（有机化学专业论文）染料亲和色谱复性蛋白质新方法的研究及其应用.pdf

，一。，j 一 hyull11i7ju4l|llloll4ill8lllt11ftllt 染料亲和色谱复性蛋白质新方法的研究及其应用 摘要 本论文分三部分，第一部分，基于大孔生物材料的染料亲和色谱，发展了一 种新型的蛋白质色谱复性新技术；第二部分，基于溶胶一凝胶法，通过氨水溶液 简单处理制备了球形硅胶支载的固定化会属亲和吸附剂；第三部分，基于溶胶一 凝胶法，通过氢氧化钠溶液简单处理制备了球形硅胶支载的生物吸附剂。 1 、基于大孔生物材料的染料亲和色谱( d l a c ) ，发展了一种新型的蛋白质 色谱复性新技术。采用具有表面大孔结构的壳聚糖一硅基( c s - s i l i c a ) 材料作为 d l a c 的基质材料。利用基质中的氨基，共价偶联亲和染料配基活性蓝( c b f ) 得到d l a c 吸附剂。模型蛋白质过氧化氢酶经6m o l l 尿素变性后，d l a c 可迅 速去除变性剂，并通过c b f c s s i l i c a 的吸附成功实现过氧化氢酶的复性。利用 荧光光谱和过氧化氢酶活性研究考察了变性过程并对色谱洗脱步骤进行优化。与 常规吸附复性法相比，可在蛋白质浓度提高2 0 倍的条件下进行d l a c 复性。 2 、提出了制备新型有机一无机复合基质的有效途径。以球形硅胶作为支载核、 以壳聚糖有机一无机杂化层作为壳，基于溶胶一凝胶反应，通过氨水简单处理后制 备了该吸附剂。在基质上固定金属离子后，即得到吸附蛋白质的固定化金属亲和 吸附剂。扫描电镜表征表明，经氨水溶液简单处理后，基质具有稳定的多孔表面。 x 衍射分析表明，有机一无机杂化和氨水处理过程可破坏壳聚糖的结晶区，从而 提高活性氨基的可利用度。采用同步热重一微量热分析进一步对制备的基质进行 了表征。在基质表面固定作为特异性亲和配体c u 2 + 后，制备了新型固定化金属 亲和吸附剂。以b s a 为模型蛋白，通过吸附实验考察了该吸附剂的吸附性能。 该吸附剂对b s a 吸附速度快、吸附容量大。提出的方法及制备的基质在生化分 析中具有潜在的应用前景。 3 、提出了制备新型有机一无机生物吸附剂的有效途径。以球形硅胶作为支载 核、以壳聚糖有机一无机杂化层作为壳，基于通过溶胶一凝胶反应，经氢氧化钠溶 液简单处理后制备了该生物吸附剂。有机一无机杂化层通过壳聚糖与前驱体丫环 氧丙氧丙基三甲氧基硅烷( g p t m s ) 溶胶一凝胶化过程共价固定到硅胶表面。c s 上的氨基与g p t m s 上的环氧基团交联后，克服了其酸溶性缺点。通过氢氧化钠 溶液简单处理后发生的湿法相转移，使制备的复合生物吸附剂具有粗糙的表面。 制备的生物吸附试剂可以用来处理电镀废水。 关键词：壳聚糖，硅胶，蛋白质复性，染料亲和色谱，多孔生物材料 i - 。一 l - - i 青岛科技人学研究生学位论文 t t h ed e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o n o fn e wc h r o m a t o g r a p h i c r e f o l d i n go fp r o t e i n sb yd y e a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y a bs t r a c t t h e r ea r et h r e ep a r t si nt h i st h e s i s an o v e lc o l u m n - b a s e dp r o t e i nr e f o l d i n g s t r a t e g y w a sd e v e l o p e d u s i n gd y e - l i g a n da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y b a s e do n m a c r o p o r o u sb i o m a t e r i a li n t h ef i r s tc h a p t e r as i m p l es t r a t e g yw a sp r o p o s e df o r p r e p a r a t i o no fs p h e r i c a ls i l i c a - s u p p o r t e dp o r o u sc h i t o s a nm a t r i x b a s e do ns o l - g e l r e a c t i