（微生物学专业论文）草本纤维提取专用菌种资源整理、整合及多样性研究.pdf

摘 按照国家微生物资源标准化整理与整合要求，从中国农业科学院麻类研究所保存的微生物资 源中随机选择8 0 2 份菌种资源进行了三万多项相关特征的规范化描述，对相应实物进行活化、提 纯、复壮、保存，对部分资源补充或修正鉴定，然后根据规范化描述信息进行物种多样性研究， 并采用r a p d ( 随机扩增多态性d n a ) 技术对代表菌株进行遗传多样性分析，其目的在于优化、 挖掘、保护草本纤维生物提取菌种资源，逐步提高草本纤维生物提取菌种资源的数量与质量，为 草本纤维生物提取的收集，整理、保藏、评价、共享和开发研究提供理论依据和实物资源。通过 研究，得出以下结论： l 、整合草本纤维提取微生物资源8 0 2 份，整理信息数据6 4 5 7 4 项，修复、补充信息数据2 7 7 6 7 项；同时，活化、提纯、复壮并保藏菌株6 1 5 份。这些菌种资源信息已整合到国家自然资源e 一平 台、实物已交a c c c ( 中国农业微生物菌种保藏管理中心) 保藏，初步建成草本纤维提取生物菌 种资源库。 2 、已整理菌种资源隶属2 2 属3 8 种，实物涉及2 0 属3 1 种。种群多样性分析结果显示，芽孢 杆菌属和类芽孢杆菌属占明显优势，其中，枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、第三梭菌、胡萝h 软腐欧文氏杆菌等具有优良的脱胶功能，而黑曲霉、黄孢厚毛平革菌等具有良好的制浆功能；生 境多样性分析结果表明，土壤和水体是此类微生物比较理想的生境，从土壤中分离到的菌种占 3 6 ，0 3 ，涉及2 0 属2 8 种，其次是水体，占2 1 5 ，而从腐殖质中分离到的菌种比较少；物种多 样性与地域关系不是很大，多样性指数在1 2 2 2 之间，群落相似性在0 2 0 7 之间。 3 、现有微生物资源的遗传多态性比较丰富， 得9 0 条清晰的d n a 带型，其中b 2 条呈多态性， 6 个 0 b p 引物扩增6 个品种的欧文氏菌系列获 占总带数的9 11 ：7 个l o b p 引物扩增1 2 个品 种的芽孢菌杆菌系列获得1 1 0 条清晰的d n a 带型，其中1 0 5 条呈多态性，占总带数的9 55 ， 多数遗传距离在o 5 o 8 5 之问；在d = 0 5 8 6 处，6 个欧文氏菌系列聚成3 类，在d = 06 3 4 处， 1 2 个芽孢杆菌系列聚成3 类，不论是相同系列的人工诱变菌株还是不同地域的同类天然菌株，均 表现出了较大的差异性和遗传多样性，草本纤维提取菌株的遗传聚类与选育方法及其地域有直接 相关性。 关键词草本纤维提取，菌种资源，整理，多样性 要 a b s t r a c t i na c c o r d a n c ew i t h r u l e r sf o r t h ec o l l e c t i o nc h a r a c t e r a t i o np r e s e r v a t i o nm a n a g e m e n to f m i c r o o r g a n i s mr e s o u r c e s ，t h er e s e a r c hr a n d o m l ys e l e c t e d8 0 2h e r b a c e o u se x t r a c t i o nm i c r o o g a n i s m s c h o s e nf r o mi n s t i t u t eo f b a s tf i b e rc r o p s ，c h i n e s ea c a d e m yo f a g r i c u l t u r es o i e n c e s ( i b f c ，c a a s ) ，a n d f i n i s h e do v e r3 0t h o u s a n 凼r e l a t e ds t a n d a r d i z e dd e s e r i p t i o n r e l a t e dm i c r o o r g a n i s mr a s o u f c 搴sv c e r e a c t i v a t e d ，p u r i f i e d ，面u v e n a t e d ，p r e s o p , e da n di d e n t i f i e d b a s e do nt h ed e s c r i b e di n f o r m a t i o n ，s p e c i e d i v e r s i t yw a ss t u d i e d ，a n dg e n e t i c 出v e r s i l yw a ss t u d i e df o rs o m er e p r e s e n t a t i v eo n e su s i n gt h er a p d t e c h n o l o g y t h ep a p e r si n t e n t i o nw a st o 舯v i d es