o r kw a sd o n e ： 1 t h ee f f e c to fd i f f e r e n tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ：t h ei n o c u l a t i n gt i m e3 6 h ，i n o c u l a t i n ga m o u n t 1 0 m u l t i p l i c a t i o nt i m e7 2 h ，f e r m e n t a t i o nf l u i dp h6 0 ，m e t h a n o ls u p p l y1 5 ，a m o u n to f l i q u i di nf e r m e n t a t i o np o t1 0 a n dt i m eo fi n d u c e m e n ta n de x p r e s s i o no f1 2 0 hc a nh i g h l y i m p r o v ep r o d u c t i o no fp h y t a s e 1 6 4 4 1 6 7 u m lo ft h ep h y t a s ew a so b t a i n e d i tw a sh i g h e r15 t h a nb e f o r e w h e nt h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mw a , sa d d e dp e n i c i l l i n ，s t r e p t o m y c i n ，t r i t o n - 11 4a n d t w e e n 8 0 i th a d n ta n yp r o m o t i n ge f f e c t , i n s t e a dh a ds o m ec e r t a i ni n h i b i t o r ya c t i o n 2 t h es t u d yo ns u i t a b l ec a r b o ns o u r c ea n ds u p p l ya m o u n ts u g g e s t e dt h a tp h r a s ec a na c h i e v e 9 6 0 6 7 u m la n d8 3 4 5 8 u ，m lr e s p e c t i v e l yw h e nu s e1 g l y c e r i n ea n d1 0 m a l tj u i c e i n d i v i d u a l l y i na d d i t i o n , s u i t a b l en i t r o g e ns o u r c ei ss t u d i e d p h y t a s ec o u l d b eo b t a i n e d 9 6 5 5 7 u m lw i t ha c c e s s i o n5 f i s hp o w d e r a n da d d i t i o n a l5 p e p t o n e11 9 0 0 8u t m lw a s o b t a i n e d c o n s i d e r i n gt h em 虹i ! t i o ns o k l r c ea n dc o s t ，w eu s e d1 0 o f t h em a l tj u i c e s 粘e 材b o n s o u r c ea n da b o u t5 o f f i s hp o w d e ra st h en i t r o g e ns o u r c e t h eo t h e rf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nd i d n o tc h a n g e 1 0 3 2 7 5 u m lo f p h y t a s ew a so b t a i n e d i ti n d i c a t e dt h a ti sag o o dr e s o l u t i o n 3 r e f e