o na n ds i m p l et r e a t m e n tw i t ha m m o n i as o l u t i o ni nt h es e c o n dc h a p t e r s p h e r i c a l s i l i c a s u p p o r t e db i o s o r b e n tf o rc o p p e ri o n sr e m o v a li nw a s t e w a t e rw a sd e v e l o p t e db y s o l - g e lr e a c t i o na n ds i m p l et r e a t m e n tw i t hs o d i u mh y d r o x i d ei nt h et h i r dp a r t 1 an o v e lc o l u m n b a s e d c h r o m a t o g r a p h i cp r o t e i nr e f o l d i n gs t r a t e g y w a s d e v e l o p e du s i n gd y e - l i g a n da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ( d l a c ) b a s e do nm a c r o p o r o u s b i o m a t e r i a l c h i t o s a n - s i l i c a ( c s - s i l i c a ) b i o m a t e r i a lw i t hm a c r o p o r o u ss u r f a c ew a s u s e da st h es u p p o r t i n gm a t r i xf o rt h ep r e p a r a t i o no ft h ed l a cm a t e r i a l t h ed y e l i g a n dc i b a c r o nb l u e f 3g a ( c b f ) w a ss e l e c t e da sa f f i n i t y h a n d l ea n dc o u l db e c o v a l e n t l yi m m o b i l i z e dt of o r md y e - l i g a n da f f i n i t ya d s o r b e n t ( c b f - c s - s i l i c a ) u s i n g t h er e a c t i v i t yo f n h 2o nc s - s i l i c ab i o m a t e r i a l a f t e rt h em o d e lp r o t e i nc a t a l a s ew a s d e n a t u r e dw i t h6m o l lu r e a ，t h ed e n a t u r a n tc o u l db er a p i d l yr e m o v e da n dc a t a l a s e c o u l db es u c c e s s f u l l yr e f o l d e da sf a c i l i t a t e db yt h ea d s o r p t i o no fc b f - - c s s i l i c a t h e u r e ad e n a t u r a t i o np r o c e s sa n de l u t ec o n d i t i o nf o rt h ec h r o m a t o g r a p h i cr e f o l d i n gw e r e o p t i m i z e db ym e a s u r i n gt r y p t o p h a n f l u o r e s c e n c ea n da c t i v i t yo fc a t a l a s e t h e r e f o l d i n gp e r f o r m a n c eo ft h ep r o p o s e dd l a cw a sc o m p a r a b l et od i l u t i o nr e f o l d i n g t h ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o