（微生物学专业论文）可降解聚乳酸的细菌选育及其解聚酶的研究.pdf

摘要 聚乳酸( p l a ) 是一种新兴的高分子材料，其理化性能优异，很多方面可与 现阶段广泛使用的通用塑料相比，某些性能甚至超过通用塑料，而且聚乳酸还能 被生物降解为无毒无害物，因此其应用前景被普遍看好，目前已被应用于医学、 生态学、纺织业等高附加值领域。 本论文重点在于证明聚乳酸生物降解可行性。筛选出一株具有降解聚乳酸能 力并可分泌聚乳酸解聚酶的细菌，探究该菌株分泌聚乳酸水解酶的最佳条件，分 离、纯化出聚乳酸解聚酶，并对其酶学性质进行初步研究。 实验结果具体如下： 1 由野外采集的多个土样中筛选出可降解聚乳酸的一株细菌，经初步鉴定为 纤维单胞杆菌属 c e j j u o m o n a s ( b e r g e ye ta 1 ，1 9 2 3 ) ，c l a r k ，编号为 d s 2 0 0 6 。通过菌种培养条件优化实验，测得菌种产聚乳酸解聚酶的最适培 养温度为3 5 、最适培养p h 值为7 4 。 2 对d s 2 0 0 6 产生的聚乳酸解聚酶进行分离纯化，并对其酶学性质进行初 步探讨。纯化倍数约为1 4 8 7 ，酶活力回收率1 1 2 5 ，酶蛋白的相对分子质量约 为4 2 8 k d 。 3 该酶最适反应温度为4 5 ，最适反应p h 值为7 。5 。在温度3 0 以下和p h 值 7 0 - 8 0 范围内时较稳定。金属离子c a 2 + 、m 9 2 + 对p l a 解聚酶有激活作用，而c u 2 + 、 h 9 2 + 、z n 2 + 等金属离子对此酶有明显抑制作用。质谱仪测得聚乳酸解聚酶降解聚乳 酸的产物中含有乳酸及乳酸二聚体。 4 进行聚乳酸薄膜降解，降解时间为1 0 天，降解后膜强度大大降低，透明 度明显减弱，变为白色，膜的边角明显变圆，质地变酥脆。从扫描电镜观察到试 样表面部分地方开始变化，聚乳酸膜逐渐走向解体，膜表面因被降解而开始变得 不平直至膜出现细微裂痕和空洞。 关键词：聚乳酸；生物降解；聚乳酸解聚酶 a b s t r a c t p o l y l a c t i ca c i d ( p l a ) i sah i g hp o l y m e rm a t e r i a l sn e w l yr i s i n g i t sp h y s i c a l p r o p e r t y a n dc h e m i c a l p r o p e r t y i s o u t s t a n d i n g 硒p l a s t i c ，c o m p a r e d w i t h p e t r o - c h e m i s t r yp l a s t i cw h i c hi sw i d e l yu s e da n dk n o w na so n eo ft h ee n v i r o n m e n t a l p r o t e c t i n gm a t e r i a l s p o l y l a c t i c a c i dc a nb e d e g r a d e dt o h a r m l e s sm a t e r i ab y m i c r o b i o n ，s oi t sp e r s p e c t i v ei sa b s o r b i n g n o w ，p o l y l a c t i ca c i dh a db eu s e di n m e d i c a ld o m a i n ，e c o l o g i c a ld o m a i na n ds oo n t h ee m p h a s e so ft h ee s s a ya r ep r o v i n gt h ef e a s i b i l i t yo fd e g r a d i n gp o l y l a c t i c a c i db ym i c r o o r g a n i s m s ，p r o c u r e i n gab a c t e r i u mw h i c hc a nd e g r a d ep o l y l a t t i ca c i di n ar e l a t i v es h o r tt i m e s u c hb a c t e r i u mh a db eo b t a i n e d ，a n di t sg r o w i n go p t i m u m c o n d i t i o nh a db eo b t a i n e d ，t o o p o l y l a c t i ca c i dd e p o l y m e r a s eh a sb e e np u r i f i e da n d s o m ep r i m a r ya n a l y s i sh a sb e e n d o n eo ni t t h em a i nr e s u l t so b t a i n e df r o mt h ew o r ka r e 弱f