（有机化学专业论文）新型手性肽核酸单体—大环多胺缀合物的合成与性质研究.pdf

新型手性肽核酸单体一大环多胺缀合物的合成与性质研究 有机化学专业 磅究生马裁建 糖导教耀余攀蒸教授 融核酸是一类模叛d n a 的发义核酸，它遴过对生物体肉的d n a 阮上特异 序列的识别、结合来阻止其转录、翻译等。现在p n a 类化含物在疾病的诊断和 治疗上已初步显示出其独特的作用。 大巧多胺化会甥是一类性震独特的佳秀配体，其骞良好的金属配位塞力， 其金属配合物作为人工酶模型广泛应用于核酸结构及功能研究、基因表达与调 控、撬瘗药镌静磷涮等垒穆、弦学耪医学铡蠢它翻在疾病治疗、控摹l 缨耱生 长和其他方面将会得到广泛应用。 本文致力于一种新黧手经熊核酸革体大环多胺酝台耪韵设计合成，并获得 了些有意义与缨果。 我们从l _ 半胱氨酸簸酸盐和尿嘧啶出发，设计合成了一系列含有特殊位点 连接瓣尿唆嚏豹鬟c 基酸秘二默，爨这些疑棱酸苹髂连接大臻多琏劳形成金震配 合物，并对配合物的一些特性做了初步的探讨。 关键谰：默核酸大环多黢合减尿崤睫 d e s i g na n ds y n t h e s i so fn o v e lc h i r a lp n am o n o m e r - c y c l e n c o n j u g a t e s s p e c i a l t y ：o r g a n i cc h e m i s t r y g r a t u a t es t u d e n t ：l i - j i a nm a s u p e r v i s o r p r o f x i a o - q iy u p e p t i d en u c l e i ca c i d ( p n a ) ，a sm i n c eo fd n a ，i sak i n do fa n t i s e n s en u c l e i c a c i d p n ac a r lp r e v e n td n a r n af r o m1 x a n s c n p t i o na n dt r a n s l a t i o nb yr e c o g n i t i o n a n db i n d i n gw i t ht h es p e c i f i c a ls e q u e n c eo fd n a o rr n ai no r g a n i s m n o w a d a y s ， p n aa n dt h e i ra n a l o g u e sh a v er e p r e s e n t e de x p r e s sf u n c t i o ne l e m e n t a r i l yi nd i a g n o s i s a n d t h e r a p yo fd i s e a s e s m a c r o c y c l i cp o l y a m i n e i sat y p eo f t m i q u ea n de x c e l l e n tl i g a n df o rc o o r d i n a t i n g m e t a li o n s m a c r o c y c h cp o l y a m i n em e t a lc o m p l e x e s 鹤e n z y m em o d e l sa r ew i d e l y u s e di nc h e m i c a lb i o l o g y , m e d i c i n ea n dg e n et h e r a p y i nt h i st h e s i s ，as e r i e so fn o v e lc h i r a lp n a m o n o m e r - c y c l e nc o n j u g a t e sh a v e b e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d p r e l i m i n a r ys t u d i e so i lt h ec h a r a c t e r so ft h e i rz i n c c o m p l e xh a v eb e e np e r f o r m e d s o m eu s e f u lr e s u l t sh a v eb e e no b t a i n e df i o mt h i s s t u d y t h et a r g e tc o m p o u n d sh a v eb e e ns y n t h e s i z e db yl - c y s t e i n eh y d r o c h l o r i d ea n d u r a c i l w i t ht h i ss y n t h e t i cm e t h o dw eh a v es u c c e s s f u l l ys y n t h e s i z e das e r i