nd u r i n gt h ep r o p o s e dc h r o m a t o g r a p h i cr e f o l d i n gw a s i n c r e a s e db yaf a c t o ro f2 0w i t h o u tr e d u c i n gt h ey i e l da c h i e v e dc o m p a r e dt od i l u t i o n r e f o l d i n g t h e c o l u m n b a s e d p r o t e i nr e f o l d i n gs t r a t e g y b a s e do nd y e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y w i t h p o r o u s b i o m a t e r i a l b e i n g m a t r i x p o s s e s s e dp o t e n t i a l i n c h r o m a t o g r a p h i cr e f o l d i n go fp r o t e i n i i 青岛科技人学研究生学位论文 2 an e wa n de f f e c t i v e s t r a t e g y w a s p r o p o s e d f o rt h e p r e p a r a t i o n o f o r g a n i c i n o r g a n i cc o m p o s i t em a t r i xb yu s i n gs p h e r i c a ls i l i c aa ss u p p o r t i n gc o r ea n d p o r o u sc h i t o s a n ( c s ) h y b r i dl a y e ra s s h e l lb a s e do ns o l - g e lr e a c t i o na n ds i m p l e t r e a t m e n tw i t ha m m o n i as o l u t i o n a f t e rm e t a li o nl o a d i n g ，i m m o b i l i z e dm e t a la f f i n i t y a d s o r b e n tf o r p r o t e i na d s o r p t i o n w a so b t a i n e d s c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p y i n v e s t i g a t i o ns h o w e dt h a t t h ew e tp h a s e i n v e r s i o no fc si na m m o n i u mh y d r o x i d e s o l u t i o ne n d o w e dt h ec o a t e dc sh y b r i dl a y e rw i t hc h e m i c a l l ya n dm e c h a n i c a l l y s t a b i l i z e dp o r es t r u c t u r e x - r a yd i f f r a c t i o ni n v e s t i g a t i o nr e v e a l e ds i g n i f i c a n td e c r e a s e o fc sc r y s t a l l i z a t i o n ，i n d i c a t i n gt h e a v a i l a b i l i t y o fa c t i v ea m i n e g r o u p s t h e a s - p r e p a r e dm a t r i xw a sa l s oc h a r a c t e r i z e du s i n gs i m u l t a n e o u st h e r m o g r a v i m e t r ya n d d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r y a f t e rl o a d i n gc d + a s p s e u d o b i