（微生物学专业论文）苏云金杆菌40718菌株的毒力测定及晶体毒素性质的研究.pdf

b ti c p sr i dh p l ce d t as d sa c rb i sa p st e 正dt i i ss d s p a g es e mt e mp i a g ee s i m s 山d i t o f m ss aa c ni p g刀翻缩写表苏云金杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s )杀虫晶体蛋白( i n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n s )虫口减退率( r a t e o f i n s e c t d r o p )高效液相色谱( h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y )乙二胺四乙酸( e t h y l e n d i m n i n et e t r a a c e t i ca c i d )十二烷基磺酸钠( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e )丙烯酰胺( a c r y l a m i d e )亚甲基双丙烯酰胺( m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d e )过硫酸铵( a m m o n i u mp e r s u l f a t e )四甲基乙二胺( t e t r a m e t h y le t h y l e n ed i a m i n e )三羟甲基氨基甲烷( t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e )十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s o d i u md o d e c y ls u l f a t ep o l y a c r y l a m i d e 鲥e l e c o p h o r e s i sj扫描电镜( s c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e )透射电镜( t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p e )聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s )电喷雾质谱( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y )基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( m a t r i x - a s s i s t e dl a s e rd e s o r p f i o ni o n i z a t i o nt i m eo f f l i g h tm a s ss p e c t r o m e w )芥子酸( s i n a p i n i ca c i d )乙腈( a c e t o n i t r i l e )固定p h 梯度( i m m o b i l i z e dp hg r a d i e n t s )三氟乙酸( t r i f l u o r o a c e t i ca c i d )苏云金杆菌4 0 7 1 8 菌株的毒力测定及晶体毒素性质的研究中文摘要本研究对我室选育的苏云金杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i & 简称b t ) 4 0 7 1 8 菌株( 国家菌种保藏号：c c t c cn o 2 0 0 0 16 ) 进行了室内及田间毒力测定。分离了伴孢晶体并对其进行了电镜观察。对伴孢晶体的溶解性及胰蛋白酶酶解特性进行了研究。从s d s p a g e 胶上回收杀虫晶体蛋白原毒素及核心多肽。探索了从s d s - p a g e 胶上回收蛋白质进行质谱分析的方法。通过双向电泳技术对b t 杀虫晶体蛋白的亚基组成、分子量及等电点进行了分析。实验结果如下：i 毒力测定在4 0 7 18 菌株制剂2 50 倍对小菜蛾( 川 e ，ax y f o s t e t l a ) 3龄幼虫的室内生物测定试验中，发现在7 2 h r 时小菜蛾校正死亡率高达1 0 0 ，高于供试其它菌株；在4 0 7 1 8 菌株制剂2 5 0 倍对室内棉铃虫3 4 龄幼虫的室内生物测定试验中，7 2 h r 时棉铃虫校正死亡率达7 9 3 ，高于供试其它菌株。在防治第三代棉铃虫( h e l i o t h i sa r m i g e r a ) 的大田小区试验中，施用i 0 0 倍、2 0 0 倍、3 0 0 倍的4 0 7 18 菌株制剂，药后3 天的虫口减退率分别为7 6 2 、6 6 7 和4 7 6 ，药后7 天为8 1 - 4 、6 5 1 和6 2 8 ，防效极显著高于生产上应用的同类型农药苏云金杆菌制剂千胜( 2 0 0倍，药后3 天和7 天的虫口减退率分别为2 1 4 和3 4 2 ) 和化学农药甲胺磷( 6 7 0 倍，药后3 天和7 天的虫口减退率分别为2 8 5 和3 0 1 ) 。