（微生物学专业论文）产几丁质酶酵母的筛选、鉴定及其酶学性质研究.pdf

摘要 目的： 广泛筛选、鉴定产几丁质酶酵母，对其产生的胞外几丁质酶进行分离、纯化及性质 研究，为进一步研究其在果蔬采后真菌病害防治中的应用提供科学依据。 方法： 利用几丁质作唯一碳源的选择培养基，从土壤、水果果实表面以及实验室保存的菌 种中筛选产几丁质酶酵母；通过透明圈法和d n s 比色法，筛选出酶产量较高的菌株进行 鉴定及酶纯化研究；观察该酵母菌株个体和群体培养特征，利用常规方法进行部分生理 生化特征鉴定，并以2 6 sr d n a 序列为基础分析该菌株与其他模式菌株的相似性及同源 关系，综合这几项特征对该酵母菌进行鉴定；利用硫酸铵盐析、d e a e 一纤维素f d e 3 2 1 柱层析、s 印h a d e xg 1 0 0 柱层析对该酵母产生的胞外几丁质酶进行纯化，结果用 s d s p a g e 验证；利用常规实验方法研究该酶的基本性质，并研究其在平板实验上对供 试病原菌的拮抗活性。 结果： 1 利用几丁质作唯一碳源的选择培养基，分离出9 株产几丁质酶酵母菌( 依次编号 为c y - 1 c y _ 9 ) ，发现c y - 6 菌株产酶能力最强，其发酵液酶活力达2 4 1 u m l 。 2 ，通过观察c y 6 菌株个体和群体培养特征，进行部分生理生化特征鉴定，发现该 菌株的表型特征与陆生伊萨酵母( 地盘把 p n 埘膪f c o 肠) 最为接近。以2 6 sr d n a 的 d 1 仍2 区域为基础，分析该酵母菌与其他模式菌株序列的相似性并构建系统发育树，发 现该菌株与陆生伊萨酵母( 上招，f c o 缸) 相似性大于9 9 ，且在系统发育树中聚成一亚 分支。综合其形态培养特征、生理生化特征及2 6 sr d n a 序列分析结果，将该酵母鉴定 为陆生伊萨酵母( 上胞f c d ，口) 。 3 以不同的诱导物诱导该酵母产酶，结果表明胶体几丁质的诱导效果最好。通过纯 化得到一条分子量约为4 2 4 k d 的酶带，其反应的最适温度和最适p h 分别为5 0 和7 o ， 以胶体几丁质为底物的砌z 和砌积分别为6 9 1 m g i n l 和1 2 9 5 砌o l m i n 。 4 抗菌实验显示，用纯化后的酶液对供试病原菌进行平板拮抗实验，发现该酶对病 原菌菌丝的延伸有不同程度的抑制作用。 结论： 1 分离筛选出9 株产几丁质酶酵母菌，其中c y - 6 菌株产酶能力最强，其发酵液酶 活力达到2 4 1 u ，m l 。 2 综合c y - 6 菌株形态培养特征和生理生化特征，结合2 6 sr d n a 序列分析结果， 将该酵母鉴定为陆生伊萨酵母( z 糟f c d 胁) 。 3 纯化出该酵母菌产生的一种胞外几丁质酶，测得该酶的分子量为4 2 4 k d ，酶反 应的最适温度和最适p h 分别为5 0 和7 0 ，以胶体几丁质为底物的厨”和矿锄鼎分别 为6 9 1 m 咖l l 和1 2 9 5 姗o i n ，且该酶对几种供试病原菌有不同程度的抑制作用。 关键词：几丁质酶；陆生伊萨酵母；采后真菌病害； 抑菌机制 i i c o n c i u s i o n ： 1 s c r e e n e d9s t r a i n so fc l l i t i n a s e p r o d u c i n gy e a s t st o 【a 1 1 y ，a n d 缸1 eo n ec a l l e dc y _ 6h 0 1 d l e1 l i g h e s te n z y m ep r o p e r t i e s ( 2 4 1 “m l ) 2 t h ea c c e s s i o nn u m b e ro f 也e2 6 sr d n ad 1 d 2d o m a i nw eg o ti sd q 4 5 0 8 8 3 t h es 廿a i n w a si d e 埘f i e dt ob e 上槽f c d 胁b y 吐l es e q u e n c eo f2 6 sr d n ad 1 ，d 2d o m a i na n ds o m eo t l l e r b i o c h e m i c a lc k l r a c t e r i s t i c s 3 w ei s 0 1 a t e do n ek i n do f c h i t i n a s e 矗m 上胞r r f c o 肠i t sm o l e c u l a rm a s sw a se s t i m a t e dt o b e 曲o u t4 2 4 mb ys d s p a g e t h ec l l i t i i l a s e 砌i b i t e do p t i m mc 删”i ca c t i v 时a tp h 5 o a n d5 0 r e s p e c t i v e l y t h e 曲押a n d 砌z 锻v a l u e so fc h i t i n a s eo nc 0 1 l o i d a lc h m n 他r e 6 9 1 m 咖la n d1 2 9 5 舢o l m i n n