（微生物学专业论文）单菌株发酵和混合菌株发酵产纤维素酶的研究.pdf

摘要 摘要 纤维素占植物干重的3 5 一5 0 ，是地球上分布最广、含量最丰富的可再 生资源，纤维素酶可将其转化为人类所需的能源、食物和化工原料。对解决当 前环境污染、食物短缺和能源危机具有重要意义。关于纤维素酶的生产方法， 国内研究较多是单菌株发酵产纤维素酶，混合菌株发酵研究较少。本文选用实 验室筛选的三株纤维素酶生产菌，进行了单菌株与双菌株混合摇瓶发酵实验， 对六种不同发酵液进行了纤维酶的提取纯化对比研究，并比较了它们各自纤维 素酶酶系组分。具体概括如下： 1 、串珠霉、链霉菌、技孢菌初始单菌发酵实验中。串珠霉产酶活力最高， 链霉菌最低。串珠霉产c i v i c 酶、f p a 酶和b g 酶活力分别为1 4 6i u 、1 0 4i u 、 0 3 8 i u 。 2 、通过单因素和s a s 二水平设计及响应面分析，得到了串珠霉发酵产纤维 素酶最佳条件。p b 设计法筛选出影响其产酶活力的显著因素为稻草添加量、麸 皮添加量和p h 。b b 设计法对这三个显著因素响应分析得最佳发酵条件为：稻 草粉6 3 ，麸皮2 8 ，豆饼粉3 玉米粉2 ，k h 2 p 0 4 0 5 ，c a c l 2 0 3 p h 4 7 ，2 8 ，接种量3m l ，发酵7 天。实验结果有良好稳定性，优化后串珠霉产 c m c 酶、f p a 酶、f i g 酶活分别达2 4 5 砌、1 3 7i l j 、o 7 2i u ，是优化前的1 6 8 、 1 3 0 、1 8 9 倍。 3 、混菌发酵产纤维素酶实验得出：a 、产纤维素酶酶活晟高的是串珠霉与链 霉菌混合发酵，c m c 酶、f p a 酶、b g 酶酶活分别为3 7 5i u 、1 5 2l u 、2 4 5l u ； 其次是串珠霉与枝孢菌混合发酵，产c m c 酶、f p a 酶、g g 酶酶活分别为4 0 8 、 1 5 3i u 、2 7 li u ，校孢菌与链霉菌发酵产酶最小，产c m c 酶、f f a 酶、b g 酶 活分别为1 4 2i u 、1 2 8i u 、o 3 1i u ；b 、真菌与真菌混合时之间存在竞争性抑制 作用，早期二者必须分开培养：真菌与放线菌混合对彼此互利共生。一起培养 比分开培养酶活高。c 、混菌株发酵产纤维素酶酶活比单菌株高，并且发酵周期 比单菌株短。 4 、优化得到串珠霉与链霉菌混合发酵产纤维素酶最佳条件为：稻草粉5 8 ， 麸皮3 ，豆饼粉3 。玉米粉2 ，k h 2 p 0 4 0 5 ，c a c t 2 0 3 ，起始p h4 5 ，链 霉菌：串珠霉接种比例3 5 5m l ：2m l ，先3 7 c 发酵4 天再2 8 继续发酵，发酵 摘要 总时间5 7 5 天。在此条件下，产c m c 酶、f f a 酶、b g 酶酶活分别为4 0 8i u 、 1 5 3m 、2 7 1i u ，是各单菌株发酵酶活的2 7 9 4 2 5 倍、1 4 7 2 3 9 倍、5 4 7 1 3 倍。 。 5 、纤维素酶酶系分析发现：从6 种发酵液提取纤维酶采用的盐析硫酸铵饱 和度不同；6 种租制酶液经相同条件层析，它们各自的c i v i c 酶、f p a 酶、f i g 酶酶活吸收峰个数及位置不一样；6 种精制纯化后的酶液经s d s p a g e 电泳得到 的纤维素酶蛋白条带数及r f 值也各有区别，而且比较分析发现混菌发酵产生的 酶蛋白条带较单菌多，纤维素酶酶系较齐全。这说明了不同菌株之闻及单菌株 与混合菌株之问发酵产纤维素酶酶系是有差别的，由于混合菌株发酵时菌株间 存在相互影响，相互协同作用，因此有助于纤维素酶活力的提高 关键词：纤维素酶；单菌发酵；混菌发酵：响应面分析法；酶系 a b s t r a c t c e l l u l o s ea c c o u n t sf o r3 5 一5 0 w e i g h ti nd i i e dp l a n t a n di ti st h em o s t a b u n d a n tr e n e w a b l er e s o u r c et h a ti sd i s t r i b u t e dw i d ei nt h ew o r l d c e l l u l a s ec 衄 c o n v e r t 础i i l 0 t oe n e r g y , f o o d , i n d u s t r i a lm a t e r i a l sa n ds oo n s oi th a sg r e a t r e a l i s t i cm e a n i n gf o rh u m a nb e i n gt os o l v ee n v i r o n m e n g tp o l l u t i o n , f o o ds h o r t a g ea n d e n e r g yc r i s i s 。