在防治第三代棉铃虫的大田大区对比试验中，4 0 7 18 菌株制剂施用浓度2 0 0 倍，药后3 天和7 天的虫口减退率平均分别为5 9 7 1 和7 5 5 9 ，对照生物农药大英雄( 3 3 0 倍) 分别为5 9 4 0 和6 3 80 。4 0 7 1 8 菌株制剂对棉铃虫的防效在药后3 天与大英雄相近，在药后7天杀虫效果高1 1 7 9 。在防治第四代棉铃虫的大田对比示范试验中，4 0 7 18 菌株制剂施用浓度2 5 0 倍，药后3 天棉铃虫的虫口减退率平均为7 9 3 5 ，杀虫效果与化学农药高渗久效磷( 3 5 0 倍) 和甲胺磷( 5 0 0 倍+ 来福灵10 0 0 倍) 相近。2 伴孢晶体的分离及电镜观察研究了苏云金杆菌4 0 7 1 8 菌株晶体的分离及其在电镜下的形态特征，并通过s d s p a g e 对其杀虫晶体蛋白迸行了分析。发现4 0 7 1 8菌株晶体有立方体型和双金字塔型两种，分别由65 k d 的c r y i 原毒素及13 0 k d 的c r y 原毒素组成，该菌对鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) 和双翅目( d i p t e r a ) 昆虫均有毒杀作用。3 伴孢晶体原毒素的s d s p a g e 电泳特征及含量比较分析比较了4 0 7 18 菌株与其它四个菌株在原毒素电泳特征上的差异，测定了4 0 7 18 菌株与其它四个菌株伴孢晶体碱溶后的蛋白含量，结果表明4 0 7 1 8 菌株蛋白含量较其它四个菌株高。4 伴孢晶体溶解性及胰蛋白酶酶解特性的研究研究了4 0 7 1 8 菌株伴孢晶体通过碱性条件和表面活性剂等处理后的溶解性，比较了在不同p h 值、不同酶解时间对伴孢晶体胰蛋白酶酶解的影响。并通过碱溶、等电点沉淀、胰蛋白酶酶解和硫酸铵沉淀粗纯化了抗胰蛋白酶核心多肽。5 杀虫晶体蛋白原毒素及毒性核心多肽的纯化及质谱检测以4 0 7 1 8 菌株杀虫晶体6 5 k d 原毒素为材料，探索了从s d s p a g e胶上回收蛋白质进行质谱分析的方法。比较了不同染色方法对蛋白回收的影响。蛋白纯化的步骤包括s d s - p a g e 、电洗脱、脱盐和去除s d s 。电洗脱采用半透膜法，用超滤法脱盐，冷丙酮沉淀法除去s d s 。这一纯化步骤基本适应13 0 k d 原毒素及核心多肽的纯化。纯化后的65 k d原毒素经e s i - m s 检测，分子量约6 4 50 0d a 。经m a l d i m s 检测，未能有明显蛋白峰出现，通过s d s p a g e 及p a g e 分析表明，这可能是经过上述途径纯化后的蛋白在与基质混合时处于聚和悬浮态所致。6 苏云金杆菌杀虫晶体蛋白的双向电泳分析以双向电泳( i p gxs d s p a g e ) 技术分析了苏云金杆菌库斯塔克亚种h d 一1 及4 0 7 1 8 菌株伴孢晶体内蛋白质的亚基组成、分子量和等电点分布。结果表明，苏云金杆菌伴孢晶体内蛋白质的双向电泳图谱可分辨出1 0 0 多个亚基成分，6 5 k d 亚基组分和13 0 k d 亚基组分均存在显著差异。关键词：苏云金杆菌，毒力测定，晶体毒素，s d s p a g e ，电洗脱质谱检测，双向电泳t o x c i t ya s s a ya n dp r o p e r t i e so fi n s e c t i c i d a lc r y s t a l so fb a c i l l u st h u r i n g i e n s i ss t r a i n4 0 7 1 8a b s t r a c tt h ei n d o o ra n df i e l dt o x i c i t ya s s a yo fb a c i l l u s t h u r i n g i e n s i ss t r a i n4 0 718w e r es t u d i e d ，t h ep a r a s p o r a lc r y s t a l sw e r es e p a r a t e da n dt h eo b s e r v a t i o nw a sm a d eu n d e re l e c r o m n i c r o s c o p e ，t h es o l u b i l i t ya n dp r o p e r t i e so ft r y p s i n i s a t i o nw e r es t u d i e d ，t o o p r o t o x i na n dt o x i no fp a r a s p o r a lc r y s t a l sr e c o v e r e df r o ms d s p a g e ，a n dt h em e t h o do fa n a l y s i sb ym a s ss p e c t r o m e t r yo fr e c o v e r e dp r o t e i nf r o ms d s - p a g ew e r ee x p l o r e d ，t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i sw e r ee m p l o i e dt oa n a l y s et h ei c p so fb tf o ri t sp a t t e r n so fs u b u n i t sc o m p o s i t i o n ，m o l e c u l a rw e i g h ta n di s o e l e c t r i cp o i n to fe a c hs u b u n i t s 1 t o x i c i t ya s s a yi ni n d o o rb i o a s s a yt h ec o r r e c t e dm o r a l i t yo fs t r a i n4 0 718p r e p a r a t i o nd i l u t e d2 5 0t i m e st o3i n s t a rp l u t e l l a 母, i o s t e l l al a r v a ew a s10 0 w i t h i n7 2 h r , t h ec o r r e s p o n d i n gr e s u l t st o3t o4i n s t a rh e l i o t h i sa r m i g e r al a r v a ew a s7 9 3 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n t r o le f f e c to fs t r a i n4 0 718i sh i g h e rt h a no t h e rs t r a i n s i nf i e l dp l o t ss t r a i n4 0 7 18p r e p a r a t i o nd i l u t e d1 0 0 ，2 0 0a n d3 0 0t i m e st oc o n t r o lt h i r dg e n e r a t i o nh e l i o t h i sa r m i g e r a ，t h er a t eo fi n s e c td r o p ( r i d ) w e r e7 6 2 ，6 6 7 a n d4 7 6a t3 r dd a y , 8 1 4 ，6 5 1 a n d6 2 8 a t7 t hd a y sr e s p e c t i v e l y t h ec o n t r o le f f e c ti so b v i o u s l yh i g h e rt h a ns i m i l a ri n s e c t i c i d eb tp r e p a r a t i o n “q i a n s h e n g d i l u t e d2 0 0t i m e s ，w h o s ei u dw e r e2 1 4 a n d3 4 2 a t3 r do r7 t hd a yr e s p e c t i v e l y , a n dc h e m i c a li n s e c t i c i d ea c e p h a t e m e td i l u t e d6 7 0t i m e s w h o s er i dw e r e2 8 5 a n d3 0 1 a t3 r do r7 t hd a yr e s p e c t i v e l y i nf i e l dr e g i o n ss t r a i n4 0 718p r e p a r a t i o nd i l u t e d2 0 0t i m e st oc o n t r o l3 r dg e n e r a t i o nh e l i o t h i sa r m i g e r a ，r i dw e r e5 9 7 1 a n d7 5 5 9 a t3 r dd a y , w h e m st h ec o n t r o lb i o l o g i c a li n s e c t i c i d e “b i gh e r o d i l u t e d3 3 0t i m e sw e r e5 9 4 0 a n d6 3 8 0 r e s p e c t i v e l y t h ec o n t r o le f f e c ta t3 r dd a yi ss i m i l a rt o “b i gh e r o ”a n di s11 7 9 h i g h e rt h a n “b i gh e r o a t7 t hd a y i nc o m p a r i s o nf i e l d sd e m o n s t r a t i o ns t r a i n4 0 718p r e p a r a t i o nd i l u t e d2 5 0t i m e st oc o n t r o l4 t hg e n e r a t i o nh e l i o t h i sa r m i g e r a ，r i dw e r e7 9 3 9 a t3 r dd a y ，t h ec o n t r o le f