（微生物学专业论文）蜡样芽胞杆菌6371的多效性及发酵条件的研究.pdf

学位论文独创性声明 本人郑重声明： l 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 望6 4 2 6 8 6 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 1 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名：多啤卅 日期：w 口妒 罗 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利i f l 的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密厉适用本规定。 作者签名：j 毒胡 日期：训中s i 南京师范大学2 0 0 4 届硕十学位睑文 蜡样芽胞杆菌的多效性投发酵条件的研究 摘要 本文以蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 ( b a c i l l u sc e r e u s 农业微生物菌种保藏中心提供) 为材料，研究了其生物学功能，蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 具有抗病原菌特性、氨化作 用，可降解有机磷，溶解无机磷，促进植物的生长，增加植物的抗逆行，为一种 多效菌。并对该菌的发酵条件以及由该菌制成生物肥的工艺进行了研究。 蛋白质浓度越高，氨化量越大，可利用糖抑制氨化作用。蜡样芽胞杆菌在代 谢过程中产生大量的有机酸，苹果酸、乙酸、琥珀酸含量较高。将蜡样芽胞杆 菌6 3 7 1 施于土壤中，植株的过氧化氢酶、过氧化物酶活性提高，从而提高植株 的抗病虫、抗逆境胁迫的能力；叶绿素含量提高，光合作用强度增加，能促进植 株的生长。蜡样芽杆胞菌对棉黄萎菌、婆婆纳刺盘孢有抗性，抗菌物质在菌体孢 囊期产生，具有耐热性，等电点在p h 3 0 左右，可用7 0 的饱和( n h 4 ) 2 s 0 4 或2 倍体积丙酮沉淀，葡萄糖、蛋白胨最适宜抗菌物质的产生。紫外诱变得到具有抗 人参炭疸菌的蜡样芽胞杆菌菌株。 获得高发酵单位( c f u m 1 ) 足生产生物肥的关键。因此本文通过单因子及正 交试验对蜡样芽胞杆菌的培养基组成( 碳源、氮源、无机盐) 及工艺条件( 起始p h 、 装液量) 进行了研究。碳源、氮源比值大，碳源利用率降低，相反，则大，培养 液中适量加入m g s 0 4 7 h 2 0 、k 2 h p 0 4 、c a c 0 3 有利于菌量的提高。可溶性 碳源、氮源利于芽胞形成，芽胞形成需要有充足的氧气。结果表明比较理想的配 方是：豆饼粉2 、玉米粉0 5 、m g s 0 4 7 h 2 00 1 、k 2 h p 0 4o 0 5 、 c a c 0 3 0 1 。起始p h 7 0 ，培养温度3 0 。c ，装液量2 0 m l 2 5 0 m l 锥形瓶。在此基 础上利用镇江东方生物工程设备公司生产的7 l 发酵罐进行发酵，发酵参数设计 为3 5 0 r m i n 、通气量3 ：1 ，在此条件下芽胞量可以达到7 2 亿毫升，培养周期 4 8 小时。本研究将为工业化生产提供有益的参考。 关键词：蜡样芽胞卡t 菌，多效性，诱变，发酵，菌量，芽胞 露泰邸整天学2 0 0 4 瑶硬学缝论义 蠛样茅拖辑莹靛多效性及发酵条稃的研究 a b s t r a c t b i o l o g i c a l f u n c t i o no fb a c i l l u se e e 毓s6 3 7 1o f f e r e d b yc h i n aa g r i c u l t u r e a c a d e m y w e r es t u d i e di nt h e p a p e r b a c i l l u s c e r e u s6 3 7 1w i t ha n t i m i c r o b i a la c t i v i t y ， a m m o n i f i c a t i o nc o u l dd e c o m p o s e o r g a n i cp h o s p h o r u s ，d i s s o l v ei n o r g a n i cp h o s p h o r u s ， p r o m o t eg r o w t ho f p l a n t a n dr e i n f o r c er e s i s t a n c eo f p l a n t ，s ob a c i l l u sc e r e u s6 3 7 1 h a v em u c hb i o l o g i c a lf u n c t i o n i na d d i t i o n ，f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，f e r m e n t a t i o n t e c h n i c sa n d s p o r e f o r m i n gc h a r a c t e r i s t i cw e r e a l s od i s c u s s e di no r d e rt or e a l i z et h e i n d a s t r i a l i s a t i o no f b a c i l l u sc