c o n c e r n i n gt h em e t h o d so fp r o d u c i n ge e l l u l a s e , m o s to ft h ed o m e s t i c r e s e a r c h e sf o c uo nt h em o n o x e n i ef e r m e n t a t i o n , h o w e v e ri ti sr a r ea b o u tt h em i x e d f e r m e n t a t i o n i nt h i sr c s e a r 吐l , w eh a v ec a r r i e do u tt h em o n o x e n i ef e r m e n t a t i o na n d t h em i x e df e r m e n t a t i o nw i t ht h r e ec e u u l a s ep r o d u c i n gs t r a i t l sw h i c hw c i cs c r e e n e db y o u rl a b t h e nw er e s e a r c h e de x t r a c t i n ga n dp u r i f i c a t i o no fc e l l u l o s e ，a n dc o m p 删 t h ec o m p o n e n to fc e l l u l a s , s e r i e sb e t w e e nt h i st w of e r m e n t a t i o nm e t h o d s i h ed e t a i l c o n c l u s i o n sa r ef o l l o w i n g ： 1 a m o n gt h em o n o x e n i ef e r m e n t a t i o no fm o n i l i a 。s t r e p t o m y c e s ，c l a d o s p o r i u m ， m o n i h a sa b i f i t yo fp r o d u c oc e u u l a s ei st h eh i g h e s t i t sy i e l d i n go fc m c a s e ，f p a a s e a n db g o s eh a v er e a c h e d l 4 6i u ，1 0 4i u ，0 3 8i l lr e s p e c t i v e l y b u ts t r e p t o m y c e s s a b i l i t yo fp r o d u c ec e u u l o s ei st h el o w e s t 2 w i t ht h ee x p e r i m e n t so fs o m es i n g l ef a c t o r sa n da n a l y s i so ft h es a s ，w e o p t i m i z e dt h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sw h i c hm o n i l i ap m d u c e sc e l l u l o s e b yt h e m e t h o d so fp b ，w ef o u n dt h em o s tn o t a b l ef a c t o r st h a ta f f e c tt h ep r o d u c t i o no f c e l l u l o s ea r ea d d i n go fs t r a wp o w d e r , p ha n da d d i n go fb r a n a n dw i t ht h ed e s i g no f b b ，w eg o tt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s 猫f o l l o w i n g ：s t r o wp o w d e r 6 3 ， b r a n 2 8 ，b e a np o w d e r 3 o ，c o r nf l o u r 2 0 ，k h 2 p 0 4 0 5 ，c a c l z 0 3 ，p h4 7 ， 2 8 1 2 ，f e r m e n t a t i o np e r i o d7 d a y s ，i n o c u l a t i o ns i z e3 m lr e s m l to ft h i se x p e r i m e n ta r e s t e a d yw i t ht h i so p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，m o n i l i ay i e l d e dt h ea c t i v i t yo f c m c a s e ，f p a a s ea n d8 g o s ei s2 4 5i l l 、1 3 7i u 、0 7 2i ur e s p e c t