（微生物学专业论文）副干酪乳杆菌素的分离纯化及其在肉制品中的应用初探.pdf

中文摘要 中文摘要 本课题组从l 乳酸酸菜发酵液中分离出一株乳酸杆菌，通过对该菌株的优化 与鉴定，确定其为副干酪乳杆菌( 三口c 幻施c 讲姗p 甜口c 珊p f ) ，命名为副干酪乳杆菌 h d l 7 。经过前期研究得知，副干酪乳杆菌h d l 7 所产抑菌物质( 副干酪乳杆菌素) 具有抗菌活性强，抑菌范围广等优点，具有良好的应用前景。本试验对副干酪乳 杆菌素进行了分离纯化、初步确定其相对分子量并对其在肉制品中的应用做了初 步研究，为日后该种细菌素的大量生产及其在食品中的广泛应用奠定一定的理论 基础。 本试验对副干酪乳杆菌素的分离纯化方法及条件进行了研究，确定了以 3 0 6 0 硫酸铵逐级盐析、截留相对分子量5 ，0 0 0 和1 0 ，0 0 0 的两种超滤膜进行超 滤、s p s e p h a r o s ef a s tf 1 0 w 离子交换层析、s e p h a d e xg 一5 0 凝胶层析的操作流程对 副干酪乳杆菌素进行分离纯化。同时，在分离纯化过程中进行效价和蛋白含量的 测定。经分离纯化后的副干酪乳杆菌素，比活力为1 7 2 5 3 a u m g ，是原发酵液3 7 0 9 倍，得率为1 0 4 6 。通过尿素一s d s p a g e 对副干酪乳杆菌素的相对分子量进行了 测定，初步确定其相对分子量为7 ，8 0 0 。 对副干酪乳杆菌素在蒸煮火腿和烟熏肉中的防腐应用做了初步的研究。结果 表明副干酪乳杆菌素与某些化学防腐剂单独使用时均有一定的防腐作用。但如果 将副干酩乳杆菌素与化学防腐剂联合使用其防腐的效果更佳、且能减少化学防腐 剂的添加量，从而减小化学防腐剂对人体的副作用。试验结果表明，副干酪乳杆 菌素粗制品添加量为1 0 0 m g 埏与1 乳酸钠联合使用的防腐效果要优于其它防腐 联合剂的组合。 关键词：副干酪乳杆菌素；分离纯化；防腐；应用 黑龙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t o n es t r a i mw h i c hc a l lp r o d u c e 锄t i m i c r o b i a ls l l b s t a l l c ew a si s 0 1 a t e d 行o mm e l l a bs a u e r k r a u tb r o 廿1f e 彻e n 伽o nb yo u rl a b a r e ro p t i m i z i n ga i l di d e n t i 研n gt h i s s 仃a i n ，i t 、v a si d e n t i 矗e da l s 三口c 幻6 口c f 刀搬p 伽c 傩p f ，a n di tw a l sn 锄e da s 三口咖6 口c 讲淞 册聊鲫p fh d1 7 1 u 曲t l l er e s e a r c ho nt h es t r a i n ，w ek n o w e dt 1 1 a tt 1 1 e 锄t i m i c r o b i a l s u b s t 眦c ep r o d u c e db y 工口c f d 6 口c i z z 淞p 口阳c 娜p ih d1 7h a dg t r o n ga n t i m i c r o b i a la c t i v i 够 a n dv e ub r o a d 趾t i m i c r o b i a j 瑚g e ，s oi th a sg r e a tf o r e 伊d u n di n 印p l i c a t i o n i s 0 1 a t i o n a n dp 嘶f i c a t i o no ft i l eb a c t 甜o c i np r o d u c e db y 口c 幻6 乜c f 砌s 矽口伽p fh d l 7w e r e m a i l l l ys t u d i e di i l 廿1 i sp 印e r ；t h ec o m p a r a t i v em o l e c u l a r 、e i g h to ft 1 1 eb 捌o c i nw a s a s c e r c a i n e d ；s o m ee l e m e n t a j yr e s e a r c ha b o u ti t sa p p l i c a t i o ni 1 1c 0 0 k e dm e a tf o o dw a s d o n e t h e o r ye l e m e n t sa b o u tm a s s - p r o d u c t i 伽o fn l i sl 【i n d o fb a c t 甜o c i na n dt l l e a c a d e m i ce l e m e m so fe x t e n s i v ea p p l i c a t i o no f 仳sb a c t e o c i i li 1 1f o o da m i s 印s i s 、e r e a ne a e c t i v ee x p e r i m e mp r 叭o c o lw a sr e s e a r c h e