c i e n t i f i cd a t af o ro p t i m i z a t i o n , c o l l e c t i o n a n d p r o t e c t i o no nt h eh e r b a c e o u se x t r a c t i o nm i c r o o r g a n i s mr e s o u r ， a n dd e v e l o pt h eq u a n t i t i e sa n dq u a l i t y o f t h eh e r b a c e o u se x t r a c t i o nm i c r o o r g a n i s m s n 把r e s u l t sa r ea sf o l l o w i n g s ： 1 t 1 l er e s e a r c hh a si n t e g r a t e d8 0 2h e r b a c e o u se x t r a c t i o nm i c r o o r g a n i s m s ，c o l l e c t e d6 4 5 7 4 p i e c e so fi n f o r m a t i o nd a t a ，i n c l u d i n g 2 7 7 6 7p i e c e so fb e i n gr e p a i r e da n dc o m p l e m e n t e d 6 1 5 m i c r o o r g a n i s m sh a sb e e na c t i v a t e d ，p u r i f i el , 响u v e n a t e da n dp r e s e r v e d a l lt h e s er e s o u r c ei n f o r m a t i o n h a sb e e ni n t e g r a t e dt ot h es t a t en a t u r a lr c o u r o ge - p l a t f o r ma n dt h ec o r r e l a t e dm i c r o o r g a n i s m sh a v e b e e np r e s e r v e db ya g r i c u l t u r a lc u l t u r ec o l l e c t i o no fc h i n a ( a c c c ) 1 1 1 eh e r b a c e o u se x t r a c t i o n m i c r o o r g a n i s mc o l l e c t i o nb a s eh a sb e e ne s t a b l i s h e di n i t i a l l y 2 t h e8 0 2i n f o r m a t i o nd a t ai n v o l v e2 2g e n e sa n d3 8s p e c i e s b a c i l l u sa n dp a e n i b a c i l l u sh a v ea l l a d v a n t a g ei nq u a n t i t y , e s p e c i a l l yb a c i l l u ss u b t i l i sa n dp a e n i b a c i l l u sp o l y m y x a s o i la n dw a t e r 眦i d e a l h a b i t a tf o r t h eh e r b a c e o u se x t r a c t i o nm i c r o o r g a n i s mr e s o u r c e s ，3 60 3 o fr e s o o r c 4 sa r es e p a r a t e df r o m s o i la n d2 1 5 o f t h e mf r o mw a t e r , al i t t l eo f t h e ma l es e p a r a t e df r o mh u m u s t h e r ei sn ob i gc o r r e l a t i o n b f t w e e ns p e c i e sd i v e r s i t ya n dl o c a l i t y t h ed i v e r s i t yi n d e xi s12 2 2 a n dt h ec o m m u n i t ys i m i l a r i t y i n d e xi s0 7 3 1 1 g e n e t i cp o l y m o r p h i s mo ft h eh e r b a c e o u se x t r a c t i o nm i c r o o r g a n i s m si sr i c h ，9 0d n a b a n d s a o b t a i n e db yp c ro f6p