o l l o w s ： 1 t h eb a c t e r i u mn u m b e r e dd s 2 0 0 6 ，w h i c hh a st h ea b i l i t yo fd e g r a d a t i n g p o l y l a c t i ca c i d ，h a sb e e np u r i f i e df r o mt h em u dc o l l e c t e df r o md i f f e r e n tp l a c e s t h e b a c t e r i u mi si d e n t i f i e d 嬲 c e l l u l o m o n a s ( b e r g e ye ta 1 ，19 2 3 ) ，c l a r k i t sg r o w i n g o p t i m u mc o n d i t i o nh a db eo b t a i n e d t h eb a c t e r i u mg r o w i n gi n3 5 ca n dp h = 7 4c a l l e x c r e t em o s tp o l y l a c t i ca c i dd e p o l y m e r a s e 2 s o m er e s e a r c hh a sb e e nd o n eo nt h ep o l y l a c t i ca c i dd e p o l y m e r a s ew h i c hi s o b t a i n e df r o md s 2 0 0 6 t h ef i n a lp u r i f i e de n z y m er e p r e s e n t e dt h e11 2 5 r e c o v e r y a n dt h e1 4 8 7 一f o l dp u r i f i e dp r o t e i nw i t haa c t i v i t yo f17 4 3 9 5u m g 3 t h em o s ts u i t a b l er e a c t i o nt e m p e r a t u r eo ft h i sp o l y l a c t i ca c i dd e p o l y m e r a s ei s 4 5 ca n dp hi s 7 5 b e l o wt e m p e r a t u r e3 0 ca n db e t w e e np h7 0 - 8 0 ，t h ee n z y m ei s s t a b l e c a 2 + 、m g + c a na c t i v et h ee n z y m e ，b u tc u 2 + ，h g + a n dz n 2 + w i l lm a k ei tl o s e 。 l a c t i ca c i d ( m w 9 0 ) w h i c hi st h em o n o m e ro fp l aa n dd i p o l y m e re x i s t si nt h ep l a d e g r a d a t i o np r o d u c t s 4 t h eb a c t e r i ad s 2 0 0 6a l s oh a v et h ea b i l i t yt od e g r a d ep l af i l m s a f t e rn i n e d a y s d e g r a d a t i o n ，p l af i l m sp a r t l yl o s tt h e i ri n t e n s i t ya n dt r a n s p a r e n c y t h ep h o t o s b ye l e c t r o n i cs c a n n i n gm i c r o s c o p es h o wt h a tt h es u r f a c eo ft h ep l af i l m sh a sb e e n d e g r a d e dp a r t l y k e y w o r d s ：p o l y l a c t i d e ( p l a ) ；b i o d e g r a d a t i o n ；p l ad e p o l y m e r a s e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 期： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东：l ku j 币范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东- i l ! j i 范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复 印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 日期 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：2 之盘 日 期：竺墨：笸：f 电话： 邮编： 己l吉 丁i 口 以通用塑料( 聚氯乙烯、聚乙烯等) 为代表的高分子材料作为2 1 世纪划时 代的材料，以其价格低廉，生产工艺简便，原料来源容易，物理化学性能优异等 独特优点，已在工农业生产，国防军工，科学研究，日常生活及医学等方面发挥 着巨大的作用。