e so fa m i n o a c i d sa n dd i p e p t i d e st h a tc o n n e c tu r a c i lt oi t ss p e c i a lp o i n t t h e i rs f f u c t u r e sw e l - e i d e n t i f i e db ym sa n d1 h n m r k e yw o r d s ：p e p t i d en u c l e i ca c i d s ( p n a ) ，m a c r o c y c l i cp o l y a m i n e ，s y n t h e s i s ， u r a c i l 四川大学硕士学位论文 第一章肽核酸及箕类似物的合成与性质研究进展 1 1 引育 簌爱义帮爱基困翔发对痰瘸逮行治疗壹是分子生镌学领域研究鹣燕京 问题。寡聚核苷酸因能识别和作用于d n a r n a ，是最早提出的反义和反基因 药物f l 鬟。但这种反义梭酸类化食物夜结构上与d n a 或r n a 的麓采不大，仍 然是以磷酸二醮键为基本骨袈，致使其援易放体内的核酸薅识别弊馒之降勰薅 失散 3 , 4 1 。因此，能否寻找其他更有效的反义核酸类化台物，使其不易被核酸酶 降簿是翊题豹关键。予楚，逯肇来嚣瑷出了诲多嫠馋缝 奄瓣寡聚绫营酸类叛物 1 3 , - , 7 。其中，丹麦科学家n i e l s e n 等 8 1 于9 0 年代初合成的一种新型凑聚核管酸类 菇锡，鼓中性酌棒( 冬氨乙鏊) 首氨陂为绣褊擎元，替代了天然核酸中带电酶 磷酸二酸骨架。它的碱藻部分则通过旺甲羰基连接予甘氨媛中的n 原予上。因 其结构介于多肽和核酸间而被命名为肽核酸( p e p t i d en u c l e i ca c i d ，简写为 p n a ) 。英结构戏如下： p n a n i e l s e n 等的磷究表明，一定长度的p n a 类聚合物能以相当嵩的亲靼力， 序列特异地与互补的d n a 、r n a 杂交；同时，由于其结构的特殊性，使其不 爨受孩酸簿或蛋自酶辫解，在侮内具蠢稷磐鹅生爨稳定矬，麸瑟有幕望躐为一 类新的以基因为靶的制荆而广泛得到应用。目前p n a 已初步应用于分子水平 且 四川大学硕士学位论文 的疾病诊治中。 但是，p n a 类化合物不易穿透细胞膜，水溶性差，且杂交作用局限于一定 的离子强度下。所以，近年来化学家们进行了广泛的结构修饰，其中包括基于 原p n a 分子骨架的修饰【9 】，如链的延长，手性的引入等；还包括以完全不同的 含氨基和羧基化合物来构建结构单元，如以天然氨基酸作为主链单元等 1 q 。这 些修饰的结构都能在一定程度上改善p n a 的性质和功能。为了充分理解这类 分子的作用和构效关系，还需要合成更多不同类型的p n a 分子。 1 2p n a 及其类似物的合成 1 2 1p n a 单体的合成 目前，用于合成p n a 及其结构类似物的单体结构单元有很多种，其中一 个重要的差别在于它们对氨基和核酸碱基等所用的保护基 ( p r o t e c t i n gg r o u p ， p g ) 不同。另外，许多修饰p n a 将手性和非手性的骨架结构单元添加到n 一 ( 2 - 氨乙基) 甘氨酸基本单元上；还有一类是通过改变链的长短、骨架原子顺 序，或通过基团的替换、侧链的变化等合成p n a 结构类似物。这里将介绍一 些重要的单体结构单元以及它们的主要合成方法。先介绍含氨乙基甘氨酸骨架 的单体结构单元的合成。 典型的p n a 骨架由n _ ( 2 一氨乙基) 甘氨酸组成，它的第二个氨基被核酸 碱基乙酸衍生物酰化。通常使用酸或碱不稳定的保护基团临时保护主要的氨基 官能团。p n a 单体的合成可分为带保护基的n _ 氨乙基甘氨酸即主链骨架块2 的合成和核酸碱基乙酸衍生物即侧链块l 的合成两部分，先分别加以叙述。 h o lv o 眺c o o 一+ 氓一h “j 一氓n o u o r n 。 vv 、 2 四川大学硕士学位论文 1 , 2 , 1 1 圭链鸯黎决2 酶食藏 强下怒三零孛踅要款会戏路线： 1 h 2 n v n h 2 奠- h9 阮n h n 人。姆 p grab b o cm e i c i c i - h c 0 0 h ，2 m e o h h c l( b o c ) 棚，d i o x a n e h 2 0 1 1 b o c 国u ( b o c ) 2 0 , n e t 3 c h 2 c 1 2 f m o c 国u b r c h 2 c o o b u c h 2 c 1 2 m i n t e t i c i c h 2 c o o t b u ，2 。e t o h h c l c 1 c h 2 c o o t b u , n e h ，c h 2 c 1 2f 1 2 】 f m o c - o n s u , d i e a 【1 3 】 m - m t - c t , n e t 3 , c h 2 c 1 2 【1 4 2 、 o h oo 璩n 人滞业b o c - n h v 久- h 与泓n h 一，怒k 。