（微生物学专业论文）泡菜中优良乳酸菌的筛选及高效混合菌株发酵剂研制.pdf

摘要 泡菜作为一种传统的发酵食品，由于其口感独特，营养丰富而深受大众喜爱。 因此，实现人工发酵对于提高泡菜品质，实现工业化具有重要意义。本文从泡菜中 分离并筛选出产酸速率快、硝酸盐降解能力强的乳酸菌株，对其进行发酵性能和菌 种优化搭配进行了研究；研究了泡菜发酵剂菌株适宜生长的廉价增殖培养基，优化 筛选出适合工业化生产的冻干复合保护剂；研究了乳酸菌增殖培养、细胞浓缩分离、 真空冷冻干燥的工艺技术：制备出高效浓缩型乳酸菌冻干发酵剂，并对冻干发酵剂 在蔬菜盐水中的发酵活力进行了检测；对泡菜的产品质量进行了初步分析和评价。 本文从8 种泡菜样品中分离出产酸菌株8 6 株，经革兰氏染色镜检、接触酶反 应及乳酸定性试验，并以产酸速度及亚硝酸盐降解能力进行了比较，筛选出五株产 酸较快，亚硝酸盐降解能力较强的乳酸菌l s 、l n ( d 、l n 、儿和z l l ，经 形态特征、生理生化特性初步鉴定分别为短乳杆菌、肠膜明串珠菌葡聚糖亚种、戊 糖乳杆菌、植物乳杆菌和植物乳杆菌。并对筛选出的优良菌株进行了发酵性能的研 究，结果表明五株菌均适用于低温泡菜的发酵。 将筛选出的发酵性能较优的肠膜明串株菌l n 、植物乳杆菌儿、短乳杆菌 l s 三株菌按比例组合搭配，组成发酵剂，筛选出l n ：儿伊l ：2 、 l n ( i ) ：l s = 1 ：2 、l n ：j l ：l s = 1 ：l ：l 作为优良发酵剂，并研究了三组 发酵剂在不同温度条件下发酵泡菜试验，确定i o c 为发酵泡菜的最适温度。 选择原料易得、价格低廉、易于分离细胞的番茄汁培养基、白菜汁培养基、胡 萝卜汁培养基，通过细胞生长试验，确定了白菜汁培养基是泡菜优良发酵菌株的最 适基础培养基。在此基础上，研究了在白菜汁中添加不同营养物质对细胞生长量的 影响，优化筛选出白菜复合汁增殖培养基，其最佳配比为：在含有0 2 k 2 h p 0 4 的 白菜汁基础培养基中添加，1 蛋白胨、1 牛肉膏、0 7 玉米浆、o 5 葡萄糖；与 白菜汁基础培养基相比l s 、l n ( i ) 、j l 在此增殖培养基中的最大细胞生长量分 别提高了3 9 倍、4 2 5 倍和5 4 5 倍，与在液体m r s 培养基的最高活菌数数量级相当。 通过研究离心力、离心时间对乳酸菌离心损失率、离心存活率及离心收得率的 影响，确定了短乳杆菌l s 、肠膜明串株菌l n 和植物乳杆菌j l 细胞浓缩分离 的最适离心条件为均为3 6 7 2 9 ( 6 0 0 0 r p m ) ，1 0 r a i n ，活菌收得率分别为9 6 2 8 、9 7 5 2 和9 8 9 3 。 筛选出抗冻干、耐贮藏的复合冻干保护剂1 种，冷冻干燥后，短乳杆菌l s 、 肠膜明串株菌l n 和植物乳杆菌儿冻干发酵剂活菌含量均在1 0 c f u g 以上，冻 干存活率均达9 5 以上。 肠膜明串株菌l n 、植物乳杆菌儿、短乳杆菌l s 冻干发酵剂以万分之一 的接种量接入蔬菜盐水中1 0 发酵，6 d 左右即可达到成熟，p h 为3 5 5 ，滋味浓郁， 酸度适中，与传统液态混菌发酵剂相比无明显差别。 关键词乳酸菌；泡菜；增殖培养基；真空冷冻干燥；保护剂；高效混合菌株发酵 剂 s t u d y 0 1 1f i l t r a t i o nl a c t i ca c i db a c t e r i af r o mp i c k l i n gv e g e t a b l ea n dh i g h a c t i v i t y a d m i x t u r eb a c t e r i n ms t r a i ns t a r t e rc u l t u r e a u t h e r ：，ur u j s u p e r v i s o r ：p r o f h o n g t a ot i a n m a j o r ：m i c r o b i o l o g y a b s t r a c t p i c k l i n gv e g e t a b l ei sa s o r to ft r a d i t i o n a r yf e r m e n tf o o d , i th a ss e p e c i a ls e 刀t s ea n d a b u n d a n c en u t r i t i o n ，i ti sp o p u l a r e df o rt h ep e o p l e i nt h i sp a p e r , l a c t i ca c i db a c t e r i a w e