（植物学专业论文）松属单维管束亚属植物rdna的染色体定位研究.pdf

摘要 松属植物的基因组十分庞大( 大于2 0 0 0 0 m b p ) ，其中约9 0 是由重复序列 组成的，我们对其结构和组成仍知之甚少。松属在系统分类上分为两个亚属：单 维管束亚属和双维管束亚属。基因组大小研究发现单维管束亚属植物的基因组 更大。r d n a 作为一类有功能的多基因家族重复序列，其自身特性决定了它在基 因组研究中的重要性。f i s h 技术为r d n a 在染色体上物理定位提供了有力的工 具。尽管现在对松属r d n af i s h 已有不少报道，但主要集中在双维管束亚属， 对单维管束亚属的研究几乎是空白。本研究选择5 个单维管束亚属松属植物只 b u n g e a n a ，只k o r a i e n s i s ，只a r m a n d i i ，只w a l l i c h i a n a ，只s t r o b u s ，进行r d n af i s h 研 究。旨在弄清1 8 s 2 5 sr d n a 和5 sr d n a 在单维管束亚属植物染色体上的位点 数目和分布模式。结合前人对松属双维管束亚属植物的工作，对单、双维管束 亚属植物之间r d n af i s h 结果进行比较，从而可以从整体上认识松属植物的 1 8 s 2 5 sr d n a 和5 sr d n a 在染色体上的分布式样。在此基础上进一步探讨 1 8 s 2 5 sr d n a 和5 sr d n a 这些重复序列在松属植物基因组结构和组成中的地 位和作用。本研究主要结果如下： 1 r d n af i s h 在松属染色体核型分析中的作用 本研究中5 种松属单维管束亚属植物染色体数目均为2 n = 2 4 ，除最短一条染 色体为亚中部着丝粒染色体外，其余n 条均为中部着丝粒染色体，长度和臂比 也十分接近，同源染色体的不容易鉴定，很难排出精确的核型。在我们的研究 结果中，5 个松属植物中，除了白皮松外，1 8 s 2 5 sr d n a 和5 sr d n a 分布在 1 2 对染色体中的1 0 对染色体上，这些位点可作为染色体标记，大大提高了同源 染色体鉴定的准确度，但是染色体之间排序问题依然没有很好地解决。核型比 较认为种间是否存在部分同源染色体关系也不是十分明确，仅号和号染色 体有这种关系，这主要由于号和号染色体容易准确地鉴别出来。核型分析 的精确仍有待增加标记来提高。 2 r d n a 位点数目在松属两个亚属间的比较及其与基因组大小的关系 松属植物1 8 s 2 5 sr d n a 位点通常为5 - 1 0 个，5 sr d n a 位点为1 - 4 个。其 中单维管束亚属1 8 s 2 5 sr d n a 位点通常为9 - 1 0 个( 除白皮松为4 个外) ，5 s r d n a 位点为2 4 个；双维管束亚属为1 8 s 2 5 sr d n a 位点通常为5 - 1 0 个，5 s r d n a 位点通常为1 - 2 个。而二倍体被子植物1 8 s 2 5 sr d n a 位点通常为1 - 5 个， 5 sr d n a 位点为1 - 3 个。暗示1 8 5 2 5 sr d n a 和5 sr d n a 位点数目多少和基因 组大小还是有一定的相关性。因为松属植物的基因组比典型的二倍体被子植物 大得多，单维管束亚属植物的的c 值又普遍比双维管束亚属植物的高。白皮松 虽有些例外，1 8 s 2 5 sr d n a 位点数目少，但信号强度大得多，代表拷贝数高， 因此其基因组大小可以从r d n a 拷贝数上得到解释。 3 1 8 s 2 5 sr d n a 和5 sr d n a 位点在松属两个亚属之间的分布模式比较 1 8 s 2 5 sr d n a 和5 sr d n a 位点在松属两个亚属染色体上的分布方式有明 显不同，每个亚属均有两种分布形式，并形成各自稳定的分布模式。在单维管 束植物中，1 8 s 2 5 sr d n a 和5 sr d n a 位点或相邻分布于同一染色体同一臂上， 5 sr d n a 位于臂的远端；或两位点分布于不同的染色体。而在双维管束植物中 1 8 s 2 5 sr d n a 和5 sr d n a 或相邻分布于同一染色体同一臂上，1 8 s 2 5 sr d n a 在臂的远端；或两位点分布于同一染色体两条臂上。在两个亚属中，当1 8 s 2 5 s r d n a 和5 sr d n a 位点位于同一条染色体臂上时，相对位置正好相反。这完全 不同的r d n a 分布模式的形成，可能与松属这两个亚属植物的物种形成和分化 过程中染色体发生倒位或易位有关，暗示这两个亚属的基因组结构存在分化。 但这各自的分布模式是否可以作为判断亚属的特征依据仍有待加大样本量证 实。 4 r d n a 位点分布及变异具有系统学意义 r d n af i s h 结果符合分类中亲缘关系越近，分布模式越相似的原则，因而 认为r d n a 位点在染色体上的分布模式，具有系统学意义。基于已知的松属植 物r d n af i s h 结果构建的系统关系，符合传统分类系统中对亚组划分。r d n a f i s h 结果与分子系统学的研究结果相比较认为，松属单维管亚属5 种松中，以 乔松和北美乔松关系最近，与同一个亚组的华山松稍远，与另一个亚组的红松 更远。