（植物学专业论文）丛粒藻的摇床培养和固定化尝试.pdf

摘要 摘要 丛粒藻( 又译葡萄藻) 是一种富含烃类的群体体型微藻，在世界各地均有分布。 在一些石油沉积中几乎全部的有机质都是该藻形成的，美其名日“油藻 。在澳大 利亚和苏联都有开发利用天然丛粒藻的例子，己取得一定的效果丛粒藻作为一种能 源微藻的开发利用，前景十分广阔。 目前国外学者对丛粒藻的研究多集中于生理生化方面，在开发利用方面的研究 还很少，主要困难是丛粒藻生长缓慢，倍增时间长，因此研究丛粒藻生长的培养条件 对加快丛粒藻的生长速率，提高培养生物量和产烃量，十分关键。 本文对化学种b 的丛粒藻7 6 6 的实验室培养进行了摸索，运用单因子试验方法研 究培养条件对丛粒藻摇床培养生长速率，生物量和产烃量的影响。最终确定在5 0 0 m l 三角瓶装摇床培养中，以培养基c h u l 3 2 ，2 0u m l 的抗生素浓度( 青霉素) 2 0 0 m g l 的n a h c 0 3 作为补碳碳源，2 0 0 m g l 的k n o 。作为氮源，2 0 0 4 0 0 m g l 的k ：h p o 。作为磷 源，1 5 0 m l - 2 0 0 m l 的装瓶量，2 0 - 3 0 接种量，n a f 浓度为0 1 m g l 是比较合适丛粒藻 7 6 6 的实验室摇床培养条件。 在液体培养的基础上利用海藻酸钠固定化技术对分属化学种a 和化学种b 的丛 粒藻3 5 7 和7 6 6 进行固定化培养。相对丛粒藻的液体培养，固定化培养延长了两株丛 粒藻的指数生长期，在一定程度上提高了产烃量，生物量略低于液体培养，但产烃量 有一定程度的提高。 关键词：丛粒藻；摇床培养；烃；海藻酸钠；固定化 a b s t r a c t a b s t r a c t b o t r y o c o c c u sb r a u n i ii sac o l o n ym i c r o a l g a et h a tr i c hi nh y d r o c a r b o n ，t h a tw i d e l y d i s t r i b u t i o na l lo v e rt h ew o r l d t h ed e p o s i t i o no fs o m eo i lp e t r o l e u ma l lm o s tf o r m e db y i t ，s oi ti sn a m eo f “o i la l g a e ”i th a ss u c c e s s f u le x a m p l e si ne x p l o i t a t i o na n du t i l i t a t i o no f b o t r y o c o c c u s b r a u n i ii na u s t r a l i aa n ds o v i e t t h e p r o s p e c t i sc h e e r f u lt ou s e b o t r y o c o c c u sb r a u n i ia sae n e r g ya l g e a i np r e s e n t ，t h es t u d yi nb o t r y o c o c c u sb r a u n i ii nf o r e i g nm o s tc o n c e n t r a t i o ni n p h y s i o l o g y , f e wo fc o n c e r n i n ge x p l o i t a t i o na n du t i l i t a t i o n t h ed i f f i c u l t i e si st h e s l o w - g r o w i n ga n dt h el o n gd o u b l et i m eo fc e l l s s ot h es t u d yi nt h ec o n d i t i o n so fc u l t u r e f o rb o t r y o c o c c u sb r a u n i ii sm e a n s i m p o r t a n c e ，t oa d v a n c eg r o w t hr a t ea n dh i g h e r b i o m a s sa n do u t p u t t h ep a p e rm a k ei n i t i a t i v e s t u d yf o rt h eb o t r y o c o c c u sb r a u n i ic u l t u r ei nt h e l a b o r a t o r y , s t u d yi nt h ec u l t u r eo fb o t r y o c o c c u sb r a u n i ii nt h eb e d ，a n dt h ei n f l u e n c e f a c t o r si ng r o w t hr a t e ，b i o m a s sa n do u t p u t f i n a l l yd e