dt 0i s o la = t ea n d 皿匆t 1 1 e b a c t e r i o c 证p r o d u c e db y 三口c 幻6 口c f 刀淞p 舢c 伽e fh d1 7 ，锄d 吐l ec o n 击t i 啪o f i s 0 1 a t i o n 锄dm l r i f i c 撕o n 、v a sa s c e r t a i n e d u l 臼a f i l 蚴i o n 、a sc o n d l l c t e db yu s m gu l 饥l f i l 乜a t i o n m 锄b r a i l e s 聃栅c hc o m p 撇t i v em 0 1 e c u l a r 、v e i 曲t 、a s5 ，0 0 0a 1 1 d1o ，0 0 0 i tw a l s c o 蚯n i l e d 曲t 廿们u 曲a n l m o t l i 啪s u l p h a t ep r e c i p i t a t i o n ( 3 0 6 0 ) ，s p - s e p h a r o s ef a s t f 1 0 wi o ne x c h a l l g ec l d m a t o g r a p h ya n ds 印h a d e xg 一5 0g e lc l l r o m a t 0 伊a p h y ，廿1 e b a c t e r i o c i l lc o u l db ei s o l a t e d 锄d 咖n e de f f e c t i v e l y d e t e m l i r l a t i o no f p r o t e i l lc o n t e m a i l dt i t e rw a so p e r a t e dd u r i j l gt h ep r o c e s so fi s o l a t i o na i l dp u r i f i c a t i o n a r e ri s o l a t i o n 卸dp 嘶f i c “o n ，恤s p e c i f i ca c t i v 时o f b a c t e r i o c i n 、糯1 7 2 5 3 a u m g ，3 7 0 9f 0 1 dt l l a i l m ei n i t i a lc u l t u r ea i l dar e c o v e 巧0 f1o 4 6 o f 廿l ei n i t i a ja c t i v i t ) rw a so b t a i l l e d t h e c o m p 删t i v em o l e c u l a rw e i g h to fm e 删m i c r o b i a lb a c t e r i o c i nw a sd e t e m i n e dt ob e 7 ，8 0 0b yu r e a - s d s - p a g e 1 1 a b s t r a c t e l e m e m a r yr e s e a r c hw a sd o n et 0m a k et h eb a c t e o c i n 、) ，：h i c hw a sp r o d u c e db y 上d c f d 6 口c f 刀z 厶，p 口r 口c 口s p fh d 1 7b ea p p l i e di nb r a j s e dh a ma n db a c o n t h er e s u l t s s h o w e d 也a tm e 上a c t e o c i na 1 1 ds o m ec h e m i c a lp r e s e r v a t i v e sa 1 1h a dc e r t a i na j l t i s e p s i s r 0 1 ew r h e nu s e ds i n g l y w h e nt h eb a c t e r i o c i na i l dc h e m i c a lp r e s e r v a t i v e sw e r em i x e d t o g e 也e r ，n e wp r e s e r v a t i v e sw o u l de n h a l l c et h ea n t i s e p s i se 位c t ，a n dt l l ea d d i n gd o s e o f c h e m i c 甜p r e s e r v a t i v e s 、o u l db er e d u c e d s os i d ee 仟e c to fc h e m i c a lp r e s e r v a t i v e st 0 h u m a nb e i n g sw o u l db ed e c r e a s e d t h ee x p e r i m e n tr e s u l t sd e m o n s 缸a t e dt l l a tt l l e m i 灶u r eo fb a c t e r i o c i na 1 1 d1 n a lh a db e t t e ra n t i s e p s i se 氐c tt h a no t l l e rp r e s e r v a t i v e c o m b i n a t i o n s k e y w o r d s ： b a d 舒o c i np r o d u c e db y 口c f d 6 口c 砒岱p 口阳c 鲫p fh d l 7 ；i s o l a t i o na 1 1 d p u r i f i c a _ t i o n ；a n t i s 印s i s ；a p 脚i c a t i o n i i l - 独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉迢太堂或其他教育机构的 学位或证书面使用过的材料。 