e 出缸a s e 印p c a r e dt ob ea 埘矗m g a la c t i v i t ya g a i n s t t e s t e dp 础o g e n i c g u s ，e s p e c i a l y 出r 胛4 结口玎df d 碍印d r “ k e yw o r d s ：c 址i n a s e ；上把玎i c d 肠ipa _ m o g e i l i c 劬g io f p o s t h a n ，e s t 丘u i t s ；a n t a g o i l i s m i v 引言 1 引言 1 1 几丁质酶概况 几丁质( c h i t i n ) 又称甲壳素或甲壳质，是由卅乙酰一b d 一氨基葡萄糖以6 一l ，4 糖 苷键连接而成的高分子生物多聚体( g o m e se ta 1 ，2 0 0 0 ；吴东儒，1 9 8 7 ) 。在自然界中几 丁质贮量十分丰富，其产量仅次于纤维素，占天然聚合物贮量的第二位，是真菌、甲壳 类动物和藻类等生物的重要结构物质( 黄秀梨，1 9 8 9 ) ，同时还是昆虫中肠围食膜的主要 结构成分( b r a n d t ，1 9 7 8 ) 。天然状态的几丁质很少单独存在，通常与蛋白质或其它多 聚物结合成不溶解状态，难以被多数生物利用( 王十全等，1 9 9 4 ) 。 几丁质酶( c h i t i n a s ee c 3 2 1 4 ) 是一类能催化降解几丁质b 一1 ，4 糖苷键的水解酶， 广泛存在于各种微生物、植物和动物中，参与多种生理过程( s i m i ，1 9 9 4 ) 。几丁质酶 能够催化几丁质水解为几丁寡糖和n 一乙酰氨基葡萄糖( n a g ) 等，在自然界物质循环 中起着不可替代的作用。由于几丁质酶是几丁质生物降解过程中的关键酶，因此研究几 丁质酶不仅对几丁质资源的开发利用有重大意义，而且在植物病虫害防治领域也有着巨 大的潜在应用价值。 微生物是一类重要的产几丁质酶生物。自b e n e c k e ( 1 9 0 5 ) 首次分离到能够利用几 丁质作为营养物质的溶几丁质芽孢杆菌c 如c f f f 驸c 砌翻口v f 阳淞) 之后( 陈三风等，1 9 9 3 ) ， 人们便开始关注和研究微生物几丁质酶，并在植物保护、医药工业、基础生命科学等领 域发挥了重要作用。近年来，由于环境问题的日益严峻，传统化学杀菌剂缺点的日益突 出以及生物防治概念的提出，在真菌病害防治中微生物几丁质酶的作用逐渐受到人们的 重视。利用产几丁质酶拮抗微生物来防治真菌病害具有安全、有效、无毒等一系列优点， 在未来的农业生产中必将发挥重大的作用。 植物中也广泛存在着几丁质酶。在通常状况下植物体内的几丁质酶含量较低，当受 到病原菌侵染、乙烯及损伤等外界刺激后，植物体内的几丁质酶含量水平迅速提高( 韦 新葵等，2 0 0 2 ；赵和，2 0 0 4 ) 。在研究植物对各种病原微生物和化学物质处理的应答反 应中所产生的p r ( p a 也o g e n e s i sr e l a t e d ) 蛋白时，发现其中几丁质酶是重要成分之一， 这说明几丁质酶基因的表达是植物自我保护的表现( 赵和，2 0 0 4 ) 。理论上推测，如果 把外源几丁质酶基因克隆到植物体内，进一步增强植物的这种内源抗病机制，就可起到 防治真菌病害的作用，是一条植物真菌病害防治的新途径。目前，已有很多转几丁质酶 基因植物问世，表现出良好的抗病虫害效果。 1 引言 动物几丁质酶相对于微生物和植物几丁质酶而言，研究工作仅局限于产酶的动物种 类、酶的基本性质及酶的作用机理方面( 蒋红彬等，2 0 0 0 ) 。资料表明两栖类动物、鸟 类及昆虫等都能产几丁质酶，主要用于消化液、腺体、胃及肠粘膜。这表明几丁质酶来 源于动物本身，其重要作用是用于消化含有几丁质的猎物( 陈红，2 0 0 2 ) ； 1 2 微生物几丁质酶及其在植物真菌病害防治中的应用 1 2 1 产几丁质酶微生物种类 目前研究发现许多细菌、放线菌和真菌都能产生几丁质酶。据不完全统计，产几丁 质酶微生物约有4 6 个属近7 0 种，主要如下( j e s u se ta l ，1 9 9 2 ；f e l s ee ta l ，2 0 0 0 ；冯波， 1 9 9 8 ：徐同等，2 0 0 2 ) ： ( 1 ) 细菌 粘质沙雷氏菌( 聊砌m 口阳8 s c e 瑚) 、环状芽孢杆菌( 砌c f f 7 淞c 沁“陆n j ) 、地衣芽 孢杆菌( b c f f ? 淞，缸而8 m 咖r 聊妇) 、斯氏假单孢菌( n p “如m d 月娜s 护“船r f ) 、巨大芽孢杆菌 ( 肋c f f f 珊e 舶耙r j “m ) 、液化沙雷氏菌( & 舢打口，j g “向c f 8 5 ) 、液化肠杆菌( 勘f e 瑚6 钟据 脚“e 廊c 把m ) 、嗜水气单孢菌0 8 阳m o h 娜砂岫砷f 肠) 等。 ( 2 ) 放线菌 灰色链霉菌( & ，印加删c e s p ，f 阳f 郴) 、红色链霉菌( 胁印f d 哪7 c p sd ，f v 口c p o v f r 眺s ) 及其 它一些未定种的链霉菌( 勋印幻哪，c 甜印s _ 8 4 ) 。 ( 3 ) 真菌 绿色木霉( 开f c 矗d 出m 口v f ，j 出) 、哈茨木霉( 伽c d 出删口 们妇“m ) 、淡紫拟青霉 ( p 已栉f c 订f f 甜聊z f 加“研) 、枯草毛霉( 拙c d rj 甜6 f 玎泌砌驸) 、米曲霉( 一聊僖f ，f 淞以，) 彪d p ) 、 烟曲霉翻印p 曙f f f “s 扣朋国q f 埘) 、球孢白僵菌( 曰8 口“w ，抽6 跚缸 口) 、季也蒙假丝酵母 ( o n 确出f f f i 8 r 聊o ”击j ) 、橄榄假丝酵母汜口n 讲出o f p 叩 妇) 等。 1 2 2 微生物几丁质酶的诱导表达及理化性质 微生物几丁质酶是一类诱导酶，几丁质、可溶性的几丁质衍生物以及一些病原真菌 的细胞壁均可以诱导微生物产几丁质酶。不同的微生物具有不同的几丁质酶基因，即使 同一种微生物体内也会有不同的几丁质酶基因，这可能与生物进化过程中所处环境中几 丁质的结构、脱乙酰度以及与其它成分的连接方式有关，其诱导产生的几丁质酶也各不 相同。几丁质酶常以同功酶的形式分泌，相互有顺序地调节，构成了几丁质酶基因调节 的多样性( 肖湘等，2 0 0 3 ) 。通常同菌株能产生好几种几丁质酶，由不同的基因编码 2 引言 产生，或由相同基因编码的前体酶蛋白通过不同方式加工产生，相互之间差异较大，同 源性较低。虽然各种几丁质酶差异较大，但多数微生物几丁质酶都具有相似的结构域， 从n 端到c 端依次含有信号肽( s i g n a lp e p t i d e ) 、几丁质酶催化域( c a c a l y t i cd o m a i l l ) 、几 丁质结合域( b i n d i n gd o m a i n ) 以及一个短的c 端区域( 冯俊丽等，2 0 0 4 ) 。 微生物几丁质酶的多样性很丰富，其理化性质也有很大差别。不同微生物几丁质酶 分子量大都不同，但其分子量基本在2 0 1 8 0 k d 的范围内。微生物几丁质酶的最适温度 一般在4 0 6 0 之间，最适p h 常在5 左右。金属离子如f 矿、c a 2 + 、c u 2 + 、m 矿等对微生 物几丁质酶的活性也有影响，几丁质酶来源不同，其激活或抑制的程度也不一样。微生 物所产生的几丁质酶作用于底物的方式大多不同，按照初级产物类型和水解几丁质时酶 切位点的不同，可以将几丁质酶分为外切几丁质酶( e x o c l l i t i n s a s e ) 和内切几丁质酶 ( e n d o c l l i t i n s a s e ) 。前者指水解几丁质时持续作用于几丁质多聚物的非还原末端，释放 出几丁单糖；而后者是以随机的方式切割几丁质内部的糖苷键，其产物有几丁单糖、几 丁二糖和几丁寡糖等( f e i s ee ta l ，2 0 0 0 ) 。 1 2 3 微生物几丁质酶对植物病原真菌的作用机制 植物病原真菌是引起粮食、蔬菜、水果发生病害重要原因之一，它对寄主的侵染和 在其上的扩展主要通过菌丝大量生长来完成的。微生物几丁质酶对植物病原真菌具有明 显的拮抗作用，其可能的机制主要有以下几点： ( 1 ) 水解病原菌细胞壁 通过现代免疫化学技术观察到在真菌菌丝顶端及其侧壁里层有几丁质存在，几丁质 酶水解细胞壁中的几丁质组分抑制真菌孢子萌发和芽管伸长；通过降解菌丝末端新合成 的几丁质，破坏细胞新物质的沉积，阻碍菌丝延伸，达到抑制病原菌生长的目的( a r l o r i o m ，1 9 9 2 ；s e l a - b u u r l a g e ，1 9 9 3 ) 。 ( 2 ) 提高植物的防御能力 几丁质酶水解真菌菌丝细胞壁中的凡丁质组分产生几丁寡糖。几丁寡糖不仅能够抑 制病原物的侵入和扩展，阻碍病原物生长，而且在调节植物细胞代谢活动、提高植物防 御能力等方面具有很好的作用( 郭玉莲等，2 0 0 5 ) 。几丁寡糖可以作为激发子，在植物 防御反应中充当信号因子，迅速启动植物的防御反应，诱导植物细胞对病原菌入侵作出 反应，调节与抗病性及苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 等酶活性变化，产生植保素、酚类化合 物等抗菌物质，使植物体内病程相关蛋白含量升高，提高抗病性。 3 引言 ( 3 ) 与其它植物防御反应酶蛋白的协同增效作用 成熟真菌细胞壁中形成交错的几丁质一葡聚糖纤丝，且外面被有其它多糖及蛋白， 其他防卫蛋白( 如b 一1 ，3 一葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶等) 的存在可使微生物几丁质酶 与其水解底物更好的接触，提高生防效果( m e i r a ve ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 1 2 4 微生物几丁质酶在植物真菌病害防治中的应用 直接利用几丁质酶产生菌来防治植物真菌病害是传统生物防治的主要途径，几丁质 裂解菌有很多应用实例。目前利用产几丁质酶绿色木霉菌( zv f ，f 出) 、哈茨木霉菌( z 船蛔 “聊) 防治农作物菌核病( & k 阳砌洒矗西p 卯p ) 、立枯病( 胄厅咖c 向n 地j d f fm r ) 已 形成规模，表现出了一定的抑菌效果( 李华等，2 0 0 3 ) 。