f e c to fc h e m i c a li n s e c t i c i d eh i g hp e r m e a b i l i t ym o n o c r o t o p h o sd i l u t e d2 5 0t i m e sa n da c e p h a t e m e td i l u t e d5 0 0t i m e sa d d e de s f e n v a l e r a t ed i l u t e dl0 0 0t i m e sw a ss i m i l a r 2 s e p a r a t i o no fp a r a s p o r a lc r y s t a l sa n do b s e r v a t i o nu n d e re l e c t r o n m i c r o s c o p et h es e p a r a t i o no fc r y s t a l sf r o ms t r a i n4 0 718a n di t sm o 咄0 1 0 9 yu n d e re l e c t r o n m i c r o s c o p ew e r es t u d i e d ，i t si n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n sw e r ea n a l y z e db ys d s p a g e ，t o o b a s e do ns h a p e ，t h e r ea r et w om a j o rt y p e so fc r y s t a l s ，t h o s ew i t hs h a p eo fb i p y r a m i d a l ，c o m p o s e do f13 0k dc r y ip r o t o x i n ，a n dt h o s ew i t hs h a p eo fc u b i c ，m a d eu po f6 5k dc r y l ip r o t o x i n t h es t r a i ni st o x i ct oi n s e c t so f l e p i d o p t e r aa n dd i p t e r a 3 c o m p a r i s o no fc h a r a c t e ro fs d s - p a g ea n dc o n t e n to fi n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n so fd i f f e r e n tb ts t r a i n sc h a r a c t e ro fe l e c t r o p h o r e s i sa n dc o n t e n to fp a r a s p o r a lc r y s t a lp r o t e i n so fs t r a i n4 0 7 18a n dt h o s eo fo t h e rf o u rs t r a i n sw e r ec o m p a r e d ，t h er e s u l t sr o w e dt h a tt h ep r o t e i nc o m e mo fp a r a s p o r a lc r y s t a l so fs t r a i n4 0 7 18i sh i g h e rt h a no t h e rf o u rs t r a i n s 4 s o l u b i l i t ya n dp r o p e r t i e so f t r y p s i n i s a t i o no f p a r a s p o r a lc r y s t a l st h es o l u b i l i t yo fs t r a i n4 0 7 1 8p a r a s p o r a lc r y s t a l sh a n d l e db yd i s t i l l e dw a t e r , a l a k ia n ds u r f a c ea c t i v er e a g e n tw e r es t u d i e d ，a n dt h ee f f e c to fd i f f e r e n tb u f f e rp hv a l u e sa n dr e a c t i o nt i m eo nt r y p s i n i s a t i o nw e r ec o m p a r e d ，p r i m a r yp u r i f i c a t i o nw a yo ft o x i ns o l u b i l i z e di na l a k ib u f f e rc o n t a i nb m e r c a p t o e t h a n o l ，p r e c i p i t a t e da g a i nw i t ha c i d ，f o l l o w e db yt r y p s i n i s a t i o na n da