e r e u s6 3 7 1 p e p t o n e ，g l u c o s e w e r es u i tt op r o d u c eo f a n t i b a c t e r i a la g e n t i tw a sd i s c o v e r e dt h a t l a r g ea m o u n to fo r g a n i ca c i d w a s p r o d u c e di nt h em e t a b o l i s mo f b a c i l l u sc e r e u s 6 3 7 1 ，o f w h i c ht h ea m o u n to f m a l i ea c i d ，a c e t i ca c i d ，s u c c i n i ca c i dw a sm o r et h a n 攮e o t h e r a c t i v eu n i to f p e r o x i d a s e ，c a t a l a s e i n c r e a s e da f t e rc u l t u r eo fb a c i l l u sc e r e u s w a sf e r t i l i z e di n t os o i l ，a sar e s u l t ，t h ea b i l i t yo fp l a n tr e s i s t i n ga d v e r s i t yw a s e n h a n c e d ，t h ea m o u n to fc h l o r o p h y l i n c r e a s e da l s o ，s o p h o t o s y n t h e s i si n t e n s i t y i n c r e a s e d ，t h eg r o w t ho fp l a n tw a sa c c e l e r a t e d b a c i l l u sc e r e u s6 3 7 1 r e s t r a i n e d g r o w t h o f c o l l e t o t r i c h u m ，v e r t i c i l l i u ma l b o a t n r m a n t i m i c r o b i a la g e n tw h i c h c o u l d b e p r e c i p i t a t e db y ( n h 4 h s 0 4 o ra c e t o n ew a sp r o d u c e di nt h e p r o c e s s o f s p o r e f o r m i n g ，i s o e l e e t r i cp o i n to f a n t i m i c r o b i a la g e n t w a s p h 3 0 o rs o ，t h es c o p eo f b a c i l l u sc e r e u sr e s i s t i n gn o s o p h y t ew a sa m p l i f i e db ym u t a g e n s i s ， o b t a i n i n gt h e 越g hl e v e lo f c f u m li st h ek e yi np r o d u c i n gb i o l o g i c a lf e r t i l i z e r t h e r e f o r e ，t h em e d i ac o m p o n e n t sa n d c u l t i v a t i o nc o n d i t i o n so fb a c i l l u sc e r e u sw e r e i n v e s t i g a t e dt h r o u g hs i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a lt e s t s d i s s o l v i n gc a r b o ns o u r c e ， n i t r o g e ns o u r c ew e r es u i tt os p o r e f o r m i n g , o x y g e nw a s e s s e n t i a lt os p o r e - f o r m i n g 。 t h et e s t ss h o w e dt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nm e d i t u nw a sc o n s i s t e do f c o r nf l o u r 4 ，b e a nc a k e1 5 ，k h z p 0 4o 1 5 ，2 0 m li n v e n t o r y 2 5 0 m lf l a s ka n d i n i t i a l p h 6 0 7 5 ，i nt h i sc o n d i t i o nt h eb i o m a s sw a s7 2 1 0 8 c t h m l ，m e d i aa n di n c u b a t e c o n d i t i o nw e r ea l s ou s e di nt h ef e r m e n t o r t h es t u d yw i