r e n c e dt oo p t i m i z e df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o ni ns h a k ef l a s k ，w ed e s i g n e dt h a tm a t e r i a la d d e d i nf e r m e n t a t i o np o ti n t e r m i t t e n t l yo rd i dn o ta d d e d ，a n dm e t h a n o l a d d e di n t e r m i t t e n t l yo r c o n s t a n t l y t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h em a t e r i a la d d e di n t e r m i t t e n t l y a n dm e t h a n o l a d d e d 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t c o n s t a n t l yw a sm o r es u i t a b l e t h eh i g l e s tp h y t a s ei s2 3 5 2 9 0 u m l ，w h i c hi s2 2 8t i m e so f r o c k e rf e r m e n t a t i o n 1 0 3 2 7 5 u ，m l k e y w o r d s ：g e n e t i ce n g i n e e r i n gp h y t a s es t r a i ne - 2 2 ；c u l t i v a t i o nc o n d i t i o n ；p i c h i ap a s t o r i s n u t r i t i o ns u b s t a n c e ；h i g h - d e n s i t y - f e r m e n t a t i o n 1 1 1 独创性声明 学位论文题目： 垫堕坠叁鱼苎堡菌星：2 至鱼篮睦苎墨盟查 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者：了习端果签字日期：驴年二月、r 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口 保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：4 司诌粜导师签名： 签字日期：d 绰月j 日签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 6 月r 日 西南大学硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 植酸酶的发酵研究 1 1 植酸 植酸，又名六磷酸肌醇。是一种强酸性的黄色液体，是植物体内磷的主要储存方式l l 】，占 植物中总磷的6 0 8 0 ，在种子和果实中含量较多，其含量高达1 3 。因单胃动物体内 缺乏植酸酶，所以很难利用植酸磷，其利用率不到4 0 ，造成许多问题：首先，饲料中的磷 源不能得到有效利用，造成磷资源的巨大浪费口j 。为了满足动物对磷的需求，又必须在饲料中 添加无机磷，提高了饲料成本，也浪费了磷资源：其次，饲料中8 5 左右的植酸磷会被动物 以粪便形式直接排出体外，造成环境中的磷污染：此外，植酸在动物胃肠道中可以络合多种 金属离子，如z n ”、c a 2 + 、c u 2 + 、f e 2 + 等，也能和蛋白质鳌合形成相应的不溶性复合物，降低 了动物对这些营养物质的有效利用1 3 】。因此，植酸是一种抗营养因子。 1 2 植酸酶及其应用研究 植酸酶( p h y t a ，e c31 3 8 ) 是催化植酸( 或植酸盐) 水解成肌酵与磷酸( 或磷酸盐) 的一类酶 总称。植酸酶具有重要的应用意义【4 j 。第一，植酸酶的使用能减轻江河、水域等环境的磷污染。 我国每年从粪便中排出的磷就达2 5 0 万吨之多，是水体富营养化污染的罪魁祸首之一。