r i m e f sf r o m6 s t r a i n so fe r w i n i a mp o l y m o r p h i s mb a n d s 8 2 ，w h i c h a e c , o u n t f o r 9 1 1 ，1 1 0 d n a b a n d sa r eo b t a i n e db y p c ro f 7p f i m e r s f r o m l 2s t r a i n so f b a c i l l u s t h e p o l y m o r p h i s mb a n d s 1 0 5 w h i c ha c c o u n tf o r9 5 5 t l - eg e n e t i cd i s t a n c ei sb e t w e e no 5 加3 5 + t h e h e r b a c e o u se x t r a c t i o nm i c r o o r g a n i s m sf r o ma r t i f i c i a lm o d i f i c a t i o na n dw i l de n v i r o n m e n th a v er i c h g e n e f cd i v e r s i t ya n dd i f f e r e n c e t h eg e n e t i cc l u s t e ri sd i r e l y r e l a t e dt om o d eo f b r e e d i n ga n d 删一 k e yw o r d s ：h e r b a c e o u se x t r a c t i o n , m i c r o o r g a n i s mr e s o r t e r s ，d e s c r i p t i 0 i l ，d i v e r s i t y i i 英文缩略表 英文全称 a g r i c u l t u r a lc u l t u r ec o l h - t i o no f c h i n a e r w i n i ac a r o t o v o r ac x j z 9 5 1 9 8 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d e t h i d i v a nb r o m i d e d i s o d i u me = t h y l e o e d i a m i n et e t r a a c e t e a c c e l e r a t i o no f g r a v i l y g r a m m i l l i g r a m m i n u l c m i l l i l i t r v m i l l i m o l e r e l a t i o nm o l e c u l a r w e i g h t o p t i c a ld e n s 时 p o l y m c r a s cc h a i nr e a c t i o n r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a r e v o l u t i o np e rm i n u t e p a e n i b a c i l l u s p o l y m y x a t l l 6 3 b a c i l l u as u b t i l i st 2 s b a c i l l u ss u b t i l i st 6 6 m i c r o g r a m m i c r o l i t r e m i c r o m o l e u n w e j 曲t e ap a i r - g r o u p m e t h o d u s i n g a r i t h m e t i ca v e r a g e s v 中文名称 中国农业微生物菌种保藏管理中心 欧文氏菌c x j z 9 5 1 9 9 双重蒸馏水 脱氧核糖核酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸钠盐 重力加速度的倍数 克 毫克 分钟 毫升 毫摩尔 相对分子量 光密度 聚合酶链式反应 随机扩增多态性d n a 每分钟转速 多粘类芽孢杆菌t 1 1 6 3 枯草芽孢杆菌t 2 8 枯草芽孢杆菌t 6 6 微克 微升 微摩尔 非加权分组平均法 嬲一一一眦阻一g。嘴曲札枞址腿，一呻一亿；墨峙出小 一 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名：霰激时间：如7 年； 月如日 导师签名： 当一1 嘲 时间：切年占月厶日 申馐农业科学譬碗士学b 论t 第一章绪论 1 1 草本纤维提取 1 1 1 草本纤维 第一章绪论 1 1 1 1 草本纤维的概念 纤维是人类生存仅次于粮食的第二大必需物资( 刘正初，2 0 0 7 ) 。