（有机化学专业论文）分子印迹聚合物对手性化合物的hplc拆分.pdf

分子印迹聚合物对手性化合物的h p l c 拆分 专业：有机化学 硕士生：李丽虹 指导教师：刘岚副教授，邓芹英教授 摘要 本文将分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t i n gp o l y m e r s ，m i p s ) 作为高效 液相色谱的固定相，对联萘类化合物和4 一苯基一2 一嗯唑烷酮的外消旋体进行了手 性拆分。对前者的拆分性能研究，主要是考察了色谱条件对m i p s 固定相的拆分 性能的影响，以及固定相对非模板化合物的交叉拆分能力。对后者的拆分性能研 究，主要是摸索和优化m i p s 的合成条件以及色谱分离中的流动相组成。 在本研究中分别以( 固一1 ，1 - 联一2 一萘酚，僻) 一5 ，6 ，7 ，8 ，5 1 ，6 ，7 ，8 - 八氢1 ，r - 联2 萘 酚为模板分子，4 乙烯基吡啶为功能单体，乙腈为致孔剂，以本体聚合的方法合 成m i p s ，以此作为高效液相色谱固定相，分别对外消旋的1 ，1 - 联一2 萘酚和 5 , 6 ，7 ，8 ，5 ，6 ，7 ，8 一八氢一1 ，1 - 联一2 萘酚进行了手性拆分，并对色谱条件进行了讨论 和优化。结果表明，流动相中加入乙酸、提高流速都使m i p s 的选择性下降，但 能改善峰形；减少进样量，或在一定范围内升高温度能提高m i p s 的选择性，但 柱温不能过高。此外，还考察了这两种固定相对与模板分子结构相似的外消旋体 的拆分能力。发现这两种m i p s 还具有一定的交叉选择性，经过色谱条件的优化 后，对非模板的联萘类化合物也能实现手性拆分。 此外，还制备了印迹$ 一( + ) 4 一苯基一2 一嗯唑烷酮的m i p s ，但实验尚处于摸索 和优化合成条件及色谱条件的阶段。以( 研( + ) - 4 苯基2 一嗯唑烷酮为模板分子，分 别以甲基丙烯酸或丙烯酰胺为功能单体，以乙二醇二甲基丙烯酸酯或- - 7 , 烯基苯 为交联剂，选用不同的溶剂进行条件优化，得到的m i p s 用作高效液相色谱固定 相，评价其拆分性能。结果表明：交联剂选用二乙烯基苯，功能单体选用甲基丙 烯酸，溶剂体系选用低极性溶剂，得到的m i p s 的分离效果较理想；但流动相的 选择规律性不大，对于不同条件制得的m i p s 都有各自不同的情况， 关键词：分子印迹聚合物，高效液相色谱，固定相，手性拆分 c h i r a ls e p a r a t i o no fs e v e r a lr a c e m a t e sb ym o l e c u l a r l y i m p r i n t i n gp o l y m e r so uh p l c m a j o r ：o r g a n i cc h e m i s t r y n a m e ：l il i h o n g s u p e r v i s o r ：d r l i ul a n p r o f d e n gq i n y i n g a b s t r a c t t w ob i n a p h t h y lc o m p o u n d sa n d4 - p h e n y l 一2 o x a z o l i d i n o n ew e r ee m p l o y e da s t e m p l a t e s ，r e s p e c t i v e l y , f u rt h ep r e p a r a t i o no fm o l e c u l a r l yi m p r i n t i n gp o l y m e r s ( m i p s ) w h i c hw e r eu s e da st h es t a t i o n a r yp h a s e so fh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) i nt h ef i r s tp a r to ft h i ss t u d y , m i p sw e r ep r e p a r e db yb u l kp o l y m e r i z a t i o n u s i n g 但) 1 ，1 - b i - 2 一n a p h t h o lo r 僻) - 5 ，6 ，7 ，8 ，5 ，6 ，7 ，8 - o c t a h y d r o - 1 ，1 - b i 2 n a p h t h o la s t e m p l a t em o l e c u l e ，4 - v i n y lp y r i d i n ea n de t h y l e n eg l y c o ld i m e t h a c r y l a t ea sf u n c t i o n a l m o n o m e ra n dc r o s s l i n k e r , a c e t o n i t r i l ea sp o r o g e n t h ec h i r a lr e c o g n i t i o np