学位论文作者签名： 曹悄 签字日期：嬲年乌细 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕴堑态堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕉堑太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者虢曹膨 签字日期：纱踢年多月乒日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名：杏彘啄 签字日期：抑p 年占月l 毕日 电话： 邮编： 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 天然食品防腐剂的研究现状 食品安全一直为人们所关心，由于食物腐败变质所引起的中毒事件近些年更 是层出不穷。有数据表明，在美国每年大约有7 6 0 0 万人会发生食物中毒事件，死 亡人数约为5 0 0 0 人【1 j 。然而，从市场现有的防腐剂种类和来源上看，其主要是化 学防腐剂，它们的特点决定了该类防腐剂使用的局限性。因此，寻找一种高效、 安全的天然生物防腐剂成为食品加工工业及食品相关专业研究领域的研究热点。 天然防腐剂主要是指从植物、动物、微生物代谢产物以及天然有机化合物中 提取的物质，也称作生物防腐剂。天然防腐剂具有抗菌性强、安全无毒、水溶性 好、热稳定性好、作用范围广等化学防腐剂无法比拟的优点【2 1 。随着人们生活水平 的提高和对健康的关注，研究开发广谱、高效、低毒、天然的食品防腐剂已是大 势所趋【3 】。乳酸菌细菌素便是由微生物产生的一种天然防腐剂，它具有较好的抑菌 效果，现已成为研究的热剧4 】。 天然防腐剂按其来源可分为微生物源防腐剂、动物源防腐剂和植物源防腐 剂。其中微生物源防腐剂主要以乳酸菌所产细菌素居多。乳酸菌细菌素是某些乳 酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有生物活性的蛋白质、多肽 或前体多肽，它对其它相近种类的细菌具有抑制作用，而且可以抑制食品中的致 病菌和腐败菌，包括蜡状芽孢杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、单核细 胞增生利斯特氏菌、金黄色葡萄球菌等。乳酸菌细菌素一般是带正电荷的小分子 蛋白( 约3 0 6 0 个氨基酸残基) ，大部分乳酸菌细菌素对热稳定、具有高等电点 和亲水特性，可以与食品一起在加热处理时使用、减少食品的加热时间、节省食 品在加工过程中的能耗，降低营养成分的损坏程度。它们的杀菌作用方式普遍呈 不可逆性，在食品中稳定；可在人体内进行生物降解和消化；其对人体健康无害 而且在低浓度下亦具有活性。因此，可以通过它来控制食品中的某些腐败菌和致 病菌，这引起了人们极大的兴趣【5 | 。 黑龙江大学硕士学位论文 1 2 乳酸菌细菌素概述 1 2 1 乳酸菌细菌素的发现及其开发利用现状 早在1 9 2 8 年，l a r o g e r s 等在美国首次报道，发现乳酸链球菌的代谢产物能 抑制部分细菌；1 9 4 7 年英国的m a t t i c k a t r 认识到血清学n 群中一些乳酸链球菌 ( s t r e p t o c o c c u si a c t i s ) 能够产生具有蛋白质性质的抑菌物质，并将其命名为 n i s i n ”，取自n i i l l l i b i t o 拶s u b s t a n c e ”1 6 j ；19 51 年h i r s c h 的研究表明，n i s i n 可被用 作食品生物防腐、保鲜剂以控制g + 菌的污染【7 】；1 9 5 3 年n i s i n 的第一批商业产品 - n i s 印1 i n 在英国面市；1 9 6 9 年f a o 侧h o 食品添加剂联合专家委员会批准n i s i i l 可用作为一种食品添加剂；1 9 7 0 年w h o 的微生物标准委员会制定n i s i n 国际标 准计量单位为i u 。1 9 9 0 年我国卫生部食品监督部门签发了n i s i n 在国内使用的合 格证明书，同时被列入国际g b 2 7 6 0 8 6 的1 9 9 0 年增补品种中，可用于罐头食品、 植物蛋白食品、乳制品和肉制品中。目前，已经有6 0 多个国家和地区批准n i s i n 可作为一种纯天然食品防腐剂、保鲜剂使用l s 】。 