纤维可分为天然纤维和化学 纤维两大类，天然纤维包括植物纤维、动物纤维和矿物纤维，植物纤维可分为木本纤维、草本纤 维和子实纤维。 草本纤维是指来自于草本植物茎干或叶片的一类纤维素纤维。草本纤维植物同粮食、油料、 蔬菜一样属于个集体名称，是苎麻、红麻、亚麻、黄麻、大麻、龙须草、芦苇、麦草等可以从 其茎杆或叶片中获取纤维索纤维的一类草本植物的总称，涉及1 9 科3 7 属3 0 0 多种植物，有一年 生和多年生之分，其中，一年生的草本纤维植物有黄麻、红麻、亚麻等，多年生的有苎麻、罗布 麻、剑麻、芦苇、龙须草等( 刘正初，2 0 0 7 ) 。 1 1 1 2 草本纤维是传统制造业和生物质产业的基础原材料 麻类等草本纤维的开发利用在解决人类面i 临的森林资源枯竭，生态环境恶化问题，提供多样 性产品等方面具有重要作用( 李宗道，1 9 8 0 ；卢浩然等，1 9 9 3 ) 。随着石油和森林资源的短缺以及 人们生活质量的提高，世界各国都在寻求新型纤维资源，而草本纤维因具有用途广、适应性强、 环保、纤维产量高、品质好等特点，是替代石油和森林资源的重要物资： 【1 ) 用途广。草本纤维植物具有十分重大的开发价值，萆本纤维的纤维及其伴生物开发利用 前景十分广阔( 刘正初，2 0 0 7 ) 。草本纤维在我国造纸原料总量中约占3 0 ，曾经一度达到纸浆产 量的8 5 以上( 李忠正，2 0 0 6 ) 目前，国内外利用麻类等草本纤维资源开发出了许多可替代森林 和石油制品的新产品。例如，各类高档服饰、可降解膜( 王朝云等，2 0 0 5 ) 、纸品、密度板( 型) 材，复合高分子材料等，罗布麻叶用来开发治疗心脏病、高血压、哮喘、感冒等多种疾病的成药 和保健品，苎麻根开发安胎、消炎药物等。 总之，国内外利用苎麻等草本纤维开发出了许多产品，形成了。以麻补棉”、“以草代术”和 “以草本纤维为生物质产业主要原料”的产业态势( 刘正初，2 0 0 7 ) ( 2 ) 纤维品种齐全。草本纤维的单纤维的形态和大小因植物的种类而异，多数为线形或纺锤 形，末端尖细或钝圆，有的末端有分枝。纤维细胞的横断面为不整齐圆形、椭圆形，卵形或不整 多角形。苎麻单纤维最长，可以达到5 8 0 r a m ；大麻、亚麻次之，平均长度2 0 m m 左右；黄麻，红 麻和剑麻较短，平均长度在l o m m 以下。苎麻单纤维细胞的直径最大红麻、大麻、剑麻次之， 亚麻和黄麻较小。龙须草纤维的长，径比具有特色，平均长度是2 1 m m ，直径只有l o 4 pm ，平均 在2 0 0 倍以上。棉花的单纤维细度为3 6 0 0 3 8 0 0 n m ，羊毛单纤维细度在6 0 0 n m 左右，苎麻变化 于8 0 0 3 5 0 0n m 之闻。( 刘正初，2 0 0 7 ) ( 3 ) 生态适用性强，经济效盏和生态效益显著。草本植物可以在荒山、坡地、滩涂，甚至沙 漠等各种生态环境下生存，草本植物不仅不与粮食、棉花等大宗作物争地，而且兼有改良土壤、 中周农业科学笔硕士学位论文 第一章绪论 防治水流失等生态功能。 ( 4 ) 产量高。纤维素是植物光合作用的主要产物，植物光合作用形成的高分子产物中，纤维 索占总重的6 0 以上：而且，作为农产品，草本植物具有单产数量大和生产周期短的特征。 1 1 2 草本纤维提取的概念、方法及原理 1 1 2 1 草本纤维提取的概念 草本纤维提取是指采用化学或生物方法除去苎麻等草本纤维原料中大量键合和非键合型草本 纤维伴生物而获得主要产品为纤维索纤维的i j t l m 过程。草本纤维化学提取是利用化学催化剂一 酸和高温条件下的碱催化草本纤维中非纤维素物质的降解，并辅以一些后处理措旄而获得满足后 续加工要求的纤维索纤维的加工过程草本纤维生物提取方法是以生物催化剂( 酶) 催化非纤维 索物质降解为核心而获得满足后续加工要求的纤维索纤维的加工过程。不同的行业对草本纤维提 取有不同豹术语及其具体的涵义。纺织行业将草本纤维提取过程称为“脱胶”，制浆造纸行业称为 “制浆”，生物质能源产业称为“糖化”( 刘正初，2 0 0 7 ) 。 1 1 2 2 草本纤维提取方法及原理 草本纤维包裹在植物的茎杆或叶片中，必需采用适当方法提取才能体现出使用价值，草本纤 维提取方法主要包括：水沤法、蒸煮法以及生物降解法( 张盆等，2 0 0 5 ) 。 沤麻是人类最早发明和使用范围晟广的麻类脱胶方法。我国关于沤麻的文字记载最早见于公 元前6 世纪的诗经陈风篇中的“东门之池，可以沤苎”，到今天至少已有2 6 0 0 多年历史- 而 今，除了苎麻、大麻、亚麻，罗布麻等精纺纤维采用其他方法以外，国内外还普遍采用沤麻方法 进行麻类( 如黄麻、红麻、玫瑰麻等) 脱胶生产。传统的沤麻方法之所以能沿袭数千年，是因为 它适宜个体操作、加工过程除了劳动力投入之外不需要其他成本。但是，沤麻方法存在占用水面 ( 与发展水产业相矛盾) 、产品质量不稳定、环境污染严重、劳动强度大、生产环境恶劣、损坏农 田水利设施等突出问题。 1 7 0 0 多年前，我国就有利用“石灰腌料法”处理嫩竹等草本植物制造纸张的记录。化学脱胶 和制浆方法的创立为草本纤维产业走上工业化生产作出了重大贡献。经过不断的改进和完善，化 学提取方法业已成为苎麻、大麻、罗布麻等精纺纤维脱胶和麦草、芦苇，龙须草等草料制浆的主 要方法。