r 鲻埘大学硕士学位论文 3 、 h o o o 黼n h 八，j j 几。m 。 oo 。刚八j j j 。h 上剐i j j 僦 h 。n 八n h 2 2 h c i a 一 。 融。辩h 八，j j 。融 h c l f i g u r e 3 毒f i 套p d c , h 2 0 ；协m e o h h c i ；c ) m i n t - c 1 , d m f , n e t 3 ； m f m o e ( o n s u ) , d i o x a n a l l 2 0 ；e ) m e o h h c l 1 2 1 2 侧键块j 的合成 以下怒孩酸碱基乙酸衍生物的一黧台成方法。 1 ) 胸腺嚏唆乙酸的合成不需要力h 碱基保护基圈就可以直接进行。 o o 峪墩 帅 0 甄删糟4 m t t h o d l 鼍趣1 1 b r c h z c o o m e , k 2 c o m d m f ；2 n a o h , h 2 0 m e t h o d 2 t 8 ：a ) b r c i t 2 c o o h , k o h , h , o 2 ) 胞嘧啶乙酸的台成一般采用c b z 或取代的苯甲酰基保护伯氨基，再和 溪乙酸率精等反反得弱l 位氮被烷纯的产耪，然后遂行永解搠，有褥荦孛安璇方 法。 4 4 四j i l 大学硕士学位论文 护。 h 瓣 掰 d 妁 l 矿l 占r 26 h f i g u r e 5 m e t h o d 堇：a ) 4 - t e r 4 r a y l b e a 雠l c h l o r k l e n e t 3 d m f ；秘玛珏弗9 鼬矗b i a 琢扫聪靶 c ) n a o f f , h q o , 1 0 - c u m ；r l - - 4 - t e r t - b u t y l b e a t z o y l ；j r 2 = m e m e t h o d 2 ：a ) c b z c l , d m a p , p y r l d l n e ；b ) b “瑚u 1 0 0 c ( a l 妇k 2 c o _ c _ s c o h d m f ； e ) h o , 1 , 4 - d i o x a 糖c h 2 a 2 ；r 1 = a 辫r = tc ( c 鞋搞 3 ) 腺瞟呤乙酸合成时环外伯氨摹也可采用4 _ 甲氧基苯二苯甲基氯来保 n 每o n h 啦n h r l 。暾n h r t 苫 f i g u r e 6 m e t h o d l ：a ) a n i s o y l c h l o r i d e , p y r l d i n e ；b 1 b r c h g c o o c i 1 3 , n a i l , d m f ； c ) n a o h , h z o , d i o x a n e ；r 1 = a n i s o l y ；r = m e m e t h o d 2 ：霹a 嬲，璜l 鲴殴瓣赫琏翔氍硇。醢a ；b b o 目0 。3 ，哪； c ) t f a , c h 2 c l z , e h s i h ；r i = c b z ；r o ( ( 瓤m 4 ) 鸟噤岭的伯氨基保护起来比较蹰难，一般用璐基来保护。其合成方法 还在不繇改遴1 2 0 。 5 o 今n ，洲 四川犬学硕士学位论文 oo o u h n 、， h n 人人 乎k t i f i g u r e 7 站t - b u t y l b e n z o y l c h m d e , n f 韭3 s d m f ； b ) n a i l , d m f , b r c h 2 c o o c h 3 ；t ) n a o h , h 2 0 , d i o x a u e 1 2 2 , p n a 寡聚体的固相会成 由于网相合成方法在莎肽合成上的广泛应用，以及它不断显现出的合成方 法楚瘦、会裁效率裹等俊点，霆摆合成方法逛越来越多遮被应弱蘩了黜。豹 合成上来，也充分显示出了这种方法的优越性。k o c h 等口1 1 在已有盼合成工作 基础上，发展并优化了合成p n a 所用的肽固相合成方法，从而建立5 - 适合p n a 本身结构的标准固租合成方法，并使之威甩于自动合成之中，该合成方法可总 结囊下鹜( f i g u r e8 ) 。s e i t z 等1 2 踞霹已嘲诧方法合袋了标记静p n a 。 尸 n n _ o 今摊，洲 四川火学硕士学位论文 8 鹞q ；黼嗡涤 b f i g u r e 8 ( 援凇：擎麓磺建 辩搦，t t a l 坩d ：未：羲磷酸纯蚶燕杂摹筹三氮绺l 基 1 ，1 ，3 ，知整攀差瀑) 随着瞬相合成化学、肽合成和组合化学的发展，p n a 的固相合成将会不断 遗发展。馕褥一提的是，缀合化学中的u g i 四组分缭合反应有望开创p n a 固 辐台藏的新天逢，鸯p n a 懿高效积多样纯合成提袋了穰荮的方法。 妇 四川大学硕士学位论文 1 2 3 一黧p n a 类戳豹静合成 由于p n a 类化合物在结构和功能上依然存在很多不足之处，所以修饰结 构的p n a 即p n a 类似物的出现是这一领域一大发展。