1 2 2 乳酸菌细菌素的种类 1 2 2 1l a n t i b i o t i c s 类 这是一类含有约1 9 5 0 个氨基酸分子的肽类，并具有诸如：羊毛硫氨酸 ( l a n t h i o i l i n e ) 、b 甲基羊毛硫氨酸( b m e 也y l l a n “0 1 1 i n e ) 、脱氢酪氨酸 ( d e h y d r o b u t 妒n e ) 、脱氢丁氨酸( d h b ) 以及脱氢丙氨酸( d e h y d r o a l a n i n e ，d h a ) 等非编码氨基酸【9 j 。 如若进一步细分，l a n t i b i o t i c s 又可再分为2 个亚类：一种是带有正电荷、疏 水基团的肽类，它可以在细胞膜上形成通道，如i l i s i n 、l a u c t a c i n 4 8 1 ；另一种是球状 肽类，它不带电荷或者带负电荷，如m e r s a c i d i n 、a c t a g 砌i 1 1 e 等【】o 】。 1 2 2 2 小分子热稳定肽( s h s p ) 这是一类相对分子量小于1 0 ，0 0 0 ，疏水的、具有膜活性的肽，其又可以分为3 个亚类：( a ) n - 末端氨基酸序列为t y r g l y - a s n v a l ，并由两个半胱氨酸所构成的s s 第1 章绪论 桥，具有抗李斯特杆菌活性，这类乳酸菌素包括：p e d i o c i np a 1 ，l e u c o c i na ， m e s e n t 撕c i n y10 5 ，c 锄o b a c t e r i o c i na ，b m1 和b m 2 ，s a c k c i na 及s a c k c i np ，e m e r o c i n a 等】。( b ) 孔道复合物由2 个具有不同氨基酸序列的肽类寡聚体形成，其又可分 为两类：第一类每一个多肽都有活性，但另一个多肽的存在会增强它的活性，其 中l a c t a c i nf 是代表；另一类型是活性依赖于2 个多肽，任何一个多肽单独都没有 活性，l a c t o c o c c i ng 是其中的代表之一，其中l a c t a c i nf 是代表。( c ) 能被硫醇激 活、活性基团要求有还原性半胱氨酸残基，其中l a c t o c o c c i nb 是唯一的代表。 1 2 2 2 大分子量的、热不稳定的细菌素 这类蛋白相对分子量大，通常大于3 0 ，0 0 0 ，1 0 0 、3 0 m i n 加热使其失活【】1 】。 只有少数该类细菌素有较为详细的报道。这类细菌素包括：h e l v e t i c i nj ，l a c t i i l la ， 1 a c t c i nb ，c a s e c i n8 0 和a c i d o p l l i l u c i na 。 1 2 3 乳酸菌细菌素活性的检测 琼脂扩散法是检测抗生素的标准方法，所以很多人尝试把类似的方法应用于 乳链菌肽( n i s i n ) 的检测，后来因为表面活性剂t w e e n 8 0 的使用，n i s i n 难于在 琼脂中扩散的问题有所改善。t r 锄e r 和f o w l e r 于1 9 6 4 年建立了琼脂扩散法的基 本方法【1 2 】，之后，w o l f 等进一步对琼脂扩散法进行了优化。与t r 锄e r 等的最初 的方法相比，精确度提高了5 7 ，准确度提高了1 2 【1 3 】。 1 3 乳酸菌细菌素分离纯化方法 作为一种肽类物质，细菌素具有蛋白质的一些基本特性。所以蛋白质的分离 纯化方法同样也适用于细菌素的提取1 1 5 】。常用的分离纯化方法和技术有：沉淀 法( 包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等) 、离心、吸附层析、凝胶过滤层 析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。 根据细菌素分子量的大小、疏水性以及阴、阳离子等特点，人们设计了许多分离 纯化的方法和不同的操作流程以获得大量高纯度的乳酸菌细菌素。 黑龙江大学硕士学位论文 1 3 1 乳酸菌细菌素分离纯化的常用方法 1 3 1 1 有机溶剂沉淀法 有机溶剂沉淀法是纯化乳酸菌细菌素的一种有效方法。其原理主要是加入有 机溶剂后，会使水和有机溶剂混合液的介电常数减小，因此在不同蛋白质离子表 面上，具有相反电性离子基团之间的吸引力增加，这就促使它们互相聚集并析出 沉淀【j 6 】。 1 3 1 2 吸附法 吸附法作为一种有效的蛋白质分离手段，早已应用于乳酸菌细菌素的分离纯 化过程。吸附法有以下优点：操作简便、安全；设备简单；生产过程中p h 变化小； 适于稳定性较差的细菌素分离。缺点是：选择性较差；收率不高，特别是无机吸 附剂性能不稳定；不能连续操作，劳动强度大；炭粉等吸附剂影响环境卫生。因 此，一般情况下吸附法已被其它方法所取代1 7 】。 1 3 1 3( n h 4 ) 2 s 0 4 沉淀法 硫酸铵是进行蛋白质沉淀时常选用的盐类物质，原因是与其它盐类相比，硫 酸铵具有溶解度大、对温度不敏感、分级效果好并具有稳定蛋白质结构的作用。 但是用硫酸铵或其它盐类进行分级沉淀都有一个共同的缺点，即得到的样品如果 想要继续对其进行纯化，需花一定的时间脱盐【1 8 1 。