m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o nw e r em a d e 5 p u r i f i c a t i o no f p r o t o x i na n dt o x i na n da n a l y s i sb ym a s ss p e c t r o m e t r yt h ew a yo fr e c o v e r i n gp r o t e i n sf r o ms d s p a g eg e lt ou s e6 5k dp r o t o x i nf r o mb ts t r a i n4 0 718a sam o d e lf o rm a s ss p e c t r o m e t r yw a se x p l o r e d t h ee f f e c to fd i f f e r e n ts t a i n i n gm e t h o d st or e c o v e r i n gp o t e h aw a sc o m p a r e d t h ep u r i f i n gs t e p si n c l u d e ss d s p a g e ，e l e c t r o e l u t i o n ，d e s a l t i n g ，a n ds d sr e m o v a l e n t r a p m e n to ft h e e l u t e dp r o t e i nw i t hs e m i p e r m e a b l em e m b r a n ef o re l e t r o e l u t i o n ，c e n t r i f u g a t i o nu l t r a f i l t r a t i o nf o rd e s a l t i n ga n dc o l da c e t o n em e t h o dw a su s e df o rs d sr e m o v a l t h ep u r i f y i n gs t e p si sa d a p t i v et o13 0 k dp r o t o x i na n d6 0k dt o x i n t h er e s u l ts h o w st h a tm o l e c u l a rw e i 曲to f6 5k dp r o t o x i ni sa b o u t6 4 5 0 0d ab ye s i m s t h e r ea r en oo b v i o u sp r o t e i np e a k sb ym a l d i m s ，p e r h a p st h eh i 曲h y d r o p h i cp r o t e i na g g r e g a t e si ns u s p e n s i o nm i x i n gw i t hm a t r i xa n a l y z e db ys d s - p a g ea n dp a g e 6 t w o - d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i sf o ri c p st w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ( i p g s d s - p a g e ) w e r ee m p l o i e d t o a n a l y s e t h e i c p s o f b tk u r s t a k i h l 3 - 1a n ds t r a i n 4 0 7 1 8 f o r i t sp a t t e r n so fs u b u n i t sc o m p o s i t i o n ，m o l e c u l a rw e i g h ta n di s o e l e c t r i cp o i n t0 i ) o fe a c hs u b u n i t s t h es i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a ss h o w e db o t h6 5k da n d13 0k ds u b u n i t sb e t w e e nt w os t r a i n s k e y w o r d s ：b a c i h u st h u r i n g i e n s i s ，t o x i c i t ya s s a y , i n s e c t i c i d a lc r y s t a l s ，s d s p a g e ，e l e c t r o e l u t i o n ，a n a l y s i sb ym a s ss p e c t r o m e t r y ,t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s 前言苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n s i e n s i s ，b t ) 由日本人石渡( i s h i w a t a ) 1 9 0 1 年在家蚕猝倒病( s o t t o ) 中最先发现，1 9 1 1年德国人伯利纳( b e r li n e r ) 从德国苏云金( t h r u i n g i a ) 地区地中海粉螟罹病幼虫中分离出一株致病芽孢杆菌，1 9 15 年正式定名为苏云金杆菌。