f i n i t e dt h ef i t t e dc u l t u r eo f b o t r y o c o c c u sb r a u n i i7 6 6i nt h eb e d ，w h i c hi sc h u l 3 x 2m e d i u m ，2 0 l x m lp e n i c i l l i nf o r a n t i b i o t i c s ，2 0 0 m g ln a h c 0 3 ，2 0 0 m g lk n 0 3 ，2 0 0 - 4 0 0 m g lk 2 h p 0 4 ，15 0 m l 一2 0 0 m l v o l u m e ，2 0 3 0 i n o c u l a t i o nn u m b e r , 0 1 m g ln 姐 u s et h ei m m o b i l i z e d t e c h n i q u e w i t h a l g i n a t e p o l y l y s i n e - a l g i n a t e ( a p a ) f o r b o t r y o c o c c u sb r a u n i i3 5 7a n d7 6 6c u l t u r e c o n t r a s tt h el i q u i dc u l t r u l ，i m m o b i l i z e d t e c h n i q u ei m p r o v et h edo u tp u to fh y d r o c a r b o n k e y w o r d s ：b o t r y o c o c c u s b r a u n i i ；f l a s kc u l t m l ；h y d r o c a r b o n a l g i n a t e - p o l y l y s i n e - a l g i n a t e ( a p a ) ； i m m o b i l i z e d t e c h n i q u e i 参考文献 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 本人( 姓名)逝仨苤学号 2 q q 互垒垦璺植物堂专业 所呈交的学位论文( 论文题目：丛粒藻的摇床培养和固定化尝试) 是本人 在导师指导下，独立进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除论 文中已特别标明引用和致谢的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的研究成果。对本论文的研究工作做出贡献的个人 或集体，均已在论文中作了明确说明并表示谢意，由此产生的一切法律 结果均由本人承担。 本人完全了解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：福 建师范大学有权保留学位论文( 含纸质版和电子版) ，并允许论文被查阅 和借阅：本人授权福建师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容采 用影印，缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文，并按国家有关 规定，向有关部门或机构( 如国家图书馆中国科学技术信息研究所等) 送交学位论文( 含纸质版和电子版) 。 ( 保密的学位论文在解密后亦遵守本声明) 学位论文作者签名：汴i 2 欹 指导教师签 签字日期： 7 年加，口日 签字日期： 绪论 1 1 前言 绪论 全球面临的能源短缺和环境污染问题日益严重，世界能源危机的频频爆发严重 制约着世界经济的发展，促使开发和利用可再生无污染的生物能源成为当前一个紧 迫的课题。而利用微藻生产生物能源具有以下独特的优势n 2 1 ：微藻能有效地利用太 阳能，通过光合作用高效的固定c 0 2 ，将无机物转化为油脂、高不饱和烷烃、氢等能源物 质：能量要求低，投资小，不占耕地，易于进行大规模培养：微藻生物能源为可再生能 源，燃烧后并不排放有毒害的废物。因此利用微藻进行生产生物能源具有很高的潜在 应用价值口1 。 呈串状集落生的丛粒藻( b o t r y o c o c c u sb r a u n e i , 又译葡萄藻) 是一种广世界性 分布的群体体型淡水绿藻h 一1 。在培养物中，其烃产量为生物量干重的0 3 7 6 m ，通 常为2 5 - - - - 4 0 口1 ：另据报道在天然样品中，最高可达8 6 随1 ，大大高于其它微生物的产 烃量( 几乎都低于1 ) 3 在国外，从晚远古代( 约1 0 亿年前) 到近代的层积岩中，在我 国的渤海湾沿岸、北部湾沿岸和茂名油页岩等石油沉积层中，均发现了古代丛粒藻的 化石，国内学者也从云南抚仙湖等多地分离到了该藻m 钔，且多为产烃量高的化学种b 。另有报道在一些陆相石油沉积中几乎全部有机质都是该藻形成的n 钉，故又美其名日 “油藻 1 酊。 鉴于该藻可能是陆相生油的重要油源，有可能提供可再生的绿色能源，自1 8 9 2 年 至今n ，特别是2 0 世纪7 0 年代以来世界石油危机频频爆发，日益引起世界各国重视。 