采用( n h 4 ) 2 s 0 4 纯化乳酸茵细 菌素时，可根据乳酸菌细菌素的不同特性，确定( n h 4 ) 2 s 0 4 的加入量、盐析时间 以及盐析温度。还可以采用( n ) 2 s 0 4 逐级盐析法，以达到较好的分离效果。 1 3 1 4 双水相萃取法 双水相萃取是利用物质在互不相溶两水相间的分配系数的差异来进行萃取的 方法【1 7 1 。是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会 形成互不相溶的两水相或多水相系统。双水相萃取法受p h 的影响较大，p h 值微 小的变化有时候会使蛋白质的分配系数改变2 3 个数量级；双水相体系温度的改 变也会影响蛋白质的生物活性。 第1 章绪论 1 3 1 5 超滤法 超滤是以压力为推动力，依靠膜的孔径选择将液体中的不同组份进行分离的 方法。目前，超滤法在乳酸茵细菌素的分离过程中较为常用。 1 3 1 6 离子交换层析 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在利用离子交换剂为固定相、液 体为流动相的系统中进行，是根据荷电溶质与离子之间交换剂之间静电相互作用 力的差别进行溶质分离的洗脱层析方法。当蛋白质p h 低于等电点( p i ) 时，它们 能被阳离子交换剂吸附；反之，p h 高于p i 时，它们能被阴离子交换剂吸附。若在 相同的p h 条件下，且p i p h 时，p i 越高，碱性越强就越容易被阳离子交换剂吸附。 因此，通过提高溶液中相反离子浓度或降低蛋白质所带电荷数等方法可将蛋白质 从树脂上洗脱下来，所以在离子交换层析中平衡缓冲液、洗脱缓冲液的离子强度 与p h 值的选择对于分离效果有很大的影响【1 9 】。 通常离子交换层析的洗脱液为n a c l 溶液，n a c l 溶液洗脱一般有两种方法： 梯度洗脱，利用梯度仪逐渐加大洗脱液浓度；步进式洗脱，洗脱液中n a c l 浓度阶段性提高。 1 3 1 7 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析是一项重要的蛋白质纯化技术，又称凝胶过滤、凝胶排阻或分 子筛，它是根据料液中溶质相对分子量的差别进行分离的液相层析法。 凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗 粒的物质。这种物质可以完全或者部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而不 能排阻某些小分子化合物，但可以让其在筛孔中自由地扩散、渗透。因此，在同 一凝胶过滤柱上分离相对分子量不同的物质时，这些分离物质将发生排阻和扩散 效应。若缓冲液连续倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续发生，其最 终结果是相对分子量大的物质先从柱中流出，相对分子量小的物质则后从柱中流 出。流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分 的各管流出物，即等于把相对分子量不同的物质相互筛分开了。 黑龙江大学硕士学位论文 1 3 1 8 反相高效液相色谱法 反相高效液相色谱( r p h p l c ) 是用于纯化和制备肽类、生物碱、皂苷等化 合物的一种有效方法。用反相高效液相色谱分离和鉴定肽类物质时，具有速度快、 灵敏度高、分辨率好等优点【1 8 】。因此，r p h p l c 也是纯化乳酸菌产细菌素的常用 方法。但该方法需要有细菌素的标准样品。 1 3 2 乳酸菌细菌素分离纯化的研究进展 1 9 4 7 年，m a r t t i k 和h i r s c h 向含有n i s i n 的发酵液中加入一定量的氯仿，经充分搅 拌萃取后静置，取乳浊层，并向其加入冷的乙醇，会产生含有乳链菌肽的沉淀物， 用0 0 5 m o l lh c l 溶解沉淀，调节p h ，再用冷乙醇沉淀，最后冷冻干燥，测其活性 为2 o 1 0 6iu 儋，纯度为5 【2 0 j 。这种回收乳链菌肽的方法步骤繁琐，回收率低( 只 有2 0 左右) ，而且产物纯度也很低。 19 5 6 年，c h e e s e m a l l 、n j b e 币d g e 等利用有机溶剂萃取法纯化乳链菌肽n i s i n 。 他们用n a c l 饱和的勋印f d c c 娜肠c 加发酵液，经正丙醇提取和丙酮沉淀达到了较 好的分离纯化效果，其回收率达到5 0 以上【2 1 1 。这是早期对乳链菌肽的分离纯化， 并得到了纯度较高的细菌素。 g o n z a 】e z ( 1 9 9 4 ) 等将植物乳杆菌( 上口c f d 6 口c 川螂p 册厶盯甜聊) 所产生的 p 1 a i l t 撕c i l l ，先用硫酸铵盐析，疏水性c 8 柱结合，最后采用h p l c 纯化。得到相 对分子量为3 5 0 0 ，提取率为4 8 的产品，并对其n 端序列进行了测定【2 2 1 。 陈秀珠、还连栋( 1 9 9 6 ) 经n a c l 盐析、有机溶剂萃取和离子交换柱层析分 离纯化获得乳链菌肽【2 3 1 。 刘稳、朱文淼( 1 9 9 6 ) 经超滤、非极性大孔径树脂层析、c m s e p h a d e xc 2 5 层析和s e p h a d e x g 5 0 层析后，纯化了乳酸链球菌s m 5 2 6 所产乳链菌肽【2 4 】。 