（微生物学专业论文）类细菌素生产菌ll184的固定化培养研究.pdf

四川大学硕士学位论文 6 5 抗菌谱分析5 2 7l l l 8 4 所产抑菌活性成分5 2 7 1 硫酸铵沉淀5 2 7 2s e p h a d e xg 一1 0 0 柱层析5 3 讨论5 4 1 固定化菌生产类细菌素5 4 2 抗菌效价的定义5 4 3 抑菌物质的初步定性5 4 4 关于l l l 8 4 所产类细菌素5 5 小结5 6 参考文献5 7 致谢6 1 发表论文及获奖情况6 2 声明6 3 图形目录 研究论文 图1 p c r 产物的电泳结果4 0 图2 p e r 产物纯化后的电泳结果4 1 图3 两性霉素b 标准曲线4 4 图4 枯草芽孢杆菌生长曲线4 4 图5 海藻酸钠浓度对固定化细胞产类细菌素效价的影响4 5 图6 时间对固定化菌产类细菌素的影响4 6 图7 p h 值对固定化菌产类细菌素的影响4 7 图8 温度对固定化菌产类细菌素的影响4 7 图9 供氧量对固定化菌产类细菌素的影响4 8 图1 0 接种量对固定化菌产类细菌素的影响4 8 i l l 四川大学硕士学位论文 图1 1 固定化细胞与游离细胞产类细菌素效价的比较 图1 2 类细菌素对蛋白酶k 的敏感性 图1 3 类细菌素对溶菌酶的敏感性 图1 4 硫酸铵饱和度对提取抗菌蛋白及活性的影响 表格目录 研究论文 表1 l l l 8 4 菌株的生理生化特征 表2 两性霉素b 标准曲线的测定结果 表3 c a c l ：浓度对固定化小球菌落数的影响 表4 l l l 8 4 所产类细菌素的热稳定性 表5 不同p h 对发酵液抑菌活性的影响 表6 固定l l l 8 4 的抗菌谱 弱 昌；钙钙n n 娩 四川i 大学硕：t 学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在导师指导下取得的，论文成 果归四川大学所有，特此声明。 四川大学硕士学位论文 类细菌素生产菌l l l 8 - 4 的 固定化培养研究 微生物学专业 研究生：马莉指导教师：胡承 摘要 从四川某酒厂采集的酒糟和酒糟浸出液为样本中筛选得到一株对多种革 兰氏阳性指示菌、革兰氏阴性指示菌及部分霉菌具有广谱抗菌活性的类细菌素 产生菌，菌株编号l l l 8 4 。经形态观察及生理生化实验和1 6 sr d n ap e r 扩增 和序列测定，鉴定该菌为枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 。 由于游离发酵等传统的微生物发酵法存在着局限性，近2 0 年来固定化技 术已经得到广泛的关注，固定化方法具有菌体密度高，反应快，抗干扰能力强， 可缩短发酵周期，提高转化率，节省人力、物力以及产物分离方便，菌体可重 复连续使用的优点。本文以海藻酸钙为材料，固定枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) l l l 8 4 ，研究不同的固定化小球制备对类细菌素效价的影响。结果表 明，利用3 海藻酸钠在2 c a c l 2 条件下，得到固定化细胞颗粒的类细菌素效 价和稳定性较好，可维持2 1 6 h 无破裂。 通过单因素法对其固定化菌进行发酵条件的研究发现，当培养温度为3 7 ，p h 值6 5 ，接种量1 ，培养时间7 2 h 静止培养后，固定菌所产类细菌素 的抑菌活性高，最高效价能达到3 3 4 2 u m l 。 对固定化枯草芽孢杆菌l l l 8 4 进行半连续培养的研究，结果表明通过 2 1 6 h 三批次循环的半连续培养，固定菌活性能维持在2 6 0 9u m l 以上。对该 类细菌素生物学特性进行初步研究，用蛋白酶k 、溶菌酶处理发酵上清液后， 该类细菌素对蛋白酶k 部分敏感，对溶菌酶不敏感：经高温处理一定时间后抑 四川大学硕士学位论文 菌活性保持较完整，证明其热稳定性较高：抑菌活性d h 范围是4 5 8 5 。 对固定化菌所产类细菌素进行了抗菌谱分析，实验表明该类细菌素对大多 数植物病原真菌、多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较好抑菌作用。经 过对固定化菌发酵上清液进行了盐析、透析和s e p h a d e x6 - 1 0 0 柱层析后发现， 该抑菌活性的主要成分为蛋白类物质。 经本文研究发现，应用固定化方法生产类细菌素发酵结果好，显示了良好 的应用潜力，所产类细菌素具有成为天然防腐剂的潜能。 