o s p e c i f i cl i g a n d ，n e w i m m o b i l i z e dm e t a l a f f i n i t y a d s o r b e n tw a so b t a i n e da n di t s p r o t e i na d s o r p t i o n p e r f o r m a n c ew a se v a l u a t e db yb a t c ha d s o r p t i o ne x p e r i m e n t su s i n gb o v i n es e r u m a l b u m i n ( b s a ) a sas i m p l em o d e lp r o t e i n t h ea f f i n i t ya d s o r b e n ts h o w e df a s tk i n e t i c s a n dh i g hc a p a b i l i t yf o rb s aa d s o r p t i o n t h ep r o p o s e d a p p r o a c ha n dt h ep r e p a r e d m a t r i xs h o w e dp o t e n t i a la sap l a t f o r mt oc o n d u c tb i o a n a l y s i s 3 an e wa n de f f e c t i v e s t r a t e g y w a s p r o p o s e d f o r p r e p a r i n g n e w o r g a n i c i n o r g a n i cc o m p o s i t eb i o s o r b e n tb yu s i n gs p h e r i c a ls i l i c aa ss u p p o r t i n gc o r e a n dc h i t o s a n ( c s ) 一b a s e dh y b r i dl a y e ra ss h e l lb a s e do ns o l - g e lr e a c t i o na n ds i m p l e t r e a t m e n tw i t hs o d i u mh y d r o x i d e ( n a o h ) t h ec o a t i n gl a y e rw a sc o v a l e n t l yb o u n do n t h es u p p o r t i n gs i l i c at h r o u g hp o l y s a c c h a r i d ei n c o r p o r a t e ds o l - g e lp r o c e s ss t a r t i n gf r o m c sa n di n o r g a n i cp r e c u r s o r - g l y c i d o x y p r o p y l t r i m e t h o x y s i l o x a n e ( g p t m s ) g p t m s h a de p o x i d eg r o u p sa n dc r o s s l i n k e da m i n eg r o u p so fc st oa v o i di t sa c i d i cs o l u b i l i t y t h ec o m p o s i t eb i o s o r b e n th a dc o a r s es u r f a c ed u et ot h ew e tp h a s e - i n v e r s i o nb y t r e a t i n gi nn a o hs o l u t i o n t h ep r e p a r e db i o s o r b e n tc o u l db eu s e di nt r e a t i n ge l e c t r i c p l a t i n gw a s t e w a t e r k e yw o r d s ：c h i t o s a n ，s i l i c a ，p r o t e i nr e f o l d i n g ，d y e 1 i g a n da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ， p o r o u sb i o m a t e r i a l i i i 。