我国 江河、水域的富营养化污染极为严重，如滇池的严重污染、发生的红潮等，造成污染的关键 因素是水体中的氮和磷过量。形成高磷粪便的原因是饲料中的磷没有得到有效利用。植酸酶 的使用将使粪便中磷的排除量减少4 0 7 5 即我国每年磷的排放量减少约1 8 0 万吨，将大 大减轻江河、水域等环境的磷污染。第二，植酸酶的使用能缓解我国资源匮乏、供应不足的 局面。我国是一个缺磷大国，磷的产量不足需求量的1 1 0 。是仅亚于蛋白质的第二大缺口饲 料原料。植酸酶的使用可代替饲料原料中所添加的无机磷( 磷酸氢钙) ，全国每年少用磷酸氢钙 8 0 1 2 0 万吨，从而可关停相应一批污染重的磷酸氢钙生产厂，这对我国这种严重缺磷的国家 而言，有着更为重要的社会效益和生态效益。 植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物。不同来源的植酸酶可分为两大类；3 植酸酶 ( e c 3 1 3 3 ) 和6 植酸酶( e c 3 1 2 6 ) 。植物来源的植酸酶均为6 - 植酸酶。不适合在单胃动物酸 性的胃中起作用，而且在植物中含量极低。目前，唯一报道的植物来源的植酸酶是m a u g e n s e t 等【5 】从萌发的玉米种子中分离的。研究晟多的是微生物来源的3 植酸酶。s h i e h 等【6 j 发现所用 的2 2 株黑曲霉菌中有2 1 株能产生植酸酶。从此以后，陆续从十几种微生物中分离到植酸酶， 如枯草芽孢杆菌【7 1 、假单孢杆菌 8 1 、乳酸杆菌1 9 1 、大肠杆菌1 0 “】、酵母、曲霉、i 辊孢伏革 菌i ”1 等。另外还有一种非特征性的正磷酸单酯磷酸水解酶( e c 3 1 3 2 ) 0 6 。植酸酶主要存在 于微生物，植物和动物中含量极少。所以，植酸酶的开发主要来自于微生物。早在上个世纪 7 0 年代，植酸酶就吸引了人们的注意力，但由于成本很高而并没有得到广泛应用。n e l o s n 等 茜南大学磺士学位论文 第一章文献综述 ( 1 9 7 1 ) 首先研究表明，将来自无花果曲霉的纯植酸酶制荆添加到鸡的玉米一豆粕型日粮中可有 效地分解植酸磷，提高日粮中植酸磷的利用率。直到9 0 年代，美国、芬兰、德国，荷兰等国 家先后开发出商用植酸酶之后，植酸酶才开始被添加到饲料中去。1 9 9 3 年1 1 月，加拿火批准 了在家禽和猪的日粮中应用植酸酶。此后，随着生产成本进一步降低，植酸酶在饲料中的应 用也日益推广。我国市场上的植酸酶大部分要依靠进口，价格昂贵，限制了植酸酶在我国饲 料行业中的广泛应用。我国暂时没有象欧美等国严格限制畜牧业生产中磷的排放量。随着人 们对绿色饲料和环境保护的日益重视，咀及我国加入w t o 的要求，在饲料中用植酸酶代替磷 酸氢钙已成为必然的发展趋势，因此植酸酶的需求量将日益增大【1 ”。我国每年产7 0 0 0 万吨配 合饲料，按添加无机磷盐1 5 计算需添加1 0 5 万吨，仅按配合饲料总景的1 0 添加植酸酶， 则需植酸酶1 0 5 万吨，每年至少可产生经济效益6 0 亿元以上。我国也在9 0 年代后期开始了 植酸酶产品的开发研究，最初是通过诱变筛选植酸酶高产菌株来生产植酸酶。最近，通过基 因工程构建植酸酶工程菌提高植酸酶的产量，降低生产及应用成本已成为植酸酶研究的热 点。 真菌如黑曲霉是富产植酸酶的主要菌种，但由于其天然菌株产植酸酶酶量低，直接用其 生产出的植酸酶成本较高。另一方面，天然植酸酶的抗逆性，尤其是热稳定性不能完全满足 饲料及饲料加工的要求。基因工程技术的发展，为这些问题的解决提供了一条新的有效途径， 己成为全世界对植酸酶研究的主要路线。许波等【1 8 】构建的基因工程菌所产生的中性蛋白酶表 达量是原始菌株的3 倍。实验室摇瓶发酵时酶活可达2 4 1 0 0u m l ，其粗酶的酶学和应用性 质的进一步研究，工程菌所产中性蛋白酶的耐热性和p h 适性较原出发菌株有进一步提高；通 过对发酵条件优化。最佳发酵条件下的中性蛋白酶产量平均可达2 9 8 7 8u m l 。植酸酶基因在 丝状真菌中表达受到底物磷浓度的影响，为此一般在低磷的环境中进行诱导培养。p h y a 在酿 酒酵母中表达证明，信号肽和培养基的组成影响植酸酶的表达i ”1 。