在澳、法、美国日本、比利时等发达国家相继开展了利用该藻生产可再生能源的研究， 并取得了一定的成就，在前苏联和日本等国都有开发利用丛粒藻的报道n 6 1 。 目前关于丛粒藻的研究多集中在其生理生化方面，尚未有大规模培养的报道，主 要困难在于丛粒藻生长缓慢，生长周期长 1 8 , 1 9 因此研究丛粒藻的生长条件对提高丛 粒藻生长速率、缩短生长周期、实现工业高密度培养十分关键1 。 福建师范大学谢仁荣硕士学位论文 1 2 丛粒藻的研究概况 1 2 1 丛粒藻的形态和分类 在光学显微镜下，ab r a u n i i 的集落( c o l o r f i e s ) 呈大小不一的细胞串，互相间 以透明的折射细丝相连，大的集落可达1 姗。藻细胞为梨形，大小一般为1 3um 7um ， 包埋在胞外的基质中，细胞质内有油质。老龄细胞的叶绿体中含有淀粉粒，是 c 1 a l o r o p h y c e a e 的典型特征之一。在透射电子显微镜下可见，围绕着细胞的厚基质 是由连续的藻细胞分裂产生的外壁( o u t e rw a l l ) 所构成的，并借以将藻的集落互相 粘合起来形成群体体型。从世界各地得到的不同丛粒藻株，在细胞形态上没有明显区 别，但产生的烃类( 油质) 却明显不同，据此将丛粒藻分为三个化学种：a 、b 和l 。化学 种a 产生直链的奇数c ：。c 3 ：，的n 二烯烃和三烯烃，偶尔有较短的n 一链烯烃。化学种 b 产生丛粒藻烯，国内首次发现的抚仙湖株亦属于此啪1 。化学种b 含油高，比重小，易 漂浮于水面：产烃量较高，多为其藻干重的2 5 - 4 0 乜1 物，可用过滤法直接收集：且有 报道可耐n a c l1 8 9 l ，有秘于防止杂菌杂藻污染嘲。国内发现的丛粒藻多为化学种 b 。化学种l 比较罕见，产c , n 的l y c o p a d i e n e n 创。 关于不同丛粒藻藻株产生不同性质烃类的原因，b r o w n 认为脚，可能是由其生理 状态不同产生的：化学种a 类烃可能是绿色的正常细胞的典型产物，化学种b 类烃( 丛 粒藻烯) 可能出现于休眠的褐色细胞中。但是有报道取自自然界的绿色样品中只含有 b 类烃1 ，而在实验室培养物中也未发现这两类烃有互变现象泓矗毋，在生长的稳定期也 未发现出现b 类烃的痕迹这表明，不同藻株间产生的烃类差异应与其生理状态无关， 而可能是不同藻株本身的生理特性，或是产生了变种n 叼。 该藻不同化学种的不同藻株的产烃水平差距很大，化学种a 烃含量较低，化学种b 产烃高，有报道在取自自然界的丛粒藻烃含量最高达8 6 ，化学种l 不同株间烃的产量 波动范围在其干重的2 1 0 瞳6 一。因此藻株的选择十分重要的n 钉。 1 2 2 液体培养条件 丑b r a u n i i 的培养的营养需求和培养参数的适宜范围是由c h u 的开创性研究确定 的，经过改良的c h u l o 和c h u l 3 培养基一直沿用至今 2 9 o 用此培养基在气升式光生物反 应器中培养丛粒藻，硝酸盐为限制因子：提高硝酸盐的起始浓度，会导致藻的指数生 长期延长，直到其它营养因子也成为限制因子。在批式培养中，在培养后期补加硝酸 绪论 盐可提高其生物量和产烃量，分别增加约7 5 和6 0 。磷酸盐浓度较高，不会引起生物 量明显变化，但烃产量却受p ，n 比的影响，磷酸盐含量增加一倍，产烃量增加约1 0 。 在p 匮乏的培养基中培养丛粒藻，该藻也可缓慢生长。在培养液中加入6 的n a c l ，其脂 类含量由对照的3 5 提高到5 0 m 1 。而化学种bb e r k e l e y 株有较好的耐盐性，在含 1 8 的n a c l 或添力n l 3 海水的培养基中可以正常生长，但倍增速度降低n 叼：在培养基 中加入n a f0 i m g l ，化学种aa u s t i n 株的生物量由对照的0 7 9 l 提高到o 8 9 9 l ，将 n a f 浓度提高到o 2 5 m g l 以上，该藻即受到明显抑制作用 3 2 o 而另有报道，该藻株n a f 的适宜浓度约为0 1 1 0m g l 之间n 6 一铂。 有实验指出光照强度最适化，可提高化学种a 的生物量，其产烃量也随之提高了1 倍多嘲1 。有报道化学种bb e r k e l e y 株可适应的生长温度较高，在3 5 c 下其生物量仍可 达到每天15 2 9 h 3 5 , 3 e l ，稍高于2 5 c 时的1 3 3 9 d ，但其产烃量仍以2 5 c 培养时最高 。丛粒藻的培养适宜温度多1 8 - - 一2 5 c 。在关于生长条件和生理状态的变化对该藻烃类 性质和相对丰度的影响方面，有实验结果表明，化学种a 的变化不明显，化学种b 产生 丛粒藻烯的组分却对生长条件很敏感3 刀。丛粒藻的三个不同化学种在批式培养的 指数生长期，烃的生产比细胞其它组分快，在稳定生长期，产烃水平降低。丛粒藻不同 化学种的最高产烃量均发生在指数生长期后期乜2 瑚瑚圳。化学种b 在缺n 和p 时无烃积 累n 旬。 1 2 3 固定化细胞培养 将b o t r y o c o c c u s b r a u n i i 化学种a 直接包埋在海藻胶聚氨基甲酸乙醇泡沫胶中， 或吸附在现成的泡沫上批式“培养”油1 。