关键词：枯草芽孢杆菌类细菌素海藻酸钙固定化细胞发酵条件 抑菌活性 2 四川大学硕士学位论文 s t u d yo nb a c t e r i o c i n - l i k es u b s t a n c e f e r m e n t a t i o nb yi m m o b i l i z e d b a c i l l u ss u b t i l i sl l l 8 4 m a j o r ：m i c r o b i o l o g y p o s t g r a d u a t e ：m al i t u t o r ：h uc h e n g an o v e lb a c t e f i o c i n l i k e p r o d u c i n gs t r a i nw a ss c r e e n e da n di s o l a t e df r o m m a t u r ea l c o h o ld i s t i l l e r yg r a i na n dy e l l o ww a t e rs a m p l e s t h es t r a i nw a si d e n t i f i e d a sb a c i l l u ss u b 打l i s b yp h y s i o l o g i c a l b i o c h e m i c a lt e s t i n g ，a n dm o r p h o l o g i c c h a r a c t e r i s t i c s t h e1 6 sr d n ag e n eo ft h es t r a i nw e r ea m p l i f i e db y p c r ，a n d s e q u e n c e d i tw a sn a m e du 1 8 4 i m m o b i l i z e dc e l l sh a sm a n ya d v a n t a g e so v e rf r e e c e l l c u l t u r e s ，i n c l u d i n g h i g h e rp r o d u c t i v i t ya sar e s u l to fh i g hc e l ld e n s i t i e s ，l o n g - t e r mo p e r a t i o n a ls t a b i l i t y , i m p r o v e dp r o c e s sc o n t r o l ，p r o t e c t i o na g a i n s tc o n t a m i n a t i o n ，a n di m p r o v e dp l a s m i d s t a b i l i t y t h ea t t e m p t sw e r em a d et op r o d u c eb a c t e r i o c i n l i k es u b s t a n c eb y i m m o b i l i z e dc e l l so fb a c i l l u ss u b t i l i sl l l 8 - 4e n t r a p p e di nc a l c i u ma 垮h a t e b e a d s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei m m o b i l i z e dc e l lb e a d sw e r ei n t a c tf o r2 1 6 h r u n d e r3 o fc a l c i u ma l g i n a t ei n2 c a c l 2s o l u t i o n t h ep h y s i c a ls t a b i l i t yo fb e a d s w a si m p r o v e d a n dt h e f o l l o w i n gf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r et h e b e s tf o r i m m o b i l i z e dc e l lt o p r o d u c e b a c t e r i o c i n l i k es u b s t a n c eo ft h e h i g h e s t a c t i v i t y ：c u l t u r et e m p e r a t u r ea t3 7 c ，p h6 5 ，1 i n o c u l a t i o nq u a n t i t y , i n c u b a t e d7 2 h c u l t u r et i m ea n dv a l e n c ea s3 3 4 2 u m l t h ec o n c e n t r a t i o no fb a c t e d o c i n l i k e p r o d u c e dd u r i n gt h et h i r dc y c l e si n c r e a s e dt o2 6 0 9 u m lp r i m a r ys t u d yo f b i o l o g i c a lp r o p e r t i e so fs u c hs t r a i ni n d i c a t e dt h a ts u c hs t r a i np a r t i a ls e n s i t i v et o p r o t e i n a s ekt h i sk i n do fb a c t e r i o c i n l i k es u b s t a n c eh a sh i 。