但通用塑料在给人们生活带来种种便利和好处的同时，它的难降 解性使得其广泛应用造成了严重的堆积，形成了2 l 世纪最大的环境问题之一 “白色污染 n 3 。寻找可降解高分子材料以代替传统通用塑料成为2 l 世纪 科学界的重大课题。 可降解塑料按来源方式可分为合成材料和天然材料。合成材料主要包括聚酯 类，聚酰酐类，聚酰胺类，聚原酸酯类；天然材料包括多糖和蛋白质阻2 3 。按降 解方式可分为化学降解材料、物理降解材料和生物降解材料口3 。按其降解条件又 分为四类： 光降解类塑料掺入光敏剂，在曰照下逐渐分解掉的塑料。它属于较早 的一代可降解塑料，其缺点是降解时间因日照和气候变化而变化，因而难以控制 降解时间； 生物降解类塑料在自然界微生物( 如细菌、霉菌和藻类) 的作用下，可 完全分解为无毒低分子化合物的塑料。其优点是贮存运输方便，只要保持干燥， 不需避光，应用范围较广，不但可以用于农用地膜、包装袋，而且可以广泛用于 附加值较高的医药领域； 光一生物降解塑料光降解和微生物降解相结合的一类塑料，它同时具 有光和微生物降解塑料的特点，可快速降解，但贮存条件要求较高； 水降解塑料生产过程中添加吸水性物质，用完后弃于水中能逐渐溶解 掉的塑料，主要用于医疗用具方面( 如医用手套等) ，便于销毁和消毒处理。 各类可降解材料相比较，生物降解材料以其降解方式最简便易行、成本相对 低廉、合成技术及加工技术成熟而最具发展前景h 5 1 。 生物可降解塑料一般文献中定义为“被生物体逐渐破坏最后完全消失的材 料 ，是指能被生物体水解或酶解成为生物能够吸收利用的无毒小分子物质。 理想的生物可降解材料应具备多种综合性能1 ： ( 1 ) 具备生物安全性与相容性，聚合物与降解产物均无毒。 ( 2 ) 力学性能、理化性质、生物性能通过调控分子结构达到指定标准，不需要 ( 3 ) 添加剂与辅料或只需无毒添加剂与辅料h 1 。一 加工成型工艺可沿用传统通用塑料加工成型技术与设备，或者更为简便易行、成 东北师范大学硕士学位论文 本低廉。 ( 4 ) 原材料来源和价格具商品化生产可行性阿1 。 目前生物可降解材料的合成研究方兴未艾，部分材料如聚羟基乙酸，聚乳酸， 聚二氧杂环己酮，聚三次甲基碳酸以及以天然物质如淀粉为基础的聚合物等，合 成技术已相当成熟，。其中聚乳酸及其它乳酸类聚合物的降解过程和降解产物( 乳 酸等) 对生物体无毒无害、可在自然状态下被生物体吸收并转化为c 0 ：和h 2 0 这 一优良特性引起广泛研究兴趣伸1 ，相关合成技术及改性技术研究较多，并且已实 现商品化生产。但因其生产成本较高目前尚未广泛应用，仅在医疗、科研等高附 加值的领域得到应用旧，。 2 东北师范大学硕士学位论文 一、文献综述 1 、聚乳酸简介 聚乳酸( p o l yl a c t i ca c i dp l a ) 在自然界中不存在，它是一种通过现代工 业方法人工合成的高分子材料。聚乳酸安全无毒是其广泛应用的最基本条件u 0 | 。 将聚乳酸制成医用缝线，以家兔为载体进行毒性研究。实验结果表明，聚乳酸对 机体没有明显毒副作用，且具有防止粘连，能逐步降解、吸收等特性。 生产聚乳酸的的原料为乳酸3 。乳酸是天然化合物，无毒无害。在乳酸分子 中含有一个羧基和一个羟基两个官能团，具有较高的反应活性，在适当的条件下 容易脱水缩和成聚乳酸。乳酸可通过发酵玉米秸秆，稻草等农业产品获得，其来 源广泛、价格低廉且对环境无害，与通用塑料的原材料石油相比，乳酸具有 良好的可再生性，可谓取之不尽，用之不竭，而且无毒无害，环境安全性较高。 这都为聚乳酸商品化生产奠定了良好的基础。 在现已提出的生物可降解高分子材料中，聚乳酸有较高的熔点( t m ) ，因聚 合度不同熔点在1 8 0 。c 附近，大大超过了国际通用的家用塑料熔点超过1 2 0 的 标准，为其在生活中广泛使用奠定了基础口别。聚乳酸易溶解于多种有机溶剂。结 晶温度及玻璃化转变温度适中，成型加工性能好。熔融挤压后有拉伸性，可提高 机械强度、韧度及耐热性口引。聚乳酸还可在生理盐水中自然水解n 制。其基本性质 见表1 。这些特性使聚乳酸具备了取代传统通用塑料的能力，在某些领域可以使 聚乳酸完全取代通用塑料，甚至超越通用塑料。因此聚乳酸有很好的应用前景。 然而，聚乳酸由于具有玻璃态化温度低，单独成型时质地硬而脆，吸水性较强等 特点，因此暂时不能在包装材料、农用材料等领域中使用n 副。 表1 不同旋光性p l a 的性质比较 3 东北师范大学硕士学位论文 目前，通过化学改造的乳酸聚合物在保持原有优良特性的情况下，也具备了 相当的柔软性和更加优良的热塑性。主要是通过在聚乳酸内部添加具有柔软性的 脂肪族二羧酸、羟基脂肪族羧酸、乙二醇等实现的口6 1 。