酵母菌几丁质酶的研究近年来 也逐步受到重视。范青等( 2 0 0 1 ) 报道利用毕赤酵母妒f c 办缸肼p m 6 m 船危c f p h jh a n s e 曲 和罗伦隐球酵母( c 仰幻c c 淞k “憎n f f fs k i m l e r ) 防治桃采后的真菌病害，发现这两种酵 母菌产生的几丁质酶对桃软腐病菌孢子的萌发有明显的抑制作用。 分子生物学的蓬勃发展使微生物几丁质酶用于植物病害生物防治的研究上升到了 基因工程水平。几丁质酶作为一种抗菌蛋白，是利用基因工程技术进行抗病育种的一个 理想的开发目标( 李君等，2 0 0 1 ) 。l 耐t o 等( 1 9 9 8 ) 首次报道了将哈茨木霉( zj i 2 日陀胁“m ) 的内切几丁质酶基因如f 4 2 导入烟草和马铃薯中，发现该基因可以在这些植物的不同组 织中高效表达而不影响植物的生长发育，经转化获得的工程植株对多种病原菌有很高甚 至完全的抗性。随后e s p o s i t o 等( 1 9 9 8 ) 利用农杆菌介导法又将哈茨木霉( z 们抽n 枷惭) 内切几丁质酶基因p c 铊转入矮牵牛中获得成功。 利用真菌几丁质酶基因转化植物，不仅获得了高效而广谱的抗性，而且克服了来源 于植物或细菌的几丁质酶基因转化植物后表达水平低的缺点。正因如此，近年来许多科 学家致力于将真菌( 如：彳妒p 曙f ? z 珊n 诵y 肠mc 口n 幽缸。舾f c a n 只z 矗。舷地n 蜊等) 的几丁 质酶基因转入植物以增加植物的抗病虫性，已经获得成功的转基因植物包括烟草、马铃 薯、矮牵牛、大豆、棉花、水稻和玉米等 b x o g l i ek e ta l ，1 9 9 1 ；何迎春等，2 0 0 3 ： 马慧等，2 0 0 3 ) 。这些植物表达几丁质酶的生物活性，不仅可抗病原真菌，还对植物线 虫、昆虫和其它一些病原微生物具有抗性。 另外，通过外源几丁质酶的表达也可以改良生防菌，提高生防菌抑制病害能力。 l o r i t o 等( 1 9 9 3 ) 将哈茨木霉( z 矗船妇月“聊) 内切几丁质酶基因砌勘4 2 转入一种内切 几丁质酶活力很低的生防细菌( 砌耙阳6 口c 把，c f d 口c n e ) 中，转入砌砌4 2 的改良细菌菌 4 引言 株在木霉内切几丁质酶的参与下，能附着在灰葡萄孢霉的孢子和菌丝上大量繁殖，因而 增强了生防效果。c a r s o l i o 等( 1 9 9 9 ) 将多拷贝的p c 自翱转入到哈茨木霉( z 船f 册“聊) 野生菌株中，同时构建了相应的基因突变株，通过比较发现遗传改良菌株的几丁质酶活 性较野生菌株提高4 2 倍，而突变株则不表现活性。微生物几丁质酶基因的高效表达将 产生更有效的抗真菌性生防因子。 1 2 5 微生物几丁质酶在植物真菌病害生防应用中存在的问题 目前尽管有关微生物几丁质酶及其在植物真菌病害防治中的作用报道较多，但由于 几丁质酶的多样性，其调控机理的复杂性，因此离实际应用的要求还相距甚远，造成这 一现象的原因是多方面的。 首先，从自然界分离到的菌株几丁质酶活性不太高，离体几丁质酶的酶活力在体外 的存活时间短就是一个问题。常温菌产生的几丁质酶量少、热稳定性差、易失活、货架 时间短，从而限制了它在田间的应用，这方面的问题已经引起了人们的重视。有人已经 从嗜热真菌f 砌p ，聊d 明梆如聊呼”o s “j 中分离到热稳定性高的几丁质酶，该酶的最适反 应温度为5 5 ，在7 0 保温2 0 i n i n 后仍保留2 4 的酶活力，其应用前景非常诱人( 郭 润芳等，2 0 0 5 ) 。 其次，几丁质酶抑制植物病原真菌的机理不甚明了，也是阻碍其投入实际应用的一 个重要原因。目前普遍认为其可能的机理是由于真菌菌丝顶端细胞壁中的几丁质组分被 几丁质酶分解而使真菌的菌丝生长受到抑制。也有人认为，几丁质酶对真菌细胞壁的破 坏是多组分酶( 如几丁质酶，b 一1 ，3 一葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶等) 的协同效应( 冯 波，1 9 9 8 ) ，这一结论已在酵母菌和木霉的研究中得到证实，但在其它真菌的研究中报 道甚少。 最后，诸多研究表明，微生物几丁质酶抑菌作用具有选择性。真菌细胞壁结构、几 丁质所占的比例、几丁质暴露程度的差异、真菌体内且- l ，3 一葡聚糖酶或其他因子的作用 都有可能影响几丁质酶抑菌作用的选择性，今后有必要对选择机制作深入研究，以便扩 大几丁质酶抑菌谱。 所有的这些问题，都需要在今后做更深入的研究。相信随着分子生物学和基因工程 技术的发展，微生物几丁质酶将在植物真菌病害防治中发挥更大的作用。 1 3 拮抗微生物在果蔬采后真菌病害防治中的应用 1 3 1 果蔬采后腐烂现状及传统防治方法的局限性 5 引 言 新鲜水果和蔬菜采后的保鲜和防病害问题已成为全球性的突出问题。果蔬采后如不 采取积极有效的措施，造成的损失是十分惊人的。据报道，每年发达国家有l o 3 0 的新鲜果蔬损失于采后的腐烂，而在发展中国家，由于缺乏必要的储运冷藏设备，果蔬 腐烂损失率更高( ei - g h a 0 1 1 me ta 1 ，1 9 9 5 ；梁泉峰等，2 0 0 2 ) 。