p y p p 转化子在y e p d 培 养基上具有相当的活性，但在s a b o u r a u d - r a f f i n o s e 和s a b o u r a u d - g l y e e r o l 上则显示低的活性： 而p y e p i 转化子在y e p d 上无活性，但在s a b o u r a u d - r a f f i n o s e 和s a b o u r a u d g l y c e r o l 上具有相 同的活性。近年来，由于p h y a 基因在毕赤酵母得到了表达，由于毕赤酵母的二阶段培养发酵 模式，研究其在毕赤酵母中表达的影响因素( 包括高密度发酵条件下) 显得尤其重要。m a y e r 等 【l9 】将植酸酶基因接合到汉逊酵母( 砌口“蛔咖n 叫瑚中，高密度发酵后获得每升培养液 1 3 5 9 植酸酶的高表达量，占该酵母菌分泌的胞外蛋白的9 7 。 1 3 植酸酶的发酵研究 利用微生物发酵技术生产植酸酶，是获得大量稳定高效植酸酶的主要途径。利用微生物 发酵植酸酶要对其发酵条件优化。发酵条件包括培养基成分、温度、p h 值、溶氧、甲醇的流 加及其他发酵工艺的控制。培养基主要对生物量和诱导表达有影响。在培养基中添加特殊的 营养物质( 如添加限制氨基酸；表达含有金属的酶时，在培养基中添加金属元素) ，能提高一些 2 西南大学硕士学位论文 第一章文献综述 特殊蛋白的表达水平。充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达极其重要，应该保持高通 气量。实验室在三角瓶中培养时可以加人适当的缓冲液调整p h 值，以保持最高程度的通气量 来满足诱导表达的需要。甲醇诱导型菌株甲醇诱导的方式、用量、诱导时间都会影响外源 蛋白的表达水平。诱导期间每天应往培养基中补加甲醇，以弥补甲醇的消耗和蒸发；由于培 养条件和转化子表型不同，添加甲酵的最也有所不同，一般添加量为培养基体积的o 5 1 。 诱导时间过短则表达量很低。过长则外源蛋白的降解增加，应根据菌株的需要选择合适的诱 导时间。 1 3 1 植酸酶培养条件的优化 从接种量、接种龄、培养时间、培养温度、发酵液初始p h 等方面进行发酵条件优化。菌 种不同，培养条件也不相同，发酵条件应根据具体情况进行优化。温度对发酵有重要的影响， 影响菌株生长与发酵产酶。产植酸酶的菌株主要是真菌，最适发酵温度为2 5 3 4 c t ” 2 2 1 。菌 种不同，最适发酵温度不同。同一菌种，不同的菌株其最适温度也不相同。来源于加拿大俾 诗大学郑国展的l 株毕赤氏酵母的植酸酶工程菌的适宜发酵温度为2 8 c 2 ”，而毕赤酵母 g s l l 5 p h y a 菌株最适产酶温度为2 5 c 左右i ”i 。培养基的p h 不论对菌体生长还是对蛋白的分 泌表达都是相当重要的。发酵培养基的p h 对微生物的生长繁殖和产物合成的影响：影响酶的 活性，当p h 值抑制菌体中某些酶的活性时。会阻碍菌体的新陈代谢；影响微生物细胞膜所带 电荷的状态，改变细胞膜的通透性，进而影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄： 影响培养基中某些组分和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用；p h 值不 同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。菌株不同，其生长 适宜p h 不同，发酵产酶p h 也不相同。适宜发酵产酶p h 一般为5 0 6 5 t 2 2 、2 。接种量、接 种龄、培养时间等主要对发酵液中菌的生跃状态调节进而影响到发酵产物的表达。菌种适宜 的培养条件是综合优化的结果。钟秋平等【2 l 】研究木薯渣在箱式固态发酵反麻器中用黑曲霉 ( , 4 s p e r g i l l u sn i g e r ) p d 菌株发酵生产植酸酶的影响：单因素试验最佳条件为水质量分数7 5 ，料 层厚度5 1 0 e m ，接种量1 5 ，培养温度3 2 3 4 ，培养时间6 8 d 。在此条件下，植酸酶活 力最高达4 1 8 9 肛l o 垤。