而白皮松作为一个特有的孑遗类群，系统位置比较特殊，分子系统学研 究认为其处于基部的位置，本研究表明其r d n a 位点有明显的特点：位点数目 少，但信号强，反映了拷贝数多。那是否它就代表了祖先类群的位点分布模式， 需要更多的基部类群的r d n a f i s h 结果支持。 关键词：松属，r d n a ，荧光原位杂交，核型 a b s tr a c t p i n e sh a v el a r g eg e n o m e s ( ：2 0 0 0 0 ) c o m p o s e do f9 0 h i g h l yr e p e t i t i v ed n a t h eg e n u sh n u si sd i v i d e di n t ot w os u b g e n e r a ：s t r o b u s ( h a p l o x y l o n ) a n dh n u s ( d i p l o x y l o n ) e a r l yi n v e s t i g a t i o n sh a v es h o w n t h a tm e m b e r so ft h es u b g e n u ss t r o b u s g e n e r a l l yh a v el a g e rg e n o m e st h a nt h o s eo ft h es u b g e n u sp n u s n eg e n o m e s t r u c t u r eo fp i n e s ，h o w e v e r , i ss t i l l p o o r l yu n d e r s t o o d ，a si s t h ed i f f e r e n t i a t i o n b e t w e e nt h et w o s u b g e n e r aa tt h eg e n o m el e v e l c h a r a c t e r i z e da sm u l t i g e n ef a m i l i e s ， t h et a n d e mr e p e a t e dg e n e se n c o d i n g1 8 s 2 5 sa n d5 sr i b o s o m a lr n aa r em a j o r c o m p o n e n t s o ft h er e p e t i t i v ed n ai n p l a n tg e n o m e h u o r e s c c n c e ns i t u h y b r i d i z a t i o n ( f i s h ) h a sp r o v e dt ob eu s e f u lt o o lf o rc h r o m o s o m a ll o c a l i z a t i o no f 1 8 s 2 5 sr d n aa n d5 sr d n a a l t h o u g ht h e r eh a v eb e e naf e wr e p o r t sa v a i l a b l eo n r d n af i s hi np n u ss p e c i e s ，a l m o s ta l lo ft h e m 铀co ns u b g e n u sp n u s t h e r ei s v i r t u a l l yn or e p o r tt i ut o d a yo nt h er d n ah s hc h a r a c t e r i z a t i o ni ns u b g e n u ss t r o b u s i nt h i ss t u d y , t h e1 8 s - 2 5 sr d n aa n d5 sr d n aw e r el o c a l i z e ds i m u l t a n e o u s l yo n m e t a p h a s ec h r o m o s o m e so ff i v es p e c i e so fs u b g e n u ss t r o b u s ，只b u n g e a n a ，只 k o r a i e n s i s ，只a r m a n d i i ，只w a l l i c h i a n a ，a n d 旦s t r o b u sb yf i s h c o m b i n e dw i t h p r e v i o u sr d n ah s hr e p o r t so nt h o s es p e c i e so fs u b g e n u s 鼍n u s ，t h ec o m p a r i s o no f t h e1 8 s 一2 5 sr d n aa n d5 sr d n al o c in u m b e ra n dl o c a l i z a t i o np a t t e r nb e t w e e nt h e t w os u b g e n e r ac a nb em a d e ，w h i c hi s n e c e s s a r yt og e n e r a l i z et h er d n al o c i d i s t r i b u t i o np a t t e r ni np m u s t h i ss t u d ya i m e dt oe x p l o r et h eg e n o m eo r g a n i z a t i o n a n ds t r u c t u r eo fp n u s t h em a i nr e s u l t sa n dc o n c l u s i o n sa l ef o l l o w i n g s ： 1 t h ek n r y o t y p e a n a l y s i sw i t h1 8 s - 2 5 sr d n a a n d5 sr d n am a r k e r s n ec h r o m o s o m en u m b e ro ft h ef i v ep i n e sw a st h es a m e ，2 n = 2 4 t h ek a r y o t y p o w a sc h a r a c t e r i z e db y1 1 p a i r s o fm e t a c e n r i ca n d1p a i r so fs u b m e t a c e n t r i c c h r o m o s o m e s s i n c em o s to ft h ec h r o m o s o m e sh a v es i m i l a rl e n g t ha n da r mr a t i o s ，t h e i d e n t i f i c a t i o no fh o m o l o g o u sp a i r sh a v ep r o v e dd i f f i c u l t , a n dt h i sp r e v e n t e dp r e c i s e k a r y o t y p ea n a l y s i s n e1 8 s 2 5 sr d n a o r5 sr d n al o c iw e r od e t e c t e do nt e np a i r s o fc h r o m o s o m e si nt h ef i v es p e c i e se x a m i n e de x c e p tf o r 只b u n g e a n a t h e s er d n a m a r k e r sm a d et h ei d e n t i f i c a t i o no fh o m o l o g o u se a s i e r h o w e v e r , e v e nw i t ht h e a i do f t h e s er d n am a r k e r sp r e c i s ei d e n t i f i c a t i o no fh o m o c o l o g o u sc h r o m o s o m e sa c r o s s s p e c i e sw a s s t i l ld i f f i c u l t ，o n l yc h r o m o s o m ex i ，x i ic a nb ea l i 萨c dw i t hc e r t a i n t yd u e t ot h e i r su n a m b i g u o u sc h r o m o s o m em o r p h o l o g yc h a r a c t e r s t h e r e f o r e ，m 0 他m a r k e r s a r cn e e dt oa c c u r a t e l ya s s e s st h ek a r y o t y p ef o rp i n u ss p e c i e s 2 t h ev a r i a t i o ni nr d n al o c in u m b e rb e t w e e nt h et w os u b g e n e r aa n di t s a s s o c i a t i o nw i t hg e n o m es i z e o u rr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ea r cu s u a l l yn i n et ot e np a i r s1 8 s 2 5 sr d n a l o c i ， w i t ht h ee x c e p t i o no ft h ef o u rl o c i i nt h e 只b u n g e a n a ，a n dt w ot of o u rp a i r so f5 s r d n al o c ii nt h es p e c i e so fs u b g e n u ss t r o b u sa sc o m p a r e dw i t hf i v et ot e n1 8 s 一2 5 s r d