：? 0 世 - r 目录 第一章引言1 1 1 蛋白质的性质l 1 1 1 蛋白质的组成。l 1 1 2 蛋白质的结构2 1 2 蛋白质的变性2 1 2 1 包涵体的产生3 1 2 2 包涵体的性质4 1 2 3 包涵体的溶解4 1 3 蛋白质的复性4 1 3 1 传统的蛋白质复性方法5 1 3 1 1 稀释复性。5 1 3 1 2 透析复性6 1 3 1 3 超滤复性6 1 3 2 色谱辅助复性方法6 1 3 2 1 凝胶排阻色谱7 1 3 2 2 疏水作用色谱7 1 3 2 3 离子交换色谱。8 1 3 2 4 亲和色谱9 1 3 2 4 1 固定化金属亲和色谱9 1 3 2 4 2 分子伴侣亲和色谱1 0 1 3 2 4 3 脂质体亲和色谱1 2 1 4 染料亲和色谱1 2 1 5 壳聚糖在染料亲和色谱中的应用前景1 4 1 6 课题研究思路1 6 参考文献17 第二章基于大孔生物材料的染料亲和色谱用于蛋白质复性新技术的 研究2 6 2 1 引言2 6 2 2 实验部分2 7 2 2 1 仪器与试剂2 7 2 2 2 染料配基亲和色谱吸附剂的制备2 7 ， i 。 2 2 3 过氧化氢酶的尿素变性2 7 2 2 4 过氧化氢酶活性和蛋白浓度的测定2 7 2 2 5 荧光表征过氧化氢酶2 8 2 2 6 染料亲和色谱在柱复性过氧化氢酶2 8 2 2 7 过氧化氢酶的稀释复性2 8 2 3 结果与讨论2 9 2 3 1 染料配基亲和色谱吸附剂的制备2 9 2 3 2 尿素变性过氧化氢酶2 9 2 3 3 过氧化氢酶的稀释复性3 l 2 3 4d l a c 色谱法洗脱条件的优化3 2 2 3 5 染料亲和色谱复性过氧化氢酶3 3 2 4 本章小结3 5 参考文献3 6 第三章基于溶胶一凝胶和氨水溶液制备新型固定化金属亲和吸附剂 的研究3 8 3 1 引言3 8 3 2 试验部分3 9 3 2 1 仪器3 9 3 2 2 试剂3 9 3 2 3 硅胶负载c s 杂化基质的制备3 9 3 2 4 固定化金属亲和吸附剂的制备4 0 3 2 5 固定化金属亲和吸附剂对牛血清蛋白的吸附实验4 0 3 2 6b s a 的测定4 0 3 3 结果与讨论4 0 3 3 1 利用溶胶一凝胶和氨水溶液制备新型多孔性基质4 0 3 3 2 基质上亲和配基的固定化4 3 3 3 3 亲和材料对b s a 的吸附4 4 3 3 4 蛋白质的动态吸附和吸附等温线4 6 3 4 本章小结4 7 参考文献4 8 第四章基于溶胶一凝胶和氢氧化钠溶液制备球形硅胶支载生物吸附 剂的研究5 0 4 1 引言5 0 4 2 实验部分5l 4 2 1 试剂51 4 2 2 仪器和设备5 1 4 2 3 硅胶负载c s 杂化基质的制备5 1 4 2 4 吸附剂的性能表征5 2 4 2 5 吸附剂对c u 2 + 的吸附实验5 2 4 2 6 通过柱层析吸附废水中的c u 2 + 5 3 4 2 7 吸附剂的再生与再利用性5 3 4 3 结果与讨论5 3 4 3 1 基于硅胶负载c s 有机一无机杂化层制备吸附剂的过程5 3 4 3 2 吸附剂的特征5 4 4 3 3 吸附剂对c u 2 + 的吸附5 6 4 3 4 共存离子对c u 2 + 吸附的影响5 8 4 3 5 废水中c u 2 + 在色谱柱中的吸附5 9 镶t ， 4 3 6 解吸附和再利用6 0 4 4 本章小结6 0 参考文献6 1 结论。6 3 致谢6 4 攻读硕士学位期间发表的学术论文6 5 独创性声明6 6 一 爹 ， i； 1 ：一 青岛科技人学研究生学何论文 第一章引言 基因工程技术的迅猛发展揭开了人类生命科学研究的崭新篇章，也开辟了现 代生物工业发展的新纪元。将目标蛋白质基因转入原核或真核表达体系中异源表 达制备重组蛋白质，已成为目前临床及工业上获取蛋白质的重要途径。以大肠杆 菌为宿主菌的原核表达体系表达周期短、产量高、易于控制，是生产重组蛋白质 的首选表达系统。然而，许多蛋白质在大肠杆菌中高效表达时常以包涵体的形式 沉积于细胞内。用变性剂溶解包涵体后，人们必须进行蛋白质复性以获得具有生 物活性的蛋白质i l 巧j 。如何高效复性包涵体蛋白质是基因工程技术面临的一个难 题，也是决定基因工程产品能否商业化的关键。随着人类基因组计划的完成和后 基因组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。因此，对蛋白质高效 复性技术及复性机理的研究是当前国际上研究的热点，具有重大的学术意义和应 用价值。 