这些p n a 类似物包括 夤絮嚣予j 瓣豹改交、菜蓬基霞懿替换疆及铡链豹变俄等等，臻萼冬其中较典垂 的一些介绍如下。 1 2 3 1o p n a ( o x y - p n a ) o - p n a 是分子夤絮中含骞醚键兹一类p n a 类截秘辫】，醚键戆灵活毪蓑荚 具有优于蒋通p n a 水溶性，并且对互补的d n a 鼠馘垒或无的杂交形式。 o ! ! 旦旦劂! ! ! 璺， 0e t2) na ”b h4 e to hb o c b f i g u r e 9 b 。沁j l 。2 3 2d 一渊袁 一p n a 是以l - g 一鬣基酸为原辩合成的嘲，与p n 相 b ，a - p n a 中碱基与主 链间不含羰基。 。j 四j i i 大学硼士学位论文 州h p 。k k c o o h k b o c n 比酎cb 盼n h b l pl b o c - n h c o o c h 3 8 c o n h v c 0 0 0 2 h 5 k g l l r e l 0 c o o c h 3 螃玉鹕凇坤n 丑s 蕾魄；砖n a i l , b a s e ；鸯e d 嚣- 罄雨强啦l 酶 a n f i n o ) p r e p y l - 3 - e t h y l e a r h y d r o d 枷a e ) ，g l y o e t , h c 矾q l 1 2 3 3p - p n a ( p h o s p h o n o - p n a ) p - p n a 楚主链骨架摹元中含有磷酸基因的一类p n a 类似豹嘲，它的细照 通透性和水溶性都好于p n a ，而且不翳发生自聚。另外，它能与d n a 形成更 稳定的络念物，且不易被核酸酶降解。 r、o“0 t n h 2 兰骘lt | c h 2 l 兰嗡嗤n h v i p ( o p h i ) 。 旦q 蝤- 1 - 旦四h 冒 旦旦型-j 世 d 0 p h o r f i g u r e l l b x = n h , o ；耻熟d 龇如吨r i b d b u ：l 毋蜘魏略d s 一净锄幽e e n b 辛；m 醒t u i m o r 鞴黼越i 嘟蠹- i t y l 9 弋v 一 四j i l 大学硕上学位论文 1 2 3 a 转俊p n a ( r e l t o - i n v e r s op n a ) 转位p n a 是在主链骨架中将酰氮键翻转了的p n a 类似物【2 7 l ，佬在对d n a 序列的识别上比p n a 受力口优越。 俐v v 蹶h s i 刚人，| v 丫。锇 8 璺- o 呈- b 酬h n y 刚5州v n y 渊 o 0 f i g u r e1 2 螃刍砖韵麴神咄翻秘e ，k l 戗d m 鹭b b c h z c o o h , d c c ；c ) 1 ，1 - b i s ( w i f l u o r o 鼬 e t o x y ) - l o d o b e n z e n e , c h 3 c n h 2 0 ；d ) d l b u t y l - d i e a r b o n a t e , k a c o d l o x a n e ；e ) l i o l l ，t h f 1 2 3 。5 毗喙烷p n a ( p y r r o l i d i n ep n a ) # 糯绥p n a 是圭爨莺架单元中含有灌喀靛结梅豹一类p n a 类钕物嘲，这 种结构与p n a 相比，增加了对互补d n a 和r n a 低聚体的亲和能力。 a m e o o t b s 1 0 b 0 t b s 四川大学硕士学靛论文 e e o c h n ! _ b o t h n b o c h n l c o o m e 8 t - - - c o o m e l - c o o h tl 聪蝉聪：1 3 莉c s 0 0 m 鸸嬲嘲艮譬b s - a 趣曲l 黼。l ，期电a 鹏旺 协l a b l b t h f ； 0 m s - o , d m a , c h z c h ；n a n 3 , d m f ；t f a , a 蛾d ) b r c h z c o o m 岛 d i e a , t i i f ；b o e 2 0 , i k p d c , a c o e t ；t b a f , t h f ；e ) 帆p y r l d i n e ； 0 1 - b 姻略d m f , 工r a p r e a g e t n t ；1 b 缸o l 的2 h 每n p n a 类似物的种类述有很多徽多，豫2 5 a - p n a 、p n a - 多歉缀念耪、 p n a - d e t a 等等。霹兹，臻究久爨仍褒不涔强警黎p n a 缒终露援制，力濯改遴 翻搴丢纯其缀稳。另步 ，戆罄组合化学等合成手段瓣出域，p n a 类化金甥黥台戒 方法将嶷键越来越方便，它魄匣慰藏黢也瓣更如广阔。 