但是，该方法同样存在三个突出问题：一是成本高、能耗大，二是纤维流失多而且结构 受到损伤，三是环境污染严重，尤其是化学方法在降解非纤维素的同时损伤纤维固有的形态与结 构，使得纤维制品丧失了许多优良特性( 郝利民，1 9 8 3 ：l i a 等，2 0 0 4 ) 。 生物提取法包括菌降解法和酶降解法。酶降解法是将少量活化态菌种接种到专用培养基上进 行多级发酵并制成酶制剂以后，再将苎麻等草本纤维原料浸泡于按照各类酶的性质及其合适比例 配置成的酶液中，利用酶在特定条件 催化非纤维索物质降解而实现草奉纤维生物提取的工艺过 程。由于目前人们对降解草本纤维的多酶体系的组分及其作用原理了解的还不够深入，因此酶降 解工艺暂时处于初步探索阶段。 菌降解法是将少量活化态菌种直接接种到苎麻等草本纤维原料上，在适宜专用菌种生长的条 件下利用苎麻等非纤维素物质为培养基来扩增微生物数量，使之分泌复合酶系来催化非纤维索物 质降解而实现草本纤维生物提取的工艺过程。菌降解工艺可以分为真菌工艺、细菌工艺以及混合 2 中国农业科学爱硕士学位论t第一章绪论 1 菌工艺，菌降解工艺有望克服传统水沤法以及常规化学方法存在的弊端，在短期内大规模产业化。 无论利用草本纤维开发何种产品，都需要进行草本纤维提取。草本纤维提取过程一般需要除 去占草本纤维原料重量2 2 - 4 5 的非纤维索物质，包括果胶( 4 8 ) 、半纤维素( 1 2 1 8 ) 、 木质素( 2 5 ) 等物质( 李宗道，1 9 8 0 ；a k h t a r ，1 9 9 8 ；郭清泉等，2 0 0 1 ) ，这些物质镶嵌于细胞 之间及细胞壁中，结构十分复杂( b a c i s 等，1 9 8 8 ；a k h t a r 等，1 9 9 8 ；p a u l 等，1 9 9 7 ) ，甘露聚糖及木 聚糖是纤维素与木质素连接的重要桥梁，它常以共价键的方式与纤维素连接，以氢键或其它非共 价键的方式与木质素连接( b a c i s 等，1 9 8 8 ；p a u l 等，1 9 9 7 ：k h a n o n g n u c h 等，1 9 9 9 ) 。果胶主要由多聚 半乳糖醛酸组成，降解产物为半乳耱醛酸( 扬礼富等，2 0 0 1 ) 。半纤维紊则是一类结构和成份十分 复杂的物质，主要包括甘露聚糖、本聚糖及多聚半乳糖等。木质素是一类由多聚苯丙烷等组成的 杂环类物质，组成极为复杂，降解最为困难，不过草本纤维原料中的木质素含量一般不高( 郝利 民，1 9 8 3 ；张运雄，2 0 0 0 ) 。 常规化学方法的基本原理是利用纤维素分子与非纤维素物质对酸、碱、氧化荆等化学试剂的 稳定性差异，来达到降解非纤维素物质、保留纤维素的目的( 李宗道，1 9 8 0 ) 。纤维素对稀酸、浓 碱、氧化剂等化学试剂及高温具有相对的稳定性；在强酸和高温下的浓碱条件下，果胶、半纤维 素等物质比较容易分解：木质素容易被氧化剂氧化而分解。 草本纤维生物提取原理是利用微生物分泌出的果胶酶，半纤维素酶、木质素酶等一系列水解 蹲来降解草本植物中的非纤维素成分，从而分离出纤维素。中国农业科学院麻类微生物脱胶研究 者孙庆样研究员率先提出了“胶养菌一菌产酶一酶脱胶”的微生物降解原理( 刘正初等，2 0 0 1 ) ， 继而中国农业科学院麻娄研究所刘正初研究员提出了“块状崩溃”理论( 张运雄，2 0 0 6 ) 。 1 1 3 草本纤维生物提取是生物质产业的发展方向 传统的天然水沤法和化学蒸煮法己成为产业发展的制约因子，而生物法提取草本纤维能很好 的解决天然水沤法和化学蒸煮法所带来的问题，是发展草本纤维产业的关键所在( 刘正初，1 9 9 6 ) 。 基于传统方法不适宜工业化生产而常规化学方法对环境造成严重污染等问题，英国牛津大学 a c t h a y s o n 和h j b u n k e r ( 1 9 2 7 ) 提出“纤维索半纤维索果胶及胶质的微生物学”这个概念后， 国际上广泛开展了“生物脱胶”、4 生物制浆”和“生物塘化”研究，统称为“草本纤维生物提取”， 先后有英国牛津大学、前苏联农业科学院亚麻研究所、印度黄麻研究所、美国佛罗里达大学、日 本早稻田大学以及中国农业科学院庶类研究所，湖南师范大学、武汉大学、华中农业大学、中国 科学院遗传研究所，山东大学等十几个国家的1 0 0 多个单位进行了相关研究。 国内最早报道麻类生物脱胶实验结果的是江西省轻工业厅( 1 9 5 4 ) ，之后，中国农业科学院麻 类研究所孙庆祥研究员，从1 9 7 1 年起，全面开展了麻类微生物脱胶技术研究，经历了菌种选育、 酶制荆脱艘试验、加酋脱胶试验等长期努力，直至1 9 8 5 年率先发明了“苎麻细菌化学联合脱胶技 术”并成功应用于工厂化生产。近年来相继发明的“苎麻生物脱胶工艺技术与设备”( 刘正初等， 1 9 9 6 ) 和“高效节能型龙须草生物制浆技术”( l i u 等，2 0 0 4 ) 等成果属于这些研究的杰出代表。 在工厂化条件下，与化学方法比较，生物法提取与精制草本纤维具有以下优势：( 1 ) 工艺辅料投 入减少6 0 ；( 2 ) 能耗节省3 5 以上；( 3 ) 精制纤维产量提高1 58 ；( 4 ) 无机和有机污染物排 放量分别减少6 0 和5 0 ( l i u ，2 0 0 4 ) 。