g hh e a ts t a b i l i t y b a c t e r i o s t a s i sa c t i v i t yp hr a n g e db e t w e e n4 5t o8 5 b l sp r o d u c i n gs t r a i n sw e r ed e t e r m i n e du n d e rc o n d i t i o n se l i m i n a t i n gt h e 3 婴型查量塑主竺竺笙苎 e f f e c t so fo r g a n i ca c i d sa n dh y d r o g e np e r o x i d e a sar e s u l t ，t h i s i n h i b i t o r y s p e c t r u mw a so b t a i n e db yt h ew e l l d i f f u s i o na s s a y i te x h i b i t e dab r o a ds p e c t r u mo f a n t i m i c r o b i a l a c t i v i t yi n c l u d i n ga g a i n s tv a r i o u sp l a n tp a t h o g e n i cf u n g i t h e b a c t e r i o s t a s i sa c t i v i t ys u b s t a n c ew o u l db eak i n do fp r o t e i n t h ef e r m e n t a t i o nr e s u l t sa l ed c s k a b l e ，a n di ts h o w sa l la b r o a dp r o s p e c to f a p p l i c a t i o n s t h i s b a c t e r i o c i n - l i k es u b s t a n c e m i g h tb eu s e f u la san a t u r a l p r e s e r v a t i v e k e y w o r d s ：b a c i l l u ss u b t i l i s ；b a c t e r i o c i n - l i k e s u b s t a n c e ；c a l c i u m a l g i n a t e ； i m m o b i l i z e dc e l l ；f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ；b a c t e r i o s t a s i sa c t i v i t y 4 四川大学硕士学位论文 综述 固定化菌发酵生产类细菌素的研究进展 引言 早在1 9 世纪初叶，人们发现，某些微生物细胞具有一种吸附在固体物质表 面的天然倾向和特殊功能，并以这种方式被束缚，固定起来。当时，曾利用这种 方式被吸附的微生物细胞，在滴滤反应系统内生产醋酸“。此后，有人将类似 的方法用于污水处理。1 。从6 0 年代开始，国际上固定化酶的研究迅速发展起来， 到7 0 年代，作为酶源的微生物菌体本身的固定化，即固定化微生物，也引起了人 们极大的注意。 所谓固定化技术，是指利用化学或物理手段将游离的细胞( 微生物) 或酶， 定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术“3 。包括 固定化酶技术和固定化细胞技术。生物细胞固定化技术是指利用化学或物理的 手段将微生物自然固定或定位于限定的空间区域内，保持其固有的催化活性， 并能反复使用。固定化生物细胞能持续增殖、休眠及衰亡，其活性始终保持稳 定。固定化的生物细胞除保持其原有的识别、结合和催化活性外，还具有易 于分离、可重复使用及稳定性提高等显著的优点。自从固定化技术问世以来， 固定化技术正在以空前的向前发展，并不断完善。如今已涉及到酶固定化，细 胞( 微生物，动物，植物) 固定化，原生质体固定化，其固定方法也是多种多 样，包括吸附法样，包括吸附法、包埋法、结合法、交联法以及后来出现的无 载体固定法等。但是目前研究较多的是包埋法固定化技术，且其应用也比较成 熟。包埋法是将酶或细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化酶或细胞的方法。 根据载体材料和方法的不同，分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。凝胶包埋法是 将细胞包埋在各种凝胶内部的微孔中而使细胞固定的方法。半透膜包埋法是 将细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内而使细胞固定的方法。 1 固定化细胞的制备方法 固定化细胞的制备方式是多种多样的，任何一种限制细胞自由流动的技术， 5 四川大学硕士学位论文 都可以用于制备固定化细胞，国内外不同的研究工作者用不同的分类方法，因 此，很难对此作出精确的分类。