1 3p n a 的物理化学性质 电予默攘酸毅d n a 滁了核镕舂煮泌 ，没鸯共弼的确戆滋，艇以p n a 弱化学 稳定性与d n a 存在明显蒺异。d n a 用强酸处理，可弓i 起脱嘌呤，丽肽核酸对 酸则相当稳定。不过，在氨基端的游离氨基可能怒化学不稳定的，特别是在碱 靛条彳串下，通过环闭合可发生核碱麓乙酸的n 一谶化转移藏氨蕊辩p n a 的切 割l 捌。p n a 是电中设的仡合物，因此，水溶住较差囱“d n a 胡e b 。根据孙滁 塞聚秘瓣彦秘不同，中豫翡p n a 分子饔发生不辫撵艘聚繁酶趋势。p n a 静溶 解应趣与寡聚物的长发数及嗓冷德犍豹钢毒裂。些修馋，氢攒褒入豢燕 四川大学硕士学位论文 电荷的赖氨酸残基( 羧基端或骨架修饰) ，可以改善p n a 的溶解度。也可引入负 电荷，尤其是对p n a - d n a 嵌合物，会增加其水溶解度。p n a 单体的消光系数 与d n a 或r n a 单体的不同，这是因为不同的骨架结构会对核碱基的7 c 体系产 生不同的影响。由于不同的p n a 单体的消光系数还没有确定，而且肽骨架对 核碱基丌体系的影响大小还是未知的，这样在实际应用当中，p n a 寡聚物的浓 度是通过测定在8 0 、2 6 0 n m 处的吸收来进行测定的口2 l 。在该温度下，核碱 基的堆积得到完全解除，而且来自有序骨架的贡献可以忽略。 p n a 以一种序列依赖的方式与互补的d n a 和r n a 序列杂交，遵从 w a t s o n - c r i c k 氢键结合准则，也可形成既包含w a t s o n 4 2 r i c k 又包含h o o g s t e e n 碱基配对的三链体结构调。p n a 靶向作用于双链d n a 时有以下4 种结合方 式，见下图朔。 f i g u r e1 4 ( a ) 三链体；三链体厦入；( c ) 双链体厦 ；( d ) 双重双链体侵入 其中，一条全嘌呤的d n a 或r n a 链与两条序列互补的p n a 链间形成的 三链体是特别稳定的，这是因为当全嘧啶的p n a 寡聚体与互补的双链d n a 靶 标结合时，不是形成常规的p n a d n a 2 三链体，而是形成一种三链侵入复合物 ( 其中d n a 双链体被一内部的p n a 2 d n a 三链体所侵入) , 3 4 1 ，这种结合类 型仅限定于全嘌呤全嘧啶的d n a 靶标。 p n a 对d n a r n a 的识别特性，以及非常好的化学和生物稳定性、化学 四川大学硕士学位论文 合成的灵活性，使得p n a 在有机化学、分子生物学、阪学等学科方面引起了 人粥极大兹兴趣脚删。 1 4 礤湓的反义作用 寡缳残氧孩营酸( o d n ) 鹣反义终思极潮在予形藏o d n - r n a 二联分子，经 r n a s eh 降解其中的r n a ，从而抑制某熙蛋白质的翻译，进_ 丽抑制相应细胞的 骁稚。鬻p n a 不舟寻r n a s e h 活经，辑戮p n a - r n a 复合耪中韵r n a 不被r n a s e h 降解。p n a 附反义作用机嚣0 在于立体阻断r n a 的加工及向胞浆运输或翻译过 程。体步p 研究鼹示，p n a 与m p d q a 的献滔起始区域甄补而形成的双瞟旋，以 及与m r n a 编码区的多聚嘌呤部位形成的三螺旋，均8 玲窍效她抑制翻译过穰。 p n a 虽阿结合于m r n a 的5 端非翻译区( 5 剁r r r ) 、起始僚点以及编码隧， 毽其l 攀剃魏译簸毒效基特捧镶蠛戆长度楚1 5 1 8 藏基【4 3 】。p n a - r n a 双螺旋豹 作用是挪制翻译的起始，而隳抑制翻译的延伸需要p n a z - r n a 三螺旋的形成。 p n a 静圭述爱义律瘸梳毒袋鞠其裔可髓俸为反义药耱蹋于菜黧疾病瀚防治。 在急性早幼粒细胞白血病中，9 5 以上的病例与早幼粒细胞白血瘸融合礅自 p m l r a ra 的形成膏关。稻此g a m b a c o r t i - p a s s e r i n i 等应用针对p m l r a ra 翻 译起始区或多聚嘌岭区的p n a ，在薅雒特异性搀到了该融合基因戆麴译。 m o l o g n i 等州的研究，证实了针对5 - 2 u t r 的黼a 是p m i j r a r am r n a 翻 泽戆最强撩专l 裁。承漶基因瓣异常激活是绥藏瑟受麓霉凳特餐，鑫戴，p n a 黯 癌基因的表达进行抑制是种合理的治疗癌症的策略。墩近研究显示，p n a 以 二氢鼙酾为载体速入蓊歹i 豫滏细胞癌，髓有效阻瞬c - m y c 癌基闵的表达阀；p n a 与m r n a 的a u g 起始区域和与5 - 2 u t r 结合均能抑制人b 细胞淋巴瘸的 b c l - 2 基因的表达嘲；p n a 逐能有效抑制人黑色潦瘤细胞中端粒酶的活性 4 t j 。 g o o d 和髑豳e 珏在对毅泽魏细莹鲍生长熬硬究显示，与2 3 sr r n a 熬功能 性位点结合的p n a ，可在大肠杆菌无细胞转录翻译系娩中抑制翻译，这种体外 静蔫l 效应与跫躲的蘸译撩澍潮帮銎环素等类鬣，英春裁罄菝耧聋应。p n a 麓葶牵 制大肠杆菌的b2 内酰胺酶慕因的袋达，从而抑制大肠杆菌的生长。