s u a r e z ( 19 9 7 ) 等用免疫亲和层析一步纯化乳酸链球菌肽。他们将n i s i n a 单克 隆抗体直接结合到免疫吸附介质n 羟基琥珀酰亚胺活化后的琼脂糖凝胶上，磷酸 盐缓冲液平衡洗柱后，用甘油h c l 缓冲液洗脱已结合到柱上的乳酸链球菌肽。微 量分析和竞争性酶联免疫吸附测定( c d e l i s a ) 发现洗脱乳酸链球菌肽的最大活 第1 章绪论 性峰在2 2 0 m 波长处。该纯化方法简单、重复性好、与已知的其他方法相比具有较 高的产量，收率可达7 2 7 【2 5 】。虽然该方法在一定范围内可以提供较好的纯化结果， 但不适合大量回收和纯化细菌素。 m a c k a v ( 1 9 9 7 ) 等利用细菌素的阳离子和疏水性，采用硫酸铵分步盐析，各 种离子交换层析和疏水作用色谱，经高效液相色谱纯化从复杂的发酵液中分离、 得到了高浓度的肽2 6 1 。 曾志刚、陈英( 2 0 0 3 ) 从香肠中分离得到一株产细菌素的乳酸片球菌，该菌 株发酵液经硫酸铵盐析及c m s e p h a d e xc5 0 阳离子交换柱层析后，得到的细菌素 样品通过s d s p a g e 证明是一条带，获得细菌素【2 7 1 。 李从军( 2 0 0 6 ) 等采用大孔吸附树脂分离纯化谷胱甘肽，得到分离纯化的最 佳条件：上样p h 2 o 、流速o 5 5 b v 1 1 ；7 0 甲醇解吸附，流速1 0 5 b v 1 1 。在最佳 条件下回收率7 8 8 4 【2 9 】。 1 4 乳酸菌细菌素的应用进展 绿色食品是当今整个食品行业发展的主流，因此，食品防腐剂的发展趋势之 一是研究开发天然食品防腐剂，而天然防腐剂代替化学防腐剂是食品发展的必然 趋势。 目前，在食品中应用较广的乳酸菌产生的细菌素是乳链菌肽。其已在全世界 6 0 多个国家和地区广泛应用于食品防腐保鲜中。我国卫生部1 9 9 2 年3 月2 9 日批准、 1 9 9 2 年1 0 月1 日实施的g b 2 7 6 0 8 6 规定，乳链菌肽在罐装食品、植物蛋白食品最大 使用量为0 2 9 k ，乳制品、肉制品最大使用量为0 5 9 厥g ，一般参考用量为 o 】一o 2 班g 。经我国科研工作者和乳链菌肽生产厂家及应用单位的共同努力，乳链 菌肽已在高温灭菌奶、各种罐头、肉制品等中应用试验获得成功，有些已在食品 加工中得到应用【2 9 1 。 乳链菌肽最早用于奶酪的防腐，有研究表明，芽孢杆菌孢子1 1 5 加热1 5 m i n 仍有残留，添加2 0 m g l 乳链菌肽于高温灭菌奶中，可完全抑制这些孢子的萌发3 0 1 ， 而且还可以改善牛乳由于高温加热而出现的不良风味【3 1 】。础c h 砌( 1 9 9 3 ) 研究发 黑龙江大学硕士学位论文 现乳链菌肽和乳链菌肽产生茵是抑制c 锄e m b e r t 干酪中单核增生性李斯特菌最简 单、最经济、最有效的方法【3 刭。对于罐头食品，在酸性罐装蔬菜中加入乳链菌肽 可控制嗜热腐败微生物的生长从而延长该类食品的贮藏期【3 3 】。在蔬菜防腐方面， f a n g ( 1 9 9 7 ) 等将真空包装的样品用5 1 0 3iu 儋乳链菌肽和3 山梨酸联合处理蔬 菜食品，有效地抑制金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的生长，明显地延长了蔬菜 食品的货架期【3 4 1 。食品包装材料方面，将乳链菌肽添加到食品包装膜和可食用膜 中，可以减少抗菌剂或化学防腐剂的用量。如果在膜中同时加入e d t a 和裂解酶， 可增加对大肠杆菌的抑制效果。将乳链菌肽应用于食品保鲜膜是减少病原菌对食 品污染的一种有效途径1 3 5 1 。 1 4 1 乳酸菌细菌素的抑菌活性 乳链菌肽对许多革兰氏阳性菌具有抑菌活性，其中包括葡萄球菌、李斯特菌、 链球菌、微球菌、分枝杆菌、棒杆菌和乳杆菌等，一些产孢子的革兰氏阳性菌， 如芽孢杆菌、梭茵对乳链菌肽也很敏感。乳链菌肽对部分革兰氏阴性菌、酵母菌 和霉菌的作用效果则不甚明显【3 6 】。 1 4 2 乳酸菌细菌素的安全性 在美国抗生素被禁止应用于食品中，1 9 8 8 年美国食品药物管理局( f d a ) 已 将n i s i n 认定为安全食品( g e n e r a l l yr e c o g m z e da ss a f e ) 。为获得正式批准，细菌 素必须做化学和其它特性的鉴定，必须证明其应用的效果，必须阐述其制造加工、 肽的量化和标准化的试验方法，也必须有完整的毒理学资料和食用后分子代谢的 资料。 作为l a b 的产物，乳酸菌细菌素已被使用了几个世纪，n i s i n 的正式批准是根 据已发表的和未发表的安全性资料确定的，而不是根据其使用的历史。急性、亚 急性和慢性毒性试验以及繁殖、敏感性、体内和交叉耐受研究表明，n i s i l l 在每日 摄入量低于2 9 m 人情况下对人体而言是安全的【翊。 第1 章绪论 1 4 3 食品防腐技术研究进展 目前我国肉类工业中具有一定使用量的防腐剂主要是有机酸及其盐类，如： 丙酸及其盐类、山梨酸及其盐类、乳酸和乳酸钠、双乙酸钠、单辛酸甘油酯等。 近年来，随着人们生活和消费水平的提高，对食品加工的需求也越来越向“绿色” 和“天然”等理念转变。