一般来说大致可以分成吸附法、共价结合法、 交联法和包埋法等4 大类，其中以包埋法使用最为普遍。 1 1 吸附法 很多细胞都有吸附到固体物质表面，或其他细胞表面的能力，这种吸附能 力可以是天生具有的，也可以是经过处理诱导产生的，依靠这种吸附能力，人们 发展起许多廉价而又有效的固定化方法。吸附法可分为物理吸附法和离子吸附 法，前者是使用具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维 素等吸附剂将细胞吸附到表面上使之固定化。这是一种最古老的方法，操作简 单，反应条件温和，载体可以反复利用，但结合不牢固，细胞易脱落。后者根据细 胞在解离状态下可因静电引力( 即离子键合作用) 而固着于带有相异电荷的离 子交换剂上，如d e a e 一纤维素、d e a e s e p h a d e x 、c m 一纤维素等。利用细胞的表面 吸附能力，早在1 8 2 0 年，就有人用此法由酒精生产“速酿酸”。接下来有人用此 生产啤酒、酒精、生化药物和用于污水处理等方面。 1 2 共价结合法 共价结合法是细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成 化学共价键连接，从而成为固定化细胞。该法细胞与载体之间的连接键很牢固， 使用过程中不会发生脱落，稳定性好，但反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛 刻。有人用此法将卡尔酵母固定在已活化的多孔玻璃珠上“1 ，虽然细胞已经死亡， 但仍然保留生产尿酐酸的活性。利用此法制备的固定化细胞，细胞大多死亡。 1 3 交联法 交联法与共价结合法一样，都是靠化学结合的方法使细胞固定化，但交联 法所采用的载体是非水溶性的。如采用戊二醛或偶联苯胺等带有两个以上的多 功能团交联剂与细胞进行交联，可形成固定化细胞，但反应条件激烈，对细胞活 性影响大。千烟一郎曾用此法制得具有天门冬氨酸活力的固定化大肠杆菌细胞 ，也有人用此法制得具有葡萄糖异构酶活力的固定化细胞。 6 四川大学硕士学位论文 1 4 包埋法 包埋法是细胞固定化最常用的方法。按照包埋系数的结构可分为凝胶包埋 和微胶囊法，即将细胞包裹于凝胶的微小格子内或半透膜聚合物的超滤膜内， 该方法操作简单，对细胞活性影响较小，制作的固定化细胞球的强度较高，目前 被广泛地用于废水处理。 目前工业应用上以凝胶包埋法固定细胞最为广泛，主要是它具有以下特 点：1 、方法简便，将细胞与单体或聚合物一起聚凝，细胞被包埋在形成的聚 合物之中。2 、条件温和，可选用不同的聚合物载体，不同的包埋系统和条件， 以保持细胞的酶催化活性。3 、细胞不易渗漏，稳定性好。4 、有较高的细胞容 量，聚合体中的细胞含量可达5 0 - 7 0 。 1 4 1 海藻酸钠( s a ) 包埋法 1 4 1 1 方法 将菌悬液加入海藻酸钠溶液中充分混匀，然后用注射器将其滴入一定浓度 的c a c l 。溶液中，得到白色小珠，将小珠浸泡在c a c l 。中于冰箱内过夜，滤出小 珠，洗净备用。 1 4 1 2 研究与发展 目前，由于u j 凝胶机械强度较好，内部成多孔结构，对生物的毒性较小， 其应用比较广泛，r j a m u n a ”1 等利用s a 固定枯草芽孢杆菌细胞，结果表明固定 化细胞在发酵产酶十次后，酶活都在2 5 0 u 左右。郝建平0 1 等用s a 固定柴胡细 胞，王克明。1 用s a 固定混合多菌种，都取得一定成功。 在固定化过程中，细胞包埋量、海藻酸钠浓度、小珠的直径大小对固定化 细胞的作用影响较大。曾胤新“”将5 m l 克鲁维酵母r 一8 5 细胞加到2 0 m l 2 的 s a 中，再滴入到4 的氯化钙溶液中，得到2 m m 左右的小珠，发现该法不仅制 作工艺简单，而且机械强度较好，酶活保留率较高，但经多次发酵后，凝胶小 珠体积膨大，颜色由白转为透明，机械强度明显降低，部分凝胶发生融化现象。 1 4 2 聚乙烯醇( p v a ) 包埋法 7 四川大学硕士学位论文 1 4 2 1 方法 将一定量的菌悬液与p v a 混匀，倒平板，) j n n 饱和硼酸溶液，置冰箱内静 置过夜。用手术刀切成小块状，用无菌水洗净备用。 1 4 2 2 研究与发展 由于p v a 具有高强度、化学稳定、强抗微生物分解性能、对微生物无毒、 价格低廉等优点。近年来获得较广泛的应用。 陈九武“”等用p v a 固定细胞比较发现p v a 的浓度为1 2 时固定化细胞相对 活性及细胞增殖情况较好。刘智敏“”等用p v a 固定枯草杆菌用于生产a 一淀粉 酶发现使用1 0 的p v a ，3 的硼酸，包埋菌量为4 一8 时p v a 凝胶机械强度大， 产酶能力高。由于p v a 凝胶颗粒具有非常强的附聚倾向，在制备珠体时比较困 难，吕晓猛o ”等通过加入s a 的方法来降低制备p v a 珠体的难度，研究结果表 明，在p v a 浓度为1 2 5 ，s a 为1 2 5 ，所用的氯化钙的浓度为4 ，固定4 8 h 后，制各的珠体效果较好。