r ei s o l a t e da n di d e n t i f i e df r o mm a n ys o r t so fp i c k l i n gv e g e t a b l ef o rh a v i n ge x c e l l e n t c h a r a c t e r i s t i c si na c i dp r o d u c t i o na n dt h ea b i l i t yf o rd e g r a d a t i o nt h en i t r a t e 1 1 k f e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s i c so ft h e s es t a i n sw e r ea l s os t u d i e d i th a si s o l a t e ds t r a i n sa n d o p t i m i z a t i o nc o l l o c a t i o nf o rf i n el a c t i ca c i db a c t e r i a , s t u d i e dt h ep r i m a r yf a c t o r sw h i c h a f f e c tm a n u f a c t u r i n gt e c h n o l o g yo fp i c k l i n gv e g e t a b l e t h ec h e a pe n r i c h m e n tm e d i u m s u i t e d f o ri n d u s t r i a lp r o c e s s i n ga n df r e e z e - d r y i n gp r o t e c t a n tw e l es c r e e n e d t h e t e c h n o l o g yo fe n r i c h m e n tc u l t u r ef o rl a c t i c a c i d b a c t e r i a , c c uc o n c e n t r a t i o n , l y o p h i l i z a t i o nw e r es t u d i e d t h ef e r m e n t a t i v ea c t i v i t yo ft h ef r e e z e - d r y i n gs t a r t e ri n c a b b a g eb r i n ew e r ee x a m i n e d 8 6s t r a i n so fl a c t i ca c i db a c t e r i aw e r ei s o l a t e da n di d e n t i f i e df r o me i g h tp i c k l i n g v e g e t a b l e f i v e s t r a i n sw e r es e l e c t e df o rh a v i n ge x c e l l e n tc h a r a c t e r i s t i c si na c i d p r o d u c t i o na n dt h ea b i l i t yf o rd e g r a d a t i o nt h en i t r a t e f o rm o r p h o l o g ya p p r a i s e m e n ta n d t h et e s tf o rp h y s i o l o g ya n db i o c h e m i c a le v e n t , t h e r ea r et w ol a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ， o n e ，o n el a c t o b a c i l l u sp e n t o s u s , o n el e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e ss u b s p d e x t r a i n i c u m t h ef e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s i c so f t h e s ef i v es r a i n sw e r ea l s os t u d i e d i tm a k el