b t 的分类主要根据鞭毛抗原血清学反应、生物化学特性和酯酶同功酶分析等，目前已发现7 0 个血清型，8 3 个亚种，其中我国发现的有i 1 个血清型“1 。b t 能产生o 【、p 、y 一外毒素、5 一内毒素等多种杀虫活性物质，其中最主要的是5 一内毒素，或伴孢晶体( p a r a s p o r a lc r y s t a l ) 。伴孢晶体由一种或几种杀虫晶体蛋白( i n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n s ，i c p s ) 组成，敏感昆虫吞食后，在昆虫肠道碱性环境和蛋白酶的作用下，释放出毒性肤，与昆虫中肠肠道上皮细胞受体结合后，破坏细胞内外渗透压平衡，导致昆虫死亡“1 。目前，苏云金芽孢杆菌的杀虫谱已从无脊椎动物节肢动物门中的鳞翅目( l e p i d o p t e r a ) 扩大到双翅目( d i p t e r a ) 、鞘翅目( c o l e o p t e r a ) 、同翅目( h o m o p t e r a ) 、直翅目( o r t h o p t e r a ) 等9个目的昆虫，同时还发现对线虫( n e m a t o d e s ) 、螨虫( m i t e s ) 、原虫( m a l l o p h a g a ) 等有害种类有杀虫活性”1 。自1 9 8 1 年成功克隆第一个杀虫晶体蛋白基因后，b t 分子生物学基础研究方面取得了突破性的进展，在应用方面创造了显著的经济、社会和生态效益。自1 9 3 8年第一个商品制剂问世以来，目前已有6 0 多个国家生产1 2 0 多种商品，其商品剂型有粉剂、可湿性粉剂、乳剂、糊状剂、颗粒剂、胶囊剂等“3 。1 伴孢晶体的化学组成1 1 蛋白质的氨基峻组成伴孢晶体主要由蛋白质组成，自a n g u s 等”1 第一个发表杀虫晶体蛋白氨基酸组成以来，综合众多研究者进行的杀虫晶体蛋白氨基酸组成分析的结果，发现杀虫晶体蛋白由18 种氨基酸组成，其中天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸是含量最高的几种氨基酸，而甲硫氨酸、色氨酸是含量最少的氨基酸”1 。戴美学等1 “对苏云金杆菌s d 一5 菌株的晶体蛋白氨基酸组成进行了分析也证明了这一点。但不同亚种的氨基酸组成可能不同，但同一亚种类的氨基酸组成基本近似。1 - 2 伴孢晶体内的核酸b ts u b s p k u r s t a k ih i ) 一73 、s u b s p a l e s t i 、s u s p 0 1 7 t o n l o c i d u s 、s u bs p t o l w o r t h i 、s u bs p g a l l e l i a 、s u b s p k u r s t a k ：h d 一1 以及含有c r y l a a 、c r y l h b 、c r y l a c 基因的大肠杆菌产生的晶体中都发现有2 0 k b 的d n a 片段”“。c r y l a 原毒素能够与2 0 k bd n a 发生紧密结合。当d n a 同原毒素发生解离或者用胰蛋白酶将原毒素酶解成毒素后，2 0 k bd n a 由于失去原毒素蛋白的保护而恢复了对d n as e 的敏感性。目前一般认为，d n a 分子能够维持原毒素分子的结构完整性。除去了d n a 分子的原毒素用胰蛋白酶处理时全部被降解为小的肽段，不能产生抗胰蛋白酶的毒性片段。目前对于2 0 k bd n a 片段的来源以及其序列和特异性的结构，还没有明确的认识。1 - 3 其它成分曾有报道伴孢晶体内存在葡萄糖、木糖，并指出其存在与否不影响其毒力，但也有人认为伴孢晶体内存在的碳水化合物系污染所致，并非本身固有成分”1 。2 杀虫晶体蛋白的分类1 9 8 9 年，h o f t e 和w h it e l e y ”圳根据各种i c p s 氨基酸序列的同源性和杀虫谱的差异将i c p s 基因分为五大类( h w 分类系统) ，即编码的i c p s 对鳞翅目有活性的c r y i 类、对鳞翅目和双翅目有活性的c r y i i 类、对鞘翅目有活性的c r y i i i 类、对双翅目有活性的c r y i v 类和对双翅目有毒性且具有溶细胞作用的c y t 类。在每一类型下用英文字母a 、b 、c 等代表不同的基因型，再用小写的英文字母a 、b 、c 等代表不同的基因亚型，如c r y i h ( a ) 、c r y l a ( b ) 等。h w 分类系统被广。i二二二二二一r _ 矗：_ = _ _ _ _ - u _ u _ _ _ h = = = ：u = 二二= = = 三二= = ：_ _1e，_ * 一一_ 1 二=ii一= _ _ ：_ =。一一“l - 一- c1一1 一兰三三，。