这种乳酸类塑料的合成方 法仍然以乳酸为主要原料，在催化剂存在的适宜条件下，与柔软的脂肪族酯类进 行共聚。在合成阶段通过调整乳酸与脂肪族酯类的比例，可以制得特性不同的高 分子聚合物，既可以制得物理性能与聚苯乙烯类似的聚合物，也可制得物理性能 与聚乙烯和聚丙烯类似的聚合物。 应用型改性乳酸类聚合物根据其物理特性主要分为两类n 7 1 剐：硬质型和软质 型。硬质型是一定百分比的柔软性脂肪族聚酯与乳酸共聚制得的，改善了聚乳酸 的脆性缺点，既保持了聚乳酸原有的刚性，又提高了其耐冲击性；而软质型则是 更高百分比的柔软脂肪族聚酯与乳酸共聚制得的，兼备透明性及和聚烯烃一样的 韧性及柔软性。硬质型与软质型聚乳酸的比较见表2 。硬质型和软质型乳酸类聚 合物均具有1 6 0 左右的熔点，完全能达到热塑加工工艺的要求。 聚乳酸的力学性能受其结晶性的影响也很大口钔。随着分子量增大，聚乳酸的 力学强度有很大提高。研究发现结晶度较高的聚乳酸植入体内2 4 周后其弯曲强 度仍可保持在1 8 0 m p a 以上，剪切强度保持在7 5 m p a 以上。尽管其剪切强度下降 比弯曲强度要快，但是两者的强度都大于皮革骨的强度，完全能满足骨折内固定 的基本要求，促进骨折早期骨性愈合。这一性质使得聚乳酸成为一种具有开发价 值的新型吸收性接骨材料。 表2 硬质型与软质型聚乳酸的比较 2 、聚乳酸的合成与加工 聚乳酸的合成具有长期的历史，聚乳酸的合成研究最早始于1 9 1 3 年，法国人 由乳酸直接脱水聚合得到低相对分子质量的聚乳酸。分子量低、产量低，且强度 低使得当时聚乳酸没有任何实用价值，未引起重视。6 0 年代末至8 0 年代，集中在 研究通过丙交酯间接合成高相对分子质量聚乳酸，这种聚乳酸由于对热和水的 敏感性，长期以来也未引起足够的重视啪1 。后来在对聚乳酸对水敏感这一特性重 4 东北师范大学硕士学位论文 新审视后，凭借其优点而被开发为可降解的手术缝线材料。引发了聚乳酸作为生 物医用材料的开端。8 0 年代末! n 9 0 年代初，经过改进聚合工艺和大量研究共聚改 性技术，使聚乳酸的分子量大大提高，性能得到进一步提高和完善，其应用领域随 之也迅速扩大昭。当前聚乳酸已成为生物降解材料领域中最受重视的材料之一。 目前，聚乳酸的合成大体上有以下几种方法： 直接聚合法晗2 1 直接聚合法是在脱水剂的存在下，乳酸分子间受热脱水，直接缩聚成低聚物 的方法，是最早研究的聚乳酸合成方法，由法国人始创于1 9 1 3 年。但是最初由于 涉及反应中产生的水的脱除等关键技术未能完全解决，聚合产物的分子量较低 ( 均低于4 0 0 0 ) ，强度极低，易分解，没有实用价值。 日本昭和高分子公司采用减压脱水缩合，再在2 2 0 , - - - 2 6 0 下熔融缩聚的方 法得到了相对分子量在4 0 0 0 以上的聚乳酸。但用这种方法生产的聚乳酸反应时间 长，反应产物后期在高温下会老化分解变色。复旦大学的钟伟等用真空直接缩聚 法制备聚乳酸，经苯甲醚回流后产物的相对分子量可达到1 9 0 0 0 以上，再通过己撑 二异氰酸酯h d i 扩链，产物的相对分子量可进一步增至! u 6 3 0 0 0 。 用直接法生产聚乳酸的优点是：生产过程不需使用有毒催化剂，产品无毒， 可适用于食品包装、医学等领域。缺点是：相对分子量不高，强度较低，成形加 工困难。若要提高分子量，则反应时间长，温度高，条件过于苛刻。 开环聚合法 为提高聚乳酸的相对分子质量，开环聚合法是目前全球使用较多的生产方 法。乳酸脱水缩合，在三氧化锑、三氟化锑等催化剂作用下制得2 ，2 一二甲基一3 ，6 一 二氧代一l ，4 一二恶烷( 聚乳酸的环状二酯) 简称丙交酯然后再加入辛酸锡、二酯 锌、四苯基锡、三氟化硼等催化使其发生环聚反应而制得较高相对分子质量的聚 乳酸。相对分子质量可由催化剂浓度、种类及聚合体系的真空度来控制。 开环聚合法合成的聚乳酸分子量可达百万以上，机械强度高，性能好。聚合分 两步进行：第一步是乳酸经脱水环化制得丙交酯； f h 3 貌水h 3 二h o _ c c ! o o h 丽 o 琢o o o c 两 第二步是丙交酯经开环聚合制得聚丙交酯( 聚乳酸) ；此法可通过改变引发剂的 种类和浓度，控制产物的相对分子量。 5 东北师范大学硕士学位论文 h ； 等十鬻 o o c 如 此法的优点是：产物相对分子量最高可达百万以上，机械强度较高，各种物 理性能好。缺点是：得到的聚乳酸中残存的催化剂量较多，难以除尽。部分催 化剂有毒，不能适应医疗要求，而且合成中要用易爆、价格较昂贵的二恶烷作 溶剂，操作不便而且反应时间长。 共聚法幽1 由于聚乳酸的降解速度较快，本体浸蚀后强度下降很快。聚乳酸为疏水性物 质，且降解周期难于控制，随着聚乳酸应用领域的不断开拓，单独的聚乳酸均聚 物已逐渐不能满足要求，在长效药物释放载体和外科缝合线的应用上尤为显得不 适合，特别是在高分子药物的控制释放体系中不同的药物要求其载体材料具有 不同的、可控的降解速度。近年来聚乳酸与其它单体共聚已成为研究的热点。共 聚改性是通过调节乳酸和其它共聚单体的种类、比例来改变聚合物的性能，或由 各种其他单体赋予聚乳酸以特殊性能，如亲水疏水性、结晶性等心明。