e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e ss u b s p l n ，l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m 儿 a n dl a c t o b a c i l l u sb r e v i sl s p r or a t ec o m b i n a t i o na r r a n g ei np a i r sf o rs t a r t e r i ts c e c n o u tl n 0 ) ：j l 1 ：2 、l n ：l s l ：2 、l n ：几：l s = i ：l ：1a t e c h o i c e n e s ss t a r t e r , a n dm a k et h et h r e es t a r t e ri nd i f f e r e n tt e m p e r a t u r ef e r m e n tc a b b i e ， m a k es u r eio ci st h eb e s tt e m p e r a t u r ef o r t h ef e r m e n tc a _ b b a g e t o m a t oj u i c em e d i u m , c a r r o tj u i c em e d i u ma n dc a b b a g em e d i u mw h i c ha l ea p tt o g a i na n ds e p a r a t ea r eo b t a i n e db yc e l lg r o e t he x p e r i m e n t e d t h er e s u l ts h o w e dt h a t c a b b a g ej u i c ew a st h eb e s tb a s em e d i u mf o rl a c t o b a c i l l u sb r e v i sl s 1 1 1 ee f f e c to f a d d i n g12k i n d so fd i f f e r e n tn u t r i e n tf a c t o r si nc a b b a g ej u i c em e d i u m t h er e s u l ts h o w e d t h a tt h eo p t i m m ne n r i c h m e n tm e d i u mo b t a i n e db yo r t h o g o n a l i t yt e s tl 9 ( 3 4 ) c o n s i s to f a d d i n g1 p e p t o n e , 1 b e e v e s ，o 7 c o r nl i q u o r , 0 5 g l u c o s ea n d0 2 k 2 h p 0 4i n c a b b a g ej u i c em e d i u m i nt h eo p t i m u me n r i c h m e n tm e d i u m , t h el i v i n g - c e l ln u m b e ro f l s 、l n a n dj l w e r ei n c r e a s e db y3 9t i m e s ，4 2 5t i m e sa n d5 4 5t i m e sc o m p a r e d w i t hc a b b a g ej u i c eb a s em e d i u ma n dt h es a m ew i t ht h el i v i n gn u m b e ri nt h em r su s e d i n l a b t h ee f f e c t so fc e n t r i f u g i n gf o r c e ，t i m eo nt h el o s sr a t e ，s u r v i v a lr a t ea n dh a r v e s tr a t e o fl a c t o b a c i l l u sw a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o r c e n h i f u g a t i o no fl a c t o b a c i l l u sb r e v i sl s ，l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e