包埋在海藻胶中藻细胞受空间障碍影响，其 生长倍增时间由游离细胞的1 7 d 延长到2 5 d ，但烃产量约增加了2 0 ：并且藻细胞的 光合系统受到保护：而游离细胞在气升式培养条件下容易发生退化，叶绿素含量明显 降低，细胞逐渐解体，在稳定生长期若不及时移接，这种变化将不可逆转h 。 用聚氨基甲酸乙酯作包埋剂有一定毒性，少数聚合物毒性虽然较小，但细胞的代 谢活性和产烃量均降低，不适合于丛粒藻的固定。有人将该藻直接吸附在现成的小块 泡沫上，其生物量和产烃量均与游离细胞的产量相当。而有研究将纱布作固相载体用 于吸附藻细胞，置于批式光照摇床上或进行气升式培养，其0 。释放量生物量和产烃 量依次为1 8 41 jm o l m i n 几，1 4 4g l 和o 8g l ，都与游离细胞的相当，证明纱 布是一种良好的载体m j 舶。这些研究指出固定化培养丛粒藻可能是提高丛粒藻生物 福建师范大学谢仁荣硕士学位论文 量和产烃量的一个途径n 盯。 1 2 4 协同培养、处理污水 在自然生活环境中，将丛粒藻与其它生物共处于开放式系统中进行大规模培养 时，由于该藻生长缓慢，生长周期长，难以保持纯种培养。因此，研究且b r a u n i i - 细菌 共生体系的具有重要的研究意义。 据报道，泽山茂树等用日本茨城县二次处理后的生活污水( s t s ) 培养化学种b b e r k e l y 株，实验结果表明该体系能够减少向大气排放的c 0 2 ，又可利用污水中的n 和p 。在光生物反应器中用生活污水培养该藻时，bb e r k e l y 可持续生长，烃含量为 4 0 - 5 0 ，与在c h u l 3 中培养时相当，这些实验结果表明，将该藻产烃与生活污水的处 理相结合是个可行的途径，应该引起人们的重视n 吼4 3 4 钔。 1 2 5 烃的回收 晟b r a u n i i 的大部分烃类( 约9 5 ) 储藏于细胞周围厚厚的外壁中。这些胞外烃大 部分可用轻微地机械处理进行回收，细胞可再度用于培养口钔，但其产物呈乳状液，且 并不适用于固定化细胞培养物。 ? f r e n z 等从1 5 0 0 种溶剂中选择1 8 种进行试验烃的萃取，观察到在溶剂极性和细 胞的配伍性之间存在着强烈的负相关，只有九种可与丛粒藻配伍。当用n 一己烷萃取过 滤得到的湿细胞，烃的回收率可达7 0 。用萃取过的藻细胞进行再培养，并未发现有不 利的影响，其生物量和烃产量与未经萃取的细胞相当：固定化藻细胞的生物活性亦未 受损：当萃取时间短时，烃的回收率也比用过滤法的高n 们。 1 2 6 应用前景 澳大利亚达尔文河上4 0 0 0 h a 平均水深为6 m 的水库水面上发育了壮观的 丑b r a u n i i 水华，w a k e 和h i l l e n t 吼伯1 根据该藻生物量1 5 m g l 进行过计算，该藻重量达 1 5 0 0 t ，以含油3 0 计算，每年可产油3 5 t h a 。若用1 0 0 万公顷水面养殖该藻，每年可能 提供3 5 0 0 万t 烃类，并从成本核算上论证了它的适用性。法国l a r g e a u 等h 力据室内小规 模试验结果进行计算，每公顷水体可产烃达6 0 t ，岩本浩明嘲认为，如在室外能够排除 污染，得到这种结果是可以应用于生产的。他们在室外培养化学种bb e r k e l e y 株的结 绪论 果为：生物量平均每天l o g ，产烃量占干重的5 0 ，每年可得烃1 8 t h a 。据估算，世界石 油的原始储量为6 万亿7 万亿桶( 不包括油页岩和油砂) ，现在还有已证实的储量1 万 亿桶和未证实的5 0 0 0 亿桶。在2 0 1 0 年以前，采出成本低于2 0 美元桶的廉价油将有一 半被消耗能源危机的压力会越来越紧迫，研究将该藻产油工业化的途径，无疑是一 项十分诱人、具有良好前景的课题n 叫。 1 3 微藻固定化技术 固定化细胞技术起步于2 0 世纪6 0 年代，是在固定化酶技术的基础上发展起来的， 而微藻固定化技术是于2 0 世纪8 0 年代末才开始进行探索性的工作。自从固定化技 术问世以来，这项技术就在以空前的速度不断向前发展，并不断予以完善和扩大适用 的范围。早在1 9 世纪初叶的时候，人们就发现某些微生物细胞具有天然吸附在固体物 质表面的倾向，并以这种方式被束缚、固定起来。如今固定化领域已发展涉及多个领 域：酶固定化，原生质体固定化，细胞( 微生物，动物，植物) 固定化等。固定化细胞技 术早期的研究主要集中在固定化方法的研究上，近年来，人们开始将注意力投向反应 器的选择和应用、固定化细胞的特性等方面。尽管微藻固定化细胞技术出现较晚，但 其应用的范围更为广泛。微藻固定化细胞技术作为细胞工程的一个重要组成部分，近 几十年来其发展十分迅速：固定化微藻在污水处理、环境保护生物传感器、种质保存 有用物质及能源的生产及模拟生物反应等多个领域有着广泛的运用呻1 。 固定化细胞技术其核心技术是用海藻胶等材料作为固定化载体，将生活的微生 物细胞包埋于胶球中构建生物反应器。固定化培养的微藻，有两个优点：l 、能保证胶 球内细胞的高密度和高活性：2 、固定化藻细胞可在低温、黑暗条件下长期保存，有利 于长期培养和保种呻1 。 