目前，我国果蔬采后损 耗约占总产量的3 0 4 0 ，每年因此造成的经济损失约达7 5 0 亿元人民币( 陈萃仁等， 1 9 9 7 ) 。据研究，果蔬采后腐烂大多由真菌引起。果蔬在采收、包装、贮存和运输过程 中若受到机械损伤，霉菌很容易通过伤口侵蚀果蔬，并在其上大量生长，从而造成果蔬 的腐烂( 孙俪等，1 9 9 6 ) 。 以往，人们防治真菌病害的方法主要是采用优良的采收和包装技术、尽量减低伤果 率及适宜的贮藏条件以保持产品的抵抗力。此外，只能采用化学杀菌剂来控制植物真菌 病害。但是，长期使用化学杀菌剂会对环境和人类造成巨大的危害。特别是近年来，随 着人们对健康重视程度的提高，对绿色无公害食品的需求也日渐增长，逐步认识到使用 化学杀菌剂所引起的严重后果，加上多种病原菌对化学杀菌剂产生了抗药性，迫使人们 努力寻找能够控制病害的新方法( ei g h a o u t he ta l ，1 9 9 5 ；h o l m e se ta i ，1 9 9 9 ) 。 1 3 2 利用拮抗微生物控制果蔬采后的真菌病害 利用有效拮抗微生物来防治果蔬采后病害，是近年来国内外发展起来的一个新的研 究领域( s m i l a n i c ke ta l ，1 9 9 2 ) 。利用微生物之间的寄生、拮抗作用，是生物防治的理 论基础，它比化学药剂处理更安全有效、无特异性，对多种致腐败霉菌均有效，且不易 引起抗性( m a c l a u 曲1 i nda l ，1 9 9 2 ；吴敬德等，1 9 9 8 ) 。 目前研究者已从苹果、柑橘、梨、桃等1 0 余种水果上筛选到的十几种拮抗微生物， 主要用于防治果蔬贮藏期间的青霉病、灰霉病及其它腐烂病( 见表1 ) ( j a n i s i e w i c ze ta 1 ， 1 9 9 4 ：t i a ne ta l ，2 0 0 2 ) ，均表现出良好的抑菌效果，有些拮抗菌已经进入商业化应用 阶段，如n 硪出d 地 x 引言 1 3 3 拮抗微生物作生防因子的作用机制 各类拮抗微生物对果蔬采后的作用机制比较复杂，主要有以下几种： ( 1 ) 营养和空问竞争 果蔬采后病害的发生多由病原微生物引起，病原微生物进入果实的途径一般有两 种：通过果实上的自然通道( 皮孔、气孔等) 侵入，或是由机械损伤形成的伤口侵入，且 后者为主要途径( d r o b ye ta l ，1 9 9 4 ) 。果实有伤口时，在果皮表面的拮抗菌和病原菌孢 子同时开始抢占伤口的营养。以营养与空间竞争为拮抗机理的拮抗菌，能够在短时间内 利用伤口营养大量繁殖，尽可能快的消耗伤口营养并占领全部空间，使得病原菌得不到 合适的营养与空间而抑制病害的发生。酵母类拮抗菌的作用方式主要是这种。将季也蒙 假丝酵母( c f f 抬m d ”西1 ) 接种到桃果实的伤口上，在有病原菌存在时该拮抗酵母菌的 数量一天内可以猛增2 0 0 多倍( 范青等，2 0 0 0 ) ，这种高速的繁殖活动反映出拮抗菌与 病原菌之间的营养竞争。由于拮抗酵母对病原菌的抑制主要是通过营养和空间竞争，故 可以克服那些靠产生抗生素的拮抗菌所带来的弊病。从2 0 世纪9 0 年代初开始，人们便 将拮抗菌的筛选从细菌转向酵母菌，迄今已经发现多种具有此种拮抗机理的有效拮抗 菌。 ( 2 ) 对病原菌的直接作用 拮抗菌对病原菌的直接作用有两种方式：一种方式过分泌胞外水解酶进行作用。 拮抗菌在代谢活动中通过分 x 引言 ( 1 ) 提高果蔬表面已存在的拮抗菌的拮抗能力 实践中发现，用清水冲洗过的果蔬更易腐烂，说明果蔬表面存在某些拮抗菌落。因 此，利用采前或采后措施，使果蔬表面的环境有利于拮抗菌而不利于病原菌生长，就能 达到控制果蔬采后病害的目的( j a i l i s i e w i c ze ta 1 ，1 9 9 2 ) 。例如，在苹果表面上喷洒l 一天冬酰胺、l 一天冬氨酸能促进有益菌的生长。另外，喷洒2 脱氧葡萄糖可抑制病原 菌的葡萄糖代谢，从而控制苹果的青霉病( j 趾i s i 捌c ze ta l ，1 9 9 4 ) 。通常，果蔬潜伏 侵染病害较难防治，若能通过相应的栽培措旋和喷施某些营养剂来改善果蔬表面有益微 生物的生长环境，对于减少果蔬潜伏侵染病害具有重要意义。 ( 2 ) 人工导入拮抗菌 向果蔬表面人工导入拮抗菌，是目前利用拮抗菌的主要途径。导入拮抗菌的方法有： 用含拮抗菌的悬浮液浸溃或喷施果蔬，这是人工导入的主要方法( k o r s t e nc t 虹， 1 9 9 5 ) 。 采前在花或幼果表面喷施拮抗菌悬浮液，如用拮抗类酵母真菌“陀0 6 盘眺姗 p “，f “肠疗) 悬浮液喷施草莓的花，能显著减少草莓果实采后灰霉病的发生( l i i ae t 乩 1 9 9 7 ) 。 将拮抗菌混入 x 引言 因为与会产生抗生素的细菌相比，它具有很多的优点： 干燥情况下可在果面定植并存活相当长的时间； 能产生胞外多糖，有利于本身存活，并限制周围真菌孢子萌发和定植； 能有效地利用营养快速增殖； 受杀菌剂影响较小，是非常值得重视的拮抗菌。 现在正逐渐开发酵母类生防产品，如防治柑橘、苹果、葡萄、番茄等采后腐烂病的 季也蒙毕赤酵母，防治苹果和梨采后腐烂病的枝顶孢和几种隐球酵母，它们能够在干燥 的条件下长期拓踞于果蔬表面，产生胞外多糖以增强其生存能力，萌发繁殖体，快速利 用营养物质增殖，并且受农药的影响极小。