程辉彩等口2 】研究植酸酶产生菌黑曲霉9 0 3 ( a s p e r g i l l u s 岫弘r ) 的最适产 酶条件：初始p n5 0 6 5 ，温度2 9 士1 ，培养时间4 d ，2 5 0 m i n 三角瓶发酵液的装量为5 0 m l 。 张梅申等b 8 】对自行分离菌株发酵条件研究，最适接种龄为3 6 h ，接种量1 0 ，装液量在5 3 0 范围内随装液量增加，发酵液中酶含量下降。装液量在5 或1 0 时，产酶量差别较小，从经 济角度来考虑，选择5 0 0 m l z 角瓶中装液量5 0 m l ，即装液量比例为1 0 ，发酵液初始p h 为5 0 。 1 3 2 植酸酶发酵培养基优化 发酵培养需要一定的营养使之适当地生长，以得到最高的生产收率和最后产品浓度。所 需要的营养包括碳源、氮源、微量元素、维生素，还有控制p h 的缓冲剂。无论实验室还是大 规模化生产，营养物质的选择是很重要的。 3 西南大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 3 2 1 发酵培养基的碳源优化 碳源在酶制剂生产中的作用比较复杂，一方面它是构成菌体、合成酶的碳架以及能量的 主要来源；另方面，它往往对产酶还具有阻遏或诱导作用。因此，碳源是影响微生物产酶 的主要因素之一。为了提高产酶，应选择那些无阻遏或阻遏作用较小，对酶的产生有诱导作 用的物质作为碳源。葡萄糖作为碳源时，由于存在葡萄糖效应，往往对菌株产酶不利。王丹 博士1 2 6 1 在研究粗糙脉孢菌发酵葡萄糖和木糖混合物时发现，在葡萄糖存在的条件下木糖是不 被利用的说明在粗糙孢菌等细菌中，木糖还原酶受葡萄糖的阻遏，即存在葡萄糖效应。酵 母等微生物在发酵多种碳源的混合底物时，也同样存在此类现象。对此类现象的解释一般是， 在葡萄糖和木糖双碳源同时存在的条件下，一般情况下微生物总是先利用容易利用的碳源葡 萄糖，只有葡萄糖被消耗怠尽时，解除了代谢关键酶的阻遏或葡萄糖浓度降到相当低从而阻 遏作用很弱时其他碳源物质才开始被利用。在植酸酶发酵时，先加入一些速生碳源【2 ”，使菌 体迅速生长，使大量的无机磷转化为有机磷，解除其对产酶的反馈阻遏作用，利于菌株产酶。 菌种不同其最适碳源也不相同阻”1 相应的晟佳浓度也不一样1 3 i3 ”。培养基中多种碳源及恰 当配比对发酵有明显的促进作用( 协同作用) 。张梅申等1 2 8 】对分离到的一株产植酸酶的菌株 液体深层发酵研究表明，在相同碳源浓度及相同发酵条件下，菌株产植酸酶利用的碳源主要 是淀粉和葡萄糖，单独使用淀粉和葡萄塘时酶活较高，二者混合使用，效果更佳。这说明淀 粉和葡萄糖同时使用时，二者有协同作用。所以选用淀粉和葡萄糖混合使用作为该测试菌株 的最佳发酵碳源。 甘油作为培养基的碳源，可极大促进毕赤酵母基因工程菌的生长，这可能是由于甘油的 代谢途径较简单，从而加速酵母菌的代谢，促进菌体生长。因此，用甘油作为发酵培养基的 碳源可缩短工程菌的培养时间，提高发酵生产的效率。此外，过多的甘油与酵母浸出粉均可 抑制酵母菌的正常生长，表明在发酵生产中不能一次性添加过多的碳源和氮源，应当保持培 养基配方中合适的碳、氮比。麦芽汁是利用麦芽中所含有的各种水解酶，在适宜的条件( 温度、 p h 、时间) 下，将麦芽原料中不溶性高分子物质( 淀粉、蛋白质、半纤维素及中间分解产物等) ， 逐步分解为可溶性的低分子物质而制成。麦芽汁营养丰富，是培养酵母的天然基质，在酿酒 工业中使用广泛而悠久，是培养酵母细胞最常用的培养基。麦芽汁中含有酵母所需的各种糖 类( 主要是葡萄糖) 、含氮物质( 麦芽汁中含有1 9 种氨基酸) 、生长因子、矿物元素和微量元素， 营养全面而丰富【3 33 4 1 。麦芽汁培养基价格低廉，来源广泛，制作简单，工艺流程成熟。采用 适当糖度的麦芽汁，能很好的满足酵母细胞生长的需要，引起足够细胞量的积累。在麦芽汁 制作时，采用高温浸提法。一方面由于淀粉酶( 主要有淀粉内切酶、淀粉外切酶、r 酶和界限 糊精酶) 在高温下被灭活，淀粉不再水解，浸提液中葡萄糖含量很少。另一方面，由于高温的 浸提作用，其他营养成分如生长因子、氮源、无机盐等照样浸出。所以，用麦芽的高温浸提 液进行诱导阶段产酶时，能很好的消除葡萄糖这一抑制因子对产酶的影响，而其他营养则可 4 西南大学硕士学位论文 第一章文献综述 皇_ i 皇曼皇量曼量量量置量曼置曼曼曼曼量曼量量曼量量量蔓| 量量量量皇量皇 以满足细胞产酶的营养需求。 