李峰“4 1 等也采用添加2 的s a 来包埋细胞，所用的 p v a 浓度为l o ，氯化钙的浓度为2 ，获得的小珠直径为3 m m ，包埋固定的小 珠具有较高的细菌活性，较好的强度及传质性能。钟娅玲“”对s a 的添加量对 p v a 珠体的影响进行研究，发现随着s a 添加量的增加，载体孔容增加，比表面 积增大，但其载体机械强度大幅度下降，但当s a 浓度为1 时，可在保证载体 在长期耐机械搅拌的同时增加载体表面积，增加孔容，改善传质效果。由于s a 不适宜含有磷酸盐缓冲液的反应体系，为此，童群义“6 1 等采用p v a 一卡拉胶混合 载体进行实验，研究发现在p v a 浓度为1 0 ，卡拉胶浓度为0 5 ，成型剂的p h 值为6 4 ，包埋菌体量为0 5 9 g ，固定时间为3 6 h 时，固定化细胞具有较好的 机械强度和较高的酶活力。陈敏“7 1 用p v a 加少量的活性炭进行固定化研究，发 现有助于颗粒成型，改善通透性，增加固定化颗粒的孔隙，达到吸附和包埋的 双重效果。黄霞“”等以p v a 一无纺布混合载体包埋固定化优势菌种用于降解吡 啶，喹啉，异喹啉，结果表明，经固定化细胞处理8 h 后，三种有机物的去除 率均达9 0 以上。取得较好效果。 1 4 3 聚丙烯酰胺包埋法 8 四川大学硕士学位论文 1 4 3 1 方法 先配制一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙稀酰胺( b i s ) 的溶液，与一定浓 度的细胞悬浮液混合均匀，然后加入一定量的过硫酸铵( a p s ) 和四甲基乙二 胺( t e m e d ) ，混合后让其静置聚合，将凝胶块用手术刀切块，获得所需形状的 固定化细胞胶粒。 1 4 3 2 研究与发展 用聚丙烯酰胺凝胶制备的固定化细胞机械强度高，可通过改变丙稀酰胺的 浓度以调节凝胶的孔径，适用于多种细胞和酶的固定化，但是由于丙烯酰胺单 体对细胞有一定的毒害作用，因此用它作为包埋剂的研究较少。 1 4 4 明胶包埋法 1 4 4 1 方法 配置一定浓度的明胶悬浮液，加热灭菌后，冷却至3 5 c 以上，与一定浓度 的细胞悬浮液混合均匀，倒入光滑的培养皿中，置冰箱内冷凝2 h ，取出凝胶， 将其浸泡于戊二醛的生理盐水中1 5 h ，再取出切割成1 2 m m 的颗粒，将凝胶 颗粒置于戊二醛生理盐水静置1 5 h ，滤出备用。 1 4 4 2 研究与发展 曾胤新“对各种包埋剂固定化细胞产酶的效果进行比较，发现1 0 的明胶 是较好的载体，不但制作工艺较为简单，而且机械强度好，该细胞产的酶活保 留率较高，最适温度及稳定性也有所提高。陈少欣“”选择明胶、s a 、壳聚糖为 固定化载体包埋产b 一半乳糖苷酶的嗜热脂肪芽孢杆菌细胞，合成低聚半乳糖， 发现明胶包埋法不仅方法简单，而且产率和所产酶的酶活力都比较高，固定化 后在反应条件和热稳定性方面都比游离细胞好，适合用于固定嗜热脂肪芽孢杆 菌生产g o s 。该实验对细胞负载量和戊二醛浓度作了研芽孢杆菌生产j k 6 。该 实验对细胞负载量和戊二醛浓度作了研究，发现酶活力随着细胞含量增大而提 高。但当细胞负载量达到5 9 l g 时，酶活力略有下降，可能是细胞负载量过大， 使得载体强度不够，细胞反而容易泄漏的缘故。戊二醛浓度对酶活力也有一定 9 四川大学硕士学位论文 的影响。在戊二醛浓度低于0 2 5 时，酶活力和载体的机械强度随着浓度增加 而增大，但进一步增加会导致酶活力下降，这是因为酶分子活性基团被戊二醛 过多地修饰，因此最适戊二醛浓度为0 2 5 ，而文新民用明胶固定果胶酶时发 现用1 5 的明胶，5 的戊二醛，酶量5 ，在p h 值为3 5 时，固定化效果较好。 1 4 5 卡拉胶包埋法 1 4 5 1 方法 用生理盐水配制一定浓度的卡拉胶溶液，灭菌冷却至4 5 c 后与适量菌丝混 合，冷却凝固后，放入2 8 c 恒温箱中干燥5 h ，切成小块，置于2 k c l 溶液中 硬化过夜。 1 4 5 2 研究与发展 王永华乜0 1 等用卡拉胶包埋乳酸乳球菌y 一7 2 ) 生产乳链菌肽，取得一定成果。 石屹峰“”用渗透交联法对k 一卡拉胶固定化细胞进行改进，将包埋菌在p h 7 0 磷酸盐缓冲液中( 5 c ) ，先后2 乙烯多胺处理l o m i n ，再加2 戊二醛处理3 0 m i n ， 发现经反应后，酶学性质得到改善，而且固定化小球的机械强度也提高了。 2 固定化细胞载体的特性 人们对一种较为理想的固定化载体有以下5 个要求：a 具有高的载体活性。 即固定化酶或微生物的活性回收率要高b 材料容易获得：c 价格便宜：d 操 作制备方便，能适用于大规模生产：e 有较高的机械强度，能较长时间使用和重 复使用。目前，所采用的载体主要有以下几种：琼脂、明胶、海藻酸钙( 简称s a ) 、 聚乙烯醇( 简称p v a ) 和丙烯酰胺( 简称a c r m ) ，其性能比较如表1 。 ( 1 ) 在5 种包埋剂中，琼脂机械强度极差，无实际工程应用价值。 ( 2 ) a c r m 凝胶中未聚合的单体对生物有毒，且在聚合过程中发热，对细菌杀 伤大：传质性能较差，固定化细胞小球内的微生物增殖不好：固定操作不易。 ( 3 ) 明胶强度较低，内部结构密实，传质性能较差。 ( 4 ) s a 凝胶和p v a 凝胶，机械强度较好：电镜观察表明内部呈多孔结构，对生 物的毒性小，固定操作容易。 四川大学硕士学位论文 表1 固定化载体的性能比较 载体s ap v a 明胶琼脂 a c r m 强度 较好 好较差差 好 传质性能较好好差差差 耐生物分解性较好好差无好 对生物性无适中无无强 固定难易易易 易 易较难 价格较贵 便宜 较贵 便宜贵 对s a 凝胶和p v a 凝胶进一步的研究表明，p v a 凝胶的机械强度优于s a 凝胶，但 s a 凝胶的传质性能比p v a 凝胶好。现阶段，有学者成功地运用了以p v a 为载体 主要成分，适量添加少量海藻酸钠和活性炭。2 ”1 ，其优点是可克服两液滴粘连现 象，有助于颗粒成型，改善通透性，增加固定化颗粒的孔隙，达到吸附和包埋的 双重效果。另有学者采用无纺布一p v a 复合载体对优势菌种进行包埋固定降解 有机物，取得了理想的效果。 3 固定化细胞成型机械类型 固定化细胞在工业应用上已越来越广泛，由于用人工切块或其他方法制造 的固定化细胞颗粒不均匀，且当工业规模应用时，其劳动强度大，不利于提高 生产效率。因此，为满足生产实际对均一，球形固定化颗粒的大量需求，大规 模的固定化细胞成型机械的研究变得十分迫切。从目前国内外的研究来看，固 定化成型机械主要采用包埋法原理进行设计，用于生产胶粒的主要手段基于下 列三种机理：滴落法、挤出法、分散法。 3 1 滴落法 该法主要起源于海藻酸钙凝胶的制备，由于海藻酸胶遇c a 2 + ，即成规则球 形，且球体在一定范围内不受滴落高度、速度及接触溶液浓度的影响，故制备 海藻酸钙球形凝胶常用滴落法固定化，这种装置放大简单，一般是增加针筒， 漏斗等滴落装置的数量，滴落的方式为调节滴落速度，分为重力式、气压式和 往复液压式。 1 1 四川大学顽士学位论文 3 2 挤出法 该法主要通过对生物催化剂和凝胶混合物射流进行断裂形成均匀微滴，落 入适当的接触溶液，形成凝胶，根据挤出方式的不同，分为共振挤出法，旋转 挤出法。 3 3 分散成型法 该法主要基于水和许多有机溶剂不相溶，即溶液使水在有机溶剂中分散成 液滴。当细胞和聚合物单体或某些聚合物溶液在有机溶剂中进行聚合或凝聚 时，即可制备成珠形固定化细胞。 以上几种成型机械，各有优缺点：滴落法装置放大有困难效率就较低，不 适合大规模使用；分散法，装置生产能力有限，且不能连续化生产，只能适合 于某些特殊体系；挤出法，共振挤出法所需的共振产生设备复杂，昂贵，制造 成本高，操作要求高，而相对而言，采用旋转挤出法原理设计的成型机械设计 新型、简单、操作方便，且适合于多种体系。 4 固定化细胞技术的应用 目前，固定化细胞技术已经在工业，医学，化学分析，环境保护，能源开发及 理论研究等方面得到了广泛的应用。 4 1 固定化细胞处理含苯酚等芳香族有机废水的研究 4 1 1 苯酚的降解 a n s w l m o 等 2 4 研究了用琼脂、海藻酸钙、卡拉胶和聚乙烯酰胺等载体包 埋固定化微生物降解苯酚。随后，他们又以聚氨酯泡沫为载体固定镰刀菌 f u s a r i u m s p 菌丝体，在完全混合器中降解酚。结果表明，与游离菌相比，固定化 细胞降解苯酚的速率要大得多，且固定化细胞生物产量低。 4 1 2 芳香族类化合物的降解 s h r e v e 等利用固定化假单胞菌降解甲苯，研究了固定化细胞生长和底物 降解过程动力学，并与游离细胞进行了比较，结果表明，固定化细胞体系的半饱 1 2 四川大学硕士学位论文 和常数( k s ) 增加了3 0 倍，细胞的最大比生长( u m ) 降解了2 倍。 4 2 固定化细胞处理农药、杀虫剂废水的研究 陈敏等”利用聚乙烯醇包埋活性炭和微生物的固定化技术对有机磷农药 水胺硫磷的降解进行了试验研究，结果表明，经固定的微生物对温度、p h 值和 水样水胺硫磷浓度的适应范围扩大，在3 个月的连续试验中，若水样初始c o d 浓度为1 3 0 0 2 5 0 0 mg l ，停留时间2 4 h ，在恒温摇床( 3 0 ，1 5 0r m i n 。1 ) 内降解，其去除率为5 5 一7 0 9 6 。 4 3 固定化细胞处理印染废水和硝化、反硝化作用研究 韩树琴。”等曾利用蜡状芽孢菌固定化细胞对染料酸性红进行了脱色研究。 刘志培等“7 3 分别采用多孔硅酸盐材料吸附固定化和聚乙烯醇包埋固定化混合 菌细胞，进行了印染废水脱色的研究，并取得了较高的使用价值。 5 固定化细胞技术的应用前景与展望 固定化细胞自问世以来，其应用己涉及到食品“、化工、医药0 1 、化 学分析、环境保护和能源开发等各方面，显示出广阔的发展前景。归纳起来主 要包括： i ) 产各种胞外产物，这些胞外产物包括酒精o “，氨基酸，有机酸，酶 和辅酶。1 ，抗生素。“，还可用于废水处理m 1 。 2 ) 用于与各种电极制成微生物电极。 目前，由于固定化细胞技术不够成熟，在固定化细胞的包埋材料的有无毒 性及某性能，固定化细胞的强度及无杂菌性等方面还存在不足，固定化细胞技 术主要用于污水处理。要将固定化技术更好地用于生产食品，药品等方面，就 必需研究出更多更好的无毒价廉的包埋材料，不断探索出提高固定化细胞强度 的方法。