这些特性可大大增强拮抗菌的生防功效。用 不产生抗生素的酵母菌来代替产生抗生素的细菌，处理果实对采后病害的控制也具有很 好的效果，同时还可以避免病原菌对抗生素产生抗性而降低生物防治效果( 、矾l s o nc l e ta l ，1 9 9 2 ) 。 ( 2 ) 拮抗酵母在果蔬采后生防应用中存在的问题 虽然许多种酵母菌已被证实对果蔬病原菌具有拮抗作用，且酵母菌应用于果蔬采后 生防有很多优势，但到目前为止进行商业化生产的酵母菌只有毕赤氏酵母、 x 引言 1 4 本课题研究的目的与意义 本课题从选题到研究方法建立及实验结果的分析，都充分利用了分子生态学的原 理。分子生态学是应用分子生物学的原理和方法来研究生命系统与环境系统糨互作用的 生态机理及其分子机制的科学。它是生态学与分子生物学相互渗透的形成的一门新兴交 叉学科，主要研究生命系统与环境系统相互作用的分子基础与分子生态学机理等。随着 分子技术和其他传统学科的越来越紧密的联系和渗透，分子生态学理论和方法对传统生 物学科的促进作用日益显著。 本课题中，首先通过简便、快速的筛选方法，从自然环境中分离几丁质酶高产酵母， 并对该菌株进行鉴定，然后对酶的诱导表达、酶的分离纯化、酶学特性以及抗菌活性进 行研究。本课题的研究成果在理论上将丰富酵母几丁质酶基本性质及生物活性等方面的 内容，为进一步研究生物体内活性物质对环境因子变化的响应提供参考；在实践上建立 一种直观、准确的筛选和鉴定产几丁质酶酵母的新方法，为进一步开发利用几丁质酶提 供科学依据。所以，笔者认为本课题的研究既有重大的理论意义，同时也兼具实践意义。 1 2 材料与方法 几丁质1 0 9 ( 处理前重量) ，蒸馏水溶解后定容至1 0 0 0 1 1 1 l 。 ( 5 ) 诱导产酶培养基i i ：科h 4 ) 2 s 0 45 9 ，k h 2 p 0 41 9 ，m g s 0 4o 2 5 9 ，酵母粉o 2 9 ，粉 状几丁质1 0 9 ，蒸馏水溶解后定容至1 0 0 0 1 l 。 ( 6 ) m c c l a r ) r 培养基：酵母粉2 5g ，葡萄糖1g ，k c l1 8 9 ，醋酸钠8 2 9 ，用蒸馏水溶 解后定容至1 0 0 0 m l 。 以上培养基配制固体培养基时每1 0 0 0 m l 另加2 0 9 琼脂。 2 1 5 主要试剂配方 ( 1 ) 胶体几丁质 参照b e r g e r ( 1 9 5 8 ) 的方法，略有改进。将片状几丁质烘干，粉碎机打碎，过1 0 0 目筛。取l g 细粉几丁质溶解于4 0 m l 冷的浓h c l 中，4 下过夜。然后将滤液缓缓加入 到盛有2 0 0 m l5 0 乙醇的烧杯中，边加边剧烈搅拌，然后静置，待胶体几丁质析出后 弃上清液，收集胶体几丁质，用蒸馏水反复冲洗胶体几丁质至p h 值呈中性，定容至 1 0 0 m 1 ，冷藏备用。 ( 2 ) d n s 溶液 d n s1 9 ，苯酚o - 2 9 ，n a 0 hl g ，酒石酸钾钠2 0 9 ，亚硫酸钠0 0 5 9 ，加蒸馏水溶 解并定容至1 0 0 i n l ，保存在棕色瓶中备用。 ( 3 ) 凝胶贮备液 丙烯酰胺( a c r ) 2 9 2 9 ，亚甲基双丙烯酰胺( b i s ) o 8 9 ，用双蒸水溶解后定容至 l o o m l ，4 避光保存。 ( 4 ) 分离胶缓冲液( 1 5 m 0 1 l t r i s h c l ，p h 8 9 ) 三羟甲基氨基甲烷( h s ) 1 8 1 5 9 ，用6 0 m l 双蒸水溶解，1 m 0 1 l h c l 调p h 至8 9 ， 双蒸水定容至1 0 0 m l 。 ( 5 ) 浓缩胶缓冲液( 0 5 m o l lt r i s h c l ，p h 6 7 ) 三羟甲基氨基甲烷( 而s ) 6 9 ，用6 0 m l 双蒸水溶解，l m o l 几h c l 调p h 至6 7 ，双 蒸水定容至1 0 0 m l 。 ( 6 ) 2 上样缓冲液( s d s p a g e 用) o 5 m o l lt r i s h c l ( p h 6 7 ) 2 m l ，甘油2 m l ，2 0 s d s ( 、w v ) 2 m l ，0 1 溴酚蓝( w v ) 0 5 m l ，巯基乙醇1 i n l ，双蒸水2 5m l 。 ( 7 ) s d s p a g e 缓冲液( t r i s g l y ，p h 8 3 ) 材料与方法 s d s1 9 ，t r i s3 9 ，甘氨酸1 4 4 9 ，双蒸水定容至1 0 0 n 1 l 。 ( 8 ) d n a 微量提取裂解液 n a c l5 8 4 9 ，e d t a1 5 6 9 ，嘣s0 6 9 ，聚乙烯基吡咯烷酮( p v p ) l g ，s d s2 9 ，双蒸 水溶解后定容至1 0 0 m l 。 ( 9 ) 5 c t a b c t a b5 9 ，n a c l5 8 4 9 ，e d t a1 5 6 9 ，t r i s3 9 ，双蒸水溶解后定容至1 0 0 m 1 。 