i v e l y ，w h i c hi s1 6 8 t i m e s ，1 3 0t i m e s ，1 8 9 t i m e so ft h eo r i g i n a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sr e s p e c t i v e l y 3 i i lt h ee x p e r i m e n to fm i x e df e r m e n t a t i o nw eg o ts e v e r a lc o n c l u s i o n s f i r s t i t i st h eh i g l l e s tc e l l u l o s ea c t i v i t yb ym i x e df e r m e n t a t i n gw i t hm o n i l i aa n ds t r e p t o m y c e s ， t h ea c t i v i t yo fc m c a s e ，f p a o s ea n db g a s ei s3 7 5i u ，1 5 2i u ，2 4 5i u ；s e c o n d ， a b s t t a c t y i e l d i n go fm i x e df e r m e n t a t i o nw i t hc a d o s p o r u ma n ds t r e p t o m y c e si st h el o w e s t , w i t hi t sy i e l d i n go fc m c a s e , f p a a s ea n d8 g a s ei s l 4 2i u ，1 2 8i u ，0 3 1i u ；t h u d , w h e nw em i x e do n ee u m y c e t e sw i t ha n o t h e re u m y c c t e sp r o d u c i n gc e l l u l a s e , t h e y w i l lr e s t r a i ne a c ho t h e rr i v a l r o u s l y ，s ot h e ym u s tb es e p a r a t e di ne a r l yp h a s ew h e n c u l t u r e d ；w h e nw em i x e dc u l t u r ee u m y c e t e sa n da c t i n o m y c e t e , t h e ye x i s ta c c r e t e l y ， a n dt h ec e l l u l a s ea c t i v i t yi sm u c hh i g h e rt h a nt h es e p a r a t ec u l t i v a t e df e r m e n t a t i o n f o r t h , t h ec e l l u l a s ea c t i v i t yo fm i x e df e r m e n t a t i o ni sh i g h e rt h a nm o n o x e n i e f e r m e n t a t i o n ，a n d f e r m e n t a t i o n p e r i o d o f t h e f o r m e r i s m u c hs h o r t e r t h a n t h e l a t t e r 4 t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fm i x e df e r m e n t a t i o nw i t hm o n i l i a a n ds t r e p t o m y c e si s f o l l o w i n g ：s t r e wp o w d e r 5 8 ，b r a n 3 ，b e a np o w d e r 3 ，c o i n f l o u r 2 ，k h 2 p 0 4 0 5 ，c a 0 2 0 3 ，i n i t i a lp h 4 5 ，r a t i oo fi n o c u l a t i o ns i z e ( m o n i l i a ： s t r e p t o m y c e s ) 2 m l ：3 5 5 m la f t e ru n d e r2 8 c f e r m e n t a t e d4 d a y st u r nt o3 7 ，t o t a l p e r i o di s5 7 5 d a y s t h ea c t i v i t yo fc m c a s e ，f p a a s ea n d8 g a s e i s4 0 8i u ，1 5 3i u ， 2 7 1i ur e s p e c t i v e l y , w h i c hi