随着生物工程和生物技术的出现，许多重组基因在外源细胞中得以表达出 来。作为一个广泛使用的基因受体，大肠杆菌可以提供一种简易的方式生产出大 量的目标蛋白。然而，这种表达蛋白通常会在细胞质中形成包涵体，原因在于该 系统中新生肽的合成速度往往要比折叠速度快。为了得到正确折叠的活性重组蛋 白，在后续的研究中，高效折叠技术尤其重要1 6 。8 】。 1 1 蛋白质的性质 1 1 1 蛋白质的组成 蛋白质是一类重要的生物高分子，英文为“p r o t e i n ”。蛋白质有成千上力种， 不同的蛋白质有不同的生物功能。蛋白质是2 0 种o t 氨基酸通过酰胺键( 肽键) 连成的长链分子，这种长链即所谓的肽链。许多蛋白质还包括飞肽链结构的其他 组成成分，这种成分称为配基或辅基。 肽链有许多氨基酸通过肽键( 相邻两个氨基酸脱去一分子水) 连接而成。2 0 种氨基酸前后沿一定的排列次序形成特定的结构。当氨基酸组成及它们的排列次 序和长短不同时，就形成了不同的蛋白质；或者，不同的蛋白质有特定的氨基酸 序列。 1 1 2 蛋白质的结构 根据蛋白质结构有不同的层次，可分别称之为蛋白质的一级结构、二级结构、 矿 染料亲和色谱复性蛋白质新方法的研究及其麻川 三级结构及四级结构。 一级结构是指肽链中的氨基酸排列序列。 蛋白质的二级结构也称为构象单元，因为它们是蛋白质复杂的空间构象的基 础。常见的构象单元有：螺旋；折叠：转角：无规则卷曲。一些构象单元的结构 不是不可改变的，p h 、温度、溶剂极性等环境因素可以影响单元的变化。 具有二级结构的的肽链空间走向可形成具有空间三级结构的蛋白质，如荧光 蛋白类，它们几乎都有生物功能和活性，其中有些还能进一步相互作用，形成更 高层次的结构。蛋白质之所以有功能，是因为分子表面有可以进一步作用的基团， 不同的蛋白质由于分子表面结构不同，可作用的基团分布和组合也不同，这种特 定的结构就是各种蛋白质具有不同的功能和活性的分子基础。 图1 - l ：绿色荧光蛋白分子立体结构图 f i g 1 1 t h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo fg f e 四级机构也可以认为是一些特定三级结构的折叠肽链通过非共价键形成的 大分子体系，也可称为亚基的装配( a s s e m b l y ) 。装配是一个非常复杂的过程，它 能使各亚基间相互调节，使蛋白质分子的功能更完善。 1 2 蛋白质的变性 蛋白质的变性( d e n a t u r a t i o n ) 是指在变性因素( 如酸、碱、热、有机溶剂、 2 活性丧失、不对称性增高、溶解度降低以及其它的理化常数发生改变【9 】，但变性 不涉及共价键( 肽链和二硫键等) 的破裂，一级结构保持完好【1 0 川。 蛋白质变性后，整个分子的形状由天然紧密的结构伸展为松散的、无一定空 间结构的链状分子【1 2 j 。变性后的蛋白质溶解度降低，容易形成聚集粒子【1 3 l ，这是 由于其高级结构受到破坏后，包藏在蛋白分子内部的疏水基团大量暴露在分子表 面，很容易引起蛋白质分子间相互碰撞而发生聚集沉淀。 1 2 1 包涵体的产生 e c o l i 表达系统是基因工程中最常用的外源蛋白表达系统，然而，重组蛋白 在e c o l i 中的高水平表达常导致形成不溶的、无活性聚集体一包涵体【1 4 】( i n c l u s i o n b o d y ) 。重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，无论是用原核表达体系还是用酵 母表达体系，甚至是高等真核表达体系，都能形成包涵体。内源性的蛋白，如果 表达水平过高，也会聚集形成包涵体。蛋白质的高水平表达是包涵体的形成的主 要原因之一 1 5 , 1 6 j 。动力学研究表明，活性蛋白质的产率取决于蛋白质的合成速率、 折叠速率和聚集速率，如图1 2 所示1 1 7j 。 蟹臼殛膏姨 1 羁丽 折卺 断夸瞳多髓链孓乏丽 聚集土_ 数反应 宋集 土包涵唯呢，哎 包洒唯 靖哞西l i l 饔 图1 2 ：蛋白质的合成、折叠与聚集示意图 f i g 1 2 s c h e m eo ft h es y n t h e s i s f o l d i n ga n da g g r e g a t i o no fp r o t e i n s 包涵体形成的原因比较复杂，一般认为，表达的外源蛋白质因局部微环境不 适宜或缺少某些协助因子，不正确地连续形成次级键，这些不恰当的中间折叠体 高浓度的积聚在起就形了不溶的包涵体。目前的研究认为，包涵体形成的具体 原因可能有如下几种f 1 8 。