_ 一1 一1 02 03 0d o6 07 0r 0日0p e 心e n ta m i n o 址i d 铷堞n c el d e n t i t y图1苏云金杆菌c r y 和c y t 蛋白的氨基酸序列同源性关系的树状谱f i g 1p h y l o g r a md e m o n s t r a t i n ga m i n oa c i ds e q u e n c ei d e n t i t ya m o n gc r ya n dc y tp r o t e i n s 泛使用，但随着i c p s 基因的大量克隆，按该系统进行分类的两大标准即同源性和杀虫谱之间的矛盾日益突出。在1 9 9 5 年国际无脊椎病理年会上成立了由n c r i c k m o r e 为首的杀虫晶体蛋白基因命名委员璧譬一耋一一一一_ o会，新的分类系统只考虑i c p s 氨基酸序列的同源性，分类的原则只考虑杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性，按其差异将杀虫晶体蛋白分成小于4 5 ，4 5 至7 5 之间，7 5 至9 5 之间和9 5 以上等四级。杀虫晶体蛋白首字母大写c r y c y t 。基因名首字母小写并用斜体，如c r y c y t 。第一级使用阿拉伯数字而不是原来的罗马数字，如c r y l和c r y 2 ，它们之间的同源性小于4 5 ；第二级使用大写英文字母，如c r y la 和c r y lb ，它们之间的同源性在4 5 至7 5 之间；第三级使用小写英文字母，如c r y lh a 和c r y la b ，其同源性在7 5 g j9 5 之间：第四级也使用阿拉伯数字，原h w 系统无此级，如c r y la a l和c r y la a 2 ，它们的同源性大于9 5 。按此分类系统，现已命名和编号的i c p s 已达19 4 个亚类“。3 伴孢晶体的分离及溶解的研究可先采用固体或液体培养，得到的孢晶悬液可采取密度梯度离心法、液体双相法、沉淀法或生物物理法等手段分离“。密度梯度离心法是利用密度的差异将芽孢和晶体进行分离。常用的密度试剂有蔗糖、碱金属盐( c s c l 、n a b r ) 、碘化密度梯度介质( r e n o g r a f i n ，m e t r i z a m i d e 泛影葡胺) 等。通过比较n a b r 、c s c l 、r e n o g r a f i n 的不同梯度的密度梯度离心可知，晶体在三者中的浮力密度并不相同，这是因为亲水程度的不同或特异结合使晶体在不同类型密度梯度中的浮力密度并不具有可比性。因此对于不同的b t 菌株，需选择不同的梯度类型。晶体一般采用在碱性条件下，辅之以还原剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇处理，使杀虫晶体蛋白溶解释放出来，有些不能被碱溶的晶体则需采用去垢剂等溶解。国内外文献上有一些不同操作条件的改变使晶体溶解的报道，这些操作条件包括：碱溶液的组成、浓度、培育时间及温度、处理的晶体量等。此外，由于晶体内蛋白酶对晶体的非特异性降解作用等因素的影响，晶体的降解特性也很复杂。4 杀虫晶体蛋白纯化的研究进展杀虫晶体蛋白的纯化可利用其分子量、等电点、溶解性或亲和性等的不同对蛋白进行分离”“0s u b s p k u r s t a k ih d 一1 菌株的伴孢晶体内含两种毒素，一种为13 0 k d 蛋白组成的菱形晶体，即p - i 组分；另一种为由6 5 k 9 蛋白组成的立方型晶体，即p - 2 组分。y a m a m o t o 和m c l a u g h li n 1 利用s e p h a c r y l 柱色谱分离了h d - i 菌株中的p 一1 和p 一2 ，方法如下：晶体碱溶后，离心，取上清液直接上s e p h a c r y l s 一3 0 0柱，用50 m m 、p h 8 0 t r is h c i 溶液( 含0 1 2 - m e ，l n ne d t a ) 洗脱，s e p h a c r y l s 一3 0 0 柱可依分子量大小将蛋白分离。b u l l a 等“”用s e p h a r o s ec l - 4 b 凝胶过滤色谱和d e a eb i o g e l a 离子交换色谱对h d - i 伴孢晶体毒素进行了分离纯化，得到了6 8 k d 的组分。伍宁丰等m 】通过分子筛s e p h a r o s e6 b ，用2 0 r a m 、p h 7 5 磷酸缓冲液洗脱，在上样于离子交换柱d e h e - s e p h a d e xd e - 5 2 ，以0 0 8 m o i ln a c l 梯度洗脱，得到了6 8 k d 的组分。此外，还有等电聚焦凝胶电泳、亲和色谱等方法分离伴孢晶体毒素的报道。用高效液相色谱( h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 分离b t 伴孢晶体内原毒素及抗胰蛋白酶酶解核心毒素也有报道。h p b i e t l o t 等”1 将s u b s p 七w s f 日七jh d - 73 的伴孢晶体用0 1 mc a p s ，p h l o 5 ，1 p 一巯基乙醇溶解后，释放的原毒素用氨甲酰基酰化，再用h p l c ( p h a r m a c i al k bb i o t c h n o l o g y ，b i o - , a dm a 7 q ) 阴离子交换柱，洗脱于室温进行，采用。