l lp r o v i d eb e n e f i c i a l r e f e r e n c e s f o rt h ei n d u s t r i a l i s a t i o no f b a c i l l u sc e r e u s6 3 7 1 + k e y w o r d s ：b a c i l t u sc e r e u s ，m u c hb i o l o g i c a lf u n c t i o n ，m u t a g e n s i s ，f e r m e n t a t i o n 5 南京帅范火学2 0 0 4 届硕士学位论文 蜡样芽胞杆菌的多效性及发酵条件的伊f 究 我围是一个农业大国，也是一个肥料消费大国，据统计1 9 8 8 年我国化肥产 量达2 9 5 6 万吨，占世界总产量的1 9 ，1 9 9 8 年化肥使用量达3 8 1 6 吨，近年来 化肥用量仍有上升趋势。但是近2 0 年来由于农业生产中过量使用化肥带来的负 面影响也愈来愈明显。现实情况是化肥利用率不高，肥效下降，土壤出现板结、 酸化，有机质含量下降，土壤根际微生物失衡，农作物病虫害增加，农产品质量 变差i ”。在作物病害防治方面，使用了大量的化学农药，施用化学农药尽管有很 好的效果，但费用较高，环境及农产品受到农药的污染，农产品质量下降，影响 人类的健康。长期使用农药也会增加病原菌的抗性，其结果导致农药的施用量增 加，成本提高，污染加重，有的则难以达到预期防治效果。 我国人口日益增加，人民生活水平不断提高，对农产品的质量和数量提出 了更高的要求，由于耕地不断减少，化肥施用量大，生产成本直线上升，环境不 断恶化等原因，微生物肥料的综合利用显示了它在农业生产方面的应用优势和十 分良好的应用前景f 2 一“j 。同时城市和农村废弃物要求消纳的压力越来越大，要 求无害化处理和综合应用，微生物肥料及相应的制剂同样有良好的应用前景。 中科院科学院士，我国土壤微生物学奠基人，华中农业大学陈华葵教授就 微生物肥料的含义指出，所谓微生物肥料，“是指一类含有活微生物的特定制品， 应用于农业生产中，能够获得特定的肥料效应在这种效应中，制品中活微生 物起关键作用，符合上述定义的制品应归入微生物肥料。” 【3j 微生物肥料的功效是一种综合作用，对植物的影响具有综合效应，微生物通 过其生命活动，增加植物营养的供应量，使植物产量增加。但微生物生命活动的 关键作用不限于植物的营养供应水平，还应包括它们所产生的植物生长刺激索对 植物的刺激作用，促进作物对营养的吸收，或者是拮抗某些植物病原微生物的致 病作用，减轻作物病害导致产量增加，如植物根际促生细菌( p l a n tg r o w t h p r o m o t i n gr h i z o b a c t e r i a ，简称p g p r ) 即属于此类5 矗7 8 1 。 微生物肥料生产成本 低，应用效果好，不污染环境，施用后不仅增产，而且能提高农产品质量和减少 化肥使用量，因此在我国农业可持续中占有重要的地位。 一、微生物肥料的作用及机理 1 、增进土壤肥力根瘤菌类、自生和联合固氮菌类微生物肥料可以固定空 南京师范大学2 0 0 4 屈硕l 学位论文蜡样芽胞杆菌的多效性及发酵条件的研究 气中的氮素，增加植物的氮素营养 9 。“。生活在根瘤里的根瘤菌类菌体利用豆科 植物寄主提供的能量将空气中的氮转化成氨，进而转化成谷氨酰胺和谷氨酸类植 物能吸收利用的优质氮素，供给豆科植物氮素营养。 2 、制造和协助农作物吸收营养解磷菌能分解有机磷，溶解难溶性的无机磷， 其机制很多，但最主要的有两种，( 1 ) 产生各类有机酸( 如乳酸、柠檬酸、草酸、 甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、a 一羟基酸、葡萄糖酸等) 和无机酸( 如硝 酸、亚硝酸、硫酸、碳酸等) ，降低环境中p h 值，使难溶性磷酸盐降解为有效 磷，或认为有机酸可螯合闭蓄态f e 、p 、a 1 、c a ，使之释放有机磷，( 2 ) 产生胞 外磷酸酶，酸性磷酸酶( a p a s e ) 催化磷酸脂或磷酸酐等有机磷水解释放p o 。3 ， r n a 酶( r n a s 0 水解r n a 释放p i 3 1 。v a 菌根真菌肥料具有促生作用，机理之一 就是其与土壤的磷素营养供应密切相关，一方面通过根外菌丝延伸可达几厘米， 甚至十多厘米以增加吸收范围，另一方面是胞外磷酸酶活性高。硅酸盐细菌类肥 料则能对土壤中云母、长石、磷灰石等含钾、磷的矿物进行分解，使难溶钾转化 为有效钾，正由于这种“解钾”作用，这类细菌也俗称“钾细菌”。【”1 1 2 1 近年来 的研究表明，使用微生物肥料可以减少化肥用量，改善作物品质，降低农业投入、 提高农作物产量、改善土壤结构、保护生态环境，有一定的经济效益和社会效益， 但微生物肥料不能完全代替化肥，它是化肥的一种补充。 3 、分泌促进植物生长的物质有关微生物肥料促进植物生长的机理研究表明， 微生物活动产生的植物激素、酸性物质以及维生素都能不同程度地刺激植物的生 长。目前，对根际促生细菌产生i a a 的作用及机制的研究较为深入，而对g t 、 c t 、c b a 、乙烯的研究报道还相当少。现已证实，假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p ) 、 枯草杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 等5 0 个种中发现4 8 个种产生植物生长激素，2 9 个 种产赤霉素，4 5 个种产激动素。