高分子聚醚 具有优良的生物相容性、血相容性以及亲水性，在疏水的聚乳酸链段中适当引入 亲水的聚醚链段，有望提高材料在生物体内的相容性，制得降解速度可控的聚一 酯一聚醚材料，适合医疗手术用，特别适合作可生物吸收的薄膜。 如已有报道的聚d 、l - - 孚l 酸与聚己内酯( p l a p c l ) 共聚，乙交酯与丙交酯共聚 形成聚乙丙交酯( p g l a ) 、聚d 、l - - 孚l 酸与聚乙二醇( p l a p e g ) 共聚等。e 1 i s s e e f f 、 k i m u r a 、b a r r e r a 等人通过设计新环制备出与甘氨酸、赖氨酸的交替共聚物，这 些新型材料是细胞组织培养工程的良好载体。 聚乳酸的加工成型技术主要分为：挤出成型、注射成型、发泡成型和吹塑成 型，与传统通用塑料的成型加工技术有很多相似之处，产品种类也多种多样，有 很好的应用前景。 挤出成型的产品和应用前景啪3 ： ( 1 ) 薄膜。聚乳酸硬质薄膜透明性好，与赛珞玢相似，可用作水果包装薄膜， 饭盒内衬，产品封口膜，纸压板衬膜等。软质薄膜柔软性和热封性与聚乙烯相似， 可用作农用复合膜，食品袋，保鲜膜和降解垃圾袋等。 ( 2 ) 成型片材。透明普通型片材的耐热温度在6 0 以下，但透明性较好，可用 于蔬菜水果包容器及各种产品的泡罩包装。不透明耐热性片材的耐热温度可达到 家庭用品品质法规定的1 2 0 ，可用于开水冲泡餐具、电子微波炉餐具等。 ( 3 ) 纤维、无纺布。聚乳酸在生物可降解塑料中拉丝性能最好，机械性耐热性 较佳，通过熔融纺丝可加工成单丝、复丝、化纤短纤维到长纤维无纺布等产品。 6 东北师范大学硕士学位论文 此类无纺布产品可用于农业、园艺、土木建材、食品、医疗、生活用品等各领域。 在成型技术方面，u n i t i k a 公司成功研制了纳米复合材料，用纳米级分子技 术及定向设计技术，将聚乳酸的结晶速度提高了i 0 0 倍，能成功生产1 2 0 c 左右 的高耐热性注射品，可用于电脑零件、手机零件等。 在发泡成型技术方面，u n i t i k a 公司在全球首次成功开发出高耐热性挤出发 泡用聚乳酸，该产品耐热性不逊于p s p ，可生产耐开水冲泡及电子微波炉加热餐 具及其他一次性餐具。 在吹塑成型方面，聚乳酸瓶气体阻隔能力的问题已得到很好的解决，可实现 工业化生产。如采用与气体阻隔性较好的通用塑料共挤，可加工成阻气水通过性 更好的瓶。 3 、聚乳酸应用 目前聚乳酸的合成加工技术已相当成熟，但其生产成本还是远高于传统通用 塑料，所以尚未在众多领域广泛应用，只是在医学领域等附加值较高的领域得到 较多应用。 ( 1 ) 外科手术缝合线犯7 1 。聚乳酸在医学上最早的应用就是手术缝合线。因为聚 乳酸本身无毒，其降解产物二氧化碳和水也无毒，具良好的生物相容性不会引起 炎症反应。在伤口愈合后可自动降解吸收，无需二次手术拆线，大大减轻了患者 的痛苦和医疗费用而受到广泛欢迎。 ( 2 ) 骨修复材料乜7 瑚1 。聚乳酸有很好的生物相容性，很适合用作软骨组织修复 材料，这种材料代替钢板、钢针起固定作用时，在骨骼和软骨组织修复过程中被 逐渐吸收，从而避免康复后二次手术取出金属装置的麻烦。但是熔融成型的的聚 乳酸强度不够高，易脆，在应用中受到限制，不能用于矫形外科、上颌面手术等 方面。而且因这一缺点致使要用大片的植入物才能保证固定牢固，这样直接导致 植入时带来过多创伤，并加重组织对异物的负荷。目前对聚乳酸进行增强处理以 解决上述问题的研究较多。d e g e r 等人把高聚相分子引入左旋聚乳酸中，使其机 械强度增高近5 倍。另外在聚乳酸中加入某些药物，如骨形成蛋白b m p 或磷酸酯 蛋白，使材料既起到支撑作用，又起到药物载体作用，加速骨折的愈合。 ( 3 ) 药物控制释放系统啪3 。最早对聚乳酸作为缓释药物包囊材料作报道是在1 9 7 3 年，由y o l l e s 等人提出。宋存先等人提出p c l 与p l a 混合制成的药物载体可通 过调节p c l 和p l a 的比例改变药物释放速度。s a n d e r 等使用n a f a r e l i n 的p l g a 植入剂成功抑制了8 个月小鼠的发情。八十年代后应药物发展需要，聚乳酸作为 药物控释载体更是迅猛发展，目前已被应用到很多药物的控制释放中，如抗癌药 ( 顺氯氨铂、阿霉素、博莱霉素等) 、生物活性分子( 生长素、牛血清蛋白等) 、 抗生素( 氯霉素、青霉素等) 、麻醉剂，麻醉拮抗剂，避孕药等。 ( 4 ) 细胞种植基体材料晗7 铷。近年来，研究表明将软骨细胞在聚乳酸支架上培 7 东北师范大学硕士学位论文 养，经卜6 个月培养，可出现类似软骨组织的结构。而聚乳酸具降解性，在一定 时间内降解完全，可获得单一的人工器官组织。 4 、聚乳酸降解特性 目前聚乳酸降解的研究是热点问题，但己发表的成果不是很多，主要分为简 单水解和生物降解。 ( 1 ) 简单水解。聚乳酸中含有大量酯键，可在水分子攻击下发生水解作用，生 成羧酸和醇，降解产生的酸可能会对降解有催化作用，形成自催化效应。简单水 解主要由以下因素影响反应速率。 p h 值。英才等人，麦杭珍口门等人的研究结果都显示p h 值是影响聚乳酸简 单水解的重要因素，在不同p h 值溶液中，聚乳酸降解速率依次为碱性条件 酸性 条件 中性条件。