2 2 方法 2 2 1 产几丁质酶酵母的分离与筛选 ( 1 ) 产几丁质酶酵母的分离 从市场上购买无病虫害，无伤口的苹果、梨、桃、番茄等水果若干。取果皮组织 1 0 9 ，分别加入到装有9 0 m 1 ! p d 液体培养基的三角瓶中进行富集培养，2 8 下1 8 0 r m i n 振荡培养4 8 h 。无菌吸管吸取1 m l 培养液，用浓度梯度法稀释成1 0 一一1 0 4 的浓度，将 1 0 、1 0 石、1 0 7 浓度的培养液分别取o 1 m 1 涂布于含几丁质的分离培养基平板上，每个 稀释度重复两次，2 8 培养4 8 h 。观察所得菌株细胞形态特征和菌落特征；并将其初步 鉴定分类。选取其中有明显水解圈的酵母菌株进行平皿划线纯化，将获得的单菌落接种 到试管斜面中备用。 ( 2 ) 产几丁质酶酵母的初筛 将所得酵母菌株活化后，分别划线接种到含几丁质的分离培养基平板上，培养3 d 后开始每天观察所得菌株的水解圈大小，实验重复两次。通过比较各菌株单菌落水解圈 大小，对分离到的酵母菌株进行初筛。 ( 3 ) 产几丁质酶酵母的复筛 a 几丁质酶活性的钡8 定( d n s 法) a 标准曲线的制作 配制5 0 0ug i n l 的n 一乙酰氨基葡萄糖( n a g ) 贮液，再将此溶液稀释成不同的浓 度梯度( 2 5 、5 0 、7 5 、1 0 0 、1 2 5 、1 5 0ug m l ) 。然后取几支干净的试管分别加入不同浓 度( 包括0 l lg m l ) 的n 一乙酰氨基葡萄糖溶液1 5 m l ，另加入1 5 m l3 ，5 一二硝基水 杨酸试剂( d n s ) 溶液，在沸水浴中保温1 0 分钟。取出试管，冷却后在t u 一1 9 0 0 双光束 紫外可见分光光度计上扫描最大吸收峰。然后在最大吸收峰处比色，记录0 d 值，绘制 材料与方法 0 2 0 1 5 m i n 1 2 0 0 0 灿离心3 m i n i 取沉淀，室温干燥后加入3 0 止t e 溶解 如果一次抽提的效果不好，可多抽提几次，以尽可能多的去除杂质。 将所得基因组样品做1 琼脂糖电泳，e b 染色后观察所得结果主带是否清晰并估 测分子量。 bp c r 扩增和测序 d 1 仍2 区域序列的p c r 扩增参考k m z m a i l & r o b n e 仳( 1 9 9 7 ) 的方法，用引物 n l l( 5 。一g c a t a tc a at a ag c ag a g g a a a a g 一3 ) 和n l 4 ( 5 g g tc c gt g tt t c a a g a c gg - 3 。) 扩增所测菌株的2 6 sr d n a 的d l 仍2 区域。 p c r 反应体系( 2 5 ul ) ： 适当浓度的模板1 | l l 弓i 物n l l ( 1 0 l 工m 0 1 l )1ul 弓i 物n l 4 ( 1 0 l 工m o l l ) 1u l 1 0 p c r 缓冲液( 含2 0 u m o l l 的m 矿+ ) 2 5u l d n t p ( 1 0 u m o l 几)o 5 ul t a q 酶( 5 u u l )0 2 u l 双蒸水1 8 8 u l 加样完毕后按下述反应条件进行3 6 个循环：9 4 ，1m i n ；5 6 ，1m i n ；7 2 ，1 5 m i n 。反应最后一圈结束后在7 2 下延伸1 0 m i n ，结束后将所得p c r 产物用2 琼脂 糖电泳检测，估算所得产物分子量，将其送上海生工生物工程技术服务有限公司进行 n l l n l 4 引物双向测序。 c 序列分析 在n c b i 网站上( h 郇：w 瞩n ) v n c b i ，l m i l i 1 g o 忉搜索其同源序列，并提交所得核苷酸 序列：登陆n c b i 官方网站，选择b l a s t ，进入n u c l e o 懿e ，将所得序列按b l a s t 格 式提交，得到与其同源性较高的菌株及其核酸序列；将所得序列用s e q u i n 软件编辑后， 向g e i l b a r d ( 提交。 用d n a m a n v 4 o 软件的h o m o l o g y & d i s t a n c em a 晡c e s 比较待测菌株与其他模式 材料与方法 菌株的相似性；用其中的p h y l o g e n e t i ct r e e 进行2 6 sr d n a 同源性分析，并进行1 0 0 0 次b 0 0 t s 仃印统计学检验，构建系统发育树。根据c y - 6 菌株的2 6 sr d n a 序列分析结果， 结合其形态培养特征和生理生化特征，对该菌株进行鉴定。 2 2 3 几丁质酶的诱导与表达 将产几丁质酶酵母菌活化后，接种于装有5 0 m ly e p d 液体培养基的三角瓶中，2 8 1 8 0 r m i n 振荡培养2 4 h 制种，后取5m l 种子接种到4 5 m l 以下三种培养基中：诱导产酶 培养基i 、诱导产酶培养基i i 以及y e p d 培养基。2 8 1 8 0 r m i n 振荡培养，在无菌环境下 每隔6 h 取样2 r n l ，将剩余的样品继续培养，测定发酵液酶活力并做发酵曲线，直至发酵 液酶活力开始下降。 