荧光假单胞菌产赤霉酸、青霉素，部分产吲哚 乙酸、维生素。恶臭假举胞菌产吲哚一3 一乙酸、吲哚3 一乳酸、赤霉素等。玉米根 际的固氮螺菌属( a z o s p i r i l l u m ) 固氮并产生调节物质、铁载体、抗生素和有机酸， 从而促进玉米生长盼| 4 1 。各种微生物肥料通过自身三羧酸循环产生的许多有机 酸除了有螯合作用和酸溶作用外，其本身就是一种生理活性物质，可促进作物7 j 三 长。有研究表明1 ：1 的琥珀酸与乳酸混合，在l o x1 0 。6 时，使得植物根生长量增 加4 0 。水杨酸( s a l i c y l i c ，s a ) 是一种铁载体，可使植物产生系统获得性抗性。同 7 南京师范大学2 0 0 4 届硕l 学位论史蜡样芽胞杆菌的多效性及发酵条件的研究 时水杨酸本身又是+ 种激素，町诱导植物开花和产热，可以抑制乙烯的生物合成， 还可以促进种子萌发，抑制伤信号转导。 4 、增强植物的抗逆性有些微生物肥料的菌种接种后，由于在作物根部大量 生长繁殖，成为作物根际的优势菌，由于它们的生长、繁殖，抑制或减少了病原 微生物的生长繁殖机会，有的还有抗病原微生物的作用，起到了减轻作物病害的 功效。菌根真菌由于在作物根部的大量生长，菌丝除了吸收有益于作物的营养元 素外，还有增加水分的吸收，利于作物的抗旱能力陋1 6 】。 5 、分泌抑菌物质，抑制病原菌的生长发育 许多用作微生物肥料的微生物产生抗菌素、胞外酶和氰化氢等而改变根圈 微环境平衡。恶息假单胞菌对豌豆上的镰刀菌有防治作用，与促使根内木质素增 加有关”】，近年来研究发现，p g p r 对控制病原线虫有作用”1 。产生抑病作用的 物质实验证明，许多芽胞杆菌可产生抗菌肽，并有一定的选择性1 9 】，从丝瓜根部 分离到强烈抑制玉蜀黍赤霉病菌的拮抗菌枯草杆菌。 6 、有利于农田污染物的降解 r o b e r t 研究表明，有些微生物对三氯乙烯、芳香族化合物及除草剂有降解作 用【2 3 。已经证明：谷胱甘肽转移酶在革兰氏阴性菌若干属中存在，尤其是存在于 肠杆菌科( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) 并u 假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 中的一些种，通过谷胱 甘肽的结合作用除去除草剂中的氯。 二、微生物肥料的发展趋势 1 、由豆科作物接种剂向非豆科用肥方面发展 微生物肥料起源于豆科作物专用根瘤菌接种剂，然而，豆科作物种植面积在 我国较小，对肥料需求量远不如粮食作物大，加之，大豆、花生产区经常用根瘤 菌剂就会出现老产区接种效果差的问题，因而四十多年来我国根瘤菌剂生产和应 用量一直不大，始终没有形成产业规模，今后微生物肥料势必将转向非豆科粮食 作物用肥。 2 、由单一菌种向复合菌种方面发展 豆科作物接种根瘤菌只能选用相应接种族的根瘤菌种，但是，由于微生物肥 料的肥效并非单一功能作用结果，因而必然发展到多种菌的复合。目前，国内微 盟物肥料多趋向于将固氮菌和磷、钟细菌复合在一起施用，使得微生物肥料能同 南京师范大学2 0 0 4 届硕士学位论文 蜡样芽胞杆菌的多效性及发酵条件的研究 时供应作物氮、磷、钾营养元素。 3 、由单功能向多功能方面发展 微生物肥料由于其微生物活动的特性，必将在微生物种群繁殖生长的同时向 作物根际分泌一些次生代谢产物，而其中的一些次生代谢产物具有改善植物营 养、刺激生长和抑制病菌等综合功能。许多微生物的功能，也不是单一的，有些 自生固氮菌除有固氮作用外，还能抑制病菌，有些杀虫细菌同时具有抑菌作用， 许多微生物都有刺激植物生长作用。因此，微生物肥料将向功效的多样化方向发 展；除要求有肥效外，还可开发兼有防治土传病害( 如小麦全蚀病、西瓜和棉花 枯萎病) 的生物肥料。 4 、由无芽胞菌转向芽胞菌种 目前，我国应用的各种微生物肥料中固氮菌类( 包括根瘤菌类) 都是无芽胞 菌类。由于无芽胞杆菌不耐高温和干燥，在剂型上只好以液体剂或将其吸附在基 质中制成接种剂，咀便于存储和运输。液体剂或固体菌剂用作拌种剂，每公顷用 量很少，如作为基肥则用量大，难以运输和施用，成本也高。无芽胞菌抗逆性低， 制成液体剂或吸附剂都不耐存储，难以进入商品渠道。因此，微生物肥料今后的 发展必然在剂型上要有革新，要求菌种的更新换代，即应选用抗逆性高、能长时 间存储的芽胞杆菌属2 ”。如现已为国际承认的有固氮作用的需氧芽胞细菌， 多粘芽胞杆菌( b a c i l l u sp o l y m y x a ) ，其中一个有较强圃氨能力的变种于1 9 8 4 年 定名为固氮芽胞杆菌( b a c i l l u sa z o l o f i x a n s ) ，其固氮酶活性可达6 9 - 2 4 0 1 0 6 t ag 分子乙烯m l h ，用凯式定氮法检定其固氮能力为3 3 6 0 m g n g ，此类菌剂8 0 0 c 干燥制成千粉后可长期储存，适合于制成粉状或颗粒状微生物肥料，是固氮菌类 更新换代的最佳菌种。 三、我国微生物肥生产应用现状、需求及发展趋势2 “2 2 1 1 初步形成了微生物肥料产业，有一定的规模水平。国内目前约有3 0 0 个企一q k q - ： 产微生物肥料，年产量超过1 0 0 万吨。整体生产设备，工艺水平都有了较大的提 高。 2 品种繁多，使用的菌种不断扩大 3 使用效果逐渐被农民认可，使用面积不断扩大。 4 行业管理初步形成，质量意识也开始深入人心，质检系统初步形成。