微藻细胞固定化其实质是一种限制藻细胞活动空间，让藻细胞在固定载体上生 长的一种技术。一般认为，一种理想的固定化方法必需具备以下几个特点：在单位体 积的载体内应该能够生长尽可能多的藻细胞：透光性和透气性良好，强度高寿命长。 应用的载体材料必须要便宜以降低成本：固定化载体对藻细胞应是惰性的，即不会对 细胞有毒性损伤细胞：固定化过程必须温和以尽可能减少对藻细胞的损伤：性质稳定， 不易被生物分解，强度要适度能耐受由于藻细胞生长分裂而引起载体破裂：固定化载 体应使藻细胞底物、产物和其它代谢产物能够自由扩散，利于生长和收集h 叼。 藻类固定方法主要运用吸附法偶联法包埋法，其中包埋法是目前藻类固定化 福建师范大学谢仁荣硕士学位论文 领域中应用最广泛的方法。包埋法固定化载体可分为两大类：一是天然高分子凝胶载 体，如琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶等；二是人工有机合成高分子凝胶载体，如聚乙烯醇 ( p v a ) 、聚丙烯酰胺( a c a m ) 、聚胺基甲酸乙酯和多孔硅胶等。包埋法方法目前应用较多 的主要有聚乙烯醇( p v a ) 包埋法、聚丙烯酰胺包埋法、卡拉胶包埋法明胶包埋法、海 藻酸钠( s a ) 包埋法等。海藻酸钠是近年研究和应用较多的一种载体，包埋方法为将藻 液与一定浓度的海藻酸钠溶液以一定的体积比充分混合，用注射器滴入一定浓度的 氯化钙溶液形成藻珠，固定化3 0 分钟后，用无菌蒸馏水清洗胶球数次，转入三角瓶中 培养删。 微藻固定化细胞技术早期的工作主要集中在淡水藻类如纤细裸藻、紫球藻等， 1 9 9 2 年，仵小南等对等边金藻、微小角刺藻、隐杆藻和盐藻等海洋微藻进行了固定化 培养，并考察了这些微藻固定化培养生长情况。而后中国水产科学院黄海研究所的马 志珍和张继红咖啪3 对多种海洋微藻进行了大量的固定化培养和保种实验。本实验室 孙杰张国海等人在多株淡水、海洋微藻固定化、种质保存和藻菌共固定及固定化对 微藻的生理生化影响等方面做了大量的研究，这些研究为我的固定化工作提供了大 量的帮助。 1 4 研究的目的意义和内容 目前国外学者对丛粒藻的研究多集中于生理生化方面，在开发利用方面的研究 还很少，还没有大规模培养的报道。主要的难题是丛粒藻生长缓慢，生长周期长，因此 对丛粒藻生长的培养条件进行研究对加快丛粒藻的生长速率提高培养生物量和产 烃量，十分关键。 目前微藻固定化方法大多因藻而异，也就是说，某种固定化方法只适应一定种类 的微藻，探索适合丛粒藻的固定化方法，就成为丛粒藻固定化研究不可回避的问题。 本研究的丛粒藻3 5 7 和7 6 6 分属丛粒藻化学种a 和化学种b 。丛粒藻3 5 7 目前国外研究较 多，而丛粒藻化学种b 具有生长快，产烃量高的特点，且国内发现的丛粒藻多为化学种 b 。 本文选择了属于国内常见的高产烃化学种b 的藻株丛粒藻7 6 6 为实验对象，运用 单因子试验方法研究培养条件对丛粒藻摇床培养生长速率，生物量和产烃量的影响。 在此基础上进行了丛粒藻海藻酸钠固定化培养的关键影响因子的初步研究工作， 以两株分属化学种a 和化学种b 的丛粒藻3 5 7 和7 6 6 为实验对象，探索丛粒藻的固定 绪论 化条件。 第一章丛粒藻的摇床培养 1 1 材料 1 1 1 藻种 第一章丛粒藻的摇床培养 b ot r y o c o c c u sb r a u n i i7 6 6 , 藻种由中科院武汉水生所提供 1 1 2 培养基 改良的c h u l om e d i u mc h u l 3m e d i u m c h u l om e d i u m 在无菌操作条件下将按下面表格已分开灭菌的各个组分添加混合到1 0 0 0 m l 无 菌蒸馏水中 s t o c ks o l u t i o n c a c l 2 2 h 2 0 m g s 0 4 7 h 2 0 n a h c 0 3 k 2 h p o , n a n 0 3 n a 2 s i 0 3 9 h ：0 f e r r i cc i t r a t es o l u t i o n m i c r o n u t r i e n ts o l u t i o n 9 g 1 0 0m lh 2 0 3 6 7 3 6 9 1 2 6 o 8 7 8 5 0 2 8 4 j吐 1 1 l 1 l l l 1 福建师范大学谢仁荣硕士学位论文 c h u l3m e d i u m s t o c ks o l u t i o n c a c l 2 m g s 0 4 7 h ：0 n a h c 0 3 k 2 h p 0 4 3 h ：o k n o 。 