s2 7 9 4 2 5 t i m e s 1 4 7 2 3 9 t i m e s , 5 4 7 1 3 t i m e so f m o n o x e n i ef e r m e n t a t i o nr e s p e c t i v e l y 5 b ys t u d i n gt h ec o m p o n e n to fc e l l u l a s es e r i e s ，w ef o u n d ：t h e s e6f e r m e n t e d l i q u o r su s e dd i f f e r e n ta m m o n i u ms u l p h a t ef r a c t i o n a lp r e c i p i t a t i o n , a n de v e ni t h e s a l i l ec h r o m a t o g r a p h yc o n d i t i o n s ，n u m b e r sa n ds i t e so fa b s o r p t i o np e a ko fc m c a s e , f p a a s ea n d8 g a s ei sd i f f e r e n t t h e ya l s oh a v ed i f f e r e n c e si na m o u n to fc e l l u l a s e b e l t sa n dv a l u eo fr fi ne l e c t r o p h o r e s i s a l lo ft h e s ec o m et ot h ec o n c l u s i o nt h a t b e t w e e nd i f f e r e n to r i g i n a ls t r a i n st h e yp r o d u c ed i f f e r e n tc e l l u l a s es e r i e s i nm i x e d f e r m e n t a t i o n , s t r a i n sc a na f f e c te a c ho t h e rg r e a t l y ，a n dp r o d u c em o r et y p e so fe n z y m e p r o t e i n sa n df i n a l l yc r e a ta c e l l u l a s es e r i e sw h i c hi sm o r ec o m p l e t e k e y w o r d s ：c e l l u l a s e ；m o n o x e n i ef e r m e n t a t i o n ；m i x e df e r m e n t a t i o n ；s a s ；e n z y m e s o r i e s 缩略语表 缩略语表 英文名 a s p e r g i u u s c e l l o b i a s e c e l l u l o s e b i n d i n gd o m s i n s c a t a l y t i c d o m a i n s c e l l o b i o s ed e h y d r o g e n a s e c a r b o x y m e t h y lc e l l u l o s e d i n i t r o s a l i c y l i ca c i d e n z y m ec o m m i s s i o n e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d f i l t e rp a p e r g l y c i n e i n t e r n a t i o n a lu n i t k i l o d a l t o n n a n o m e t e r o p t i c a ld e n s i t y p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p o w e ro fh y & o g e n r o t a t e d e t e r m i n a t i o nc o c 伍c i e n t r e l a t i v ef o r v v a r d r o o tm e a n s q u a r ee r r o r s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t r i c h o d e r m a t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e b - g l u c o s i d e 中文名 曲霉 纤维二糖酶 纤维素结合结构域 纤维素催化结构域 纤维二糖脱氢酶 羧甲基纤维素 3 ，5 一二硝基水杨酸 酶学委员会 乙二胺四乙酸 滤纸 甘氨酸 国际单位 千道尔顿 纳米。 