农业部微 澎京静范夫学2 0 0 4 届硬圭学位论文 蜡棒芽魅杆落敷多效性教发簿条 孛盼礤究 生物肥料质枪中心1 9 9 6 年正式运转，发布了行业标准，微生物肥料的登记和质 嫩管理将逐步走上科学孰道 2 3 】。 5 少数产瑟开始送入鼙际市场，蠢硅酸簸毽裁。 四、蜡样芽胞杆菌在农业生产中的应用 蜡样芽胞抒菌是一种根际微生物，日就在微生物月骸料产生的色胺的机理研究 申发现有六耪途径，色胺代游途径中，哭发蜣靖襻芽黥释蔻能产釜德蒎酸髓羧酶， 浙江省农业科学院微生物研究所从浙江锶不同地区、不同土壤的油桨、大小麦根 隧分离筛选出六株蜡样芽胞杆菌，处理种子，做种予发芽实验，接种到太羽，观 察键株防瘸效粱，室内溅定冀转佬寿梳、无税磷髓力及氮纯作蘑，实验结果表舞 蜡样芽胞杆菌有提高幼苗索质，促根增麓、增穗、增粒、键株、防瘸效果和提高 产量等效果 2 4 - 3 0 。 蟮样茅瑰释毽是一些豁类作戆、蔬菜及糖本酶内釜菌【3 ”，可遥过骜身代澈产 物或存在本身借助信号传蜉作用对植物体旌加影响，中国农业大学植物生态研 究联联研究豹增产嚣是从槭物体内分离筛选的多株芬腿籽菌，多数隶属蜡样芽胞 秆藏。嚣前，毫产上使蘑熬瀵产菌菌株s 3 1 0 、a - 4 7 、m 2 2 等均为臻榉芽服轷蓠。 尤其引起注意的是蜡榉芽胞杆菌在代谢过程中，能够产生并分泌一种抗菌物 蠖抗菌肽，抗菌肽选择性地抑制多种植物病害，对多葶孛植物病露有明显的抑 制作用，耱减轻漓菜菌孩瘸，大麦赤霉瘸，水稻绞枣鑫瘸，永稻自 稽瘸等的发疯 程度3 0 1 。西南农业大学生物技术研究中心从棉花的微管束组织分离出蜡样芽胞秆 麓对对多秸植物病原菌有嘲最的抑制作髑f 3 2 】。 聂、蜡祥芽胞杼菌6 3 7 1 豹功效 本菌肥蜜验室开发利用的微生物肥料已经过室内测定和田间试验，具有提高 幼萤素质，键避根系生长，抗病，提高产量等效应。目前实验室选髑的主要为势 臌栝菌。l 圭l 芽胞秆菌翎成的菌裁具有耐热、耐辐骞聿、懿麓稳定、傈旗麓长等特点。 蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 为其中的一个菌株。蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 能转化有机氮磷及无 枫磷能力，产生并分泌夺机酸，降解壤中难溶性无帆麓，增加无枫箍的供应， 产生并分泌虢菌物质，赫澜病原菌的垒长，增强植物掇逆境胁遣靛黥力。鉴于鼷 样芽胞杆菌熟有上述特点，所以蜡样芽胞杆菌为一种多效菌。 六、课题研究内窖 潜哀师范大学2 0 0 , 4 弱硬 ，学垃论文蝾# 劳艇拇蓥豹多效髓艇发酵条棒鲍研究 本选题从应用角度出发，以蜡样芽胞杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 6 3 7 1 为材料，探讨 蜡样芽胞杆菌的氨化作用，转化有机、无桃磷的能力，抗菌效果及对作物生长发 裔豹影舔，熏点送行貉祥势魏杼菌静发酵祭 牛的侥纯瓣辑究，鏊豹怒为了实褒多 效菌蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 的工业化生产， 甲醛滴定法测定铵盐的降解量，钼蓝比色法测寇稳机、无机磷的转化量，根 禚培养基中麓萄糖、蛋童艨瓣含量，磷怒谈源、氮滚对疆样芽藤移落6 3 7 1 氨纯 作用影响。有机酸和无机酸可使难溶憾凭机盐降解为供植物吸收的有效营养成 分，采用高效液钼色谱法确定培养条件对蜡样芽胞杆麓6 3 7 1 产生有机酸的影响。 邋过抗菌实骏溺定暗样芽臆符蓥6 3 7 1 豹抗茜谱，遥避诱交实验扩大媾棒芽藏移 谣6 3 7 1 的抗荫范围，初步分离抗菌物质，并测定碳源、氮源对蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 产生抗菌物威的影响。 时绿素含戆、遂氧纯豹酶、过氧纯鬣酶静活往是德秘三个重要辫标，终耘盱 绿素含量高，光合作用强度大，有利于产懿提高，过氧化物酶、过氧化氢酶等与植 物的抗瘸抗胁迫能力有关，选用这三个指标，根据处理与对照的菱异，了解蜡样 芽胞秆菌6 3 71 对植物生长发育的作蘑。 蜡样芽胞杆菌菌剂是f ；i i 其芽胞制成的，这是保证其活菌数的关键，芽胞制剂 具有耐热、耐辐射、性能稳定、保质期长等特点。为了实现多效菌蜡样芽胞杆荫 工业纯生产，本文重点探讨其发酵条讳及芽施形成特魏，采蘑擎戮子试验帮正交 试验，通过改变培养基成分、p h 、装液艇等操作条件，检测蜡样游胞杆菌6 3 7 1 的菌量及芽臌，以实现单位体积豹发酵波有较大的菌缀、较大芽胞挺。在研究过 程中，籀摄赡样芽照杆菌6 3 7 1 黪各麓藏俸，并搽讨辩量与芽骢形成静关系，褥 示二者之间的联系，为工业化生产提供商盏的参考。 南京师范人学2 0 0 4 届硕上学位论文蜡样芽胞杆菌的多效性发发酵条件的研究 第一章蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 的氨化作用 及降解有机、无机磷的研究 土壤中存在相当数量的动植物残体，含有大量的有机磷及有机氮，有机氮经 微生物的分解产生氨的作用称为氨化作用，氨化作用在农业生产中十分重要，许 多芽胞杆菌都具有此功能3 3 , 3 4 。有机磷经蜡样芽胞杆菌、多粘芽胞杆菌等分解才 能转变为可被植物吸收的磷酸盐的状态p3 1 。土壤中难溶性的磷酸盐及其它无机 盐，经微生物作用转变为可溶性的，主要因为微生物生命活动中产生有机酸、无 机酸促进溶解磷酸盐及其它无机盐 1 1 , 1 2 , 1 4 1 。