1 3 2 2 发酵培养基的氮源优化 以蛋白质为目的产物的发酵培养中，氮源是合成产物的重要成分，也是微生物生长所必 需的物质。马艳等口”以黑曲酶( a s p e r g i l l u s n i g e r p d ) 体发酵研究氮源，有机氮源：牛肉浸膏、 酵母浸青、尿素；无机氮源：( n h 0 2 s 0 4 、n h 4 n 0 3 、n a n 0 3 。试验结果表明黑曲霉对有机氮 源的利用情况不如无机氯源好，在无机氮源中，以添加l 2 的n h 4 n o ，最为合适。黄遵锡【2 7 i 研究不同氮源对菌株产酶的影响，与液体发酵不同，有机氮源促进菌株产酶的效果不如无机 氮源，无机氮源中以碳酸铵最好：有机氨源以酵母膏最好。刘德忠p 2 j 按文献报道的最优氮源 n h 4 n 0 3 在其他条件不变的情况下，采取不同用_ 量n h 4 n 0 3 试验，氮源n h 4 n 0 3 用量以0 5 为佳。 附加氮源的目的是为了满足菌株的快速生长以消耗无机磷，解除无机磷的反馈抑制，另一 方面是为了调节碳氨比。发酵液中的氨离子浓度对发酵有明显的影响。张励等1 3 6 1 采用流加补 料方式培养重组巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) ，表达血管生长抑制素( a n g i o s t a t i n ) 整个培养 过程分为甘油为碳源的生长阶段和甲醇为碳源的诱导阶段。全过程用氨水调节d h 时，诱导阶 段菌体生长受到抑制，蛋白质的最大表达量为9 0 8m g l 。进行不同氨离子浓度的摇瓶培养，证 实在以甲醇为碳源时，氨离子浓度对菌体的生长有明显的影响。王晨祥，张苓花2 5 1 配制无碳、 氮源的无机盐培养液：k c l0 0 5 ，m g s o , 7 r t 2 00 0 5 ，m n s 0 4 7 h 2 0o 0 0 3 ，f e s 0 4 7 h 2 0 o 0 0 3 ，其中加入2 o 的葡萄糖，再分别加入各种氮源，2 8 ，2 0 0 r m i n ，发酵7 2 h ，取0 2 m l 发酵液，p n5 5 测定植酸酶活性，考察不同氮源对植酸酶发酵的影响。结果，无机氮源不产生 植酸酶，有机氮源中蛋白胨较好，其中动物蛋白脒为最佳氮源。 1 3 2 3 添加剂对植酸酶发酵的影响 某些特殊的添加剂对发酵有明显的影响。程辉彩等吲研究植酸酶产生菌黑曲霉9 0 3 q 印川叫船城9 功的最适产酶条件发现：一定量的f e 2 + 和m n 2 + 对产酶有促进作用。苗雪霞等阳 对m r 0 2 0 菌株产植酸酶研究表明：m g s 0 4 7 h 2 0 和f e s 0 4 7 h 2 0 有明显的促进作用，其它因子 作用不明显，有些起抑制作用。在培养基中添加少量的表面活性剂可提高细胞的通透性，有 利于酶的产生，过量的表面活性剂会对细胞产生伤害。如王亚林、严建芳【2 5 l 研究黑曲霉植酸 酶液体发酵中添加适量的土温帅对发酵有促进作用。由于发酵诱导表达时间长，蛋白酶的降 解作用尤其不能忽视。通常可使用以下方法消除蛋白酶的影响：诱导期加入胰蛋白胨或酪氨 酸，用于缓解或消除蛋白酶对目标产物的降解；加人蛋白酶抑制剂，适量a n t i p a i n ，c h y m o s t a t i n ， d i i s o p r o p y lf l u o r o p h o s p h a t e ，e l a s t a t i n a l ，p m s f 等均能完全抑制蛋白酶的活性；修饰宿主细胞， 删除编码蛋白酶的p e p 4 基因。油酸是一种能诱导产生过氧化物酶体的碳源，向以a o x 2 为启 动子分泌r h s a 的p p a s t o r i s 的培养基中加入0 0 1 ( w v ) 的油酸时，r h s a 的表达量可提高一 倍。不同氨基酸对r h s a 分泌的影响有较大差异，培养基中添加0 1 ( w v ) 组氨酸能提高r h s a 产率3 3 4 4 倍p ”。 