n al o c ie x c l u d i n gt h ew e a ks i g n a l si nc e n t r o m e r i cr e g i o n s ，a n do n et ot w o5 s r d n al o c ii nt h es p e c i e so fs u b g e n u sp n u s t h u s ，t h eg e n e r a lf e a t u r eo fr d n al o c i n u m b e ri nt h eg e n u s 鼍n u sc a nb ed i s c e r n e d ，w h i c hv a r yf r o mf o u rt ot e na n do n et o f o u rf o r1 8 , 5 - 2 5 sa n d5 sr d n a , r e s p e c t i v e l y t h er d n al o c ii np n u sa r c s i g n i f i c a n t l ym o r et h a nt h eo n e t of i v e1 8 s - 2 5 sr d n al o c ia n do n et ot h r e e5 sr d n a l o c ii nt h ed i p l o i da n g i o s p e r m s i ts e e m st h er d n ac o p yn u m b e ri s p o s i t i v e l y a s s o c i a t e dw i t hg e n o m es i z ea c r o s st a x o n o m i cs a m p l e ，s i n c ep n u sh a sam u c hl a r g e r g e n o m e t h a nm o s to ft h ed i p l o i da n g i o s p e r m s ，a n dt h eg e n o m eo fs u b g e n u ss t r o b u si s l a r g e rt h a nt h a to fs u b g e n u sp n u s 3 r d n ad i s t r i b u t i o np a t t e r nb e t w e e nt h et w os u b g e n e r a i nt h es u b g e n u ss t r o b u s ，t h e1 8 s 一2 5 sr d n aa n d5 sr d n aa r ee i t h e rl o c a l i z eo n t h es a m ea r m , w i t ht h e5 sr d n at o w a r dt h et e r m i n a lo rt h et w or d n al o c io n s e p a r a t ec h r o m o s o m e s i nt h es u b g e n u sa ，l 淞，o nt h eo t h e rh a n d , t h et w or d n a l o c i a r ee i t h e rs i t u a t e do nt h es a m ea r m , w i 也t h e1 8 s - 2 5 sr d n at o w a r dt h et e r m m a l ，o r o nt h eo p p o s i t ea l m so ft h es a m ec h r o m o s o m e t h er e l a t i v ep o s i t i o no ft h et w or d n a l o c iw e r er e v e r s e db e t w e e nt h et w os u b g e n e r aw h e nt h et w ol o c ia r co nt h es a m e a r m s t h i sd i s t r i b u t i o np a t t e r ns e e m st ob eas t a b l ec h a r a c t e rf o re a c hs u b g e n u s s u c h d i f f e r e n c ei sm o r el i k e l yd u et ot h ec h r o m o s o m a li n v e r s i o na n d o rt r a n s l o c a t i o ne v e n t d u r i n gt h es p r i to ft h et w os u b g e n e r a , s u g g e s t i n gt h eg e n o m ed i v e r g e n c eo ft h et w o s u b g e n e r a m o r ep i n es p e c i e sf r o mb o t l is u b g e n e r an e e dt ob ea n a l y z e dt ov