r o p e r t i e s o ft h er e s u l t i n gm i p sw e r ei n v e s t i g a t e do nt h eh p l c t h ee f 托c to fc h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n s ，i n c l u d i n gt h ec o m p o s i t i o n so f m o b i l ep h a s e ，f l o wr a t e ，l o a d e da m o u n ta n d c o l u m nt e m p e r a t u r e ，o nt h ee n a n t i o s e p a r a t i o nw e r es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d i tw a s e x p e r i m e n t a l l ys h o w nt h a tt h em i p sh a ds p e c i f i ci n t e r a c t i o n sa n dh i g ha f f i n i t yw i t h t h et e m p l a t em o l e c u l e t h ea d d i t i o no fa c e t i ca c i dt ot h em o b i l ep h a s ei m p r o v e dt h e p e a ks h a p eb u tr e d u c e dt h es e l e c t i v i t y t h el o w e rf l o wr a t ea n dl o a d e da m o u n tw e r e b e t t e rf u rt h es e p a r a t i o n ，a n dt h et w om i p sh a dt h eb e s ts e p a r a t i o nt e m p a r a t u e f u r t h e r m o r e ，o t h e rs u b s t r a t e sw h i c hh a dt h es i m i l a rs t r u c t u r ew i t h1 , 1 一b i 一2 ，一n a p h t h o l w e r ea l s or e s o l v e dp a r t l yb yo p t i m i z i n gt h eh p l cc o n d i c t i o n i nt h es e c o n dp a r to ft h i ss t u d y , t h ep o l y m e r i z a t i o nc o n d i t i o n sw e r ed i s c u s s e di n o r d e rt op r e p a r et h e - 4 - p h e n y l - 2 - o x a z o l i d i n o n ei m p r i n t e dp o l y m e r s ，w h i c hh a dt h e b e t t e rc h i r a lr e c o g n i t i o np r o p e r t i e s t h em i p ss y n t h e s i z e dw i t hd i f f e r e n tc r o s s - l i n k e r s ( e t h y l e n eg l y c o ld i m e t h a c r y l a t e a n d d i v i n y l b e n z e n e ) ，f u n c t i o n a l m o n o m e r s ( m e t h a c r y l i ca c i da n da c r y l a m i d e ) ，a n dp o r o g e n s ( c h l o r o f o r m ，t o l u e n e ，c y c l o h e x a n e a n dh e x a n e ) w e r ec o m p a r e d t h es e l e c t i v i t yo ft h ep o l y m e r sw a se v a l u a t e dw i t h t t c h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i s t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h em i p s ，w h i c hw e r e s y n t h e s i z e dw i t hd i v i n y l b e n z e n ea s c r o s s l i n k e r , m e t h a c r y l i ca c i d a sf u n c