现在，在这些方面已取得一定进展，在有些领域已将固定化技术应用 于工业生产。随着固定化细胞技术的不断成熟，将更好地服务于更多的领域。 6 类细菌素的研究背景 四川大学硕士学位论文 随着经济与社会的不断发展，人们的生活水平也不断提高，人们对食品提 出了更高的要求。人们越来越追求方便、快捷、安全、健康的食品，为此，食 品加工业迅速发展。食品工业发展的关键问题之一就是食品的安全与卫生问 题。食品防腐剂一般分为人工合成防腐剂( 无机防腐剂、酸性防腐剂和脂性防 腐剂) 和天然防腐剂( 植物性来源、动物性来源和微生物性来源) 两大类m 1 。 目前我们国家批准使用的防腐剂有3 2 种，生产能力最大的是苯甲酸和山梨酸 两个品种。在食品工业中主要使用的防腐剂还是人工合成防腐剂，包括无机 防腐剂类的二氧化硫，亚硫酸及其盐类，硝酸盐类，亚硝酸盐类；酸性防腐剂 的苯钾酸及其盐类，山梨酸及其盐类，丙酸盐类；脂性防腐剂的对羟基苯甲酸 脂类。 防腐剂在食品加工后是作为食品的一个组成成分被人体无选择的摄取，已 知的人工合成防腐剂对人体均有一定的毒性1 。如亚硝酸盐对人的半致死量为 3 2 m g k g 体重。苯甲酸公认毒性较大，有很多国家已经禁止使用“。对羟基苯 甲酸脂类的用量一般在0 1 2 9 k g 食品”1 。山梨酸是公认的无毒防腐剂，但是 如果过量摄入，也会影响人体的正常代谢。 随着科学技术的进步和检测分析手段的完善，过去认为安全的一些人工合 成防腐剂被发现有致癌或潜在致癌的可能性，如硝酸盐和亚硝酸盐在消化系统 中可与脯氨酸形成强致癌剂n 一亚硝胺类物质。 人工合成防腐剂的特性决定了它们的使用局限性，如苯甲酸和山梨酸类防 腐剂只能在较低p h 环境下( p h 5 6 以下) 才具有较大的抑菌作用，在碱性条 件下溶解度降低，抑菌效果减弱”。对羟基苯甲酸脂类( 尼泊金脂类) 的抑菌 作用随着醇链的增加而增加，但是溶解度却随醇链长度的增加而减少，在食品 体系中，微生物仅仅出现在水相中，因此一般将几种脂类混合使用，以提高溶 解度，增强抑菌性。 另外，在常规的使用量下，某些防腐剂对食品的风味有一定的影响，如苯 甲酸的允许使用量为0 0 5 o 1 ，而入的味感阈值为0 0 5 0 0 8 ，致使这 些人工合成防腐剂的用量受到食品种类的限制，难以满足现代食品工业的需 要。此外，目前的人工合成防腐剂抗菌能力有限，使用范围有其局限性，己经 越来越不能满足食品工业的需求。因此，寻找高效、安全、稳定的天然防腐剂 1 4 四川大学硕士学位论文 已成为食品科学研究的热点之一。 关于类细菌素的研究就是在这种背景下开展起来的。 7 天然防腐剂的发展 随着研究的深入，被揭示的天然抗菌物质越来越多。根据天然防腐剂的来 源，可将其分为三类：来源于植物的天然防腐剂，来源于动物的天然防腐剂， 来源于微生物的天然防腐剂。 7 1 来源于植物的天然防腐剂 天然食用香料植物中提取天然防腐物质，如从紫苏、月桂、芥菜籽、丁香、 茴香、肉桂、小豆蔻、芜荽、众香子、百里香、甘牛至等天然食用香料植物中 提取的精油都有抗菌作用 4 t j 。也可以从天然香辛料中提取天然防腐剂，如大蒜、 花椒、生姜、辣椒、黑胡椒、洋葱、肉豆蔻、山芊菜等辛香料，均有天然的抗 菌作用，以乙醇为溶剂的辛香料提取物对多种细菌均有强烈的抑制作用，认为 其辛辣成份是抗菌的有效成份“。 我国具有丰富的中草药资源和悠久的中医药历史，因此从中草药中提取天 然防腐剂是一个极具前景的研究方向，中草药以其独特的理念及对疾病的独特 疗效而倍受世人的关注，其有效性与安全性在漫长的历史中得到了证实：将中 草药用作食品防腐剂，不仅可以避免化学防腐剂的毒性危害，而且还可以赋予 食品独特的风味，是一种深受消费者欢迎的，具有广阔前景的新型天然防腐剂 范丽、马廉兰等人对近2 0 0 种中草药进行了抑菌试验，发现有1 0 0 多种中草药具 有抑菌作用，其抑菌范围广，对常见病原菌、白念球菌、伤寒和痢疾杆菌、耐 甲氧西林的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、黑曲 霉、黄曲霉、日本曲霉、杂色曲霉、产黄青霉、毛壳菌、弯孢霉、枝孢霉、桔 灰青霉、淋病球菌、新型隐球菌等等都有较强的抑制作用。目前中草药抑菌试 验中发现黄连的抑菌能力最强，其次为大黄、黄苓、大青叶、丁香、艾叶、鱼 腥草等，再其次为黄柏、玄参、连翘、知母、马鞭草、乌梅、白头翁、茵陈、 蒲公英等等“。 四川大学硕士学位论文 7 2 来源于动物的天然防腐剂 蜂胶是蜜蜂采集的植物树脂混入蜜蜂上颚腺的分泌物和蜂蜡等制成的一 种具有芳香气味的胶状固体物，蜂胶中含有丰富的具有药效的成份，有抗菌、 抗病毒、消炎、镇痛、促进组织再生、提高免疫功能等多种效用3 ，可以用来 做食品添加剂，改善食品的口味和色泽，增强食品的保健作用 4 5 o 溶菌酶作为 食品防腐剂常用于清酒、奶油、糕点等食品中，对大肠杆菌、普通变形球菌、 枯草杆菌、副溶血性弧菌有抑制作用“”，对可以由动物体中提取，可以由植物 中提取，也可以由微生物产生“”。抗菌肽是一类由数十个氨基酸残基组成的具 有抗菌作用的短肽“”。