目前，在大 肠秆菌所致黢膜炎敝血症的小鼠体内实验中显示，p n a 可有效抑制大肠秆菌的 生长【4 9 1 。 四川大学硕士学位论文 综上酝述，p n a 遁j 遘与m r n a 靶_ | 葶剜戆特异技终合嚣按铡魏译豹进行，遴 而达至抑谁癌基因的表达秘抗缀萤感染盼霞的。可蔸，p n a 可麓成麓抗肿瘤和 抗感染的肖效反义药物。 堇5p n a 的反基医终麓 p n a 以链侵占方式( 即链置换) ：b - 式识别靶d n a 链，形成p n a - d n a 、 p n a 2 - d n a , ：研究表明，结合于d n a 嗓岭富含区的p n a 可阻止d n a 的复制和 转录。p n a 不仅裁疆受滚核生懿豹鞠粪孩垒凌豹d n a 、r n a 聚会酶懿结合， 还能抑制转录调节因予的结合，从而搠制复制和转淤。l e e 等 5 0 1 发现，与h i v - 1 基因的引物结合位点飘补的p n a 绒p n a - d n a 异源双链体能完全阻断 t r n a 3 - l y s 躲缝合，从灏辍鞭h 1 v - i 遂转录酶豹髂乡 转录豹起始。赞辩h i v - i g a g - p o l 跨读框基因的p n a ，能抑裁h i v - 1 在被感染的细胞内复案黼】。玢蛋自主 要调节人攀l 头瘤病毒的复制和转录，p n a 能特异的与e 2 蛋白结合，抑制e 2 蛋白 的活性，从瓶阻止人乳头瘸病毒在体内的复制 5 2 】。h c v 复制过程中n s 3 解链酶 莛重要佟翔，覆羚毛a 国k a ( 或甜隧) 转源双链俸对n s 3 解链酶不敝感，鼓p n a 可通过抑制解链酶而阻止h c v 基因的复制【5 3 】。可见，病毒基因缀可作为p n a 的靶基因，可将p n a 开发为有效的抗病毒药物。 生理簸浓度下，p n a 与超螺旋矮靛d n a 豹结仑 与线型d n a 戆结合狭， 而具有转泶活性的染色体多为负超螺旋，因此，p n a 与d s d n a 的结合大大加 强。研究表明，p n a r d s d n a 链置换簸合物，能作为真核生物和原梭生物r n a 聚合酶的人工强启动子，敞从另一个角度讲，可将p n a 开发为一矛孛毅型的特 异往基蠢添纯药耱。最i 凌研究显示，链置换复台貔中豹瑾繇( d - l o o p ) 可俸为 r n a 聚合辩的启动子而诱导y _ 珠蛋囱基因高表达，有望用于治疗廉状细胞贫 血和地中海贫血酬。 1 6p n a 盼体内活性 p n a 没有整体毒憔，没有非特异性蛋白结合作用，以及在人戚清和细胞提 取物中稳定性好的特点，具有基因靶肉药物的潜在优势。然丽，p n a 体内应用 酌难点在予，如侮使之鸯羧黥进天缩熬，著傈逶其与鞑m r n a 或d n a 的结合。 1 4 四川大学硕士学位论文 目前，可通过连接一个载体分子或脂质体而提高细胞对p n a 的摄入率。新近研 究发现，p n a 与一些小肽分子连接或者这些小肽分子作为载体将p n a 引入细胞 的特定部位时，能增加细胞对p n a 的摄入量。生物酰化p n a 能穿过线粒体膜， 进入线粒体基质，因此，有望作为反基因药物治疗m t d n a 疾病j 。以二氢睾酮 为载体的p n a ，能有效的进入前列腺癌细胞抑制c - m y c 基因的表达【4 5 】。缩肽分子 作为p n a 载体将p n a 导入细菌内，p n a 可通过反义作用抑制细菌生长【5 6 】。 1 7p n a 的研究展望 目前，p n a 作为d n a 的结构类似物，已成为一种新的分子生物学研究的有 力工具，其广泛应用于增强p c r 扩增、分子杂交、基因突变分析、监测端粒的 长度等分子生物学方面的研究。体外研究表明，p n a 有可能成为一种有效的反 义或反基因药物，故其在基因治疗方面有良好的应用前景。目前，制约p n a 发 展的主要因素是p n a 的低细胞摄入率。因此，需对p n a 的摄取进行全面细致的 研究。相信通过对p n a 更深入的化学修饰和改造，调整其理化和生物学特性， 拓宽其应用范围，完全能将p n a 开发成为一类实用、有效的基因治疗药物。 四川大学硼士学位论文 第二章大环多胺及其金属配合物的超分子识嬲 和仿酶穰优研究进震 2 1 引言 大环彩胶由于其特豫的结构及其圈过渡金属离子醵及重金属离子等的络 合作用，特别是形成的络合物在生物酶模拟、d n a 切割等方面的应用，为研 究生命活动过程提供了一种良好的手段，引起了人们对其广泛的荣注，并开发 密各耱不鬻结穗饔董挈焉懿大强多骏及茨鬈垒4 霹。 大环多胺配合物的禽成、稳定性及催化性能的研究，对于了解众属酶的结 构、催化作用机理以及设计合成人工酶有重要意义，成为生物化学领域研究的 重要瀑题。蠢翅趣合成鼹霄特定结构豹掰型大繇聚锩是嚣要解决鹣瓣题邸删。 在过去的二卡年闯，已经先后合成了禽耩联羟基，昧睦基，叠氮熬，硫腈基等 多种基团的大环配体，相关的酶模型配合物也有许多报道【6 ”。 大环多胺是一类类似于冠醚的环状聚胺，通常分为氮丙烷环状笄聚物和环 获聚骏。