n a e d r a f e r r i cc i t r a t e m i c r o n u t r i e n ts o l u t i o n m i c r o n u t r i e n ts o l u t i o n ( 微量元素母液配置) ： 在1 0 0 0 m l 的无菌蒸馏水中加入： n a 2 e d t a h 3 8 0 3 c u s 仪5 h 2 0 z n s o ；7 h 2 0 c o c l2 6 h 2 0 m n c l 2 4 h 2 0 n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 5 0 0m g 6 1 8 0m g 1 9 6m g 4 4 0m g 2 0 0m g 1 2 6m g 1 2 6m g g 1 0 0m lh 2 0 4 0 8 1 0 0 0 1 2 6 5 2 0 2 0 0 0 0 8 7 5 0 9 3 3 改良的配方用n a - e d t a 与f e r r i cc i t r a t e 替换原来配方中的f e r r i cc i t r a t e s o l u t i o n ，p h 值约为7 1 - 7 2 ，无需再调p h 值。 1 0 - 吡 l 1 1 l 1 1 l l 第一章丛粒藻的摇床培养 1 1 3 试剂 氧化钼( m o o 。) 硫酸铜( g u s o 。5 h ：o ) 硝酸钠( n a n o 。) 钼酸钠( n a m o o 。2 h ：0 ) 无水氯化钙( c a c i ：) 亚硝酸钠( n a n o ：) 氢氧化钾( k o h ) 浓硫酸( h 。s o 。) 磷酸二氢钾( k h ：p o 。) 磷酸二氢钾( k h ：p o 。) 葡萄糖( c 。h 。：0 。) 无水丙酮( c 。h 。0 ) 无水酒精( c ：h 。0 ) 磷酸氢二钠( n a 。h p o 。) 五水合硫酸铜( g u s o 。5 h ：0 ) 氯化钠( n a c l ) 硝酸钾( k n o 。) 1 1 4 仪器 电子天平 台式p h 计 光学折射式盐度计 台式离心机 b s1 2 4 s o r i o n8 6 8 s t 2 0 t d l 一5 硝酸钴( c o ( n o 。) 。) 硝酸钠( n a n o 。) 柠檬酸铁( f e c 。h 。0 ，5 h 。0 ) 乙二胺四乙酸钠( n a ：e d t a ) 苯酚( c 。h 。0 ) 氯化锰( m n c i ：4 h 。0 ) 硼酸( h 。b o 。) 盐酸( h c i ) 七水合硫酸铁( f e s o 。7 h ：0 ) 硫酸镁( m g s o 。7 h 。0 ) 多聚甲醛( ( c h 。0 ) 。) 醋酸铀染液 ( u o 。( o c o c h 。) ：2 h ：0 ) 柠檬酸铅 ( ( c 。h 。0 ，) 。p b 。3 h 。0 ) 亚铁氰化钾 ( k 。f e ( c n ) 。3 h ：o ) 七水合硫酸锌( z n s o 。7 h ：o ) 土壤提取液 北京赛多利斯( s a r t o r i u s ) 美国奥立龙 北京雷泰光电 上海安亭科学仪器厂 福建师范大学谢仁荣硕士学位论文 调节式万用电炉 电热恒温干燥箱 冷藏冷冻箱 光照培养箱 数位式照度计 立式蒸汽灭菌器 紫外分光光度计 光学显微镜 光学显微镜 光学折射式盐度计 漩涡振荡器 调节式万用电炉 往复式摇床 1 2 方法 1 0 0 0 - 2 0 0 0 w通州市光学仪器有限公司 2 0 2 a 一3上海康路仪器设备有限公司 b c d 一1 8 9 h l g 电子有限公司 g x z 一2 6 0 b 宁波东南仪器有限公司 t e s - 1 3 3 2 a 台湾泰仕 上海博迅实业有限公司医疗设备 y x q - l s - 3 0 si i 广 l a m b d a 9 5 0 美国p e 公司 l a i e ad m e 德国 o l y p u sc h s 日本 s t 2 0 北京雷泰光电 y x q s g 4 6 2 8 0 s (上海博迅实业有限公司医疗设备 a )厂 2 联1 0 0 0 - 2 0 0 0 w通州市光学仪器有限公司 自己设计 1 2 1 培养基和培养条件 培养条件： 基础培养基为改良的c h u l 3 2 培养基，添加抗生素：青霉素2 0 单位m 1 ，2 0 0 m g ln a h c 0 3 ，2 0 0m g l k n 0 3 ，2 0 0m g lk z h p 0 4 ，n a fl m g lp h 值调节至7 2 温度2 5 摄氏度，光照3 0 0 0 3 5 0 0 1 u x ，用5 0 0 m l _ 三= 角瓶装置于往复式摇床上培养。 单因子实验： 接种量梯度( 1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ) ，装瓶量梯度为1 0 0 o m l ，1 5 0 o m l ，2 0 0 o m l ， 3 0 0 o m l 梯度为l o ，2 0 ，3o 4 0u 儿，碳源( 2 0 0m g l n a h c 0 3 、0 5 9 l 乙酸钠，5 9 l 蔗糖 、5 9 l 葡萄糖) ，氮源( 5 0 m g l ，1 0 0m g l ，2 0 0m g l ，4 0 0m g l 的k n o 。浓度) ，磷源 ( 5 0 ，1 0 0 ，2 0 0 ，4 0 0 m g l k ：h p 0 4 ) ，n a f 浓度梯度为( 0 1 ，0 2 5 ，0 5 ，0 7 5 ，1 0 ，2 5 m g l ) 。 