j o n g 等人研究结果表明，碱催化o h _ 回咬，而矿与链基端形成 较稳定的五元环，因此碱性条件下p l a 降解较快。随着降解进行p h 值逐渐增大， 降解速率降低，但另一方面低分子量的聚乳酸亲水性更强，可提高降解速率，使 聚乳酸完全降解。 结晶度。研究表明口羽，部分结晶的p l a 降解时，最先水解的是无定型的 聚乳酸分子，当大部分无定型区的聚乳酸分子降解后结晶区的聚乳酸分子才从边 缘向中心逐渐降解。结晶度越大，降解越慢。这一特性为制造可控降解速率的聚 乳酸制品提供了便利。目前利用这一特性制成可控降解速率的骨修复和骨内固定 材料取得了良好的效果。 分子量及分子量的分布口2 3 3 3 。分子越大降解速率越慢。分子量越大，聚合 物的结构越紧密，酯键越不容易断裂，而且分子量越大经降解得的片段越长，不 易溶于水，也不易降解。对于平均分子量相同的聚乳酸制品而言，分子量分布越 均一，降解越慢。 残留金属及杂质、立构规整性都对降解速率有影响。 ( 2 ) 生物降解。生物降解是可降解材料最普遍的降解方式。自然界有多种微生 物可降解聚乳酸，如t o r t e s 发表的镰刀酶念球菌、青霉菌都可完全降解聚乳酸。 麦杭珍等研究了聚乳酸在活性淤泥、室外土埋法口钉中的降解速率，发现聚乳酸都 可被降解，且聚乳酸结晶度越低，降解速率越快。 5 、本论文工作目的 聚乳酸( p l a ) 是由工业生产发酵获得乳酸通过化学聚合方法得到的一种可 被生物降解的高分子聚酯，它除了具有可替代传统塑料的基本特性外，其生物可 降解性和优良的生物相容性倍受人们的关注，与其相关的研究方兴未艾。这种新 型的生物塑料市场潜力巨大，发展它不仅可以为工农业生产、医药以及人们的日 常生活等方面提供新的材料，而且将会对消除“白色污染 ，环保事业的健康发 8 东北师范大学硕士学位论文 展做出重要贡献。 国外对于聚乳酸的研究已经展开，并且已经筛选出部分降解聚乳酸塑料的菌 株，多为放线菌类阱1 。从阅读文献可知，现阶段我国对于聚乳酸生物降解的研究 还主要依靠国外的文献参考，本研究的目的之一就是展开对聚乳酸生物降解，特 别是实验室条件下细菌降解的研究，以期筛选出可快速降解聚乳酸塑料制品的细 菌菌株，并对其相关的解聚酶的性质和降解产物进行进一步探索，为其在工农业 和医学领域以及日常生活的应用提供进一步的理论依据。 9 东北师范大学硕士学位论文 实验材料与方法 1 、实验材料 1 1 菌株来源 野外采集多个土样进行菌种筛选，最后由长春某垃圾堆积场低洼积水处筛选 出一株可降解聚乳酸并能分泌聚乳酸解聚酶的细菌，编号为d s 2 0 0 6 ，经初步鉴 定朝，该菌属纤维单胞杆菌属 c e l l u j o m o n a s ( b e r g e ye ta 1 ，1 9 2 3 ) ，c l a r k 。 1 2 聚乳酸 由中科院长春应用化学研究所提供，乳黄色结晶颗粒，熔点1 6 4 6 c ，相 对分子质量为2 0 7 4 x1 0 。 2 、培养基口阳( w v ) 2 1 分离菌种用培养基 p l a0 1 ( 乳化制成可悬浮细微颗粒) ，n h 。c 10 1 ，c a c i 。2 h 。00 0 0 0 5 ， m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 ，f e s o 。0 0 0 1 ，n a n o 。0 2 ，k c l0 0 5 ，k h z p q0 3 6 ， n a 2 h p o 。1 2 h 2 01 4 3 ，p h 6 9 8 固体培养基为上述配方中加入2 的琼脂。 2 2 鉴定菌种用培养基嘲 产芽孢培养基( 三种) ： 淡薄培养基：酵母膏o 7 9 ，蛋白胨1 9 ，葡萄糖l g ，硫酸铵o 2 9 ，水1 0 0 0 m l ， p h 7 0 土壤浸出培养基：蛋白胨5 9 ，牛肉膏3 9 ，土壤浸汁2 5 0 m i ( 土：水= 1 ：2 5 ) ， 水7 5 0 m l ，p h 7 0 玉米粉一酵母膏培养基：肉汁胨培养基l o o m l ，玉米粉5 9 ，酵母膏l g ，水9 0 0 m l ， p h 7 2 ( d 糖发酵培养基( h u g h & l e i f s o n 培养基) ：每1 0 0 0 m l 蒸馏水中含有n a c l5 9 ， 蛋白胨2 9 ，l ( h ：p 0 40 2 9 ，l 溴酚蓝3 m l ，糖( 葡萄糖、乳糖或淀粉) 含量1 。 硝酸盐还原实验培养基：硝酸钾0 2 9 ，蛋白胨5 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 7 4 ( d 葡萄糖蛋白胨培养基：葡萄糖5 9 蛋白胨5 9k 2 h p o 。5 9 水1 0 0 0 m l p h 7 2 - 7 4 l o 东北师范大学硕士学位论文 3 、可降解聚乳酸菌株的筛选 将野外采集的8 个土样制成浸出液，分别接入上述以聚乳酸为唯一碳源的液 体选择性培养基中，置室温下振荡培养3 0 d ，取一定量的发酵液以1 0 倍稀释法 稀释涂布平板，平板中的培养基为以聚乳酸为唯一碳源的固体选择性培养基。