t i o n a l m o n o m e r , c y e l o h e x a n eo rh e x a n ea sp o r o g e n ，h a dc h i r a lr e c o g n i t i o nf o rt h et e m p l a t e k e yw o r d s ：m o l e c u l a r l y i m p r i n t i n gp o l y m e r s ，h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , s t a t i o n a r yp h a s e ，e h i r a ls e p a r a t i o n i i i 李丽虹：中山大学2 0 0 4 级硕士学位论文 第1 章前言 分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n o l o g y ，m i t ) 是二十世纪八十年 代迅速发展起来的一种新兴的分子识别技术，它将高分子化学、生物化学、材料 科学、化学工程等学科有机结合在一起。此技术是制备对特定研究对象( 印迹分 子或者模板分子) 具有特异选择性的聚合物一分子印迹聚合物( m o l e c u l a r i m p r i n t i n gp o l y m e r ，m i p ) 的过程。它被人们形象地描绘为制造识别“分子钥匙” 的“人工锁”技术。由于m i p 是针对模板分子量身定做的，对模板分子有预定 的选择性和卓越的识别能力，因而在对映体和位置异构体的分离、固相萃取、化 学与生物传感器、膜分离技术等方面有广泛的应用前景。 1 1 分子印迹技术的产生和发展 分子印迹概念的出现直接来源于免疫学的发展，早在二十世纪三十年代， b r e i n l 、h a u r o w i t z 和m u d d 就相继提出了当抗体侵入时生物体产生抗体的理论。 到二十世纪四十年代，p a u l i n g 1 】对上述理论做了进一步的阐述，并提出了以抗原 为模板来合成抗体的理论，他认为：当生物体受抗原入侵时，机体产生一系列组 成元件包围入侵物形成抗体，抗体同抗原之间能形成多重作用位点。虽然这个理 沧后来被“克隆选择理论”所推翻，但是也为分子印迹技术的发展奠定了一定的 理论基础。 1 9 4 9 年，d i c k e y i2 j 首先提出了“专一性吸附”和“分子印迹”的概念，但在 很长一段时问内没有引起人们足够的重视。直到1 9 7 2 年，w u l 甜3 j 研究小组首次 报道以共价聚合方法成功制备出分子印迹聚合物，使这方面的研究取得了突破性 进展，但由于他的研究主要集中在共价型分子印迹聚合物上，动力学过程较慢， 使其在分子识别领域的应用受到限制。1 9 8 1 年，m o s b a c h 等人【4 】首次合成了非共 价型分子印迹聚合物，这一突破拓宽了分子印迹技术在分子识别领域的应用，特 别是1 9 9 3 年m o s b a c h 等人【5 嗜关茶碱分子印迹聚合物的研究报道，使这一技术 越来越受到人们的青睐，并获得迅速发展。 李丽虹：中山大学2 0 0 4 级硕士学位论文 1 2 分子印迹技术的基本原理及分类 1 2 1 分子印迹技术的基本原理 分子印迹技术是指为获得与目标分子( 模板分子或印迹分子) 在空间形状和 结合位点完全匹配的聚合物的实验制备技术，所制得的聚合物即分子印迹聚合 物。它是通过以下三个步骤实现的：选择合适的功能单体，在适当的介质中， 与模板分子结合形成单体模板超分子复合物；加入合适的交联剂，通过引发 剂引发聚合反应，将单体模板超分子复合物相互交联起来形成共聚物，从而使 功能单体的功能基在空间排列和空间定向上固定下来；通过一定的物理或化 学方法将模板分子洗脱，这样就在共聚物中留下了模板分子的三维孔穴( 如图 1 - 1 ) 。这些三维孔穴在形状、大小和功能上与模板分子相匹配，可以选择性的重 新与模板分子结合，对模板分子有专一的识别作用。 w u l f e 【6 】认为一种理想的分子印迹聚合物应具有以下的性质：聚合物的结 构具有一定的刚性，使聚合物在脱去模板分子后仍能保持孔穴原来的形状和大 小；聚合物的空间结构有一定的柔韧性，使底物和孔穴的结合能快速达到平 衡；亲和位点容易接近，以提高分子识别过程的效率；机械稳定性，使分 子印迹聚合物可以在高压应用，这一点对于高效液相色谱尤为重要；热稳定 性，使其能在较高温度环境下使用，因为对于一般的反应，温度较高使动力学上 更有利。 物 图1 - 1 分子印迹过程示意图 2 李丽虹：中山大学2 0 0 4 级硕士学位论文 1 2 2 分子印迹技术的分类 根据模板分子与功能单体结合方式的不同，分子印迹技术基本分为两类：共 价法和非共价法。 共价法，又称预组织法，此法由w u l f f 的研究小组创立。模板分子与功能单 体通过共价键结合，在加入交联剂聚合后，通过化学手段将模板分子从聚合物网 络上断开。该方法在聚合物的制备以及之后的分子识别过程都依赖于模板分子与 功能单体之间可逆的共价键作用。