第一章丛粒藻的摇床培养 预培养藻种以1 ：1 的比例接种，用5 0 0 m l - - - 角瓶培养于g x z 一2 6 0 b 智能型光照培 养箱，光强3 0 0 0l u x ，光周期为1 2 ：1 2h ，温度为2 5 1 ，培养6 天。 i 2 2 藻种的分离纯化方法 由于原始藻种保存时间长，为保证得到纯种，需进行单细胞藻的克隆，需要说明 的是丛粒藻平时以胞外多糖形成的胶体互相连接，所有此法无法获得真正意义上的 单细胞克隆藻株。微藻藻种的分离纯化方法本试验室主要采用两种方法： 水滴分离法，将藻液稀释到适当浓度使其一滴藻液中只有一个或数个所需分离 的同类藻细胞群体。此法简便，易行，适于分离细胞较大，且在培养液中占有优势的藻 类：平板分离法，将藻液稀释到适当浓度，涂布于固体培养基上，使平板上长出互相 隔离的藻落已达到分离的目的。此法操作相对复杂但适用性强，为常用方法。本研究 使用平板分离法为主，对于在固体培养基上不能良好生长种类，则可以结合使用水滴 分离法。 平板分离法：主要用于丛粒藻7 6 6 的分离，将藻液稀释到适当浓度，涂布于c h u l 3 固体培养基上，置于恒温光照培养箱中，培养7 8 天后，平板上出现肉眼可见的浅绿 色藻落，半个月后藻落继续生长呈绿色。在无菌环境中挑取单一藻落转移到装5 m 左 右培养液的试管中。置于光照培养箱中继续培养，待试管中培养液浓度较深，再转到 l o o m l 小三角瓶中继续培养，逐渐扩大培养量。筛选出生长良好的藻株进行以后的实 验叫。 水滴分离法： 将藻液充分稀释，用毛细吸管吸取一滴到载玻片上，在显微镜下观察， 要求一滴内仅有数个细胞群体，若藻类密度太大，则需进行稀释。毛细吸管将藻细胞 冲入到装5 m l 左右培养液的试管中，然后置于2 0 。c 左右的恒温光照培养箱中进行培 养，1 0 - - - 1 5 天后进行镜检，若试管中的藻种不纯，仍有杂藻，则需重新再进行分离，直 至所培养的藻为纯种。若藻种已为纯种，且藻细胞已较多，则可以转移到5 0 m l 小锥形 瓶瓶中进行培养。在培养箱中培养一个月左右，锥形瓶底部出现绿色，再转到较大的 锥形瓶中进行培养，逐渐扩大培养量。筛选出纯种生长良好的藻株进行以后的实验。 以上两种方法的过程都在无菌状况下进行，光照条件应低于1 5 0 0 1 u x 嘞1 ，初期需 要进行遮光。 福建师范大学谢仁荣硕士学位论文 1 2 3 生物量及生长速率的测定 细胞生长检测： 定时取样，用紫外分光光度计测样品藻液在6 8 0 n m 处的光吸收值o d 6 s o ，用0 d 。表示 细胞的生长情况。 比增长速率的计算方法： 根据公式k = ( 1 9 0 d t 卜l g o d t 2 ) t 算得。 干重测定方法： 取样品l o m l ，4 5 0 0 r m i n 离心l o m i n ，弃上清液，用蒸馏水清洗三次反复离心后， 转移到称量瓶中，置于8 0 c 恒温烘箱中烘至恒重，用电子天平称其干重。 烃的测定： 取一定量的藻液于4 0 0 0r m i n 离心l om i n ，用蒸馏水洗涤后，于6 0 摄氏度干燥2 4 h ，) b h 5 0 m l 正己烷超声破碎3 0m i n 后离心，收集正己烷提取液，在恒温烘箱中于3 0 摄 氏度蒸发掉正己烷，余下即为烃，称其质量。 1 3 结果与分析 1 3 1 培养基的选择 按照1 2 1 的培养方法，固定其它培养条件，选定的培养基为c h u l o ，c h u l 3 ， c h u l 3 2 ，c h u l 3 2 + 2 0 0 m g l 的n a h c 0 3 。在4 个5 0 0m l - - - 角瓶中，分别装入上述培养基 1 6 0 m l ，各接入4 0m 1 预培养藻种，使培养初期0 d 啪在0 2 5 左右，用灭菌后的纱布包扎 瓶口，置于往复式摇床进行培养。培养条件为：光强为3 0 0 0 l u x ( 2 4 h 持续光照) ，温度 2 5 。c ，转速1 2 0r m i n 培养过程中定期取样，测定细胞生长和生物量，在第2 2 d y , ! f 烃含 量。 第一章丛粒藻的摇床培养 1 6 1 4 1 2 o 】 0 0 0 8 q o o 6 o 4 o 2 o c h u l 0 o47lo1316192 2 t i m e m e ( d ) l d ， 图1 培养基的筛选 f i 9 1 e f f e c to fc u l t u r em e d i u mt ot h eg r o w so f b o t r y o c o c c u sb r a u n i i7 6 6 1 2 1 o 8 q 、国 译 仉6 o 4 o 2 o 困c h u l o 1 培养基 图2 丛粒藻7 6 6 在不同培养基条件下生物量 f i 9 2 e f f e c to fc u l t u r em e d i u m t ot h eb i o m a s so f b o t r y o c o c c u sb r a u n i i7 6 6 1 5 福建师范大学谢仁荣硕士学位论文 表1 丛粒藻7 6 6 在不同培养基条件下生长的特性和产烃量 t a b l e f f e c to fc u l t u r em e d i u mt ot h eg r o w sa n dh y d r o c a r b o no u t p u to f b o t r y o c o c c u $ b r a u n i i7 6 6 由图1 ，2 可看出，摇床培养条件下，仅以空气中的c 0 2 作为碳源，以c h u l 0 作为培养 基时丛粒藻7 6 6 生长缓慢，延滞期约为4 d ，然后进入对数生长期，在第1 3 d 进入减速期， 在第1 6 d 进入稳定期。