5 西南大学硕士学位论文 第一章文献综述 2 、毕赤酵母的发酵研究 巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 是一种极具潜力的酵母表达系统，它能使外源真核基因正 确翻泽和翻译后加工，并能对许多蛋白质产物进行分泌，使产物易于提纯；毕赤酵母发酵产 物的累积不会对自身产生毒副作用，且毕赤酵母表达体系的显著特点就是表达菌株很容易从 摇瓶水平按比例放大到高细胞密度的发酵罐培养基中，不影响外源基因的表达水平。毕赤酵 母表达蛋白的发酵方法是根据启动子的类型和表现型决定的，启动子为p a 0 x 1 时一般采用两步 法：工程菌首先在甘油为碳源的培养基中扩增，此时酵母菌生长迅速，但p a o x l 处于抑制状态， 没有蛋白表达；达到一定密度后，停止加甘油而换用甲醇来诱导表达。根据表型的不同，达 到表达高峰的时间也不同，m 心的菌株一般需要1 5 0 2 0 0 小时。随着发酵技术的不断提高及 发酵设备的改进，如：在诱导期监测甲醇浓度并根据反馈情况适时控制甲醇的供给速度使其 达到最佳浓度；检测并控制氧气饱和度：调节p h 值等，可使达到高峰的时间减少到5 0 小时 或更少。启动子为p g p 时则不需要诱导，菌株在生长的同时就可表达，每天提取一定量的培 养液并补加适量的新鲜培养基，使细胞密度及表达水平维持在一个恒定水平，从而实现连续 表达，有时甚至可以达到1 个月。自2 0 世纪7 0 年代起建立的以巴斯德毕赤酵母作为单细胞 蛋白生产菌的高密度发酵方法已经成熟。现在发展了一种s c m 摇瓶技术( s h a k e nc e r a m i c m e m b r a n ef l a s k ) ，这种摇瓶技术培养条件比普通摇瓶发酵更接近于发酵罐高密度发酵，可以使 外源蛋白的表达比普通摇瓶发酵提高2 6 1 0 倍，因而对重组转化子的筛选更为有效。毕赤酵 母表达不同的外源蛋白的表达水平相差很大，胞内表达的巴西三叶胶睛水解酶 ( h e v e a b r a s i l i e b s i sh y d r o x y n i t r i l el y a s e ) 产量高达2 2 9 l 口”，破伤风片段c ( t e t a n u st o x i n 如g m e n l ) 产量高达1 2g l 【“，胞外分泌表达的鼠明胶蛋白( m o i l s eg d a t i n ) 3 蛔j1 4 8g l 1 3 ”，组织坏死因 子( t i s s u e n e c r o s i sf a c t o r ) ) 6 量高达6g 几1 4 0 】；而报道的表达蛋白量最低的只有lm g 几，相差可达 1 0 0 0 0 倍。这种外源蛋白表达的差异，一方面是由于外源基因本身的特性所致。另一方面发酵 条件也对表达量起了极其重要的作用。 毕赤酵母表达系统的优点之一就是容易进行放大培养，它既可以在很小的试管中培养， 也可以在大型发酵罐中生长。通常在试管或摇瓶中的表达水平明显低于发酵罐中的表达水平， 二者差别可能达到上百倍，其原因主要是：在试管或摇瓶中培养，缺乏有效的p h 值调控：通 气量不足，氧气的供应不能满足代谢的需要；不能控制营养物质供给速度使其达到最佳浓度 水平。毕赤酵母发酵时可以达到很高的细胞密度( 大于4 0 0e f t , 湿细胞或1 0 0g l 干细胞) ，分泌表 达可占到总分泌蛋白的3 0 8 0 。对于分泌性表达的蛋白，细胞密度越商意味着表达水平越 高，如人胰岛素，在酿酒酵母中表达时表达量很低当用毕赤酵母表达时由于高密度培养表 达量可以达到1 5 9 l 。值得注意的是细胞密度越高意味着酵母自身分泌的蛋白酶也越多。所 以，对于某些对蛋白酶敏感的蛋白来说，高密度发酵并不是理想的选择。 2 1 高密度发酵培养基 6 西南大学硕士学位论文第一章文献综述 在高密度发酵条件下，培养基的组成直接影响了细胞的生长和外源基因的表达乃至工程 菌的遗传稳定性。毕赤酵母发酵工艺手册上提供的f m 2 l 基础盐配成含4 甘油的发酵培养基 ”4 ”，组成为8 5 的h a p 0 4 2 6 7m l ，k 2 s 0 41 8 2g ，c a s 0 4 2 h 2 0 o 9 3g ，m g s 0 4 7 h 2 0 1 4 9g ，甘油4 0 0 9 k o h4 3 l g ，加水定容至1 l 。