使用较多的可逆共价作用包括硼酸酯、亚胺、 席夫碱、缩醛酮、酯和螯合键合作用；其中最具代表性的是硼酸酯n 因为能形 成相当稳定的三角形的硼酸酯，而在碱性水溶液中或在有氮存在下则生成四角形 的硼酸酯，与二醇能在溶液中快速达到平衡，其平衡速度可与非共价键作用相当。 非共价法，又称自组装法，m o s b a c h d 、组于1 9 8 1 年首次合成非共价型m i p 。 模板分子与功能单体通过非共价键结合形成复合物，再进一步交联聚合后，除去 模板分子。该方法在复合物的形成和之后的分子识别过程都是依靠非共价作用， 包括离子键、氢键、脚作用、疏水作用、电荷转移、范德华力等，其中最重要 的是离子键作用和氢键作用。关于非共价型m i p 的制备和应用的报道很多，包括 染料、二胺类、维生素、氨基酸及其衍生物、多肽、口肾上腺素阻滞剂、茶碱、 安定、核苷酶、萘普生。由于在单体与模板分子之间形成的是多点协调、强度较 弱的相互作用，因而此法具有制各较简便、结合容易、解离容易、可逆性好、达 到平衡快的优点；而且其识别过程的作用机理更接近于那些天然的分子识别系 统，如酶与底物、抗体与抗原等。因此，目前大多数m i p 都是通过非共价法制得。 到二十世纪九十年代，人们提出了将共价法与非共价法相结合【8 j ( 又称半共 价法或牺牲空间法) ，即模板分子与功能单体之问以共价键结合，然后交联聚合， 并除去模板分子。而在分子识别过程中，当模板分子重新进入孔穴时，模板分子 与功能单体上的功能基以非共价键形式结合。这种方法既解决了非共价法中识别 位点密度低的问题，又解决了共价法中识别速率慢的缺陷。但这种方法由于牺牲 了孔穴的一部分空间，其选择性能有所降低。例女l l c a r o 等人【9 】用非共价法和半共 价法分别合成m i p ，从水样中分离分析4 硝基酚，发现前者的选择性比后者高。 而且这种方法仍不能避免用共价法制备m 球的繁琐过程。 3 李丽虹：中山大学2 0 0 4 级硕士学位论文 1 3 分子印迹聚合物的制备 与通常的聚合物合成相比，分子印迹聚合物的合成有其独特之处：单体 必须带有能与模板分子发生作用的功能基，例如能与模板分子生成共价键的基 团，能与模板分子产生氢键或离子键作用的基团等，而不像其他聚合物先聚合再 进行功能基化。这类聚合物一般是高度交联的，以确保将有利于识别模板分 子的排列和构象固定下来，并保持识别位点在使用过程中空间形状不发生变化， 使特异性得以保留。 1 3 1 聚合体系原料的选择 1 3 1 1 模板分子 模板分子通常是待研究的目标化合物或与其结构类似的化合物。但有时目标 化合物来源窄、价格昂贵或毒性大，可以选用类似物代替。用共价法制备聚合物 的模板分子仅限于含极性可反应的基团的物质；非共价法对模板分子的限制较 小，一般来说，分子中含一个或一个以上活性基团的化合物就能制备高效的m i p 。 1 3 1 2 功能单体 要根据模板分子的性质以及功能单体与模板分子作用力的大小，合理设计、 合成或选择含有能与模板分子发生作用的功能基的单体。它必须与模板分子成 键，且在反应中它与交联剂分子处于合适的位置才能使模板分子恰好镶嵌于其 中。共价型功能单体需要与模板发生可逆的共价作用，可供选择的单体非常少。 一般是含有乙烯基的硼酸、醛、胺、酚以及含有硼酸酯的硅烷化合物。 在非共价型m 口中，由于单体与模板分子结合的形式多种多样，可供选择 的单体种类较多。常用的非共价键单体主要有羧酸类( 丙烯酸、甲基丙烯酸、2 - f 三 氟甲基) 一丙烯酸、对乙烯基苯甲酸、甲叉丁二酸等) 、磺酸类( 如2 - 丙烯酰胺2 甲基1 丙磺酸) 、杂环弱碱类( 4 - 乙烯基吡啶、2 乙烯基吡啶、乙烯基咪唑等) 。 用得最多的是甲基丙烯酸( m a a ) 1 0 j ，因为它与胺类化合物能形成离子键，而 4 李丽虹：中山大学2 0 0 4 级硕士学位论文 且与羧基有氢键作用。4 - 乙烯基吡啶( 4 一v p ) 与羧基类化合物也能形成离子键， 也有报道指对含羧基的模板分子，用4 一乙烯基吡啶作功能单体得到的m i p 比用 甲基丙烯酸得到的m i p 选择性高。而2 - ( 三氟甲基) 一丙烯酸的三氟甲基有强烈的 吸电子效应，酸性较强，适合作碱性模板化合物的功能单体。 1 3 1 3 交联剂 交联剂的作用是控制聚合物的形态、固定印迹位点和保证聚合物的机械稳定 性，使形成三维的聚合物网络。一般来说，作为交联剂的物质要有两个或两个以 上的活性反应基团，能与原料混合物互溶，形成均相体系。除此之外，交联剂既 要有一定的柔性以使孑l 穴具有良好的可近性，又要有一定的刚性和交联度以维持 孔穴的形状，一般交联度要达8 0 以上。目前最常用的交联剂是乙二醇二甲基 丙烯酸酯( e d m a ) 、二乙烯苯( d v b ) 、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯( t r l m ) 、 3 ，5 一二丙烯酰胺基苯甲酸、季戊四醇三丙烯酸酯等。其中e d m a 因价廉易得、 容易纯化、制备的m i p 性能稳定等优点而最为常用。 1 3 1 4 溶剂 溶剂在m i p 的制备中也发挥着重要作用，它不但要能溶解印迹混合物，使 聚合体系呈均相，还对聚合物起着致孔的作用，故又称为致孔剂。致孔剂的选择 对m i p 的表观形貌、表面积及孔隙结构均有很大的影响。