蜡样芽胞杆菌只能利用有机氮，不能 利用无机氮，蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 作生物肥，在代谢过程中，降解蛋白质并使一 部分蛋白质氨化，产生并分泌磷脂酶及有机酸，分解有机磷，溶解难溶性的磷酸 盐及其它无机盐，增加了植物元素营养的供应量。 一、材料和方法 1 菌种蜡样芽胞杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 6 3 7 1 ( 农业微生物菌种保藏中心提供) 2 培养基 斜面培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。 无机磷合成培养基：葡萄糖3 、蛋白胨0 7 5 、k c i o 1 、m g s 0 4 0 1 、c a c o s o 1 、 磷酸三钙0 5 、p h 7 0 。 有机磷培养基：葡萄糖3 、蛋白胨0 7 5 、k c i o 1 、m g s o a o 1 、c a c 0 3 0 1 、 卵磷脂o 5 、p h 7 0 。 1 0 卵黄琼脂培养基：肉浸液1 0 0 0 毫升、蛋白胨1 5 克、氯化钠5 克、琼脂2 5 3 0 克、p h 7 5 、1 2 1 高压灭菌1 5 分钟，临用时加热溶化琼脂，冷至5 0 。c ，每毫升 培养基中加5 0 n 萄糖水溶液2 2 毫升和5 0 卵黄盐水悬液1 0 1 5 毫升，摇匀， 倾注平板。 3 仪器和设备 d h z d 冷冻恒温震荡器、o l y m p u s 显微镜、q l9 0 1 涡旋混和器，微型滴定 管，1 0 m l 锥形瓶，1 0 m l 容量瓶。 4 铵盐的测定。” 0 o l m o l 1 n a 0 h 溶液的配制和标定。 用刻度移液管移取1 o o m l 样品溶液于1 0 m l 锥形瓶中，用滴定管加1 5 滴甲 薅寨师范大学2 0 ( 1 4 缡硕+ 学垃论文蜡样芽融毒手蔫抟多效牲驶发酵条事 的研究 麟溶液和一漓酚酞指示剂，充分摇匀后放置1 分钟，用n a 0 h 标准溶液滴定至溶 液呈微红色持绥半分钟不遐，即为终点，记录n a 0 h 标准溶液所用体积，平行滴 定3 4 浚。 5 ，无机磷或有机磷测定 向2 5 0 m l 三角瓶中加入5 0 m l 无机磷或有机磷培养基，再接种l m l 菌种悬 浮滚，露时效不按耱对照( 培莽基中熬入l m l 无藜承) ，3 0 4 c ，1 8 0 r m i n ，摄荡 培养4 8 小时精，在4 c 下离心2 0 m i n ( 5 0 0 0 r m i n ) ，赢接用p h 计测定上清液中 的p h 值，同时用钼蓝比色法测定上清液中的磷含量 3 5 。所有处理都做3 次重复。 6 有稷酸溺建 6 1 培养液中商机酸组成及其含量的测定 将发酵液的离心上清液用微孔滤膜过滤后用h p l c 测定有机酸的组成和含 繁。色谗条箨i 分；甄柱w a t e r p i c o ，t a g ，f a a 3 0 0 x 3 。9 r n m 拄；援测波长2 1 0 n m ： 流动相0 0 i m o l lp h 2 1 磷酸二氢氨溶液( 磷酸调节p h ) ；流速1 8 m l m i n ；柱 漱3 0 c 。培嚣液的酸度用p h 计测定 3 6 3 9 。 6 2 鸯辊酸定戴定量静方法 有机酸定性：以保留时间、样品加标和各有机酸紫外吸收光谱来定性。 有机酸定性定量：将备有机酸标准溶液系列在上述色谱条件下进行，以峰面 羧努标法定爨。 二二结果 1 ，蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 的氮化作用及碳氦源对其的影响 裹等疆穆铰戆疆渡纯会惫豹氮，霹瑷汲毅羹基酸、天冬蘸蒎暴爨等骞掇氮化 物，而无机氮化物中又以锻盐和硝酸盐为主，蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 不能利用无机 氮化物，只能利用有机氮化物，在利用有机氮化物的同时，将一部分有机氮化物 蘸纯，供棱貔寝 | 5 裂爱。铵釜甲醛爱应戆方鬟式隽： 4 n i t 。+十6 h c h 0 ： ( c b ) 。n j + 6 1 t 。0 十 3 h 反应液消耗的n a 0 h 摩尔数与铵盐摩尔数相等，所以可根据滴定时所用的n a 0 h 黪 容数或n a 0 1 t 戮准渡薅较数确定赣襻芽熬事 蓥6 3 7 1 熬鬣纯量。 ( 1 ) 固定氮源浓度，变动碳源浓度 见图卜3 ，无论蛋白膝浓度是5 m g m l 、1 0 m g m l 、1 5 m g m l ，增加葡萄糖浓 发，降解懿镶签或氢基酸瓣量都会减少， 说舞穰蘩糠浓发越大，终籍蕊铵婺酶 南京师范人学2 0 0 4 届顾士学位论文蜡样芽胞杆菌的多效性及发酵条件的研究 量越小，葡萄糖能减少氨化量。 刘蠹、 名n 垂3 。 篱。1 葡萄糖浓度( m g m 1 )葡萄糖浓度( m g m 1 ) 图i 蛋白胨浓度5 m g m l 图2 蛋白胨浓度1 0 m g m l 、 1 01 53 04 56 07 5 葡萄糖浓度( m g m 1 ) 图3 蛋白胨浓度1 5 m g m l ( 2 ) 固定碳源浓度，变动氮源浓度 从图4 - 5 可以看出，当葡萄糖浓度3 时，蛋白胨浓度从o 5 增加到1 7 5 ， 降解的铵盐或氨基酸的量始终再增加，当葡萄糖浓度4 5 1 n ，降解的铵盐或氨 基酸的量也是随着蛋白胨浓度增加而增加，说明蛋白胨浓度越大，降解的铵盐量 越大。 