e r i f yt h i s o b s e r v e dp a t t e r n 4 t h ep h y l o g e n e t i ci m p l i c a t i o no ft h er d n al o c ip a t t e r n o u rr e s u l t sh a v es h o w nt h a tt h en u m b e ra n dp o s i t i o no fr d n al o c iv a r ya m o n g i v t h ef i v es p e c i e s t h i sv a r i a t i o nw o u l dh a v ep h y l o g e n e t i ci m p l i c a t i o n s ，s i n c et h em o r e s i m i l a rr d n al o c ip a t t e r ni sp r e s e n ti nm o r ed o s e l yr e l m e dt a x a a m o n gt h ef i v e s p e c i e so fs u b g e n u ss t r o b u se x a m i n e dh e r e , t h er d n al o c ip a t t e r no ft h et w oa s i a n s p e c i e so fs u b s e c t i o ns t r o b i ，只s t r o b u sa n d 只w a l l i c h i a n a , w e 他m o r es i m i l a rt h a nt h e 只a r m a n d i ii nt h es a m es u b s e c t i o n a l lt h e s et h r e ep i n e ss h o wd i s t i n c td i f f e r e n c e f r o m 只k o r a i e n s i so ft h es u b s e c t i o nc e m b r a e t h em o s tu n i q u ew a spb u n g e a n a i t s h o w e dt h ef e w e s t1 8 s - 2 5 sr d n al o c in u m b e r , b u tt h es i g n a ls t r e n g t hw a sn o t i c e a b l y m o r ei n t e n s et h a nt h o s eo fo t h e rf o u rp i n e s ，i n d i c a t i n gh i g h e rc o p yn u m b e r p i n u s b u n g e a n ai si nac l o s e - t o - b a s a lp o s i t i o ni nt h es u b g e n u ss t r o b u s i t sr d n ap a t t e r n m a yr e f l e c tt h ep r i m a r yc h a r a c t e ri np i n u s m o r et a x af i o mt h ec l o s e - t o - b a s a lo rb a s a l p o s i t i o no f p n u ss h o u l db es a m p l e dt ot e s tt h eh y p o t h e s i st h a tt h ec o n d e n s e dp a a e m o f1 8 s - 2 5 sr d n al o c ii sap r i m a r yc h a r a c t e ri nt h ep i n u sg e n o m e k e y w o r d ：p i n u s ；r d n a ；h s h ；k a r y o t y p e ；g e n o m es t r u c t u r e ；e v o l u t i o n v 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解中国科学院植物研究所有关保留、使用学位论文的 规定，即：植物研究所有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅 和借阅；学校可以提供目录检索以及公布论文的全部或部分内容，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 学位论文作者签名： 每；丢 枷二年易月7 日 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指 导下，进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用 的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、 已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所 涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中 以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本 人承担。 