ss u b s p l n a n dl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m 几3 6 7 2 9 ( 6 0 0 0 r p m ) f o r10 m i na n dt h eh i g h e s th a r v e s t i n g r a t eo f l i v i n gc e l l sw e r e9 6 2 8 ，9 7 5 2 ，9 8 9 3 a c o m p l e xp r o t e c t a n tw a ss c r e e n e d ，w h i c hc o u l dp r o t e c tc e l lf r o md a m a g i n gd u r i n g f i , e e z e d r y a f t e rf t e e z e - d r y i n g ，t h er i v i n g c e l ln u m b e ro fs t a r t e r , l a c t o b a c i l l u sb r e v i s l s ，l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e ss u b s p l n oa n dl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mj l w e l eo v e r1 0 “c f u g ，f r e e z e - d r yl i v a b i l i t yw e r eo v e r9 5 mc a b b a g ef e r m e n t e x lb y p r o t e c t a n ti n10 ( 2 t h er e s u l tw e * t en od i f f e r e n t a ls i g n i f i c a n c ec o m p a r e d 、析mt r a d i t i o n a l c u l t u r ew h i c hs h o wt h ec a b b a g ec a l lb em a t u r e da b o u t6d a y sa n dt h ep hw a s3 5 5 k e y w o r d s ：l a c t i ca c i db a c t e r i a ；p i c k j i n gv e g e t a b l e ；e n r i c h m e n tm e d i u m ；l y o p h i l i z a f i o n ； p r o t e e t a n t ；c o n c e n t r a t e ds t a r t e r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逦j 点壅些太堂或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：昊蕊 签字日期：a 。分年6 月胆日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逦j 量壅些太堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权逦j 量壅些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：关j 良 导师签名：1 l 司织蚜 签字日期：0 0 0 a 年易月，日签字日期：0 - 口眸6 月f3 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 泡菜中优良乳酸菌的筛选及高效混合菌株发酵剂研制 1 1 泡菜概述 1 引言 泡菜由泡制而得，即以时鲜蔬菜为原料，入泡渍液经乳酸发酵泡渍成菜f 1 1 。泡菜是我国的传 统发酵蔬菜制品，制作工艺可以追溯到2 0 0 0 多年前，其制作过程是以乳酸发酵为主、兼有醋酸 发酵、酒精发酵等微生物的发酵过程，以其酸鲜纯正、脆嫩芳香、清爽可口、自然本色、醇厚绵 长、解腻开胃、促消化增食欲等独特的风味和丰富的营养，吸引着业内人士和众多中外消费者， 使泡菜这种饮食文化源远流长、世世相传。 1 1 1 泡菜的分类 ( 1 ) 以培菌方式分类 可分为发酵泡菜和拌制泡菜。发酵泡菜指培养乳酸菌进行乳酸发酵的泡菜。其菌种来源可以 是培养纯种乳酸菌接种，也可以利用原始泡渍液分割法接种，即该类乳酸菌处于可控状态。