名2 、， 鐾- 燃 罨0 5751 0 12 51 51 7 5 蛋白胨浓度( m g m 1 ) n ，矿舻帝 蛋白胨浓度( m g m 1 ) 图4 葡萄糖浓度3 图5 葡萄糖浓度4 5 ( 3 ) 固定碳源、氮源的配比，按比例增0 口碳源、氮源浓度 见图一6 ，随着基质浓度的增加，滴定所用n a o h 标准液的体积几乎按比例 4 8 6 4 2 o 南京师范人学2 0 0 4 屑硕卜学位论文蜡样芽胞杆菌的多效性及发酵祭件的研究 增加，说明降解的铵盐量增加，所以基质浓度越大，降解的铵盐量也越大。 鞋15r 蓑= l p p h 譬io 引，。一 星o lt 一一 2 53 1 33 754 3 85 0 5 63 基质浓度( m g m 1 ) 图6 基质浓度对铵盐降解量的影响 2 转化有机磷及无机磷的能力 有机磷分解 光目l 磷分解 图7 蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 解磷能力 在有机磷培养基接种蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 ，以不接菌作对照，由图7 可见， 蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 菌株具有很强的分解卵磷脂的能力，蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 之所 以能分解有机磷是因为其产生并分泌磷脂酶到环境中去 在无机磷培养基中，蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 具有很强的分解c a 。( p 0 。) z 的能力。 未接菌的培养液的p h 值为6 8 ，接菌的发酵液的p h 值为6 0 ，说明菌体在生长 过程中产生有机酸并将有机酸分泌到培养液中去，故认为可能是因为有机酸与 c a 。( p o 。) 。作用，将其转变为可溶性磷酸盐。 3 高效液相色谱测定培养液中的有机酸 土壤中存在的难溶性磷酸盐及其它无机盐经有机酸( 如乳酸、柠檬酸、草酸、 甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、a 一羟基酸、葡萄糖酸等) 和无机酸( 如硝 酸、亚硝酸、硫酸、碳酸等) 作用，阶解为有效磷和可溶性的金属离子，供植物 吸收利用，有机酸除了有螯合作用承 酸溶作用外，其本身就是一种生理活性物 质，可促进作物生长。 南京师范大学2 0 0 4 届硕士学位论义 蜡样芽胞杆菌的多效性发发酵条件的研究 图8 - 2 起始p h 8 0 图8 - 1 起始p h 7 0 图8 有机酸高效液相色谱图 表1 有机酸含量( m g l ) 将发酵液离心，上清液用微孔滤膜过滤后，用h p l c 测定有机酸的组成和含 量。结果表明蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 在培养过程中分泌了大量的有机酸，由图8 及 表i 可以看出：蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 过滤液中苹果酸、乳酸、琥珀酸、乙酸含量 较高，延胡羧酸、草酸的含量较少。比较两种不同起始p h 的培养基，在两种不 同起始p h 培养基中，蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 代谢产生的各类有机酸含量是有差异 的。 三小结 蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 利用环境营养过程中，降解并氨化蛋白质，摇瓶实验证 实，蛋白胨浓度越大，葡萄糖浓度越小，基质浓度越大，氨化量越大，说明蛋白 质含量越高，氨化量越大，可利用糖浓度越大，氨化量越小，可利用糖抑制氨化， 至于蛋白质降解物为什么会有一一部分氨化，具体原因不清楚。 磷脂酶分解有机 磷，有机酸溶解难溶性的磷酸盐及其它无机盐。蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 作生物肥， 可通过其生命活动增加植物营养的供应量。 南京师范大学2 0 0 4 届硕士学位论文蜡样芽胞杆菌的多效性及发酵条件的研究 第二章蜡样芽胞杆菌对麦苗生长发育的影响 蜡样芽胞杆菌是一种根际微生物 2 6 - 2 9 】，又是一些禾谷类作物、蔬菜及树木的 内生菌，可通过自身代谢产物或借助信号传导作用对植物体施加影响3 ”，在 微生物肥料产生的色胺的机理研究中发现有六种途径，色胺代谢途径中，只发现 蜡样芽胞杆菌能产生色胺酸脱羧酶4 0 “”。蜡样芽胞杆菌的许多菌株作为增产菌 应用于农业生产。目前生产上使用的蜡样芽胞杆菌增产菌菌株有8 3 1 0 、a 一4 7 、 m 2 2 等。 一、材料和方法 1 菌种蜡样芽胞杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 6 3 7 1 ( 中国微生物菌种保藏委员会农业微 生物中心a c c c 提供) 2 培养基 斜面培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 发酵培养基：玉米粉2 、豆饼粉0 5 、m g s o a 0 1 、c a c 0 。0 1 、k t f z p o l o 1 、p h 7 0 3 仪器和设备 d h z d 冷冻恒温震荡器、o l y m p u s 显微镜、q l 一9 0 1 涡旋混和器。 