一l m o l ln a c l 梯度于0 1 mc a p s ，p h l o 5 中，流速为1 5 m l m i n ，蛋白吸收峰为2 8 0 n m ，对c a m 一原毒素进行了分离，毒素的纯化采用m o n o qh r10 i o 阴离子交换柱，洗脱于室温进行，采用0 l m o i ln a c l 梯度于0 1 mc a p s ，p h l 0 5中，流速为0 2 m l m i n ，蛋白吸收峰为2 8 0 n m 。l 。m a ss o n 等“”对s u b s p a f z a w a ih d - i3 3 毒素核心多肽进行了纯化，先用5 0 m i dc a p s ( p h lo 5 ) 溶解晶体，再加入胰蛋白酶酶解，离心，超滤柱除去降解多肽，然后采用h p l c ( p a k ed e a es p w 弱阴离子交换柱) 进行纯化，以0 0 1 7 m o l ln a c l 线型梯度洗脱8 0 m i n ，2 0 m i n 后流速从1m l m i n 降到0 5m l m i n ，分离到了c r y l a 、c r y l d 、c r y l a b 的毒素。f r c l a ir m o n t 等”1 对s u b s p k u r s t a k ih d 一73 毒素核心多肽进行了纯化，采用b i o r a dh p l cm a 7 q 阴离子交换柱，采用0 i m o l ln a c l 梯度于0 1 mc a p s ，p h l0 5 中，在室温进行洗脱，流速为2 5 m l m i n ，蛋白吸收峰为2 8 0 n m 5 杀虫晶体蛋白结构与功能的研究进展b t 毒蛋白大致有三个区域范围：12 9 13 8 k d 、6 5 7 8 k d 和2 5 2 8 k d 。c r y 家族在氨基酸序列上具有的同源性，表明b t 毒蛋白在进化上具有同源性”“1 。典型的i c p s 为13 0 k d 左右，一般由两个部分构成，n 端的活性片段和c 端的结构片段。带有结构片断的i c p s 被称为原毒素，它经过蛋白酶的消化作用后，产生有活性的毒性肽。如c r yi 原毒素约13 0 k d ，其c 端经过蛋白酶的7 次水解消化作用而被除去，产生毒性多肽。c 端的结构片段中存在大量的分子间二硫键，一般认为c 端的结构片段与毒蛋白分子的稳定及晶体的形成有关。c r y i i 、c r y l i i 型毒蛋白则为例外，这些6 5 7 0 k d 的i c p s 本身就是不包含c 端结构部分的毒蛋白。通过x 一射线衍射分析，已经阐明了c r y l a a ，c r y 3 a ，c y t 2 a 等的三维结构“1 。激活后的c r y i a a 和c r y 3 a图2 苏云金杆菌c r y l a a ，c r y 3 a ，a n dc y t 2 a 的三维结构f i g 2t h r e e - d i m e n s i o n a ls t t u d u r e so f c r y la ，c r y 3 a ，a n dc y 2 a在总体结构上非常相似。它们都具有三个结构域：结构域i 位于毒性多肽的n 端，由7 个两亲的d 一螺旋组成，主要参与在昆虫中肠上皮细胞形成孔道。结构域i i 由三个反向平行的p 折叠组成的一种典型的“希腊钥匙”型拓补结构，即所谓的“1 3 一三棱柱”，决定毒素与受体的专一性结合；结构域i i i 是由两个缠绕的反向平行d 折叠片形成的一种“三明治”型“胶质卷”拓补结构，它可以调节毒素的活性，在不同的毒素中具有不同的功能。在毒素引起膜穿孔的分子机制方面，c r y l a a 和c r y 3 a 毒素结构域i 的o 【4 和a5 以及连接这两个螺旋的环( 1 0 0 p ) 形成了一个疏水的发夹结构，即g 【4 - l o o p c 【5 发夹。“伞状模型”认为，毒蛋白- 9 受体发生初步结合后，结构域i 与结构域i i 和结构域i i i 发生移位，随着i 区的o 【一螺旋束在细胞膜表面的展开，疏水的a4 - l o o p - 。( 5 发夹结构插入到细胞膜中间，a4 面向孔道的腔面，0 【5 面向疏水的脂质界面，同时其它的两亲螺旋分布在细胞膜的表面，若干发夹结构在细胞膜内通过o c5 发生寡聚化，这样便使在细胞膜上形成了孔道。一般认图3i c p s 插入质膜的两个模型f i g 3t w ok i n d so f m o d e lf o ri n s e r t i o no f i c p si n t ot h ei n s e c tp l a s m am e m b r a n e “铅笔刀”模型( t h e “p e n k n i f e ”m o d e l ) ；b “伞”模型( t h e “u m b r e l l a ”m o d e l )1 4为，。【5 对于发生寡聚化是很关键的，而o 【4 对于形成功能性孔道是非常必要的“。此外，h o d g m a n 等提出的“铅笔刀模型”认为，旺5螺旋和。【6 螺旋像打开的铅笔刀一样从结构域i 中伸出，插入脂双层膜，这一模型不需要结构域i 中其它c c 螺旋的重排，离子通道由多个