学位论文作者签名：多f 素 加6 年占月夕口日 第一章染色体荧光原位杂交技术( f i s h ) 的发展及其在植物基因组研究中的应用 第一章染色体荧光原位杂交技术( n s h ) 的发展及其 在植物基因组研究中的应用 染色体是d n a 的载体，细胞遗传学是研究染色体的形态和行为的科学， 随着细胞遗传学技术的发展，分子手段逐步渗入，可以用带标记的探针来直接 定位染色体上的靶核酸序列，鉴别染色体片段和整套染色体组，这种技术就是 原位杂交技术渤s i t uh y b r i d i z a t i o n ，i s h ) 。它的出现标志着一门交叉学科分子 细胞遗传学( m o l e c u l a rc y t o g e n e t i c s ) 的兴起，从而架起了染色体和基因组研究之 间的桥梁。染色体原位杂交技术目前已成为基因组研究的必要手段，在分子时 代为研究整个基因组的结构和组成起着不可替代的作用。本章从染色体原位杂 交技术手段的发展及其在染色体和基因组研究中的应用方面作一综述。 1 1染色体原位杂交技术的发展 染色体原位杂交的基本原理是根据核酸分子的碱基互补配对原则( a t 、 c r - - c ) ，将有放射性或非放射性标记的外源核酸( 探针) 与染色体上经过变性后 的单链d 眦补配对，结合成专一的核酸杂交分子，再通过非放射性自显影技 术或显色检测手段将核酸杂交分子在染色体上的位置显示出来。g a l l & p u d u e ( 1 9 6 9 ) 用放射性标记的r d n a 探针在非洲爪蟾细胞核上首先实现了原位杂 交原位杂交技术在人类和动物染色体上发展很快，但由于植物细胞壁对染色 体的屏蔽作用阻碍了探针的杂交，其在植物染色体上的发展远远滞后。 最初采用含有放射性同位素的核苷酸标记探针，但因其分辨率低，有污染 等缺点被非放射性标记取代。先出现的是用偶联有生物素标记的核苷酸 ( b i o t i n 1 1 d u t p ) 掺入探针( l a n g e r - s a f e r 甜a 1 1 9 8 1 ) 。后来发明了地高辛 ( d i g o x i n g e n i n 11 d u t p ) 标记探针( k e s s l e re ta 1 1 9 9 0 ) 。标记的探针用偶联有辣 根过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗体通过显色反应显示出来。随着非放射性原位 杂交技术的出现，r a y b u m & g i l l ( 1 9 8 5 ) 克服了植物染色体制片的技术困难，首 次在小麦染色体上成功地用生物素标记的探针进行了重复序列定位。 当生物素标记的探针可通过免疫细胞化学反应连接上荧光素，并可在荧光 显微镜下观察时，标志着荧光原位杂交技术( f l u o r e s c e n c e ns i t uh y b r i d i z a t i o n ， 博士学位论文松属单维管束亚属植物r d n a 的染色体定位研究 f i s h ) 正式出现。荧光原位杂交中探针标记方法主要有两类，即荧光素间接标记 法和直接标记法，前者用生物素或地高辛标记探针，随后用偶联有荧光素的抗 体来检测( n a t h & j o h n s o n1 9 9 8 ) ，而后者用荧光素直接标记探针。f i s h 技术从 出现迄今二十年来，得到了迅速的发展。它与其它原位杂交技术相比，除了具 有污染小、灵敏度高等优点外，固有的一个无可比拟的优点是：不同的d n a 序 列用不同的半抗原标记后，可以同时用不同颜色的荧光素检测出来，从而可以 确定多个靶d n a 在染色体上的相对位置。这也就是多色荧光原位杂交( m f i s h ) 的原理。 衡量f i s h 技术的两个重要指标是：灵敏度和分辨率。灵敏度是指能够被清 楚地检测出来的最短的靶d n a 的k b 值。分辨率定义为在荧光显微镜下能够被分 辨出信号的两个相邻靶i ) n a 之间的最小距离而决定灵敏度和分辨率的主要因 素，主要依赖于靶d n a 毛e 载体( 染色体或d n a 纤维) 上的凝缩程度，即d n a 分子 的三维空间包裹程度，凝缩度越低，分辨率越高( 钟筱波1 9 9 7 ) 。f i s h 技术的发 展过程也正是分辨率和灵敏度由低到高不断推进的过程。细胞周期中各个阶段 染色体上靶d n a 的自然暴露程度不同，形成不同的靶d n a 类型。与此相对应的 探针种类也有不同的选择范围。以下将f i s h 常用的靶d n a 和探针类型分别具体 介绍： 1 1 1 原位杂交的靶d n a 的类型 细胞分裂周期中不同时期的染色体有不同的凝缩状态，其上靶d n a 的伸展 和暴露程度也随之不同，所以可按照染色体分裂时期将靶d n a 分为不同的类型。 针对不同类型的靶d n a 的特点，选择什么类型的靶d n a 根据研究的目的而定。 