露燕豹大环多黢有嘭嚣蓰愆黧穆豹舔狡务聚耪，嚣掇睦( c y c l e n ) ，环 拉胺( c y c l a m ) ，含毗啶环的环状聚胺( f i g u r e1 ) 。出于c y c l e n 和c y c l a m 相对 易得，其衍生物得到了实际应用，因此大环多胺的研究主要集中于c y c l e n 、 e y c l a m 。 r 抟r 0 “u h 飘g h 糖1 从图中可以看出，大环多胺有一个共目的特点，所有该类仡合物都有一个 由多个原予组成的环，环上都有好几个可参与配位的n 原子，这一结构决定了 大环多胺的性鹱和用途。大环多胺是一噗具有独特能质的配体，它溉可以与金 属离子鬣舍，选可与带鬣邀蘅兹有凝铵离子或带受蠢蓊的有税鬻离子发生配合 1 6 四川大举硕士学位论文 睾爱，数主一窖体配合形式形成超分子，霆瑟对大繇多胺缝合锪豹念藏和配合 性质的研究楚露前在生物有机亿学，生物无视纯学鞠配位化学等学晕萼领域的重 要研究方向。 大环多胺与阳离予酝位主要是通过静电作用力，与铵离子配像是通过氢链 洙_ 壬o ) 终蘑5 7 0 5 ) 髑一部努静邂佟爰力o ( 菸) 形痰酝台秘。纛 大环多胺与阴离子相配合则是因为其有较大的孔径和较强的静电荷，孔径越大 越容易同阴离子相配合。 鸯于大嚣多胺特豫豹缕构特犍，焚愆生凌在进 爹修镑蒡终会念媾终建后会 出现特殊的特性及用途，如酶模损，分子催化，分子识男4 等。这怒戮为大环多 胺本身可以提供一个疏水腔，而且在这个疏水腔中可以络合金属离子，从而为 反应提供了一个良好的假化环境。面强大环多胺上进行修饰以后则会更匀1 1 促进 这秘效瘦瓣发生。 大环痧胺的催化功效主要依靠予扔始阶段对底物分子的选择憔识别【回。它 们既可与带正电荷的离子发生配合作用，又可以与带负电荷的有机阴离子发生 配合，驭熏培薅( h o s t - g u e s t ) 配合形式形藏超努予。嚣瓣又其鸯戆弱客俸分 子匹配的密脏，不同数醋的连接段等，这样不仅具有动力学特性，而且具有合 适的键合位置及功能瑟团，因而是一炎十分重要的藏体分子。 由于大环多胺的金鼹懿舍物特异的催纯活性旧- 4 5 1 ，对大环多黢及金属配合 物开展研究，不筏露酶僚纯反盛翡误掰、选择萑，及生物奔覆等有鬟努的模掇， 而且由于谨与生物体系服的基本过程，如光合作用、氧化、磷酰化、水解、肌 肉运动等相似，进而对深入阐明酶催化作用机制等具有重要意义。近几年来， 薄大强多簸类龚己律及醺会镌熬臻究，发震较块，茏焚是在模毅磷酸薅及孩酸等 水解金属酶方面引起了科学家的浓，孽兴趣1 6 6 , 6 7 。本露我们将对大环多胺及其金 属配合物的超分子识别和仿酶催化作用研究进展进行简述和讨论。 2 。2 大环多胺及其金属配合物懿超分子识剐作雳 2 2 1 对分子和离子的识别 大环多胺是一类广浇应用的螯合剂，一方面大环多胺可以通过形成配合物 戆形式专聚凑子缝合，筠一方覆又霉瑷缮秘予氨基豹菠子芘或季黢亿竣态逶过 四 i 大学硕士学位论文 氢键袋静追捧焉谖剃阴离子1 6 8 - 。 大环多胺及欺金属配合物魑能很好的识别羧酸根，磷酸根的主体分子。带 吖嚏港团的配合物1 ，通过超分子自组装可对对苯二甲酸进行选择性识另u p ”。 纯会秘2 与c o ( m ) 影癌魏酝会貔与p o ? - 熬形成鞠当坚霾豹酝会餐。透必分子 识别的目的，这个系统可以作为一个能使磷酸键合位置移动的新模型口2 】。将手 性引入大环多胺中，形成的配体利用其空间构型可以很好识别阴离子。如化合 妨3 ，可以选择瞧麴识舅苯甲敬熬及c l _ 等1 7 3 。 2 3 f i g u r e 2 2 文2 对核酸和核苷酸的识别 核酸是生命激动最主要的物质基础，d n a 和r n a 中的碱基在生命活动过 程中起羞至关菱癸戆箨磊。霹d n a 、r n a 送行末嫠或裂熬及应戆臻究蠢成为 当今最活跃的领域之一口4 】。大环多胺由于能激别特殊d n a 系列的小分子，可 以用作基因目标药物而受到了臌大关注。这必药物可能改变d n a 的局部结构 丽隰走阻遏甥或溪性裁的进入，达到调整最终基因的表达瑕彦鳃孽数1 7 5 1 。 瘁 5f c y c l e n ) 害西 一 矗 阱 b 雕厂m 黼l h f 州 o 掩妙 厂、jh 岫蛮 瞄 h n n h r 刚o 四川大学硕士学位论文 g 帅：入扫- n hc h 2 b 陪甑啦 。r - c h 2 c h 2 c h 2 n h - ；口c h 3 c r - 6 “2 c “2 c i 弋尹。h 3 o 帅捌筘削+ 息邺e 峨, r = 枣慨0 2 r j 1 r - - nn m r 弋 ； 7 枷2 陆娜2 眵 帅2 凹陆h dr _ r 2 凹 f i g u r e 3 含四个羰基的大环多胺4 对核苷酸的识别研究中观察到：a m p h p 0 4 2 ， 这是因为在腺嘌呤碱基与大环多胺之间有更多结合，核苷酸易通过它的磷酸根 和腺嘌呤位置与4 有效结雀一“。 大环四胺如1 ，4 ，7 ，1 0 - 四氮杂环十二烷5 ( c y c l e n ) 及衍生物与z n ( n ) 形成的配合物，不仅在水解磷酸酯方面表现出十分独特的活性，而且在识别核 苷酸及d n a 、r n a 等方面也是十分有效的 6 2 1 ，这对于进一步设计d n a 、r n a 的仿酶水解模型有重要指导意义。