发酵时流加p t m t 微量元素盐，组成为 c u s 0 4 5 h 2 06 0g ，n a l0 0 8g ，m n s 0 4 h 2 03 0g ，h 3 8 0 30 0 2 9 ，c o c l 20 5g ，z n c l 22 0 0g ， b i o t i n0 2g ，n a 2 m 0 0 4 2 h 2 00 2g f e s 0 4 7 h 2 06 5 0g ，浓h 2 s 0 45 0m l 定容至1l ，其工作浓 度为4 3 5m i 几。该培养基成分相对较为复杂，主要以盐类元素为主，营养单一且价格相对较 高。尤其是这类培养基容易形成沉淀。也不宜混合高温灭菌。高密度发酵流加p t m l 盐过高时， 容易形成沉淀，给发酵带来不便。在毕赤酵母高密度培养时。采用l n v i t r o g e n 公司提供的培养 基如b m g y b m m y 、b m g b m m 、m m m d 等。其中b m g y b m m y 、b m g b m l v l 培养基 中包括磷酸缓冲液，常用来表达分泌蛋白，适用于外源蛋白活性受p h 影响较大的情况可以 维持在一定p h 范围内获得最佳的蛋白表达量。但是，这类培养基成本高，不适合大规模发酵 或工业化生产。对于蛋白酶比较敏感，容易受到降解的分泌型表达蛋白，一般就要采用含有 蛋白胨和酵母粉的培养基，或者添加1 酪蛋白水解物。以防止或降低目的蛋白的降解，如在 表达m e g f 时，最终的表达量强烈地依赖于培养基的组成。在含酵母膏和蛋白胨的培养基中 单拷贝转化子表达量为0 0 2 p g m l ，但在不含酵母膏、蛋白胨的培养基中表达量低至 0 0 0 li 1 9 m l 。 为了降低培养基的成本。简化培养基的制作工艺，研究人员做了一系列相关的工作。王 平章h ”、赵海峡采用麦芽汁培养基来培养毕赤酵母，当细胞浓缩培养与不浓缩培养时，培 养基成本分别只有上述配方的1 1 9 8 7 8 和1 6 4 5 9 ，经济效益即产出与投入之比分别是合成培 养基( b m g y ，b m m v ) 的2 0 0 倍和6 6 倍，有效地降低了成本，为基因工程菌的扩大生产奠定 了基础。余雪冰等b 3 j 对基础培养基( 酵母汁1 、酵母粉o 4 、蛋白胨2 、( n h 4 ) 2 s 0 41 、 甘油1 ，k 2 h p 0 4o 2 3 ，k h 2 p 0 41 1 9 ，p n 6 o ) 的优化得到改良后的培养基为：酵母汁 1 、酵母粉o 5 、蛋白胨2 ，o m 4 ) 2 s 0 4 0 8 、甘油4 ，k 2 h p 0 4 0 1 ，k h 2 p 0 4o 6 ， p h 6 0 ，在接种量为5 1 0 7 m e 时，培养基3 天，菌体密度达到高峰，干重达2 5 3 9 l 。 2 2 高密度发酵补料控制 目前，高密度发酵工艺已成为生物技术中进行中试生产的主要发酵工艺，该方法工艺稳 定，发酵周期可缩短一半以上，而菌体产量和产物表达最是非高密度发酵的1 0 5 0 倍，蛋白 活性提高2 3 倍，可见高密度发酵具有无法比拟的优点【5 “。自2 0 世纪7 0 年代起建立的以巴 斯德毕赤酵母作为单细胞蛋白生产菌的高密度发酵方法已经成熟。由于分批式培养，一次性 投料和放罐，培养液初始浓度较高容易产生底物和代谢产物的抑制作用，亦不利于氧的传 递，难以实现细胞的高密度。补料培养可解除底物或代谢产物的抑制作用。补料方式常有表i 、 表2 所列举的不同方式h ”，原理也各不相同，适应的情况也不相同。叶冰等 4 9 1 研究不同补料 7 西南大学硕士学位论文 第一章文献综述 方式的高密度发酵，结果表明：补料批式发酵要远优于批式发酵流加方式的变速流加优于 间歇流加和恒速流加，变速流加最高酶活是间歇流加的1 7 5 。 表1 非反馈补料 非反馈补料工作原理 。 预先设定的恒定营养流加速率，细菌的比生长速率逐渐。f 降， 恒速补料 菌体密度呈线性增加 ， 在培养过程中流加速率不断增加( 梯度、阶段、线性等) 变速补料 比生长速率在不断改变 指数补料流加速率呈指数增加，比生长速率为恒定值，菌体密度呈指数增加 表2 反馈补料 反馈补料工作原理 恒p h 值法 恒溶解氧法 苗体浓度反馈 c e r 法 d o - s l b i 法 通过p h 值的变化，推测细菌的生长状态，调节流加速度，调节p h 为恒定值 以溶解氧为反馈指标，根据溶解氧的变化曲线