4 盆栽实验 将菜园土过4 咖筛，转入高1 5 内径1 5 的盆钵内，每盆装一千克分干土，水 浇透后，播种，上面覆盖一层细土， 一组塑料盆喷洒菌悬液1 0 0 毫升，另一组喷洒1 0 0 毫升清水。 5 叶绿素含量的测定 于小麦一叶期，两叶期，三叶期，四叶期，五叶期称取叶片0 1 克，加入5 毫升水研磨，定容至l o 毫于i ，取2 5 毫升悬浮液，再加入1 0 毫升丙酮，3 0 0 0 r m i n 离心，取上清夜，以8 0 丙酮做对照，用分光光度计测定o d 6 4 5 n m 及o d 6 6 3 n m 根 据a r n o n 公式计算叶绿素的含量，以m g g - 1f w 表示“。 6 过氧化物酶活性的测定( 比色法) 称取植物材料1 克，加2 0 m m o l lk h 。p 0 4 5 m l ，于研钵中研磨匀浆，以4 0 0 0r m i n 离心1 5 分钟，倾出上清夜保存在冷处，残渣再用5 m l 溶液提取一次，合并两上 清夜，贮于冷处备用。在比色杯中加入反应混合液3 m l k h 。p o ，l m l ，入反应混合液 南京师范大学2 0 0 4 届硕士学位论文蜡样芽胞杆菌的多散性及发酵条件的研究 3 m l ，酶液1 0 0 ul ，立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量吸光度值，每 隔1 分钟读数1 次，读数于波长4 7 0 n m 行。以每分钟吸光度变化值表示酶活性大 小。即a 4 7 0 m i n m l 蛋白质表示“。“1 。 7 过氧化氨酶活性的测定 在反应杯内内加入过氧化氢磷酸缓冲液搅动1 0 分钟，插上电极，待记录为 一直线后，注入1 0 pl 待测酶液样品，立即记下最初9 0 秒内的放氧曲线。根据 样品的放氧曲线，计算得到每分钟的放氧量，在标准曲线上查得酶活性大小“”3 。 二结果 1 蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 对小麦叶绿素含量的影响 叶绿素含量是植物光合能力的重要指标，叶绿素含量高，光合作用强度大， 制造的有机养分多，有利于作物产量提高由图卜3 可以看出，小麦一叶期，处 理与对照之间，叶绿素含量没有差异，两叶期以后，小麦叶绿素a 、叶绿素b 、 及叶绿素总的含量总是处理高于对照，小麦之所以处理株的叶绿素含量高于对照 株，除与蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 增加土壤有效养分供应外，还可能因为蜡样芽胞杆 菌6 3 7 1 在代谢过程中分泌了某些激素类物质，促进了作物的生长发育。 哪i 怒3 攀2 。 ok 且。 l234 取样时期 臣处理 口对照 2 删 蟹1 懈 熊 古o 23 取样时期 圈处理 口对照 图叶绿素a 的含量( m g g - 1 f w )图二叶绿素b 的含量( m g g - 1 f w ) 8 一 i 珊6 l 牡j 麟4 喜0 2 悃 23 取样时期 圈处理 d 对照 图三叶绿素的含量tm g g - 1 f w ) 1 ：叶期，2 ：两叶期，3 ：三叶期，4 ：四叶期 南京帅范大学2 0 0 4 届硕上学位论文 蜡样芽胞杆菌的多效性发发酵条件的剐f 究 2 蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 对对植物体过氧化物酶( p o d ) 活性的影响 过氧化物酶是植物末端氧化酶之一，它能降解众多过氧化物，其活性亦与 植物生化过程及抗逆性明显有关，小麦在一时期、两叶期，三叶期，四叶期，五 叶期过氧化物酶酶活性较对照高，这也说明蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 能增加与植物的 抗逆境能。 2 藿 蒌- 量 心h 12345 作物生长时期 圈处理 口对照 图四蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 对植物体过氧化物酶酶活性的影响 1 ：一叶期，2 ：两叶期，3 ：三叶期，4 ：四叶期，5 ：五叶期 3 蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 对植物体过氧化氢酶( c a t ) 活性的影响 1 0 攀： 萼。4 0。b 函豳& 。 圈圈明 口硼 l2345 作物生长时期 图四蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 对植物体过氧化氢酶活性的影响 1 ：一叶期，2 ：两叶期，3 ：三叶期，4 ：四叶期，5 ：五叶期 在有氧条件下，绿色植物存在过氧化氢酶，叶片组织含有较高活性的过氧化 氰酶，主要存在过氧化体中，乙醛酸体中也有发现，其功能主要是清除光呼吸过 程或脂肪酸氧化形成的过氧化氢，由于过氧化氢可直接跨膜扩散，因而过氧化氢 悔在抵抗氧化的逆境伤害中扮演很重要的角色。过氧化氢酶有较广底物特异性， 它们与细胞壁酚类化合物产生有关，还可降解吲哚乙酸，因此在植物生长发育中 起关键作用。 施用菌剂后，小麦在一叶期、两叶期，三叶期，四叶期，五叶期过氧化氢酶 南寮师范大学2 0 0 4 塥颟七学位论文蜷撵芽胞耔蕊的多敛挫投发酵条 孛鹩础究 的活性较对照黼，说明蜡样芽胞杆菌6 3 7 1 能增加与植物的抗逆境能力，这可能 怒与蜡样芽胞拇菌6 3 7 1 生长过程中产生并分泌的生理活性物质有关。 三，讨论 研究结果袭明，施用菌种样芽胞杆菌6 3 7 1 菌肥瞄，小麦从一叶一心期到五 时期小麦叶绿索含量均有所提高，叶绿象含量高