经 3 7 d 培养，对平板上生长状况良好的菌株逐一挑取，分离纯化，得降解聚乳酸 较快的两株菌株，一为细菌编号为d s 2 0 0 6 ，一为霉菌编号为d s 2 0 0 7 。 4 、聚乳酸降解菌株降解速率的测定 4 。1 底物聚乳酸悬浮液的制各啪罅1 将聚乳酸结晶状颗粒溶于氯仿，制得2 ( w v ) p l a 一氯仿溶液，与乳化剂 溶液混合，混合液经超声波处理5 m i n ，制得聚乳酸乳化液，5 0 磁力搅拌1 5 0 m i n 除去氯仿，得到聚乳酸悬浮液。 4 2 粗酶液制备 将发酵液以1 2 0 0 0 r m i n 速度离心2 0 m i n ，取上清液即为粗酶液。 4 3 酶活测定及酶活单位定义嘲 以聚乳酸为底物用分光光度计测定聚乳酸解聚酶活力。取3 m l 悬浮液置于 4 5 恒温水浴5 m i n ，待温度平衡后加入l m l 粗酶液，反应5 m i n 后，于6 5 0 n m 波 长下测其光吸收值。 一个酶活单位定义为：每分钟引起光吸收降低0 0 0 1 ( a 6 5 0 n m ) 单位所需的 酶量。 5 、菌株d s 2 0 0 6 的初步鉴定b 玩3 刀 5 1 显微镜观察 将菌株d s 2 0 0 6 接种于牛肉膏蛋白胨培养基，3 7 培养1 一 4 d ，挑取少量活 化后的菌体，制成涂片，番红染色，光学显微镜下观察其形态，并测定细胞大小。 5 2 革兰氏染色 通过革兰氏染色确定菌株d s 2 0 0 6 的革兰氏性质。 5 3 产芽孢实验 将菌株d s 2 0 0 6 接种于三种不同产芽胞培养基，3 7 。c 培养2 4 小时、4 8 小时、 7 2 小时、9 6 小时，挑取菌体镜检，观察是否产芽孢。 5 4 糖发酵实验 使用葡萄糖、乳糖和支链淀粉为不同糖源，检测菌株d s 2 0 0 6 利用糖的能力， 并检测d s 2 0 0 6 菌株发酵糖后是否产酸产气。 东北师范大学硕士学位论文 5 5 伏普实验 菌株d s 2 0 0 6 接种于葡萄糖蛋白胨培养基，3 7 培养2 4 h 。加入4 0 k o h 1 0 2 0 滴，再加入等量q 一茶酚，用力振荡( 拔去棉塞) 再放入3 7 培养4 h 观 察。 5 6 接触酶实验 菌株d s 2 0 0 6 接种于牛肉膏蛋白胨培养基培养，3 7 培养2 4 h ，在菌苔上滴 入3 h ：0 ：，观察有无气泡产生。 5 7 还原硝酸盐实验 菌株d s 2 0 0 6 接种于牛肉膏蛋白胨培养基培养，3 7 培养l 4 d ，加入甲液 ( 将对氨基苯磺酸0 8 9 溶解于2 5 m o l l 乙酸溶液l o o m l ) 和乙液( 将甲萘胺0 5 9 溶解于2 5 m o l l 乙酸溶液l o o m l ) 各一滴，观察结果。 6 、蛋白质的测定方法阳钔 按f o l i n 一酚( l o w r y ) 方法测定，以酪蛋白为标准蛋白。 7 、最适产酶条件测定m - 4 7 1 最佳产酶时间测定 将菌种d s 2 0 0 6 接种于以聚乳酸为唯一碳源的液体培养基，p h 值= 7 o ，置于 3 0 c 培养，间隔1 2 h 取样，取样1 0 次。测酶活力与蛋白含量，绘制酶活力一蛋白 含量曲线。 7 2 最适产酶温度测定 将菌种d s 2 0 0 6 接种于以聚乳酸为唯一碳源的液体培养基，p h 值= 7 0 ，分别 置于1 5 、2 0 、2 5 、3 0 、3 5 培养7 2 h 取样。测酶活力与蛋白含量，绘 制酶活力一蛋白含量曲线。 7 3 最佳产酶p h 值测定 菌种d s 2 0 0 6 接种于以聚乳酸为唯一碳源的液体培养基，p h 值分另l j = 5 5 、6 0 、 6 5 、7 0 、7 5 、8 0 、8 5 ，置于3 5 培养7 2 h 取样。测酶活力与蛋白含量，绘 制酶活力一蛋白含量曲线。 8 、酶的分离纯化方法啪4 2 4 3 1 8 1 酶液的制各 经7 2 h 发酵后的5 0 0 0 m l 发酵液于4 c 、1 2 0 0 0 r m i n 离心2 0 m i n ，弃去沉淀， 上清液即为粗酶液。 8 2 超滤浓缩 1 2 东北师范大学硕士学位论文 根据分子量大小，使用超滤膜( 截留分子量5 0 0 0 ) 超滤浓缩。 8 3 盐析 在o c 搅拌条件下，缓慢向浓缩粗酶液中加入( n 地) 。s o 。粉末至3 0 饱和度， 静置过夜；4 c ，1 2 0 0 0 r m i n 离心3 0 m i n ，弃去沉淀。再在o c ，搅拌条件下， 缓慢向所得上清液中加入( n h 。) ：s o 。粉末至7 0 饱和度，静置过夜；4 c ，1 2 0 0 0 r m i n 离心3 0 m i n ，留下沉淀溶于蒸馏水。 8 4 透析脱盐 将上步溶液装入透析袋中，4 下对蒸馏水透析，每隔6 h 换水1 次，用b a c l 。 检查s o 。2 。，直至透析液中无沉淀为止。 8 5 冷冻干燥 将透析脱盐后的酶液经超低温冷冻干燥，储存于一2 0 。c 的冰箱。 8 6s e p h a d e xc r - 1 0 0 凝胶色谱 使用n a 。h p o 。一k h 。