在制备共价型m i p 时， 由于模板与功能单体是以共价键结合，溶剂要求没那么苛刻，可选择极性较强的 溶剂如水或醇等。而制备非共价型的m m 时，所用溶剂最好能够促进模板分子 与功能单体间的相互作用。但一般极性强的溶剂会干扰氢键的形成，使生成的 m i p 识别性能较差，这时一般选择极性较低的溶剂，如苯、甲苯、二甲苯、氯仿、 二氯甲烷、环己烷等。另外，在分析m i p 的识别性能时，溶剂会使印迹聚合物 溶胀，致使结合位点的三维结构发生改变，导致对分析物的识别能力减弱，所以 识别过程所用的溶剂最好与聚合反应用的溶剂一致，以避免溶胀问题。 李丽虹：中山大学2 0 0 4 级硕士学位论文 1 3 1 5 萃取剂 模板分子的去除，一般采用萃取等手段将绝大部分模板分子洗脱下来。通常 采用甲醇、甲醇一乙酸、乙腈、乙腈乙酸、水等高极性溶剂反复洗涤聚合物以尽 可能彻底除去模板分子。洗涤过程通常非常缓慢，需要耗费大量溶剂。可使用索 氏提取器进行连续回流和萃取。 1 3 2 聚合方法 m 口通常是通过自由基引发制备的，一般以偶氮二异丁腈( a i b n ) 或偶氮 二异庚腈作引发剂，有高温热引发和低温光引发两种方式。高温热引发方式一般 可以得到较高交联度的聚合物，并可以印迹紫外光下不稳定的化合物。而低温光 引发可印迹热不稳定的化合物。这两种方式可以互补，可根据需要选择。 随着对分子印迹技术研究的深入，人们发展了许多制备m i p 的方法。其中 包括本体聚合、原位聚合、悬浮聚合、两步溶胀聚合、沉淀聚合、表面印迹等。 一般应根据具体要求选择合适的聚合方法来制备m l p 。 1 3 2 1 本体聚合( b l u kp o l y m e r i z a t i o n ) 本体聚合是传统的方法。此法制各的m i p 具有满意的“记忆功能”，对模板 分子有良好的选择性和识别特性，而且合成操作条件易于控制，实验装置简单， 便于普及。但缺点是需要较大量的模板分子；后处理过程繁杂，聚合物需要研磨、 过筛，研磨过程中会不可避免地产生一些不规则粒子和相当大量的过细粒子，这 些过细粒子需经过沉降除去，费时费力，使产量大大降低；而且得到的聚合物粒 子是无定形的，均匀度较差。当用这种m i p 作为高效液相色谱固定相时，则影 响色谱柱填充的规则性，有可能造成色谱峰扩宽和拖尾现象，这在一定程度上降 低了它的柱效和分离度【“】。不过尽管如此，由于其固有的高选择性，许多对映异 构体在这类固定相上也获得了完全的分离【l ”。 李丽虹：中山大学2 0 0 4 级硕士学位论文 1 _ 3 2 2 原位聚合( i ns i t up o l y m e r i z a t i o n ) 原位聚合法是在色谱柱或毛细管中直接聚合制得连续的棒状的m 口，这种方 法避免了对聚合物进行研磨、过筛，也省却了柱装填的麻烦，直接、简便，有很 强的实用性。m a t s u i 1 3 1 等人首先采用原位聚合的方法，直接制得了连续棒状的 m i p 色谱柱，分离了二氨基萘的位置异构体和苯丙氨酰替苯胺对映体。l i n 等【“】 以三一苯丙氨酸酰替苯胺作为模板分子，用热引发聚合得到m i p 整体毛细管柱， 并将其用聚四氟乙烯管( f r f e ) 与充满电解质的开管毛细管柱连接，实现了d 和三一苯丙氨酸酰替苯胺的手性分离。但是原位聚合法会选用的致孔剂环己醇和 十二烷醇，有时会影响单体与模板分子之间的氢键作用而影响最后得到的m 口 的选择性【1 5 】。 1 3 2 3 悬浮聚合( s u s p e n s i o np o l y m e r i z a t i o n ) 在色谱技术中悬浮聚合法是制备聚合物微球的常用方法。悬浮聚合由于所使 用的单体一般是疏水性的，所以常用水作连续相。水的存在会降低功能单体与模 板分子问相互作用的数量与强度，影响聚合物对模板分子的识别能力；而且水溶 性模板分子会在水相中损失，所以很难用水相悬浮聚合法制备分子印迹聚合物。 为了克服水或高极性有机溶剂的干扰问题，m o s b a c h ! “j 使用与一般有机溶剂都不 互溶的液态全氟烃为连续相，这样就能适用于很多模板和功能单体的组合，很多 致孔剂也都可以选用。悬浮聚合法的特点是可得到聚合物微球，并可通过调节表 面活性剂的用量来控制粒径的范围。但不足之处是得到的球形聚合物颗粒是多分 散性的。 1 _ 3 2 4 两步溶胀聚合法( t w o - s t e ps w e l l i n ga n dp o l y m e r i z a t i o n ) 该法的优点是容易制得大小均一的、单分散性的聚合物微球，很适用于色谱 柱的装填，而且m l p 的选择性与原位聚合法制得的相似，其制备过程如图1 2 所示。例如用该法制得的印迹- n a p r o x e n 的m i p 能在色谱柱上直接分析血浆 李丽虹：中山大学2 0 0 4 级硕士学位论文 样品1 1 1 l 。但是由于使用了水作扩散相，可能会削弱模板分子与功能单体之间的作 用。 罴 羔， 陴哪口拇 o m x t ac j l 瑚a 轼二掣毛 帮蕊。 