光密度 聚丙烯酰胺凝胶电泳 酸碱度 旋转 决定系数 比移植 离回归标准差 十二烷基硫酸钠 木霉属 四甲基乙二胺 三羟甲基氨基 b 一葡萄糖苷 司 ： 气 e e e 辅a伽咖咖一哪k一融叫m妨蚰一出，妒时|呈哪t一陆阳 学位论文独刨性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌盍堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：汪参巍签字日期：必d 辟，瑚矽日 f 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌太堂有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌太堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：逸金年 导师签名：，荣x 、) 0 签字日期：孙呼f 沙月匀日签字日期：钟，司年1 月1 y 曰 f f 第1 章绪论 1 ：1 纤维素的概述 第1 章绪论 1 1 ，1 纤维素分子的结构特征 纤维素分子是由成千上万的d 葡萄糖残基通过b 1 ，4 糖苷键连结而成的链 状聚合体，几十个纤维素分子平行排列组成小束，几十个小束则组成小纤维， 最后由许多小纤维构成一条植物纤维素。纤维素分子的聚合度变化很大，一般 为8 0 0 0 - - 1 0 0 0 0 个葡萄糖残基【”。研究发现，天然的纤维素由排列整齐而规则的 结晶区和相对不规则、松散的无定形区组成。纤维素链之间存在着氢键，通过 氢键的缔合作用形成纤维束，分子密度大的区域成平行排列形成结晶区；分子 密度小的区域，分子间隙小定向差形成无定形区i 羽。关于纤维素分子链的构型 现在大体有两种认同：( 1 ) 缨状纤维束模型。该模型假设大分子都是延伸不弯 曲的，方向和纤维束平行，在纤维柬中会间隔地出现一些分子间排列高度整齐 的区段结晶区，结晶区之间被一些无定形区所分隔，在一般的纤维素分子 中，结晶区和无定形区要交替1 0 次以上；( 2 ) 折叠链纤维束模型。该模型认为 纤维素大分子折叠起来并沿纤维束轴排列折叠起来的分子形成一个薄片，是 纤维束的基本单位( 聚合度约为1 0 0 0 ) ，结晶区和前一个型相似；在纤维素大 分子链中有一部分并没有折叠起来，而是单股松散地依附在相邻两个片状结晶 体上：片状组织分子链折叠部位的葡萄糖苷键与直链上的b 键在结合强度上不 同，折叠处的结合强度弱；纤维素分子的无定形区在片状组织的两端，而结晶 区在片状组织的中心部位州。 在自然界中，纤维素分子一般均包埋或嵌合在半纤维素、木质素里，三者 以复合体形式存在，并且木质素包围着纤维素且和半纤维素有着共价关系，一 起形成较复杂的网状结构 4 1 。 1 1 2 纤维素在资源利用方面的研究意义 纤维素是地球上最丰富的多糖化合物，广泛存在于树杆、秸秆、稻草等植 物中。纤维素占植物干重的3 5 - - 5 0 5 1 ，是地球上分布最广、含量最丰富的碳 第1 章绪论 水化合物。对人类而言，它又是地球上最丰富的可再生资源，其年产量高达1 0 0 0 亿吨，这些能量相当于全球人类每年能源消耗量的2 0 倍，食物所含能量的2 0 0 倍， 是永远不会枯竭的生物资源旧。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节，它 的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等阃题具有十 分重要的意义1 7 j 。但是，目前自然界中只有一小部分纤维素得到了利甩，绝大多 数纤维素都被白白浪费，而且还造成了环境污染。因此，- 如何将纤维素转化为 人类所需的能源、食物和化工原料，对解决人类社会环境污染、食物短缺和能 源危机具有及其重要的意义。 1 2 纤维素酶的概述 纤维素是年产量巨大的可再生资源，如何成功的开发这一资源，对人类的 可持续发展具有非常重要的意义。关于纤维索的水解利用方法研究较多的有酸 水解法、酶水解法两种i s - 1 1 1 。酸水解法，稀酸水解所得糖化率低，高浓度强酸虽 可有效水解纤维素，但其腐蚀性对人体及设备有害，且所需工艺条件苛刻。而 酶水解法，要求就比较简单，在常温、常压条件下就能够进行。纤维素酶是一 类可以将纤维素水解成葡萄糖的一组酶。它能够水解纤维烈1 2 1 ，水解终产物葡 萄糖可用于饲料、食品和燃料乙醇的生产1 1 3 , 1 4 j 。而且纤维素酶在纺织、饲料、食 品、酿造、污水处理、油田开采、细胞破壁及中草药有效成分提取等行业也有 着广泛的应用【1 5 】，它能有效地改善产品质量，具有良好的经济效益。因此，纤 维素酶特别是纤维素酶的生产成为近年来生物和化学工作者研究的热点。 1 2 1 纤维素酶的组成及分子结构 纤维素酶是具有多酶组分的一种复杂酶，主要来自于真菌、细菌和放线菌。 根据纤维素酶各组分酶功能的不同，可将其成分划分为三大类【1 6 1 。( 1 ) 葡聚糖 内切酶( e n d o 1 ，4 - 6 d g l u c a n a s e ) ，编码：e c3 2 1 4 。