2 1 】：( 1 ) ，蛋白质分泌序列的存在阻碍了蛋白质的进一步 折叠，导致错误折叠分子的产生：( 2 ) ，对于含二硫键( d i s u l f i d eb o n d ) 的蛋白质， 胞质内高还原性环境不利于形成正确的二硫键，导致二硫键的错配：( 3 ) ，原核 ，。 。 ， 染料求和色谱复性篮自质新方法的研究及其廊川 细胞不具备糖基化功能，真核糖蛋白无法糖基化使中间体溶解度下降，导致不溶 解包涵体形成；( 4 ) ，原核表达体系中缺乏必要的翻译后加工机制，缺乏一些蛋 白质折叠过程中需要的酶和辅助因子( 比如分子伴侣等) ，导致包涵体的形成； ( 5 ) ，原核细胞缺乏翻译后修饰以及协助蛋白折叠的系统，促使外源蛋白质形成 包涵体；( 6 ) ，此外任何影响新生肽链折叠中间体稳定性的因素，如p h 、离子强 度和温度都可能导致蛋白质的聚集而形成包涵体。 1 2 1 包涵体的性质 包涵体是具有膜结构的非结晶蛋白质聚集体，其中5 0 以上是克隆产物，其 一级结构j 下确，包含部分二级结构，但由于立体结构构型存在错误，因此没有生 物活性【2 2 2 3 1 。主要成分除目标蛋白外，还含有核糖体元件、r n a 聚合酶、环状或 缺1 2 1 的质粒d n a 、脂多糖、脂体以及外膜蛋白o m p c 、o m p f 和o m p a 等。大肠 杆菌表达外源基因时所形成的包涵体与细胞质内蛋白的物理化学性质不同【州。虽 然形成了无活性的蛋白质包涵体，但是包涵体的形成对于重组蛋白的生产也有其 有利的一方面，具体表现在1 2 5 j ：( 1 ) ，某些蛋白质以活性状态在细胞内形成时， 可能会由于蛋白质水解而无法稳定表达，而包涵体的存在消除了这个问题；( 2 ) ， 大量活性蛋白质在宿主细胞体内存在时，可能会对宿主细胞产生毒性；( 3 ) ，由 于包涵体具有较高的密度和不溶性，通过离心就能相对容易的对其进行纯化，纯 度可达9 0 以上，对于工业蛋白质的生产是一个相对经济的过程。 1 2 3 包涵体的溶解 对于包涵体蛋白，由于是不溶于水的聚集体，要获得有用的活性蛋白必须先 将包涵体溶解。常用的溶解包涵体的方法有：高浓度变性剂( 8m o l l 腙，7m o l l 盐酸胍) 1 2 6 - 2 8 】；表面活性剂 2 9 , 3 0 】，常用的有十二烷基磺酸钠( s d s ) 【3 1 1 ，十六 烷基氯化铵( c t a c ) 1 3 2 】，十二烷基肌氨酸钠删和月桂酰基氨酸钠( s a r k o s y l ) 等； 极端p h ( 酸性或碱性【3 5 ，3 6 】) 等。 包涵体的溶解方法对重组蛋白的纯化和复性有很大的影响。研究表明，用高 浓度的变性剂溶解的重组蛋白会失去包涵体中本来存在的二级结构，呈现完全无 序的结构，通常较难复1 生 3 7 , 3 8 】。而用含低浓度变性剂的碱溶液和表面活性剂溶解 包涵体则能够保留包涵体自身含有的二级结构，有利于蛋白质的复性，目前己被 广泛的应用于包涵体的溶解。 1 3 蛋白质的复性 蛋白质的复性( r e n a t u r a t i o n ) 是指包涵体溶解后，处于去折叠态的多肽链除 4 青岛科技人学研究生学位论文 去变性因素后，在合适的条件下变性蛋白重新恢复其天然结构及生物活性的过 程，又称为变性蛋白的再折叠【3 9 , 4 0 ，如图1 3 所示。 聪髦l 稚磊l 移疆器姥够 。” 。5、 鑫绉l 罐移 l 童馥t ；密线 字孑彩爱 弘缝轷爹镪 露 爨鹱 一 一，”：h ，h 、 图1 3 ：包涵体、溶解及复性后蛋白质结构示意图 f i g i - 3 c o n f i g u r a t i o no fi n c l u s i o nb o d y , s o l u b i l i z a t i o na n dr e n a t u r a t e dp r o t e i n 蛋白质变性后，其氨基酸的完整顺序没有变化，存在着向活性蛋白质再折叠 的趋势。从变性蛋白质再折叠的一般机制看，变性的蛋白质需经过一系列的折叠 中间体，最终恢复其天然构象。此过程中，蛋白质f 确折叠、错误折叠、不可逆 聚集之f j 的竞争决定蛋白质复性效率，如图1 4 所示。迅速去除变性剂、促进蛋 白质从中间态向天然态转变，抑制变性蛋白质分子间的不可逆聚集是提高蛋白质 复性效率的关键4 1 - 4 4 。 乙。：；一i i i i i i = ；= 皇：n 1lf a l l 图1 4 ：蛋白质折叠的简化动力学模型 f i g 1 - 4 s i m p l i f i e dk i n e t i cs c h e m eo ft h ec o m p e t i t i o nb e t w e e nf o l d i n ga n da g g r e g a t i o n 1 3 1 传统的蛋白质复性方法 1 3 1 1 稀释复性 稀释复性【4 5 】：变性蛋白溶液直接加入缓冲溶液，放置过夜，是实验室复性研 究最经常使用的方法。