根据发酵曲线，选取适宜的培养基进行扩大培养，收集发酵液用于几丁质酶的纯化 研究。 2 2 4 几丁质酶的纯化 ( 1 ) 硫酸铵盐析 将发酵液于4 1 0 0 0 0 r m i n 离心3 0 m i l l ，弃沉淀。将上清液转移到透析袋中，经 p e g 2 0 0 0 0 超滤浓缩后再移到干净的小烧杯中，缓慢加入固体( n h 4 ) 2 s 0 4 至9 0 饱和度， 边加边搅拌，然后置4 过夜。然后将发酵液转移至离心管中，4 下1 0 0 0 0 r m i n 离心 3 0 m i n ，弃上清液收集沉淀，用p h 8 0 的o 1 m o l l n a 2 h p 0 4 一o 0 5 m o l 几柠檬酸缓冲液溶 解沉淀，并用该缓冲液彻底透析至该溶液的电导率值不变。 ( 2 ) d e a e 一纤维素( d e 3 2 ) 柱层析 将彻底透析后的酶样品用p e g 2 0 0 0 0 超滤浓缩后，上样于经上述缓冲液平衡过的 d e a e 纤维素层析柱( 2 5 c m 2 0 c m ) ，用含0 o 8 m o l 几n a c l 线性梯度的缓冲液洗脱， 流速为3 0 m l m ，每管收集5 m l 。通过n 2 0 0 0 色谱工作站进行在线监测，洗脱后测定各 管的a 2 8 0 并作洗脱曲线，测定各峰的蛋白含量和酶活力，收集酶活性部分。 ( 3 ) s e p h a d e xg - 1 0 0 柱层析 将上述收集的粗酶液，用p h 6 0 的o 1 m o l l n a 2 h p 0 4 0 0 5 m o l 几柠檬酸缓冲液充 分透析，经p e g 2 0 0 0 0 浓缩到一定体积后，上样于经该缓冲液平衡过的s e p h a d e xg 1 0 0 柱( 2 5 c m 1 0 0c m ) ，用同缓冲液进行洗脱，流速为1 0 m l m ，每管收集3 m l 。收集酶 活力峰，并将酶液经该缓冲液充分透析后，用p e g 2 0 0 0 0 浓缩到一定体积贮存于2 0 备用。 1 9 结果 3 结果 3 1 产几丁质酶酵母的分离与筛选 3 1 1 产几丁质酵母的分离 供试材料经过y e p d 培养基富集培养后，取少量培养液涂布于几丁质平板上进行 培养。将培养后所得菌种进行划线纯化，通过观察细胞形态特征和菌落特征进行初步鉴 定。结果表明，共有1 6 株酵母菌能在几丁质平板上生长，其中9 株具有明显透明圈的 酵母菌，依次编号为c y - 1 c y _ 9 。 3 1 2 产几丁质酵母的初筛 将这9 株酵母进行划线纯化后，接种到几丁质平板上培养7 d 后，观察他们的水解 圈的大小。实验结果表明，在相同的培养时间下，来源于番茄果实表面的c y _ 6 菌株的 水解圈明显比其他几株的水解圈大( 见表3 ) 。图1 表示的是将c y - 6 菌株接种到几丁质 平板上5 d 后的水解圈大小。 图1c y _ 6 菌株的单菌落在几丁质平板上生长5 d 后的水解圈 f 追lt r a l l s p a r e n t z o n e so f c y - 6o n c h i t i n a g a ra r e r5 d 1 s i n 9 1 ec l o n eo f c y _ 6 ；2 t r a n s p a r e n tz 邮e s 3 1 3 产几丁质酵母的复筛 ( 1 ) 几丁质酶活性测定 实验中通过扫描发现，n 一乙酰氨基葡萄糖( n a g ) 与d n s 反应所得产物的最大吸 收峰在5 1 0 n l n 处，用不同浓度的n a g 为底物与d n s 反应，将所得的数据做标准曲线( 如 图2 ) 。 结果 3 2 产几丁质酶酵母的鉴定 3 2 1 形态和培养特征 c y - 6 菌株在麦芽汁液体培养基中，经2 5 2 8 培养3d 后镜检观察，细胞呈卵圆形 ( 图3 ) ，细胞大小为2 1 4 ，2 3 3 7 4um ，无性繁殖方式为芽殖，培养液不形成璞， 菌液混浊，菌体有自凝现象；在麦芽汁固体平板上菌落较厚，乳白色，边缘整齐；在 m c c l a r y 培养基2 5 2 8 培养3d 后有子囊孢子形成，每个子囊含1 3 个子囊孢子，孢 子呈圆形；在p d a 培养基上2 5 2 8 培养3 5d 后镜检观察，发现该酵母不形成假菌 鲐 图3c y - 6 菌株的细胞形态 f 蟾3m o r p h o l o g yo f s t r a i nc y - 6 3 2 2 生理生化特征 实验结果表明：c y - 6 菌株能发酵d 葡萄糖，能利用l 一赖氨酸和柠檬酸，几乎不利 用硝酸钾、蔗糖、d 一半乳糖、l 山梨糖、赤藓糖醇、木糖醇和dl 一乳酸等，在无硫胺 素培养基上不能生长( 表4 ) 。参照酵母菌的特征与鉴定手册和常见与常用真菌 中的描述，菌株c y - 6 的形态和生理生化特征与陆生伊萨酵母( 上胞f 肠) 的表型特征 最为接近。 表4c y _ 6 菌株的生理生化特征 t a b4t h ep h y s i o l o g i c a lc h 鲫a c t e 般i c so fs t r a i nc y _ 6 试剂 d 葡萄糖 硝酸钾 蔗糖 d 半