这类酶是纤维素酶中最 重要的酶，作用水解于纤维素内部非结晶区，随机水解b - i ，4 糖苷键，将长链 纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素，即纤维素末端。 葡聚糖内切酶可为外切酶提供大量的反应末端，同时它也能水解小分子的纤维 素寡糖。( 2 ) 葡聚糖外切酶( e x o 1 ，4 b d g l u c a n a s e ) ，又称为纤维二糖水解酶 ( c e l l o b i o h y d r o l a s e ) ，编码：e c3 2 1 9 1 。这类酶作用于纤维素线状分子幕端， 第1 章绪论 水解1 ，4 b 葡萄糖苷键，依次从纤维素分子中切下纤维二糖分子。( 3 ) b - 葡萄 糖苷酶( b 1 ，4 - g l u c o s i d a s e ) ，编号：e c3 2 1 2 1 。这类酶的作用是将纤维二糖 水解成葡萄糖，它在水解过程中可以大大减少低聚糖对外切酶和内切酶的产物 抑制b 葡萄糖苷酶是一种非专一性酶，它可以水解多种b 糖苷键，也可以水解 纤维三糖，纤维六糖等。 t n b e u g h 等人1 1 1 7 】对纤维素酶进行拆分研究发现，纤维素酶是由约5 6k d 球状 催化活力的核心蛋白催化区域( c d 或c p ) 、连接区( 1 i n k e r ) 和没有催化作用 但具有纤维素吸附能力的纤维素结合区域( c b d ) 三部分组成。后经许多研究 证实，zr e e s e i 酶的外切葡聚糖酶c b h 、内切葡聚糖酶e o l ，e g l l 和粪类碱 纤维单孢菌、热纤维梭菌的多个纤维素酶分子也具有类似的结构，即由一个催 化活性头部( c d ) 和楔形尾部( c b d ) 组成的州蚂状分子，如图1 1 所示。 1 2 2 纤维素酶降解纤维素的机理 天然纤维素酶解过程可分为3 个阶段。首先是纤维素对纤维素酶的可接触 性；其次是纤维素酶的被吸附与扩散过程；最后是由c b h - c m c a s e 和p g a s e 自 组织复合体( c 1 ) 协同作用降解纤维素结晶区，同时由c b h - c m c a s e 和p g a s e 随机作用纤维素无定形区。1 9 5 0 年，r c c s e 等人【坩l 提出了因天然纤维素的特异 性而必须以不同的酶协同作用才能分解的c 1 c x 假说。这个假说认为：当纤维 素酶作用时，c l 酶( 内切葡聚糖酶) 首先作用于纤维素结晶区，使其转变成可 被c x 酶( 外切葡聚耱酶) 作用的非结晶形式，c x 酶随机水解非结晶纤维素， 然后b - 1 ，4 葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖，如图1 2 所示。只有在这三 类酶的协同作用下，最终才能把纤维素分子降解成葡萄糖。微生物特别是真菌 能产生这类酶的复合物，从而把纤维素分子降解为葡萄糖分子为自己所利用。 图】1 纤维素酶的结构模型 f i g u r e l 1t h em o d e lo fc e l l u l a 5 es t r u c l u r e 第1 章绪论 非结晶纤维素 图1 2c 1 - c x 假说的酶解机理【1 9 1 f i 9 1 1t h ec 1 - c xh y p o t h e s i s o rt h ee n z y m o l y s i sm e c h a n i s m 虽然目前对纤维素酶作用结晶纤维素的机理有了比较一致的认识，但耨的 现象不断被发现如方靖【2 0 j 在实验中发现裂褶菌纤维二糖脱氢酶( c d h ) 在降 解棉花纤维素时与纤维二糖水解酶或内切纤维素酶没有表现出协同效应，但若 棉花事先在纤维二糖存在下用c d h 预处理，则变得易于被水解，水解效率提高。 高培基1 2 l 】在研究中也提出了新的观点，认为结晶纤维素难以被降解的主要原因 可能是忽略了纤维素酶的超分子结构，即聚集态结构对降解的影响。h e l e n a a z c v c d o = 1 认为c b d 并不是纤维素酶活性部位的结合位置，若去除纤维素酶的 c b d 纤维素酶仍然表现出催化活性。因此，由于纤维素酶的复杂组分，目前对 纤维素酶的降解机理仍需深入的研究。 1 2 i3 产纤维素酶的微生物 自然界可产纤维素酶的微生物主要有细菌、放线菌、真菌。细菌中产酶活力 较强的菌有纤维黏菌属、生孢纤维菌属和纤维杆菌属。但细菌纤维素酶产量低 ( o 1g l ) ，而且所产纤维素酶一般都存在于胞内或吸附在细胞壁上，不分泌到 培养液中，所以很少用作工业生产菌种。放线菌中产酶活力较强的菌种有链霉 属放线菌、玫瑰色放线菌、纤维放线菌等【矧。真菌纤维素酶产量高( 2 0 以以 上) ，研究较多的是霉菌，其中产酶活力较强的菌有木霉、曲霉、根霉和青霉l 冽， 尤以木霉属( t r i c h o d e r m a s p ) 菌种居多，如里氏木霉、绿色木霉、康氏木霉等 是目前公认的生产菌种。目前研究最清楚的是里氏木霉i 吲，其具有降解纤维素 与半纤维素的完全酶系，产生八种不同的纤维素酶。