拌制 泡菜指无须人为培菌，而是盐溃菜经调酸调味的拌制型泡菜。事实上在蔬菜数月的盐渍过程中， 拌制泡菜中也存在随机进入的耐盐性野生乳酸菌的繁殖与作用，但该类野生乳酸菌及其发酵作用 均处于非控原始状态。 ( 2 ) 以完整的生产工艺分类 可分为工业化生产工艺制作泡菜和作坊式或家庭自制的泡菜。工业化生产工艺制作泡菜此类 工艺以标准化为基础，除一般的制作工艺外，特别强调后续的保鲜储存工艺。通常要求在大流通 环境下货架期质量稳定，在常温条件下。泡菜保质期需达3 个月以上。作坊式或家庭自制的泡菜 通常以随意的非标准化方式制作，餐饮业等作坊式自制自供，家庭则为自作自食。故仅注重泡菜 的制作工艺。因产品无须进入大流通市场，所以基本上无保鲜储存的工艺措施，产品货架期仅在 数小时以内。 1 1 2 泡菜中的微生物 在泡菜发酵过程中有多种酵母、细菌参与，其中主要的产酸菌是乳酸菌。对于泡菜中微生物 的研究p e d e r s o n 和a l b u r y 等拉】研究了酸白菜、酸黄瓜等发酵过程中的菌系消长规律，发现在发酵 早期明串珠菌很活跃，随后是啤酒片球菌、短乳杆菌大量产酸，最后是植物乳杆菌完成发酵过程。 发酵初期的肠膜明串珠菌是异型发酵阶段，此时它的数量最多且生长繁殖速度快，这是因为肠膜 明串珠菌比发酵液中的其它乳酸菌的世代周期要短。但是，它对酸的敏感性较强，随着发酵的进 一步进行就会很快死去。人们从发酵的酸菜中还分离到弯曲乳杆菌、米酒醋杆菌、粪肠球菌、融 合乳杆菌、醋酸片球菌和啤酒片球菌，但是这些微生物在发酵中的作用还不清楚。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 1 1 3 乳酸菌发酵泡菜的机理 泡菜发酵过程中的有益微生物发酵主要有乳酸发酵、酒精发酵和醋酸发酵。其中乳酸发酵起 主导和决定性作用1 3 】。 大多数乳酸杆菌能通过特殊的透膜酶作用，转移进入细胞，并经b - 半乳糖苷酶将乳糖分解成 葡萄糖和半乳糖。半乳糖再由李洛氏途径转变为葡萄糖，然后通过糖酵解途径进一步转化为乳酸。 少数乳酸杆菌和大多数乳酸链球菌则通过磷酸转移酶作用，将乳糖磷酸化后进入细胞，水解成葡 萄糖和6 磷酸半乳糖，后者经6 磷酸塔洛糖进入糖酵解途径川。由于菌体内酶系统的差异，乳酸 菌发酵有异型发酵和同型发酵两种途径。如图l 和2 所示： 葡萄糖 | 6 - 磷酸葡萄糖 l 6 磷酸葡萄糖酸 上 5 磷酸核酮糖 1 l 5 磷酸木酮糖 i i a ，b 一二羟基乙酰一t p p 一酶 3 一磷酸一甘油醛 l， 羟乙酰- t p p - 酶 上 乙阶t p p - 酶 l 乙酰磷酸 土 乙酰c o a 土 乙醛 土 1 、3 一二磷酸甘油酸 上 3 一磷酸甘油酸 上 2 一磷酸甘油酸 上 磷酸烯醇式丙酮 l 丙酮酸 jj 乙醇乳酸 圈1 乳酸菌异型发酵途径 f i g 1h e t e r o f e r m e n t a t i o np a t h w a yo f l a c t i ca c i da g e n t 异型发酵途径又称每磷酸葡萄糖酸途径，异型发酵的乳酸菌缺乏e m p 途经的关键酶醛缩 泡菜中优良乳酸菌的筛选及高效混合菌株发酵剂研制 酶和磷酸丙糖异构酶， 为： c e h l 2 0 6 + a d p + p i 因此，异型发酵是通过磷酸戊糖途径进行的。葡萄糖异型发酵的总反应式 c h 3 c h o h c o o h + c h 3 c h 2 0 h + c 0 2 十a 1 限 葡萄糖 l 6 磷酸葡萄糖 i 6 书霉酸果糖 上 l ，d 二磷酸果糖 l 广 磷酸二羟基丙酮3 一磷酸一甘油醛 l l 、3 一二磷酸甘油酸 l 3 一磷酸甘油酸 、l 2 一磷酸甘油酸 上 磷酸烯醇式丙酮 上 丙酮酸 上 乳酸 图2 乳酸菌同型发酵途径 f i g 2h o m o f e r m c n t a t i o np a t h w a yo f l a c t i ca c i da g c a t 乳酸菌同型发酵总反应是： c 6 h 1 2 0 6 + 2 a d p 卜p i 2c h 3 c h o h c o o h 2 筒限 在自然发酵前期，除乳酸菌外的其它微生物还有一定的活动能力，微生物种类多，且有少量 空气存在，以异型乳酸菌的发酵为主。这类异型乳酸发酵菌一般不耐酸，随乳酸量的增加，到发 酵中后期，以耐酸的正型发酵乳酸菌进行活动。将单糖和双糖发酵生成乳酸而不产生气体。 当乳酸量继续增加，乳酸菌的活动也受到抑制。同时乳酸发酵作用也把蔬菜中的一部分蛋白 质分解成氨基酸，其中的谷氨酸同食盐中的钠结合成谷氨酸钠，酒精同醋酸生成乙酸乙醋，乙酸 乙醋是一种醇香物质，从而使泡菜鲜香兼备。 