f s n a 娜目i “e d ；m a 酶嗣“l 甜t m 曜 i 一 南h w n 嗣【 啊 图1 - 2 两步溶胀聚合法制备m a p 的过程 1 3 2 5 沉淀聚合( p r e c i p i t a t i o np o l y m e r i z a t i o n ) 悬浮聚合法虽然能制得球形的m i p 微粒，但其制各过程中所需的连续相和 惰性分散体系非常昂贵难得，推广困难。沉淀聚合法的优点是不需要复杂的稳定 剂或分散剂，后处理非常简单，所制得的m i p 呈均匀的球形，而且这些球形颗 粒的大小能分布在较窄的范围内。以茶碱为模板，用这种方法制备出的m i p 粒 径为o 2 - - 0 跏m ，合成产率超过8 5 ，而且有较高的特异性吸附，其动力学吸 附也更容易达到平衡【堋。另外，w e j 等人【1 8 1 使用该法，印迹1 7 , 8 一雌二醇制得的 微米级到纳米级( 3 m m - - 4 0 0 n m ) 的球形m i p ，h p l c 评价发现其选择性优于本 体聚合得到的m 口。然而，沉淀聚合法的缺点是产物对制备条件很小的变化都非 常敏感，致孔剂的种类和聚合条件也有一定的限制，如果要大规模的生产，仍需 寻求更经济的方法。 1 3 2 6 表面印迹 使用悬浮聚合法、沉淀聚合法等，因印迹聚合物内部存在扩散阻力，导致模 8 李丽虹：中山大学2 0 0 4 级硕士学位论文 板分子与识别位点结合困难，结合速率低，因此把识别位点建立在基质表面的印 迹技术日益受到重视。由于分子识别位点附在基质表面，模板分子在聚合物网络 中出入比较容易，因此，有望解决体积大的分子如蛋白质、糖类化合物的印迹问 题；还可以通过对粒子本身性能的调节来适应应用的需要。这类材料应用于色谱 柱中有低压、高流速的特点。 利用聚合物对硅胶表面进行修饰，这方面工作首先由m o s b a c h 1 9 1 研究小组展 开。他们将甲基丙烯酸键合n - 氧化硅粒子表面，甲基丙烯酸残基与模板分子产 生共价作用或超分子作用，经自由基聚合形成表面印迹聚合物，硅胶表面键合印 迹固定相具有溶胀系数小、传质速度快的优点。s h i m a d a 、m o r i h a r a 等使用酸碱 重排法在硅胶和铝的表面进行印迹，识别位点直接产生在硅胶表面上。这种方法 已经用于手性模板分子的印迹，如5 一苯基乙内酰脲、n 苯甲基乜甲苄基胺 【硎 1 4 分子印迹技术在分离与分析中的应用 由于m i p 不仅对被分析物具有预定性、识别性和实用性的特点，而且还具 有优良的化学、机械和热稳定性，室温下使用寿命长等优点。因而在色谱分离、 固相萃取、化学仿生传感器、膜分离等方面得到了日益广泛的应用，展现出良好 的前景。 1 4 1 在手性拆分上的应用 到目前为止，m i p 的应用方面的文献报道有一半以上是用于手性拆分的，而 手性拆分的常用方法就是色谱法。色谱法分离效能高，速度快，适用性强，范围 广，在药物对映体拆分、合成药物和天然药物的分离纯化中发挥着重大作用。而 m l p 在色谱分离中的应用主要是作为色谱固定相，m 口色谱固定相的出现是色谱 领域的一场新的革命，它既可以作为非手性固定相用于一些结构类似物的分离与 纯化，又可以作为手性固定相用于手性物质的拆分。 手性拆分的意义是不容忽视的，现在市面上的药物超过一半含有至少一个手 性中心，而这些手性药物中约9 0 以消旋体形式出售。由于生物体内部的酶、 李丽虹：中山大学2 0 0 4 级硕士学位论文 受体、核酸、蛋白质及多糖大多是光学活性的，都具有与其功能相适应的结构， 它们常常对化合物的两种对映体表现出不同的响应，使两个互为对映异构体在生 物活性、代谢机理、药物潜在的毒副作用等方面往往有着较大的差别。如镇痛药 盐酸美沙酮临床上常用外消旋体，但其左旋体镇痛作用是右旋体的2 0 倍；又如 肾上腺素的左旋体的活性比右旋体强1 2 倍，消旋体的活性只有左旋体的一半。 基于此，1 9 9 2 年美国食品和药物管理局规定：今后对开发新的旋光性药品都必 须给出手性拆分的结果，并分别测定其药物动力学和毒理学的各项指标1 1 0 j 。因 此发展有效的手性分离方法显得更为重要。目前使用的色谱手性固定相主要有低 相对分子质量型包括p r i k l e 型、大环糖肽抗生素型、生物碱型、手性配体交换型 等；高相对分子质量型，如多糖类( 主要为纤维素、淀粉) 、蛋白质类等；寡聚 体型，如环糊精类等。但目前商业化的手性固定相都存在一个问题：对被分析物 出峰顺序的预测能力有限。 同其它类型的色谱固定相相比，m i p 手性固定相具有独特的优势：较高的机 械稳定性、耐高温、高压及酸碱条件；可预测手性对映体的洗脱顺序；能识别不 同分子之间微小的结构差异，使一些难以在常规手性固定相上分离的化合物有可 能通过m i p 得以拆分；对与模板分子结构相似的对映体具有一定的交叉分离能 力【2 ”。鉴于此，m i p 作为色谱固定相在高效液相色谱( h p l c ) 、薄层色谱( t l c ) 、 毛细管电色谱( c e c ) 和超临界流体色谱( s f c ) 等方面显示了良好的应用前景。 目前用m l p 作色谱固定相分离的化合物包括糖类、氨基酸及其衍生物、蛋白质、 核苷酸、生物碱、羧酸、胆固醇、维生素、杀虫剂、除草剂、染料、药物等。 1 4 1 1m i p 在h p l c 中的应用 m i p 应用最广泛的领域是作为h p l c 的固定相，既有从结构相似物中分离出 模板分子的非手性固定相，也有以手性化合物为模板分子制各的m i p 手性固定 相。