另外真菌中黑曲霉不产生 毒素【6 1 ，是公认的安全微生物，纤维素酶应用在食品生产中该类菌占首位。表 4 或一 一 维聚 窘 卜 纤低 0 静性性ii甚l舒 | | 耳一 塑 ! | | 一 塑 ； o 第1 章绪论 l 1 是常见的可产纤维素酶的微生物。 表1 1 产纤维索酶的主要微生物 t a b l e l im a am c r o o t g a n l s mp r o d u c i a gc e l l u l a s e 分类菌种 7 ：v d q d e ( 里氏木霉) 卫t o n 抽# z ( 康氏木霉) 。 z p s e 1 0 k o n i n g l l ，zk 圪缸小， zl i g n o r u n ，zi o n g i b r a c h i a m m ， p c | f r 妇( 桔梗青霉) ，p f u n l c u l o s u m ( 绳状青霉) p i r e n s i s ，只j a n a a n e t t u m ( 微紫青霉) ， p n o t a t u mf 特异青霉) ，只v e r r u c u l o s u m ( 疣孢青霉) ， n i g e r ( 黑曲霉) ，a 舢( 黄曲霉) ， a 向舭，a f u m i g a t u s ( 烟色曲霉) ， o r y z a e ( 米曲霉) ，a s a i t o i ， t e r r e u s ( 土曲霉) ，丘a c u l e a l u s ： n o c p o r ac r a s s a ( 租壮脉纹孢) ，h u m i c o l ai n s o l e a n s ， m y r o t h e c i u mv e r r u c a r i a ( 疣孢漆孢霉) ， m a c r o p h o m i n a p h a s e o l i n a ，。f u s a r i u mm o n i l i f o r m e ( 串珠孢每) m y c e l i o p h t o r ac e l l u l o p h i l u m ( 蚀丝霉属) ， $ c h i z o p h y l l u mc o m l n l l j k ，p h o m ah i b e r n i c a ( 茎点苗属) 。 s c l e r o t i n u mr o l f j i i ，h y p o c o p r a m e r d a r i a ( 座内粪壳菌属) 。 f o m e s f o m e n t a r i s h u r a i i c o t ag r i s e a ， p l e u r o t u so s t r e a t u s ，p h y s a r u m p o l y c e h a l u m 细菌( b a c t e r i a ) c a c e t o b u t y l i ( 纤维杆菌属) ，cl o c h h e a d i i ， c l o n g i s p o r u m ，ct h e r m o c e l l u l m ， c t h e r m o m o n o s p o r a c t h e r m o c e l l u l a 日e u m c s t e r c o r a i u m p s e u d o m o n a s f l u o r e s c er r u m i n o c o c c u ba l b u s ，冠f l a v e f a c i e n s ， c e l l v i b r i o f u l v u s ，cg i l v u s ， 呈：型墨竺生 5 第1 章绪论 t h e r m o m o n o s g o r a f u s c a ( 热单孢菌属) ， 。t u ! n n o m o n o s g o r ac u r v a t a ( 热单孢菌属) ， m i c r o b i s p o r ab i 霉o r a ， 放线菌卅舐哪目)s t r e p t o m y c e sv i r i d o s p o r u s ( 链霉菌属) ， a c t i n o m y c e s m e l a n o c y c l e s ( 黑红旋丝放线菌) 。 a c t i n o m y c e s r o s e u s ( 玫瑰色放线菌) 。 a c t i n o m y c e sc e l l u l b s a e ( 纤维放线苗) s c h i z o p h y l l u mc o m m u n e , s c l e r o t i m o nr o l f s i l , 其他 p y r i c u l a r i ao r y z 鹕p h y s a r u mp o l y c e p h a l u m 1 2 4 生产纤维素酶的方法二 1 2 4 1 固、液发酵生产纤维素酶 纤维素酶的生产方法有固态发酵和液体发酵两种。