其操作的关键是控制变性蛋白加入复性缓冲溶液的速率， ，i j ， j 9 0 ，| | 懒 3 3 3 一羹冀一奏 一 蠛 妒e，；多 阶 1f凡囊k一爨捌 一霹 染料来平色谱复性篮向质新方法的研究及其戍川 使其及时混合完全以维持低的蛋白浓度而阻止其聚集。为了减少聚集，提高复性 收率，通常在很低的蛋白浓度下操作。为减少高浓度蛋白复性时的聚集，可以采 用连续流加稀释【4 6 4 7 1 和脉冲稀释4 8 , 4 9 1 等两种方式。流加稀释复性法能够让开始流 加的蛋白质在非常低的浓度下复性，随着复性的进行，已经完全折叠好的蛋白质 不易和后流加的变性蛋白质发生共聚，从而提高复性收率。但这两种方法复性时， 若不同时间的复性缓冲液组成不同，可能会影响蛋白质的正确折叠。其优点是操 作简单、生产成本低，但蛋白质复性起始浓度较低且复性后溶液体积过大，后续 分离纯化困难。 1 3 1 2 透析复性 透析复性【5 0 1 ：将变性蛋白溶液加入半透膜中，通过逐渐降低膜外溶液浓度来 控制变性剂去除速度。变性剂是通过扩散而除去的，因此变性剂浓度的降低是一 个缓慢的过程。通过改变浓度差可以控制变性剂去除的速率，透析复性又分为一 次透析、分次透析和渐降变性剂浓度的透析【5 1 5 引。优点是不增加体积，但由于透 析复性过程比较缓慢，不易实现自动化，蛋白质容易附着在透析袋上造成损失， 并且易形成无活性蛋白质聚体，不适合大规模操作。 1 3 1 3 超滤复性 超滤复性：是基于分子大小不同的一种复性技术，通过选择合适的膜，在一 定压力作用下，缓冲溶液中的小分子物质能自由进出膜，而大的蛋白分子则被膜 阻止，随着变性剂的缓慢去除，使变性蛋白分子逐渐恢复其天然构象。k a t o h 等 人【5 3 】用管式多孔陶瓷膜，对溶菌酶连续复性，发现复性效果受浓度的影响较小。 w e s t 等人【5 4 1 用醋酸纤维素酯的中空纤维超滤膜对碳酸酐酶复性进行研究。超滤法 尽管可迅速去除变性剂，但不适合样品量较少的情况，并且蛋白质聚集体容易堵 塞膜孔甚至某些蛋白会不可逆变性，难于实现大规模应用。 1 3 2 色谱辅助复性方法 利用液相色谱复性变性蛋白质的色谱复性法是近年来发展起来的蛋白质复 性新方法。该法操作快速、复性回收率高、易于放大，可实现高浓度蛋白质的复 性，是当前复性技术研究的热点。色谱法复性蛋白质时，可以较快地去除变性剂。 色谱固定相除可减少或消除变性蛋白质分子脱离变性剂环境后的分子聚集、避免 沉淀产生外，还可促进蛋白质吸附、诱导折叠、增加折叠中间体的稳定性。除此 之外，色谱复性的同时还可实现目标蛋白质与杂蛋白的分离，使复性和纯化同时 进行。 6 青岛科技人学研究生学位论文 目前，国内外科学家已分别采用凝胶排阻色谱、疏水作用色谱、离子交换色 谱及亲和色谱成功地对变性蛋白质进行了复一| 生 5 5 , 5 6 】。 1 3 2 1 凝胶排阻色谱 排阻色谱法( s e c ) 所用的载体为一定孔径的多孔亲水性凝胶。当分子大小 不同的混合物通过凝胶柱时，直径比孔径大的分子将不能进人凝胶内部，便直接 沿凝胶颗粒的间隙流出，较小的分子可以在容纳它的空隙内自由出入并且在柱内 保留时间较长。这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来， 从而达到分离目的。 复性机理为：当变性蛋白进入柱顶端，使用缓冲溶液沈脱时，因为凝胶介质 内孔径大小的差异首先将变性剂和变性蛋白分开而启动蛋白质折叠，折叠过程中 不同构型的蛋白也会分开，局部复性的蛋白分子在液一固两相间进行反复分配， 最终变为天然构象的蛋白。凝胶过滤介质骨架的空间位阻作用有效抑制了蛋白质 的聚集。s e c 的主要作用不是变性蛋白与s e c 固定相f b j 的特殊作用力，而是有利 于更换用于变性蛋白复性的缓冲溶液，不涉及二硫键是否正确对接的问题，s e c 对蛋白的复性作用依靠s e c 填料孔限制蛋白的扩散速率以及除去变性剂以减小 蛋白质的聚集这一双重作用而实现。 b a t a sb 等人1 57 。刊j 提出了凝胶过滤复性蛋白质的机理，许多蛋白质采用凝胶过 滤复性获得了成功【5 7 6 0 , 6 1 , 6 2 】，他们的研究发现折叠蛋白质的动力学半径和分配系 数与变性剂浓度呈负相关 5 9 6 0 l ，因此变性剂在凝胶过滤柱中的去除速度影响着部 分折叠蛋白与变性蛋白的分离