化合物5 或1 的z n ( n ) 配合物在中性介质中 可以与脱氧胸苷( d t ) 、尿苷( u ) 、脱氧鸟苷( d u ) 结合而达到识别的目的。 在识别d t 及u 时，核苷酸碱基残基3 。位n 上的质子失去形成负离子( d t ， t y ) 从而与z n f n ) 结合起来，同时c y c l e n - n h 与o ( 6 ) 之间形成一个氢键，两 个芳环之间的疏水相互作用和哥丁cs t a c k i n g 作用，它们同为识别的推动力。通 过5 ，6 e 的盈配合物对1 - 甲基胸腺嘧啶离子( m t ) 的识别研究发现：它 们都能与m y 形成稳定的三元配合物z n l - m t ，但由于z r l 2 + - n - ( 亚胺上) 配合 更强，2 ，4 二硝基苯基基团与嘧啶环之间有弘兀s t a c k i n g 存在，从而在识别性 能上6 e 5 【，副( f i g u r e4 ) 。 1 9 嘲j i i 大学硕士学位论文 s 6 e 5 一z n 2 h 2 0 6 e - z n 2 + - h 2 0 f i g u r e 4 带有个或两个芳环基团的大环四胺化合物7 的z n 配台物可以选择性 与天然双螺旋d n a ( 含有1 5 0 个碱基对) 联接，结合发生柱a 一富集区域。 这黪选择往窝络念辘力依靠予芳繇酶嘟s t a c k i n g 勖与芳邵数嚣。在d n a 识 别中，z n ( 玛是必需的金属离子，它不能被其他离子如c u 2 + 戏n i 2 + 所取代硎。 k i m u l a 等鳓的研究也证明：带侧臂芳环的z n o i ) 一c y c l e n 酉a 合物可以通过翩2 + ， 甄黢基受离子键鹣形成，毒选择蛙圭| 羹与单螺旋鞠双螺旋d n a 或r n a 中节或u 结合，在叛裂d n a 的a 最链中扮演分子拉镳的功能。 2 2 3 对氨基酸及小肽的识别 氮基酸及簸怒缀藏蛋叁蒺豹蒸本单元结麓。磅究蛋鑫溪熬承簿是葳获黥永 解开始的，开展对氨基酸及敞分子的识别对于阐明蛋白质水解机制有其羹骚的 理论和实践意义。 大蓼馥台甥薅夺分子毡合携黪识别主要怒与主体分子窆黢戆大，j 、嚣底物戆 长度( 距离互补) 有关雠】。以大环多胺为主体分子可班对许多生扬分子如双羧 四川i 大学硕士学位论文 酸化合物、双胺肽、氨基酸、多胺等进行选择| 生识别。 在蛋白质和磷酸酯水解中，多核金属离子组分的作用已被广泛地认识到 8 2 】。大环多胺配体可形成单核或双核金属配合物，这些配合物可以选择性与阴 离子相结合组成三元配合物螂8 3 。 单核多胺化合物不仅可以与客体形成1 ：1 型超分子体系，还可以形成2 ：l 型的主客体配合物。化合物1 可通过静电相互作用，氢键，n 一s t a c k i n g 作用 与t p t ( 二聚胸腺嘧啶核苷) 组成2 ：1 超分子体系刚。另外，利用大环多胺金 属配合物的选择性识别，还可以纯化生物大分子( 如蛋白质) 及制备微分子开 关 8 5 ，8 6 。 2 3 大环多胺及其金属配合物的仿酶催化作用 2 3 1 大环多胺配体及其金属配合物 大环多胺和一般冠醚化合物相比具有两个重要的特征：大环多胺与许多金 属离子能形成稳定的配合物，成环氮原子具有强碱性，故能与l r 形成铵离子形 式，较易导入羧基、羟基、膦酸基以及其他的亲水基团或功能基团，则可得到 一系列能形成水溶性金属配合物的配体。其中某些金属( 如铜、锌等) 的配合物 在人体生理条件下表现出很好的稳定性，因而在药物试剂如在核磁共振诊断( 人 体显像) 、x 射线诊断、超声波诊断、放射性诊断及放射性治疗等方面有潜在的 应用前景隅”。同时在金属离子的分离和回收方面也有广泛应用8 8 1 。在酶模拟研 究中，则主要是应用于羧酸酯、磷酸酯及核酸的催化水解研究，进而较为深入 地阐明酶的作用机制。 大环多胺及其衍生物，由于近年来发现它们具有很有意义的应用前景，越 来越引起了人们的重视，因而相继合成出了许多的大环多胺及其衍生物，同时 研究了它们的性质及可能的应用。 2 1 9 ( c y c l a m ) h _ _ 、h n z z u h厂-h h 一 。 hc。 四j i i 大学硕士学位论文 r r i ! i 令 8 己。r r b - 1 0 a r = c h s c o o h r = h b r = c h 2 p o ( o h ) 2 。r = h c r = c h 2 c h ( o h ) c h 3 ，r = h ( s - t h p ) d r = c h 2 c h 2 0 h ，r 一h 盯h e d ) o r = c h 2 c o o h 。r = p - n o a - a r c h s a r = h b r = c h 3 c r = c h 2 c o o h n g 畔5 由于1 , 4 , 7 ，1 0 - 四氮杂环十二烷( 5 ) 的环张力比1 ，4 7 - 三氮杂环壬烷( 8 ) 的 要小，因而对前者的衍生物的合成相对易些，研究更多一点，