固态发酵生产成本低， 酶产品收率高，后续提取过程简单；但其劳动强度大，发酵水平不稳定，生产 率低，易污染。液体发酵不易污染，培养条件易控制生产效率高，劳动强度 小，产品性质稳定；但其动力消耗大，设备要求高，生产成本高研究发现， 对于木霉而言固体发酵更接近于其自然状态下的生长习性，产生的酶系更全， 可选用任何的天然纤维素废弃物作为生产原料，而且产量一般比液体发酵高出 2 3 倍【卸。美、日、丹麦等发达国家过去在液体发酵方面做得较多，后来随着固 体发酵技术的日趋完善，以及市场竞争对低成本高产出的迫切需求，固体发酵 越来越受关注。段金柱【硼对绿色木霉产纤维素酶固体发酵和液体发酵进行了比 较研究，结果显示：固体发酵产率比液体发酵产率高2 5 ，其中葡聚糖外切酶提 高2 8 、葡聚糖内切酶提高4 2 ，8 - 葡萄糖苷酶提高4 9 ：酶组分比例也高于液 体发酵，s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱明显多出4 、5 条轻带酶解未经预处理 的稻草糖化率高于液体发酵 1 2 4 2 混合菌发酵生产纤维素酶 纤维素有效降解需要多种纤维素酶的协同作用。纤维素酶是具有不同底物 特异性的多酶系复合物酶，不同菌种产生的纤维素酶系不同，进行混菌发酵时 就可以弥补菌种之间的差异，产生多种不同功能的酶作用于纤维素的不同位点， 6 第1 章绪论 充分发挥各酶之间的协同作用，进两大幅度提高纤维素酶的活性及产量。比如 里氏木霉所产的纤维素酶系中b 葡萄糖苷酶活性非常低，k u m a t 2 9 用黑曲霉和里 氏木霉1 ：3 混合发酵，结果发现内切和外切葡萄糖苷酶活性提高3 1 一3 5 ，b g 酶活性提高4 0 涂璇【3 0 l 用黑曲霉和烟曲霉二元混菌体系混合进行发酵，结果表 明：两种霉菌按一定比例接种进行混合发酵时纤维素酶组分的活性较单菌株发 酵大幅度提高，f p a 葺孽、微结晶纤维素酶和c m c 酶活性分别较单菌株发酵提高 2 2 - - 5 1 1 、2 0 7 一3 3 2 6 、2 9 4 一2 9 9 6 。孙英华i n j 研究了木霉和风尾 菇菌交替发酵的酶活力，发现它们交替发酵的酶活力明显比单一菌种培养时高， 两者的差异高的竞达1 5 倍以上。 1 2 4 3 固定化细胞生产纤维素酶 细胞固定化能克服游离细胞在生产中对环境敏感、性质不稳定及产物难以 分离提纯的缺点。固定化细胞的工业化应用与游离细胞相比，可降低产物生产 成本，提高产物制备效率，利于实现连续化生产1 9 8 5 年日本政府推行的 “b i o f o c u s w t 大型研究计划曾引起世界关注，其中固定化细胞的研究就是其重 要内容之一。目前，国内外已有不少这方面的重要专著及综述发表l 叼。1 9 8 6 年， 田开荣报道用海藻钙凝胶将孢子和纤维素粉一起包埋，制成颗粒状固定化细胞。 进行分批补料培养试验，结果发现可重复使用i o 次以上，所得纤维素酶的平均 产率是游离酶的2 5 倍。王亚林1 3 3 1 用海藻钙凝胶包埋法制备木霉固定化细胞，结 果表明固定化不仅没降低其产纤维素酶的能力，而且使细胞产纤维素酶的能力 有所提高。夏黎明p 4 l 采用多孔聚酯材料固定里氏木霉r u t c 。3 0 菌丝细胞，将固 定化细胞在生长限制条件下重复分批培养让纤维素酶的合成和玉米秸秆纤维 原料的酶解糖化耦合在一个反应器中同时进行，连续重复进1 2 次分批培养实验， 结果c m c 酶活力平均为0 7 0i u 还原籍2 6 4 1g 以，塘化率达到理论值的 8 9 1 1 。 1 2 4 4 构建基因工程菌生产纤维素酶 采用现代分子生物学技术对产酶菌进行遗传改造，将纤维素酶基因同高效 表达基因的启动子或染色体起始位点融合，基因克隆构建高效纤维素酶分泌菌， 也将是提高纤维素酶的生产效率有效途径之一。g o d b o l e 站l 将里氏木霉c b h 基因 在巴斯德毕赤酵母中成功转化并表达。乔字l 蚓将里氏木霉内切1 ，4 b - d 葡聚糖 7 第1 章绪论 酶珏基 g e g t 2 t 函入巴斯德毕赤酵母表达载体，转化毕赤酵母菌株，获得高效分泌 表达内切葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌株g p 2 0 2 5 ，用甲醇诱导培养进行摇瓶发酵 实验，酶活力高达1 5 7 3 0u m l 另外，t a k a s h i m a t 3 7 1 将里氏木霉纤维素酶基因在 a o r y z a e 也成功得到表达，在ao r y z a e 淀粉酶基因强启动子调控下，用麦芽糖 作为主要碳源进行诱导，转化得到的重组菌葡聚糖内切酶i 的c i v i c 酶活性达5 9 8 u m g ，高于当时曾报道过的酶活。n o m a c h i | 3 s l 将绿色木霉的耐l 基因和c 黼基 因转化到l k a w a c h i i 中，所得重组菌c e k a 基因表达的葡聚糖内切酶活性是野 生菌的2 1 1 8 倍，并用其生产日本大麦烧酹。 1 2 5 发酵生产纤维素酶条件的优化 任何菌种发酵都有自己最佳的发酵条件，纤维素酶生产菌也不例外p h 值、 温度、通氧量、接种量