因此，天然、安全、高效的食品防腐剂的研发和应用成 为食品防腐剂行业发展的主要趋势。 随着生物技术的不断发展，利用微生物的代谢产物等为原料，经提取、酶法 转化或发酵等技术生产天然生物型食品防腐剂已逐渐受到人们的重视。 目前，防腐剂用于延长食品保质期的相关研究已有诸多文献报道，并已取得 长足进展。例如，石小琼等将乳酸链球菌素已用于豆腐保鲜。李东等3 明对纳他 霉素的抑菌谱和最小抑菌浓度进行研究，发现纳他霉素仅对酵母菌和霉菌有一定 的抑菌效果。山梨酸钾是广泛应用于肉制品的防腐剂，其防腐技术相对比较成熟， 但山梨酸钾延长肉制品保质期的作用有多大，目前还尚无一致公认数据。茶多酚 研究目前主要集中在它的抗氧化作用方面，将茶多酚用作防腐剂，目前文献鲜见 报道。 刘丽莉等将n i s i n 、乳酸钠、柠檬酸钠、e d t a 作为复合防腐剂运用于低温肉 制品，己筛选得到一个最佳复合防腐剂组合( n i s i n 0 5 9 、乳酸钠4 0 m l 、柠檬酸钠 3 o g 、e d t a o 5 9 ) ，实现了延长低温肉制品货架期的目洲砌。该研究中，使用的乳 酸钠、柠檬酸钠、e d t a 等都属于化学防腐剂，而且n i s i n 使用量已达到g b 2 7 6 0 规 定的最大量，其食品安全性和口感是一个值得进一步关注和研究的问题。 刘月琴等在啤酒发酵过程中用天然生物制品n i s i l l 代替酸洗酵母，发现n i s i n 在 整个发酵过程中都有一定的抑茵作用，从而提高啤酒质量，并保证口味的一致性 【4 1 1 o 罗爱平等人的研究表明，n i s i i l 能有效抑制酸奶的后发酵作用，以添加水平为 1 0 0 m g 瓜g ，4 贮藏为佳，可在1 1 天保质期内维持较高水平的乳酸菌活菌数 ( 2 6 1 0 6 个m l ) ，其酸度( 9 0 1 1 0 t o ) 、p h ( 4 5 7 4 7 8 ) 等变化平稳，保持 黑龙江大学硕士学位论文 了酸奶固有的风味和品质【4 2 1 。 1 4 4 化学防腐剂在肉制品防腐中的应用 化学合成防腐剂主要是各种有机酸及其盐类。肉类保鲜中使用的有机酸包括 柠檬酸、乳酸及其钠盐、抗坏血酸、苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、磷酸盐 等4 3 1 。试验证明，这些酸或其盐类单独或混合搭配使用，对延长肉类保存期均有 一定效果。山梨酸、山梨酸钾和山梨酸钠是具有良好抑菌防腐功能而又卫生安全 的防腐添加剂，一些国家将其作为通用型防腐剂，最大使用量是o 1 0 2 ，德 国等国家则作为干香肠、腌腊制品的防腐剂，以5 1 0 的溶液外浸使用。宋华 宾采用1 0 山梨酸钾+ 1 0 醋酸钠+ 1 柠檬酸钠+ 5 氯化钠用于鲜牛肉的保鲜，可 降低细菌总数和大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等微生物的数量，并可在2 1 下保存 将近7 0 h 【删。 肉类在生产、储存、运输、包装、销售和消费等各个环节均易受微生物的污 染，如何防止肉类的腐败变质已经越来越引起人们的重视。通过在肉类中添加防 腐剂，来延长肉制品的保质期是较为有效的方法。食品生产企业中使用的防腐剂 主要分为化学合成防腐剂和天然防腐剂两类。由于化学合成防腐剂的成本较低、 效果较明显，所以目前世界范围内食品工业中常用的防腐剂以化学合成防腐剂为 、 主。 但是，化学合成防腐剂如果使用不当会有一定的副作用f 4 5 1 ，如多数化学合成 防腐剂具有诱癌性、致癌性、致畸性和易引起食物中毒等安全问题。通过长期的 试验研究发现，长期过量摄入会对人体健康造成一定的伤害，尤其是对于儿童、 孕妇等特殊人群，某些化学合成防腐剂的过多食用，会严重地影响其健康。如近 来有报道称苯甲酸及其钠盐有叠加中毒现象，可引起过敏性反应，对皮肤、眼睛 和粘膜有一定的刺激性。苯甲酸钠可引起肠道不适，再加上有不良味道，近年来， 其应用范围愈来愈小。化学合成防腐剂所存在的这些安全问题迫使人们亟需寻找 到广谱、高效、低毒、安全的天然防腐剂。某些天然防腐剂以其抗菌性强、安全 无毒、水溶性好、热稳定性好、应用范围广等优点，越来越引起研究者的研究热 第1 罩绪论 情。另外，天然防腐剂生产工艺的不断改进也使得天然防腐剂的应用前景越来越 广泛。 1 4 5 微生物防腐剂n i s i n 1 4 5 1n i s i n 的研究进展 目前，国内外对其它乳酸菌产细菌素的应用研究报道较少，而对乳链菌肽 ( n i s i n ) 的研究取得了突破性的进展【4 6 】。 n i s i n 即乳酸链球菌素，是由上口甜d c c 船三口c f 配菌株产生的一种无毒副作用、热 稳定的小分子多肤。n i s i n 食用后在消化道内很快被胰凝乳蛋白酶消化成氨基酸， 不影响肠道内的正常菌群，是一种比较安全的食品防腐剂，自1 9 5 1 年首次使用以 来，至今已在五十多个国家得到应用【4 7 1 。 n i s i n 对一定范围微生物有抗菌效力，抗菌效果很强，浓度为4 0 0 u 1 1 i t s n l l ( 1 0 0 p p m ) 时对大多数g + 茵有强烈抑制作用，特别是细菌抱子，如抑制葡萄球菌 属、链球菌属、微球菌属和乳杆菌属的某些菌种；抑制大部分梭菌属和芽抱杆菌 的抱子，而这些抱子比营养细胞对n i s i n 更为敏感，但n i s i l l 对g 菌、酵母和霉菌的 抑制效果较差【4 8 】。 