h p l c 具有对样品适应性广，柱容量大，色谱柱可长期使用等优点，因而应 用较为广泛。w u l f f i 捌最先用共价法制得m i p 作为h p l c 固定相，利用m i p 的特 效选择性，成功地分离c t - d 一甘露吡喃糖苯苷的外消旋体。后来，m o s b a c h 等人【驯 用非共价法合成的m i p 用于h p l c 手性固定相，以l p h e n y l a l a n i n ea n i l i d e 李丽虹：中山大学2 0 0 4 级硕士学位论文 ( 工一p h e a n ) 为模板，甲基丙烯酸( m a a ) 为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸 酯( e d m a ) 为交联剂，在乙腈乙酸流动相中成功分离了消旋的p h e a n 。所以， 之后大部分的m 口手性固定相的报道都是以非共价法合成的，所研究的模板分 子种类已很多，其中包括药物、氨基酸及衍生物、肽的衍生物、核苷酸及有机酸 等。 ( 1 ) 在药物的手性拆分中的应用 m i p 在药物分离中的应用，始于对卢一拮抗剂( 卢a n t a g o n i s t s ) 的拆分，例如 噻吗洛尔( t i m o l 0 1 ) 、普萘洛尔( p r o p r a n o l 0 1 ) 。m o s b a c h 的研究小组 2 4 】于1 9 9 1 年首次报道了m i p 作为h p l c 的手性固定相用于药物的手性拆分，印迹 一t i m o l o l 的m i p 能拆分消旋的t i m o l o l 和消旋的p r o p r a n o l o l ，功能单体使用衣 康酸( i t a c o n i ca c i d ，i a ) 干nm a a 作对比，发现这里用i a 效果更好；2 0 g 的t i m o l o l 在2 0 分钟内能实现基线分离。h o s o y a 和h a g i n a k a 2 5 , 2 6 l 用两步溶胀聚合法制备了 印迹( - p r o p r a n o l o l 的大小均一的m 1 p 微球，分离消旋的p r o p r a n o l o l ，c l 达到2 9 7 。 另外，a l l e n d e r 等人【2 7 】还以印迹( 一) 一e p h e d r i n e 的m i p 分离了消旋的p r o p r a n o l o l ， 显示了m i p 的交叉拆分的优点。 m i p 还用于分离部分卢受体激动药( 卢a g o n i s t s ) 。y i l m a z 等人【2 8 l 在球形硅 胶上以表面印迹技术制各m i p 微球拆分异丙肾上腺素( i s o p r o t e r e n 0 1 ) ，实验是以 三氟甲基丙烯酸( t f m a a ) 为功能单体，二乙烯基苯( d v b ) 为交联剂，乙腈 为溶剂；在识别过程中，由于功能单体与模板之间很强的作用，故可以使用含水 的流动相。 也有分离口受体激动药( o a g o n i s t s ) 的例子。r a m s t r o m 等人【2 9 】于1 9 9 6 年 用m a a 在c h 2 c 1 2 中用本体聚合法制得印迹( + ) 一麻黄碱( e p h e d r i n e ) 的m 口，在 h p l c 上用c h 2 c 1 2 a c o h ( 8 0 2 0 ) 的流动相分离e p h e d r i n e ，a = 3 4 2 ，但峰形较 差，分离度较低凡只有0 7 。a l l e n d e r 等人【2 7 】通过本体聚合法印迹( 一) e p h e d r i n e ， 选用m a a 作功能单体，氯仿作致孔剂；在h p l c 上用m e c n a c o h ( 8 0 2 0 ) 拆分( + ) 一e p h e d r i n e ，分离因子达到8 5 。后来，d o n g 等人【3 0 l 用m a a 在c h c l 3 中 制得印迹( - ) - e p h e d r i n e 的m 1 p ，用3 0 的醋酸盐缓冲溶液为流动相，在5 p , g 的低 1 1 李丽虹：中山大学2 0 0 4 级硕士学位论文 进样量下分离消旋的e p h e d r i n e ，分离效果优于前人的报道。上述的m i p 制备中 功能单体与模板的比例都是4 ：1 ，a n s e l l 等人f 3 l 佣m aa 慎板为l ：1 的比例制备 m i p ，在c h 2 c l z b u n h 2 的流动相中，2 0 0 斗g 消旋的e p h e d r i n e 能在1 0 r n i n 内达到 基线分离。h w a n g 等人【3 2 】用m a a ，e d m c h c l 3 制得印迹( ) 一去甲基麻黄素 ( n o r e p h e d r i n e ) 的m i p ，以m e c n a c o h 为流动相，成功拆分了消旋的 n o r e p h e d r i n e ，如果在流动相中加入水，还能改善峰形。 