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 2 泡菜发酵剂 1 2 1 发酵剂分类及特点 发酵剂一般是指生产发酵制品所使用的乳酸菌的培养物。制作乳酸菌发酵产品前最重要的一 个步骤就是乳酸菌发酵剂的制备，发酵剂的好坏可以直接影响到发酵产品的质量好坏。 根据发酵剂的形态及生产方法，可将发酵剂分为三种类型即j ： ( 1 ) 液体发酵剂 液体发酵剂，即传统人工型发酵剂，其生产方式一般需要经过菌种活化、母发酵剂、中间发 酵剂、生产发酵剂等工艺过程。使用前能给予评估和检查，依据实验和已知的方法能指导生产： 价格便宜。 其主要弊端是【6 2 1 ：活菌含量低( 1 0 7 - - 1 0 。c f u g ) ；接种量大( 2 3 ) ：保藏期短( 4 ， l - - 2 d ) ；生产工序多、周期长；在发酵剂制备过程中，菌种经过多级扩大培养和繁衍，每批与 每批之间质量不够稳定，极易退化和污染。 ( 2 ) 冷冻浓缩型发酵荆 冷冻浓缩型发酵剂系乳酸菌种经液体增殖培养，浓缩分离，与冷冻保护介质混溶，再经冷冻 而制成的发酵剂。冷冻温度有2 0 1 2 、- 4 0 - 8 0 c 和1 9 6 ( 2 ，分别称为冷冻、低温冷冻和超低温液 氮冷冻【琳1 2 1 。其中，超低温液氮冷冻效果最好。 特点：活菌含量高，保藏期长，可以直接向专业生产厂家购买作为生产发酵剂使用，在生产 过程中省略了发酵剂的制各工序；接种量较传统人工型发酵剂降低1 0 0 倍左右；一次性使用方便、 简单、准确，减少了菌种车间的投资和空间，大大降低了杂菌或病毒在培养时的污染，确保每批 产品质量相同，降低因生产失误而造成的浪费。 但发酵剂的保存需要特殊的制冷装置，维持冷冻费用较高，运输不便，需要配备专用冷藏车， 对发酵剂中心的依赖性过强，在生产中应用存在一定的困难。 ( 3 ) 干燥发酵剂 千燥发酵剂系乳酸菌种经液体增殖培养，浓缩分离，与保护介质混溶，再经一定方式干燥而 成的发酵剂。干剂制备一般采用两种方法【1 3 l ，喷雾干燥法和真空冷冻干燥法。此类发酵剂一方面 可减少液态发酵剂制备的许多工作，另一方面可延长发酵剂的保存期，使其保存和分发更容易。 喷雾干燥发酵剂的干燥工艺成本较低，但菌体存活率不高，目前主要用喷雾干燥方法生产酸奶粉 1 1 4 1 。采用此法时，若喷雾温度过低( 进口温度4 0 8 0 c ) ，设备利用率大幅度降低，有时会出 潮粉；若喷雾温度过高，会造成乳酸菌大幅度死亡，产品质量不够稳定，因而未能在实际生产中 推广应用。 采用真空冷冻干燥工艺制备的乳酸菌发酵剂，即真空冷冻干燥浓缩发酵剂，又称直投式发酵 剂或直接使用型发酵剂，是指不需要经过活化、扩增而直接应用于生产的类新型发酵剂，它是 将离心分离后高浓度的乳酸菌悬浮液，添加抗冻保护剂，经冻结，再在真空条件下升华干燥，制 成干燥粉末状的固体发酵剂。其主要特点有：活茵含量高( 1 0 1 0 1 0 1 2 c f - u g ) 保质期长，能 够直接、安全有效的生产制品，大大提高了劳动生产率和产品质量，保障消费者的利益和健康； 接种方便，只需简单的复水处理，就可直接用于生产：减少了污染环节，并能够直接、安全 4 泡菜中优良乳酸菌的筛选及高效混合菌株发酵剂研制 有效的生产产品，使发酵制品的生产标准化，并减少了菌种的退化和污染菌种活力强，使接种 量较传统人工发酵荆降低1 0 0 - - 1 0 0 0 倍，菌株比例适宜。 1 2 2 直投式发酵剂 直投式乳酸茵发酵剂起源于乳品行业，1 9 世纪末2 0 世纪初，西方乳业科学家开始研制浓缩 发酵剂，1 9 6 3 年浓缩发酵剂进入商品化生产阶段。最初是冷冻浓缩发酵剂，由于其保存需要特殊 的制冷系统，成本高、运输不方便。随着冷冻干燥技术的发展，将离心分离后的高浓度乳酸菌悬 浮液添加抗冻保护剂后冻结，再在真空条件下升化干燥，制成干燥粉末状的固体发酵剂。1 9 8 8 年丹麦汉森中心实验室研制成功了超浓缩乳酸菌发酵剂系列产品，并子1 9 9 4 年将其系列产品推 向中国市场f l 习。直投式发酵剂以其巨大的优势在欧美等发达国家得到了广泛应用i l q 。国内外对 于直投式发酵剂的研究多见于保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌 1 9 - 2 4 1 ，近年来，也有学者开始研究泡 菜的直投式发酵剂。n a n c yjg a r d n e r 等进行了使用植物乳杆菌0 3 1 2 、乳酸片球菌a f e r m 7 7 2 和肠膜明串珠菌b l a c 进行冻干后复配用于胡萝卜、甘蓝、甜菜和洋葱混合蔬菜的复配发酵剂的 试验【2 5 l 。