由此可见，生物法提取草本纤维可以克服常规化学方法存 中国农业科学甍硕士学位论t 第一章绪论 l ib 在的弊端，是发展草本纤维产业的关键所在。 1 2 草本纤维提取菌种资源整理、整合 1 2 1 菌种资源是草本纤维生物提取的核心 生物多样性公约( 1 9 9 2 年) 指出，生物资源是指对人类具有实际或潜在用途或价值的遗 传资源、生物和维持异地保护及研究植物，动物和微生物的设施。无论是维持生态系统的平衡， 还是提供对人类具有实际或潜在价值的资源，动物、植物、微生物都是具有不可替代的作用。广 义的微生物菌种资源泛指所有的微生物。狭义的微生物菌种资源是指人工可以培养、可持续利用 的、具有一定科学意义、具有实际或潜在应用价值的微生物。 到目前为止，草本纤维提取菌种资源及其工艺已经涉及纺织、造纸、生物能源、材料制造等 诸多领域。但是国内外诸多学者经过了几十年“草本纤维生物提取”的探索研究，草本纤维提取 仍然未取得大规模生产应用的突破。因为，草本纤维原料种类繁多、成分复杂、结构牢固，而目 前从自然界中分离到的微生物所分泌酶的种类或活性有限，不可能凭借这些酶催化其非纤维紊物 质完全降解。 要从根本上解决这个问题，就得选育出针对草本纤维原料特性的模式菌株( 刘正初，2 0 0 7 ) 。 要获得草本纤维生物提取的模式菌株，微生物资源研究就变成了毫无疑闯的关键因素。因此，菌 种资源是草本纤维提取的核心。 1 2 2 菌种资源整理、整合有助于提高资源数量和质量 对分散的、无序的保存菌种资源进行整理，在规范化描述的基础上，对菌种资源整合统一、 标准化，实现数据化和网络化，从而提高资源数量，优化资源质量。微生物菌种的整理、整合、 保藏不仅是为当前生产和科研服务，而且也是为未来发展的需要，肩负着管理微生物菌种资源和 保护生物多样性的重任( 姜瑞波，2 0 0 5 ) 。 目前我国保藏的微生物菌种资源比较分散，对微生物菌种资源的描述不统一，造成定的混 乱，给微生物菌种资源的共享带来许多困难，同时也限制了微生物菌种资源收集和保藏工作的进 一步开展。通过对资源进行整理整合、规范化描述以及构建资源平台，充分运用信息、网络技术 等现代技术，最终实现微生物资源的收集、整理、保藏、评价，共享利用、研究开发的功能性平 台。 1 9 7 9 年我国原国家科学技术委员会主持成立了普通、农业、工业、兽医、林业、医学，药用 等7 个国家专业微生物菌种保藏中心。随着科学研究和生产的发展，一些科研机构和高校的试验室 也增设了菌种保藏机构。目前，中国在世界菌种保藏联合会注册的菌种保藏中心共1 6 个( 其中包 括香港和台湾各1 个) ，除此之外，许多其它的科研或生产机构也保藏有大量的微生物菌种。目前， 我国保藏的l o 万株微生物菌种，分散在近3 0 多个单位。微生物资源分散，描述不统一。 一 1 2 3 草本纤维提取菌种资源整理、整合状况 1 2 3 1 国内状况 4 中国农业科学冀矿t 学位论t 第一章绪论 2 0 0 3 年开始，在科技部自然科技资源平台项目的支助下，中国农业微生物菌种保藏管理中心 在我国首次对农业用微生物进行收集、鉴定、保存、评价和提供应用服务，中国农业科学院麻类 研究所首次对草本纤维提取菌种进行整理、整合以及规范化描述。此前，有关草本纤维提取菌种 的整理、整合研究尚未见报道。 在我国一股科研院校仅保存有几株至几十株脱胶或制浆菌。中国农业科学院麻类研究所从 事草本纤维生物提取研究3 5 年来，共计分离、收集相关微生物菌种资源档案信息3 0 0 0 垂；份，保存 下来的菌种资源实物2 0 0 0 多份，正在进行草本纤维提取菌种资源的整理、整合研究，并且首次采 用基因工程手段育种获得一个具有。广谱性”，。高效性”的欧文氏杆茁突变茁株c x j z 9 5 1 9 8 ， 形成了一系列具国际领先水平的原创性发明专利和鉴定成果( 蒋建雄，1 9 9 1 ；刘正初，1 9 9 6 ) - 1 2 j 2 国外状况 h a u m a n 是研究脱胶微生物的先驱者，他于1 9 0 2 年首先从浸渍亚麻茎上分离到某些细菌，到 1 9 2 2 年，c a r b o n e 和t o b l o r 分离到b a c i l l m ? 启s i n e u s ，这期问，许多学者陆续分离到了脱胶菌，而 且将它们分为需氧菌和厌氧菌( 孙庆详，1 9 8 1 ：h s s 1 9 8 7 ) ，这也是首次对草本纤维提取菌株 进行整理。 美国典型微生物菌种保藏中心a m e r i c a nt y p ec u l t u r ec o i l e c t i o n ( a r ( c ) 以及德国微生物菌种 保藏中心d e u t s c h es a m m l u n g v o nm i k r o o r g a n i s m o nu n dz e l l k u l t u r c n ( d s m z ) ，较早地保存了制浆用 菌株。据u o 统计，印度和孟加拉等产麻大国保存的菌种资源也各约在5 0 1 0 0 份之间。 