1 1 1 1中期染色体上靶d n a 中期染色体具备染色体的结构特征，为染色体鉴别所必需，是最基本的靶 d n a 的载体。由于中期染色体结构高度浓缩，在人类染色体上的分辨率大约为 1 - 3 m b ( l a w r e n c ee la 1 1 9 9 0 ，l i c h t e re la 1 1 9 9 0 ) ，在植物染色体上的分辨率也能 达到2 m b 。一个最近的研究，用流式细胞仪分离的大麦和小麦等作物的体细胞 染色体，将其长度延伸了1 0 1 0 0 倍，在保持染色体结构信息的同时提供了很高 的分辨率( v a l a r i ke fa 1 2 0 0 4 ) 对于一些染色体较小的种，中期染色体结构特征 不明显在光学显微镜下分辨不出着丝粒的种，需要考虑采用早中期或减数分裂 2 第一章染色体荧光原位杂交技术a f l s h ) 的发展及其在植物基因组研究中的应用 时期的染色体。 1 1 1 2 粗线期染色体上靶d n a 减数分裂粗线期染色体浓缩程度比中期染色体大为降低，并具有可识别的 结构特征。对一些小染色体的植物，常选用粗线期染色体。植物粗线期染色体 与相应的中期染色体长度的倍比，视植物不同而异，玉米大约是长1 0 倍，番茄 约是长1 0 1 5 倍，拟南芥长2 0 2 5 倍，而水稻约长4 0 倍( d ej o n ge ta 1 1 9 9 9 ) 。这些 植物的f i s h 分辨率随之提高相应的倍数。分辨率随早粗线期还是晚粗线期不同 而有差别，在番茄粗线期染色体f i s h 分辨率能达到1 0 0 k b 的水平( z h o n ge ta 1 1 9 9 9 ) ，在水稻染色体早粗线期甚至可以达到4 0 k b 的水平( c h e n ge ta 1 2 0 0 1 ) 。 分辨率还随靶d n a 在染色体上的位置属常染色质还是异染色质不同而不同，在 番茄中粗线期染色体上常染色质的分辨率是1 2 0 k b ，而异染色质的分辨率是 1 2 m b ( d e j o n g e t a l 1 9 9 9 ) 。在水稻中也有类似明显的常染色和异染色质分辨率 差异( c h e n ge ta 1 2 0 0 2 ) 。 1 1 1 3 间期细胞核上靶d n a 大量的间期细胞核很容易获得，间期核仍保持着细胞中染色质原有的空间 结构，在这一时期染色质浓缩程度比分裂时期低很多，故间期核也是常用的靶 d n a 载体。f i s h 分辨率在人类细胞间期核中可达到5 0 k b ( t r a s k e t a l 1 9 8 9 ) ，在 植物细胞中可达到1 0 0 k b ( j i a n g e t a l 1 9 9 6 ) 。但间期细胞核没有可识别的染色体 结构，其应用范围还是受到一定的限制。 1 1 1 4d n a 纤维( d n a f i b r e ) 用化学方法处理将染色体d n a 游离出来，可以得到d n a 纤维。w i c g a n t 等 ( 1 9 9 2 ) 和h e n g 等( 1 9 9 2 ) 首先用人类间期核制备出游离的染色质丝( f r e e c h r o m a t i n ) ，这种染色质丝已失去原有的细胞空间结构，其d n a 分子和复合的蛋 白质一起游离出来形成d 懈维，其f i s h 分辨率水平已接近1 0 k b ，这就是最初 的d n a 纤维。但这种染色质丝仍是d n a 和蛋白质的复合体，如果进一步将染色 体的结构破坏，让d n a 分子与复合的蛋白质分离，双链d n a 完全伸展并依附在 载片上，形成完全游离的d n a 纤维( e x t e n d e dd n af i b r e 。e d f ) ( i a r r a w i n d l e 1 9 9 3 ) 。目前d n a 纤维的展开度无论在植物中还是在动物中都是3 o 3 5 k b p m 接近于d n a 分子的最大自然伸展度2 9 4 k b 【m ，如果光学显微镜的最大光学限制 3 博士学位论文 松属单维管束亚属植物r d n a 的染色体定位研究 是0 1 _ n n ，其分辨率的理论值可以达到3 0 0 k b ，与常规分子生物学的限制性内切 酶图谱法的相当。目前d n af i b r e f i s h 在植物中实际分辨率能达到卜3 k b ( 钟筱 波1 9 9 7 ) 。在人类中已接近于1 k b ( h o r i j n 砑a 1 1 9 9 5 ) 。 1 1 2 探针的类型 探针作为染色体原位杂交中与靶d n a 杂交的带标记的特定核苷酸序列，其 检测灵敏度主要受靶d n a 长度和拷贝数的影响。 1 1 2 1多拷贝d n a 探针 这类探针包括通用型重复序列和特异性重复序列。 通用型重复序列主要有1 8 s 2 6 sr d n a 和5 sr d n a 、着丝粒序列、端粒及亚 端粒序列、转座子序列等。其中1 8 s 2 6 sr d n a 和5 sr d n a ，属编码核糖体r n a 的多基因家族序列，都是多拷贝串联重复序列，因而比较容易在植物染色体上 进行定位。它们同时还可作f i s h 流程的可靠性的对照探针。 