p 0 4 ( p h 值= 7 3 8 ) 缓冲液平衡s e p h a d e x g 一1 0 0 层析柱，将 上步冷冻干燥后的酶溶于同样的缓冲液中上柱分离，洗脱液与平衡用缓冲液相 同，流速9 m l h ，每管3 m l ，a 2 8 0 n m 紫外光自动监测，记录洗脱液的吸收值变化。 9 、酶的最适反应温度的测定 将聚乳酸悬浮液每管3 m 1 分别置于2 5 、3 0 c 、3 5 c 、4 0 。c 、4 5 、5 0 。c 、 5 5 c 、6 0 、6 5 、7 0 。c 的水浴中预热5 m i n ，然后每管加入l m l 的酶液，保温 5 m i n ，以蒸馏水做空白对照。绘制酶活性一反应温度曲线，找出酶活最高时的对 应温度即为最适反应温度。 10 、酶的热稳定性的测定 将酶液分别于2 5 。c 、3 0 、3 5 。c 、4 0 c 、4 5 、5 0 、5 5 。c 、6 0 c 、6 5 。c 、 7 0 。c 的水浴中保温2 h ，取样测酶活，绘制酶活性一保存温度曲线。 1 1 、酶的最适反应p h 的测定m 3 配制1 0 种从p h 3 6 - 1 0 0 的不同p h 的聚乳酸悬浮缓冲液( p h 3 6 - 5 0 乙酸一 乙酸钠缓冲液，p h 5 8 - 8 0 磷酸氢二钠一磷酸二氢钾缓冲液，p h 8 6 1 0 0 甘氨酸一 氢氧化钠缓冲液) ，用p h 计校正p h 值，以保证溶液的p h 值。将一定量的酶液加 入不同p h 值的聚乳酸悬浮缓冲液中，构成一系列酶反应体系，于4 0 下反应 5 m i n ，测酶活性，绘制酶活性一反应p h 曲线，找出酶活最高时对应的p h 值，即 为该酶的最适反应p h 值。 1 2 、酶的p h 稳定性的测定 东北师范大学硕士学位论文 将酶液与不同p h 值的缓冲液混合，在4 c 保温1 2 h 后，再按标准酶活测定 法在最适反应温度及最适反应p h 值条件下测其酶活力，以所测得最高酶活力为 1 0 0 ，其余酶活折合成其百分数。绘制酶活力一保存p h 曲线。 13 、分子量的测定h 5 】 1 3 1 制胶及电泳 采用s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 法。采用不连续垂直板电泳系 统，分离胶浓度1 2 ，浓缩胶浓度5 ，采用t r i s - h c l 缓冲体系。 1 3 2 染色及显色 考马斯亮蓝r 2 5 0 染色。 1 4 、聚乳酸膜的降解 1 4 1 聚乳酸薄膜的制备 实验用聚乳酸膜为中科院长春应用化学研究所提供。 1 4 2 聚乳酸薄膜的降解m 拍 将已称重的聚乳酸膜( 长l c m ，宽l c m ，质量介于2 5 m g 、3 0 m g 之间) 放入2 5 0 m l 三角瓶中，加分离菌种用培养基l o o m l ，接入菌种后置于3 7 摇床培养 ( 1 4 0 r m i n ) ，每隔4 天将膜取出洗尽放入新鲜培养基继续培养，定时取样。样 品取出后，用蒸馏水冲洗干净，观察其形态变化，干燥后用分析天平称重量变化。 1 5 、降解产物的测定 取适量d s 2 0 0 6 降解聚乳酸乳化液，发酵4 8 h 的发酵液1 2 0 0 0 r m i n 离心2 0 分钟，制得粗酶液，将粗酶液与底物混合，p h 值= 7 2 ，4 0 水浴加热，反应6 0 m i n ， 再以1 2 0 0 0 r m i n 离心，取上清进行降解产物质谱分析。用l d i - 1 7 0 0 激光解吸电 离飞行时间质谱仪测定降解产物。仪器工作参数为：质量范围：m z o 一8 0 0 0 0 ，排 斥电压：3 0 k v ，吸引电压：9 3 k v ，检测器电压：- 4 7 5 k v ，真空度：1 1 0 叫p a 。 16 、主要仪器 b e c k m a n 高速离心机( 美国b e c k m a n 公司) j y 一9 2 型超声波细胞粉碎机( 宁波新芝科器研究所) 7 2 3 分光光度计 超滤器( p a l lf i l t r o n 公司生产) a l p h a i 一2 型冷冻干燥机( c h r i s t 公司生产) 低温层析柜 1 4 东北师范大学硕士学位论文 不连续垂直板电泳系统 激光光密度扫描仪( p h a r m a c i al k b 公司生产) l d i - i t 0 0 激光解吸电离飞行时间质谱仪 扫描电子显微镜 东北师范大学硕士学位论文 三、实验结果 1 、可降解聚乳酸菌株的筛选和纯化 采用以聚乳酸为唯一碳源的液体培养基，接种野外采集的多个土样的浸出 液，经3 7 摇瓶培养3 0 d ，初步筛选出可利用聚乳酸作为碳源的菌株数株，用平 板画线法将上述筛选出的菌株纯化，选取其中长势良好的2 株分别编号为 d s 2 0 0 6 、d s 2 0 0 7 ，接种于以聚乳酸为唯一碳源的斜面培养基，增殖并保存。 2 、不同菌株降解酶活性的比较 将d s 2 0 0 6 、d s 2 0 0 7 菌株活化4 8 h 后，接种于以聚乳酸为唯一碳源的液体培 养基，每隔1 2 h 取样1 次，连续取样1 0 次，分别测定发酵液高速离心制成的粗