柞蚕抗茵肽的抗菌谱广，酸性条件下能够抑制革兰氏阳 性菌和阴性菌，其机理不同于一般化学防腐剂的抑菌而是杀菌，柞蚕抗菌肽被 人畜食用后易被体内的蛋白酶水解消化，对人体无毒副作用，是极有前途的新 型食品防腐剂“。此外，一些动物蛋白中均含有良好抗菌特性的天然防腐剂。 7 3 来源于微生物的天然防腐剂 7 3 1 细菌素天然防腐剂 微生物代谢产生的一些抗菌物质，主要是一些有机酸、多肽或前体多肽， 其作用机制主要是在细胞膜上形成微孔，导致膜通透性增加和能量产生系统破 坏，从而抑制微生物生长“。细菌素是某些细菌通过核糖体合成机制产生的一 类对同种或近源种具有抑菌活性的蛋白质或多肽1 ，最早由g r a t i a 于1 9 4 6 年 对大肠杆菌的研究中提出，后来发现很多细菌都可以产生类似物质，j a c o b 于1 9 5 3 年将这类物质称为细菌素。乳酸链球菌肽( n i s i n ) 是乳酸菌细菌素的一 种，乳球菌乳酸亚种的某些菌株产生的一种小肽，亦称之为乳链菌肽或乳酸 链球菌素。由于它对革兰氏阳性菌，包括对造成食品严重危害的许多腐败菌 有强烈抑制作用，成为人们广为应用的一种天然食品防腐剂。目前国内外对 乳酸链球菌素( n i s i n ) 的研究较为深入并已经广泛应用，已经达到分子水平， 1 9 3 3 年，w h i t e h e a d 分离出这种物质，并证明它是一种多肽：1 9 4 7 年，m a t t i a k 和h i r s c h 证明该物质可抑制许多革兰氏阳性菌，因乳酸链球菌在分类上属血 清学n 群，故命名为n i s i n ：1 9 4 8 年，h o y g l e 和n i c h d s 预计从牛奶中分离到的 所有乳酸链球菌中大约1 3 会产生n i s i n ：1 9 5 1 年，h i r s c h 等人将n i s i n 用作 四川大学硕士学位论文 食品防腐剂，成功地控制了由产气梭状芽孢杆菌引起的奶酪腐败问题；1 9 5 2 年。c l i n t o c k 等人把产n i s i n 的乳酸乳球菌菌株直接加到酸奶中来控制由产气 梭状芽孢杆菌引起的膨胀腐败；1 9 5 3 年，乳酸链球菌素在用作食品防腐剂方 面获得发展的契机，乳酸链球菌素的第一批商业化制备物面市，n i s i n 作为商品 进入市场；1 9 6 9 年，f a 0 3 卧t o 联合食品添加剂专家委员会确认n i s i n 可作为食 品添加剂；1 9 7 1 年，g r o s s 和m o r e l l 阐明了n i s i n 分子的完整结构； 1 9 8 8 年，b u c h m a n 等克隆了编码n i s i n 前体的结构基因并测定了d n a 序列； 1 9 9 1 年，m u l d e r s 等发现n i s i n 有2 个天然变异体n i s i na 和n i s i nz 。 7 3 2 类细菌素天然防腐剂 细菌素有它的局限性，细菌素大多是由革兰氏阳性菌产生并抑制革兰氏阳 性菌，对大多数革兰氏阴性菌和真菌没有抑制作用”“，这限制了它的使用范围。 在人们对细菌素的研究过程中，陆续发现了另外一些拮抗物质，它们也是某些 细菌在代谢过程中由核糖体合成产生的一类具有抑菌杀菌作用的蛋白或多肽， 但是能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌“2 ”“，国外的学者于1 9 5 8 年正式将这类物质定义为类细菌素并对其展开了研究“1 。 7 3 2 1 类细菌素产生菌 在微生物中有很多种属的细菌都能产生类细菌素，目前报道的产类细菌素 较集中的有魔c j j w 、e n t e r o c o c c i 、s t r e p t o m y c e s 。1 9 6 2 年，b r a n d i sh ， b r a n d i su 报道在e n t e r o c o c c i 中发现类细菌素。1 9 6 4 年，r o e l a n t sp ，n a u d t s f 报道在s t r e p t o m y c e sv i r g i n i a e 中发现类细菌素。1 9 7 4 年，d eb a r j a ch ， l a j u d i ej 报道在b a c i l l u st h u r i n g i e n s j s 中发现类细菌素侧。1 9 7 5 年， y a m a m o t ot ，i m a is ，报道在o r a ls t r e p t o c o c c i 中发现类细菌素呻1 ，1 9 7 7 年，a r a k e l o v ava 报道在p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 中发现类细菌素，1 9 7 8 年，g r o s sdc ，v i d a v e rak 报道在r h i z o b i u mj a p o n i c u m 中发现类细菌素“。 1 9 7 9 年，n e t y k s ae m ，s m i r n o v at a ，报道在b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s 中发现 类细菌