以c h u l 3 及c h u l 3 2 作为丛粒藻7 6 6 的培养基时，延滞期约为4 d ， 然后进入对数生长期，在第1 6 d 进入减速期，第1 9 d 进入稳定期，当在c h u l 3 2 培养基 中加入2 0 0m g l n a h c o 。补碳时，生长速率有所加快，延滞期约为4 d 左右，在第1 9 d 进入 减速期，2 2 d 进入稳定期。 综上所述，以c h u l o 作为培养基时，培养基营养浓度较低，藻生长缓慢，从表1 中可 以看出其烃产量低( 0 2 7 4 9 l ) ，不适合作为快速培养丛粒藻7 6 6 的培养基，但可以用 较低营养浓度的c h u l o 作为丛粒藻保种的培养基。在c h u l 3 x2 培养基培养时，初期丛 粒藻的生长速度较c h u l 3 没有明显提高，但生长周期有所延长，最终生物量有所提高， 烃产量也由0 3 8 6 9 l 提高至0 4 0 5 9 l 。当在c h u l 3 2 培养基中加入2 0 0 m g l n a h c o 。 补碳时，在生长初期对丛粒藻生长速率的提高不明显，在后期生长速率明显加快，生 物量生长周期显著变长，生物量有明显提高，烃产量为0 4 0 2 9 l 。 不同培养基条件下动力学参数的比较见表1 。由表1 可看出，添) b h n a h c 0 3 和使用 较高营养浓度的c h u l 3 ，比生长速率分别增大至0 0 4 2 1 d - 1 和0 0 3 6 0 d ，代时分别缩短 至5 4 d 和5 9 d ，最终生物量分别提高至1 0 1 l g l 和0 8 9 1 9 l ，烃产量分别为 0 4 0 2 7 9 l 和0 4 0 5 9 l 。丛粒藻作为光自养微生物需要足量的无机碳源来满足光合作 用需要，提高营养浓度，# l - j j h n a h c 0 3 补碳能大大提高丛粒藻7 6 6 的生长速率，延长生长 第一章丛粒藻的摇床培养 周期，提高最终生物量和烃产量。至于添j j i n a h c o 。的组烃产量略低于不添加的组原因 在于烃的积累主要集中在指数生长期，特别是指数生长后期，添j j f l n a h c o a 延长了丛粒 藻的生长周期，推迟了稳定期的到来，烃的积累时间不足。可以预见延长丛粒藻的生 长周期可以收获更多的烃。 最终本试验选择c h u l 3 2 + n a h c o 。培养基作为适合培养丛粒藻7 6 6 的培养基。 1 3 2 培养条件的优化 1 3 2 1 接种量对丛粒藻7 6 6 生长及产烃量的影响 按照1 2 1 的培养方法，固定其它培养条件，在5 0 0 m l 三角瓶中分别装入 1 8 0 o m l 、1 6 0 o m l 1 4 0 o m l 和1 2 0 o m l 的培养液，分别接入2 0 o m l 、4 0 m l 、6 0 m l 和 8 0 m l 预培养藻液，测定丛粒藻的生长曲线，生物量、产烃量和比生长速率，结果如图3 和表2 所示在第1 9 天测最终生物量和产烃量。 表2 丛粒藻7 6 6 在不同接种量下生长特性和产烃量 t a b 2 e f f e c to fi n o c u l a t i o no nt h eg r o wa n dh y d r o c a r b o no u t p u to f b o t r y o c o c c u sb r a u n f i7 6 6 福建师范大学谢仁荣硕士学位论文 2 5 2 o1 瓦 o o 上u q ) 8 l o 5 o o471 01 31 61 9 t i m e ( d ) 图3 接种量对丛粒藻7 6 6 生长的影响 f i 9 3 e f f e c to fi n o c u l a t i o no nt h eg r o w ，h y d r o c a r b o no u t p u ta n db i o m a s so f b o t r y o c o c c u sb r a u n i i7 6 6 如图3 和表2 可以看出，在较低的接种量条件下丛粒藻7 6 6 生长缓慢，延滞期约 为4d ，然后进入对数生长期，在第1 9d 还未进入减速期，其生物量和生长速率都较 低，生产周期大大延长，最终生物量和烃的积累也减缓了。当接种量为2 0 和3 0 ，藻 生长迅速，在4 d 后进入对数生长期，生长期一直延长到1 6 d 进入减缓期，2 0 组在对数 生长期初期较3 0 组低，在进入第7 天后，生长速率开始超过3 0 组，最终生物量也超 过3 0 组( 分别为1 0 8 9g l 和1 0 7 9 9 l ) ，虽然烃的产量略低( 0 4 6 1g l 和 0 4 5 4 9 l ) ，原因如前所述，烃的积累期不够长。4 0 组在对