特异性重复序列探针对染色体鉴定很有帮助，比较典型的例子有：来自黑 麦s e c a l ec e r e a l e 的一个非编码的高度重复序列p s c l l 9 ，可以用来检测小麦中的b 基因组( m c i n t y r ee ta 1 1 9 9 0 ) ；从山羊草a e g i l o p ss e q u a r r o s a 中分离的一段1 k b 的 重复序列p a s l ，可以用来检测小麦中的d 基因组( r a y b u m & g i l l1 9 8 6 a , 1 9 8 6 b ) ； 从燕麦中分离出一个小麦c 基因组特异性重复序列( f a b i j a n s k i e ta 1 1 9 9 0 ) ；而来 自大麦的p h v g 3 8 是一个微卫星片段，对小麦b 基因组显示大量信号，对a ，d 基 因组表现少量信号( p e d e r s e n & l i n d e l a u r s e n1 9 9 4 ) 。 原位杂交是检测分散或串联重复d n 臌分在染色体上如何分布的最精确的 方法。多拷贝靶d n a 序列在染色体上可达几十m b 或几百m b ，因此用重复序列 做探针与染色体原位杂交，容易达到很高的灵敏度。 1 1 2 2 单拷贝和低拷贝d n a 探针 单拷贝和低拷贝d n a 在染色体上的定位是比较困难的，一般通过多信号放 大来提高检测的灵敏度。由于检测的灵敏度的限制，早期单拷贝基因主要是一 些长片段的c d n a ，e s t ，r f l p 标记，在玉米、欧芹、豌豆，大麦上分别定位了 单拷贝基因，如蜡质基因( s h e l l 甜a 1 1 9 8 7 ) ，查尔酮合成酶基因( h u a n ge ta 1 1 9 8 8 ) ，豆球蛋白基因( s i m p s o n e ta 1 1 9 8 8 ) ，醇溶蛋白基因和淀粉酶基因( c l a r k 以 a 1 1 9 8 9 ；l e i t c h h e s l o p h a r r i s o n1 9 9 3 ) 目前主要从基因组文库中筛选的长片 4 第一章染色体荧光原位杂交技术( f i s h ) 的发展及其在植物基因组研究中的应用 段的单拷贝和低拷贝d n a 克隆，如酵母人工染色体( y e a s ta r t i f i c i a lc h r o m o s o m e s ， y a c s ) ，细菌人工染色体( b a c t e r i aa r t i f i c i a ld o m o m e ，b a c s ) ，作为单拷贝和 低拷贝d n a 探针定位不同时期染色体上靶d n a 。但d n a - f i b m 尤适于单拷贝和 低拷贝d n a 定位，检测灵敏度可达到1 3 k b 左右。 1 1 3 染色体原位杂交分支技术 随着原位杂交自身的发展和其它技术相结合，产生的新技术层出不穷，大 大拓展了其应用范围。下面将介绍一些染色体原位杂交相关技术及分支技术： 1 1 3 1 多色荧光原位杂交( m f i s h ) f i s h 最大的一个特点是可以用不同的修饰核苷酸分子( 半抗原) 标记不同的 d n a 探针，再用不同的荧光素检测，或直接用不同颜色的荧光素标记不同的探 针，可以同时实现不同靶d n a 的定位，并能排出不同靶d n a 的相对位置和排列 顺序，这就是所谓的多色荧光原位杂交( m - f i s h ) ( l c i t c h e t a l 1 9 9 1 ) 。不同荧光 素之间的颜色区分依赖于是否具有不同激发和发射波长( n e d e d o fe ta 1 1 9 9 0 ) 。 由于荧光素的种类有限和相互之间的光谱重叠，一般只能观测到三种不同颜色 荧光。如果算上光谱范围在红外和远红外的荧光素，并配备远红外灵敏度的照 相机的情况下，可观测到5 种颜色荧光素。在高灵敏度的c c d 和图象分析系统的 帮助下，目前在人类染色体上可观测到的荧光素已达到5 种，在人类基因组研究 中已成功地对2 2 条常染色体和2 条性染色体进行了多色染色体涂色鉴别 ( s p e i c h e re ta 1 1 9 9 6 ；s c h r o c ke ta 1 1 9 9 6 ) 。 1 1 3 2 染色体原位抑制杂交 大多数的含有单拷贝基因c o s m i d s 、y a c s 或b a c s 克隆中除了单拷贝序列外 还有大量插入的重复顺序，所以用这些探针进行原位杂交时，这些重复序列会 干扰单拷贝序列产生特异性信号。如果用一些过量的非标记的d n a 作封阻，与 标记的探针片段一起变性，探针或染色体上的重复序列与非标记的d n a 竞争性 结合，只剩下标记了的单拷贝序列与染色体上的d n a 杂交，这一过程叫做染色 体原位抑制杂交( c h r o m o m c ns i r es u p p r e s i o n ，g i s s ) ，i 主ll a n d e g e n t 等( 1 9 8 7 ) 首创。常用的封阻d n a 是基因组总d n a 或c o t l 一d n a 原位抑制性杂交原理主 要于一些原位杂交分支技术中，在一定程度上促进了这些原位杂交分支技术的 完善，如基因组原位杂交( g e n o m e i ss i r eh y b r i d i z a t i o n ，g i s h ) ，染色体着染