1 3 草本纤维提取菌种资源多样性 1 3 1 生物多样性概念 生物多样性( b i o d i v c r s i t y 或b i o l o g i c a ld i v e r s i t y ) 是指所有来源的活的生物体中变异性，这些 来源包括陆地、海洋和其他水生生态系统及其所构成生态综合体；这包括物种内、物种之间和生 态系统的多样性( 生物多样性公约，c o n v e n t i o no nb i o l o g i c a ld i v e r s i t y ) 。也就是说，生物多样 性是指地球上所有生物( 动物、植物、微生物等) 、它们所包含的基因以及由这些生物与环境相互 作用所构成的生态系统的多样化程度，通常包括遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性三个 组成部分。群落的物种多样性是生态系统结构和功能的决定因素。 物种是生命存在的基本形式，也是生态系统中生物群落组成的基本单元。种群是在一定时间 和空间内，同种生物的总和。群落是在一定自然区域内，相互之间具有直接或间接关系的各种生 物的总和。生态系统是指生物群落及其无机环境相互作用的自然系统。种群是由同种的生物个体 组成，种群组成群落，群落组成生态系统( 孙儒泳等，2 0 0 2 ) 。 广义的遗传多样性是指地球上生物所携带的各种遗传信息的总和；狭义的遗传多样性主要是 指生物种内基因的变化，包括种内显著不同的种群之间以及网一种群内的遗传变异。物种多样性 是指地球上动物、植物、微生物等生物种类的丰富程度。物种多样性包括两个方面，其一是指一 定区域内的物种丰富程度，可称为区域物种多样性# 其二是指生态学方面的物种分布的均匀程度， 可称为生态多样性或群落物种多样性。物种多样性是衡量一定地区生物资源丰富程度的一个客观 指标。生态系统的多样性主要是指地球上生态系统组成、功能的多样性以及各种生态过程的多样 中国农业科学甍碗七学位论文 第一章绪论 性，包括生境的多样性、生物群落羊d 生态过程的多样化等多个方面。其中，生境的多样性是生态 系统多样性形成的基础，生物群落的多样化可以反映生态系统类型的多样性( 阎章才等，2 0 0 1 ) 。 1 3 2 生物多样性意义 生物多样性包括生物种类的多样性、基因的多样性和生态系统的多样性。生物多样性的意义 主要体现在生物多样性的价值，生物多样性的直接使用价值是生物为人类提供食物、纤维、建材、 药物及其他工业原料；间接使用价值是指生物多样性具有重要的生态功能，维护了自然界的生态 平衡。多种多样的生物是全人类共有的宝贵财富。 整个地球是一个统一的整体，一方面，温室效应，厄尔尼诺现象，酸雨等全球气候变化改变 着物种生存环境，另一方面，人们对资源的掠夺也造成生态的恶化。由于人类的影响和破坏等原 因，如大面积森林的乱砍滥伐，围湖造田，毁林开荒，过度放牧等，造成生境的片断化和丧失， 破坏和改变生物生存的生态环境，降低生态多样性人类的生存和发展需要利用生物资源，不合 理利用生物资源，如乱捕滥猎和乱采滥挖等，也造成生物多样性的丧失。环境污染也是造成生物 多样性下降的原因之一。我国每天排放的污水每年以8 的速度递增，和经济增长率几乎一致 外来种的不适当引入也是严重威胁生物多样性重要原因之一。人口的膨胀必然导致人类对生物资 源的需求加剧，然而，人类所能利用的自然资源是有限的。 生物资源是人类赖以生存和发展的基础。保护生物多样性是当前生物科学最紧迫的任务之一， 也是全球生物学界共同关心的焦点问题之一。从2 0 0 1 年起，根据第5 5 届联合国大会第2 0 1 号决 议，5 月2 2 日被定为国际生物多样性日。 微生物由于其遗传和功能的多样性，在维持整个生物圈及人类提供物质能源方面显示了其他 生物无法取代和比拟的作用：同时，由于具有易变异的特点，l ；l 及环境的变化和生物多样性的锐 减，导致许多微生物多样性在急剧消失。草本纤维菌种资源的长期有效的保藏和共享交流，是发 挥其重要作用的前提。通过研究草本纤维提取菌种的多样性，能进一步揭示草本纤维提取菌种资 源的种类、分布，生态环境及其基因瓷源状况，优化、挖掘、保护草本纤维提取菌种资源。因此， 对草本纤维提取资源进行整理、收集、保护以及进行多样性研究就显得更加必要。草本纤维提取 的核心问题之一在于选育高效优质的菌种资源，通过对草本纤维提取菌种的多样性进行研究，将 有助于解决草本纤维提取面临的问题。 1 3 3 微生物多样性研究方法 1 3 3 1 微生物多样性研究方法 微生物多样件的实验研究方法很多，最早检测微生物的多样性是通过显微镜进行的。随后- 科赫建立了微生物纯培养技术。这一技术也成为研究微生物物种群多样性的一个经典方法。随着 重组d n a 技术的出现和广泛应用，微生物种群小规模研究成为可能。它克服了传统培养方法的 局限，可以从基因水平准确定位微生物的分类定位和种群关系。 目前，国内外采用的方法大致包括以下几类；( 1 ) 传统的微生物平板纯培养方法；( 2 ) 分子 生物学方法；( 3 ) b i o l o g 微生物平板分析方法( 郑华等，2 0 0 4 ) ；( 4 ) 脂肪酸分析方法；( 5 ) 其他 方法，如酶活性分析方法，同位紊示踪法，显微技术等( 车玉伶等，2 0 0 5 ；陈晶，2 0 0 5 ) 。