一般认为，n i s i l l 是一个疏水、带正电荷的小肽，它作用于细菌细胞壁带负电 荷的阴离子成分上，如磷壁酸、糖醛酸、酸性多糖或磷脂。抑制g + 菌细胞壁主要 成分的合成或细胞膜结合形成管状结构，引起细胞膜的渗漏，导致细胞内小分子 量的成分如钾离子、氢离子、氨基酸，核营酸等物质流出，引起细胞膜内外能差 的消失，即对d n a 、i 斟a 、蛋白质和多糖等物质的生物合成产生抑制作用。因此， n i s i n 只抑制芽孢的萌芽，并不杀死芽孢【4 9 】。 1 4 5 2n i s i n 在食品防腐中的应用 n i s i i l 作为天然防腐剂具有如下优点：可以被人体内的酶降解、消化，不影响 肠道内正常细菌的生长，对食品的色、香、味、口感不产生副作用；可降低杀菌 温度，减少热处理时间，因此不会对食品的营养价值、风味、结构、颜色等产生 改变，同时可降低能耗，保持酸性、热稳定性和低温贮藏稳定性，使其具有独特 黑龙江大学硕士学位论文 的使用特性。但是n i s i n 抑茵谱较窄，目前对g 菌、酵母和霉菌等效果不明显【5 0 】。 n i s i n 可应用于乳及乳制品、罐头、植物蛋白饮料、肉制品等的防腐保鲜中， 在肉制品中可取代或降低亚硝酸盐等化学防腐剂的添加量，有研究表明，7 5 m l 的n i s i n 即可达到1 5 0 m g l 亚硝酸盐的防腐效果。将n i s i n 用于酱鸭的保鲜中，抑菌 效果较好，且抑菌效果随浓度的增加而增强。研究表明，乳酸钠和n i s i n 联合使用 有更好的防腐保鲜作用【5 。 但是，目前n i s i n 市场价格过高，市场应用前景具有一定的局限性。因此，开 发与n is i n 具有相同功效且成本低、便于广泛应用的微生物源防腐剂是当前研究的 重点。 1 5 课题研究的目的与意义 我国拥有十三亿人口，食品消耗量巨大。因此，研制并开发无毒、高效的天 然食品防腐剂是发展我国食品工业、保障人民身体健康一个亟待解决的问题。由 于大多数乳酸菌是人类的益生菌，而且产生的细菌素多为肽类的、安全的天然防 腐剂，因此乳酸菌产生的肽类防腐剂是微生物天然防腐剂的研究热点。 目前，公众越来越重视安全的、无化学防腐剂添加的食品，乳酸菌细菌素取 代对人体有害的化学防腐剂，体现出广阔的应用前景。为此，乳酸菌及其细菌素 在医药和保健品生产方面具有广泛的研究和应用价值，引起广大从事乳酸菌、食 品添加剂、益生素及开发新药等领域研究人员的极大兴趣，出现了研究热潮。 我国是一个乳酸菌资源非常丰富的国家，但对乳酸菌细菌素的研究起步较晚， 除乳链菌肽( n i s i n ) 外，对其它乳酸菌细菌素还没有进行很好、很细致的基础研 究和开发应用研究，作为天然防腐剂的乳酸茵细菌素还存在品种少、产量低、成 本高、应用不广泛等问题。而且推广天然防腐剂还受到抑菌效果、抑菌范围、细 菌素的产量、价格等方面限制。因此，大力进行天然防腐剂的基础研究和开发、 寻找新型的天然防腐剂是相关领域研究人员的当务之急。综上所述，进行乳酸菌 细菌素的研究不仅具有重要的理论意义，而且无疑会带来巨大的经济效益和社会 效益。 第1 章绪论 本课题组从l 乳酸酸菜发酵液中分离出一株乳酸杆菌，通过对该菌株的优化 与鉴定，确定其为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌h d l 7 。经过前期研究得知， 副干酪乳杆菌h d l 7 所产抑菌物质一副干酪乳杆菌素具有抑菌活性强、抑菌范围宽 等优点，具有良好的应用前景。本研究的目的是对副干酪乳杆菌素进行分离纯化， 得到一定纯度的细菌素，以便于对其在肉制品中的应用做初步研究，丰富天然防 腐剂的种类，减少化学防腐剂对人体的伤害，为日后副干酪乳杆菌素的大量生产 及其在食品中的广泛应用打下一定的理论基础。 黑龙江大学硕士学位论文 第2 章副干酪乳杆菌素的蛋白含量测定及初步分离 2 1 试验材料 2 1 1 菌株 2 1 1 1 副干酪乳杆菌h d l 7 副干酪乳杆菌h d l 7 菌株( 三口c 幻6 口c f ，淞朋阳c 船p fh d l 7 ) ：本实验室保存。 2 1 1 2 指示菌株 藤黄微球菌( 蚴c m c d c c 淞z 甜f p 姗) ：齐齐哈尔市丰源食品有限公司提供。 2 1 1 3 指示茵浓度 选用1o 之c f u m l 菌悬液作为检测菌的检测浓度。 2 1 2 培养基 2 1 2 1 素琼脂培养基 琼脂2 0 9 ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 2 1 2 2 检测培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c l5 9 ，琼脂粉7 5 9 ，蒸馏 水1 0 0 0 m l ，p h 7 o ，1 2 】灭菌2 0 m i n 。 2 1 2 3 种子液培养基 蛋白胨1 0 9 ，牛肉膏1 0 9 ，酵母浸粉2 9 ，k 2 h p 0 42 9 ，葡萄糖2 0 9 ，柠檬酸二 铵2 9 ，无水乙酸钠5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 8 9 ，m n s 0 4 h 2 0o 2 5 9 ，吐温