m i p 拆分非甾体抗炎药( n s a i d s ) 的例子也有报道。k e m p e 等人【3 3 l 在1 9 9 4 年制得了印迹( 萘普生( n a p r o x e n ) 的m i p 手性固定相，由于n a p r o x e n 只有一 个羧基，与m a a 作用较弱，所以采用4 一乙烯基吡啶( 4 v p ) 作为功能单体， e d m a 为交联剂，溶剂为四氢呋哺，得到的m 口在四氢呋喃庚烷乙酸 ( 4 9 9 4 9 9 0 2 ) 的流动相中能拆分消旋的n a p r o x e n ，但不能拆分结构相似的布 洛芬( i b u p r o f e n ) 和酮洛芬( k e t o p r o f e n ) 。h a g i n a k a 等人【3 4 】用两步溶胀聚合法印 迹一n a p r o x e n ，同样以4 - v p 为功能单体，通过优化聚合条件和色谱条件，在较 高的柱温和较低的流速下，能改善拆分效果，还能在一定程度上拆分n a p r o x e n 的结构类似物i b u p r o f e n 和氟比洛芬( f l u r b i p r o f e n ) 。l e i l 3 5 瞎人通过本体聚合法， 以丙烯酰胺为功能单体，印迹n a p r o x e n 制得的m i p ，在含乙酸的流动相中能 分离消旋的n a p r o x e n 。 h a g i n a k a 等人【3 6 1 利用两步溶胀聚合法制备m i p 手性固定相还分离了抗组织 胺剂( a n t i h i s t a m i n e ) 例如氯苯那敏( c h l o r p h e n i r a m i n e ) 和溴苯吡丙胺 ( b r o m p h e n i r a m i n e ) 。两者都有较强的碱性基团，能与m a a 形成离子对；功能 单体的选择上，m a a 和t f m a a 相比，后者有更好的分离效果：而且印迹 c h l o r p h e n i r a m i n e 的m i p 也能拆分b r o m p h e n i r a m i n e ，反之亦然。 m 1 p 用作h p l c 手性固定相，还能分离尼伐地平( n i l v a d i p i n e ) 、那格列奈 ( n a t e g l i n i d e ) 、金鸡纳啶( d n c h o n i d i n e ) 、尼古丁( n i c o t i n e ) 、喷他脒( p e n t a m i d i n e ) 、 巴比妥( b e n z o d i a z e p i n e s ) 、大环内酯抗生素( m a c r o l i d ea n t i b i o t i c s ) 、b 内酰胺抗 生素( b 1 a c t a ma n t i b i o t i c s ) 、三环抗抑郁药( t r i c y c l i ca n t i d e p r e s a n td r u g ) 等药物。 李丽虹：中山大学2 0 0 4 级硕士学位论文 ( 2 ) 在氨基酸和肽、嘌呤、类固醇、糖和糖的衍生物的分离中的应用 一直以来，人们都在用不同的功能单体、交联剂和致孔剂制备m i p ，以求能 得到高选择性的m i p 手性固定相来拆分氨基酸和多肽。例如，有较多的报道是 以m a a 为功能单体、e d m a 作为交联剂、非极性溶剂( 如氯仿) 作为致孔剂制 备m i p 分离氨基酸和多肽的衍生物。利用m a a 与模板分子的静电作用和氢键 作用，一般o 一衍生化的氨基酸的功能单体都选用m a a 。r a m s t r o m s 等人旧制得 的印迹n - a c - l p h e - l t r p o m e ( a c = a c e t y l ，m e = m e t h y l ) 的m i p ，在含乙酸的氯 仿流动相中分离这种消旋的二肽，口达到1 7 8 。对于n 保护的氨基酸，例如 c b z - l - a s p o h 、c b z - l g l u o h 、c b z - l - p h e - o h 和c b z - l - t y r - o h ( c b z = b e n z y l o x y c a r b o n y l ) 等，一般选择4 - v p 作为功能单体【3 ”，在该体系中，氨基酸 的羧基和4 - v p 的吡啶基之间有氢键作用和离子作用。也有很多选用复合功能单 体的例子：r a m s t r o m 等人【3 9 】用2 一v p 和m a a 作功能单体，能分别拆分几种含一 个羧基的消旋物，例如c b z - d ，l t y r - o h ，d a n s y l d ，l p h e o h ，b o c d ，l p h e o h ( b o c = t e r t 一b u t o x y c a r b o n y l ) ，这样得到的m i p 的选择性比单独使用其中一种功 能单体得到的m i p 的选择性要好；s n o w 等人 柏】用4 - v p 和m a a 作功能单体， 分离了d