不同的 6 中国农业科学甍硕士学伫论文 第一章绪论 方法对微生物多掸性研究的角度不同，每一种方法均有其优缺点( 陈晓倩等，2 0 0 3 ) 。不过，分子 生物学方法使得微生物多样性研究更为直接和准确，目前，分子生物学方法已经成为了多样性研 究领域中的热点，常见方法包括p c r ，r a p d 、1 6 sr d n a 、s s r r f l p 、a f l p 、p c r - d g g e f f g g e 等( 章家恩等，2 0 0 4 ：姚斌等，2 0 0 5 ) 。 为了获得全面的多样性研究信息。同时可虑操作的可行性，一般是根据具体情况采取几种合 适的方法相结合。 1 3 3 2i 认p d 标记 r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 标记是w i l l i a m s 等和w e l s h ( 1 9 9 0 ) 在聚合酶 链反应( p o l y m c r a s ec h a i n r e a c t i o n ，p c r ) 基础上发展起来的，它以基因组d n a 为模板，以一系 列不同随机引物( 核昔酸序列) ，通过聚合酶链反应产生不连续的d n a 产物，通过对扩增产物 d n a 片段的多态性检测，反映基因组相应区域的d n a 序列多态性。虽然一个引物检测到的基因 组多态性区段有限，但是使用一系列引物可使检测区域覆盖整个基因组( 惠东威等，1 9 9 0 ：卢江， 1 9 9 3 ；朱乾浩，1 9 9 3 ) 。 与其它分子标记方法相比，r a p d 方法具有独到的优点：( 1 ) 技术相对简单、快速，成本较 低：( 2 ) 所需要的样品量少，一般每次只需d n a l 0 - 4 0 n g ；( 3 ) 标记数量极为丰富，进行品种纯 度检测潜力很大，能揭示大量从形态和生理生化指标上无法检测到的丰富差异；( 4 ) 灵敏、准确； ( 5 ) 无放射性：( 6 ) 易于早期测定；( 7 ) ) 易于标准化；( s ) 不需要明确目的基因组结构。目前 该方法广泛应用于种质资源鉴定与分类、目的性状基因的标记、绘制避传连锁图。 1 3 4 草本纤维提取菌种资源种类 1 3 4 。1 草本纤维提取菌株种类 到目前为止，有关草本纤维提取菌种的筛选分离、应用等研究已有1 0 0 多年历史，但是取得大 规模、持续应用的尚未见报道，同时，有关草本纤维提取菌种的系统的多样性研究也未见报道。 具有一定的草本纤维提取功能的菌株在自然界中广泛存在，芽孢杆菌属、梭菌属和欧文氏菌 属在麻类等草本纤维脱胶中报道较多( 孙庆祥，1 9 8 1 ；刘正初等，2 0 0 2 ) ，而自腐菌是属于担子 菌亚门的真菌，是唯一能够同时降解木材主要成分的微生物( k i r k tk e ta 1 ，1 9 8 3 ；艾尼瓦尔等， 2 0 0 2 ) 。已见报道具有草本纤维提取功能的微生物涉及细菌、丝状真菌以及酵母，麸3 5 属6 5 种， 主要有：嗜果胶颗粒状杆菌( g r a n u l o b a c t e r p e e t i n o v o r u n ) 、第三芽孢杆菌( c l o s t r f d i u r a t e r l i u m ) 、 果胶芽孢梭菌变种( c l o s t r j d i u m p e c t i n a v o m m v a r v a r p s e u d o p l e e t f i f o r m ) 、黄麻芽孢杆菌( b a d l l u s c o r c h o r u s ) ，柯氏芽孢杆菌( b a c i l l u sc o m e s i t l t o s s o 、浸麻芽孢杆菌( b a c i l l u s c e r e u s ) 、多粘芽孢杆菌 ( b a c i l l u s p o l y m y x a ) 、蜡状芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 、短芽孢杆菌( b a c i n u sb r e v i s ) 、蜂房芽孢杆菌 ( b a c i l l u sa l v e i ) 、巨大芽孢杆菌( b a c i l l u sm e g t h e f i u m ) 、藤黄微球菌( m i e r o c o c e u sl u t e u s v a r ) 、铜绿板 毛杆菌( p s e u d o m o n a sa e m g m o s a ) 、铜绿假单孢菌属( p s e u d o m o n a xa e r u g m o s a ) 、常现青霉( p e n i e i l l i u m f r e q u e n t a n s ) 、米曲霉( a s p e r g i l l u sa r y z a e ) 、黑曲霉“s p e r g i l l u sn i g e r ) ( k g m c b a r a n a n ，e t c ，1 9 8 7 ： k u r a k a