在欧洲的腌黄瓜生产中，使用1 3 0 m l 植物乳杆菌浓缩发酵剂( 活细胞数为6 5 x 1 0 1 2 c f u m l ) 直接接种到9 o t 的黄瓜中进行发酵，发酵温度通常保持2 6 - - 一2 9 c ，7 1 2 d 就可以终止发酵瞄州。 陆利霞等利用植物乳杆菌b 4 、复合弯曲乳杆菌a 8 和乳酸链球菌制各直投式发酵剂并进行纯种发 酵泡菜并进行了植物乳杆菌b 2 纯种发酵萝卜泡菜的研究【2 2 引。贺稚非等 2 9 1 进行了泡菜活性直投 式乳酸菌发酵剂的研究为直投式的乳酸菌发酵荆工业化生产提供理论依据。 1 3 高效浓缩型发酵剂制备关键技术 1 3 1 优良菌种的筛选 发酵蔬菜的主要菌群羽艘菌一直是人们研究的熟点，筛选适于蔬菜乳酸发酵的优良乳酸 菌，在提高产品风味、质量同时降低亚硝酸盐含量的前提下缩短发酵周期，使泡菜的工艺更为科 学合理，是制备高效浓缩型直投式冻千发酵剂的首要任务和关键环节。作为泡菜发酵的优良乳酸 菌应具有安全性好、生长繁殖块、发酵活力商、产风味成分多、抗逆性强等优良特性，而菌种的 安全性及生产与发酵特性是筛选菌种的首要因素。因此，根据自身特点研究特定条件下菌种的发 酵速度、产酸量、对不同发酵环境的适应能力以及评价其最终的口感与风味对优良菌种的筛选以 及确保纯接种快速发酵技术的成功都是至关重要的。 1 3 2 增殖培养基 乳酸菌对营养要求苛刻，其增殖培养基除了含有碳源、氮源、无机盐等营养因子外，还应含 有乳酸菌促生长因子。作为乳酸菌增殖的培养基应具有如下特点：适合菌体生长，繁殖速度快， 在较短时间内可得到大量高活力细胞；菌体与培养基易分离；成本低廉，最好能反复利用。 目前，实验室常用的乳酸菌培养基，如脱脂乳，m r s ，m 7 中营养成分丰富，可满足乳酸菌生长 繁殖的需要，是乳酸菌增殖培养的主要原料，但是其成分复杂，价格昂贵，制作繁琐。适合工业 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 化生产浓缩型直投式发酵剂的乳酸菌培养基必须是原料易得、价格低廉、菌体产量高、容易浓缩 分离细胞【3 0 一。我国农业资源丰富，在自然界中存在着大量的乳酸菌促生长因子，因此，根据我 国国情和资源优势，积极寻求来源广泛，经济易得的廉价原料，优化筛选适合乳酸菌大量生长的 增殖培养基，对实现我国大规模工业化生产高效浓缩型乳酸菌发酵剂具有重要意义。 对于收集乳酸菌菌体来说，发酵液粘度和蛋白质沉淀将严重影响乳酸菌的收集，所以通常在 确定培养基时多采用番茄汁、胡萝卜汁等易于与菌体分离的培养基 3 2 - 3 4 j ，同时考虑泡菜生产多以 白菜为主要原料，乳酸菌在蔬菜盐水中生长，亦可选用白菜汁作为培养基。 1 3 3 菌体细胞浓缩分离技术 乳酸菌经发酵，菌体细胞量达到最大值，即在细胞具有较强抗冻能力的稳定期时，便可以收 集浓缩培养液中的乳酸茵菌体。分离技术是制各乳酸茵冻干制剂的重要中间工艺环节，茵体浓缩 分离的方法主要有两大类。一类是膜渗析法【3 5 l ，将菌体在生物反应器( 发酵罐) 内培养，利用膜 装置将菌体与培养液分离，以浓缩菌体。膜渗析法有对菌体影响小，获得的菌体浓度高，培养液 可重复利用等优点，但膜装置成本高，滤膜的污染、清洗、杀菌、老化等一系列问题使商业化生 产受到一定程度的限制 3 6 1 。第二类方法是离心法f 3 7 3 j ，即借助离心机的离心力作用使菌体沉积。 以提高悬浮液的含茵量。此类方法简便、快速、处理量大适合商业化生产；但在离心分离过程中， 一方面，离心力机械作用以及温度和基质p h 值等因素的影响，会造成部分菌体死亡；另一方面， 部分菌体必然残留在上清液中而损失。如果离心工艺掌握不当，菌体死亡率和损失率随之增高， 使活菌收得率大大降低，直接导致发酵剂的活菌含量下降。因此，须对离心力、离心时间、温度、 基质p h 等影响乳酸菌离心损失率、存活率的因素进行深入的研究，以寻求最佳离心条件，获得 最高活菌收得率 1 3 4 真空冷冻干燥技术 干燥工艺主要有：真空低温干燥法、喷雾干燥法和真空冷冻干燥法( 简称冻干法) 1 3 9 1 0 其中， 真空低温干燥法和喷雾干燥法制各的浓缩型发酵剂，一般活菌含量偏低：而真空冷冻干燥法制备 的浓缩型发酵剂不仅活菌含量高，而且保藏和运输方便，机械化程度高，便于工业化批量生产。 利用真空冷冻干燥技术生产活菌制剂是多种保藏方法中较为理想的一种m ，其主要优点是1 4 1 旬j ： ( 1 ) 干燥过程在高度真空的低温下进行，适宜热敏性和对氧敏感微生物干燥：( 2 ) 干燥后保持 原有形状，具有多孔结构和理想的速溶性及快速复水性，活菌存活率高；( 3 ) 便于贮藏，微生 物保藏期延长；( 4 ) 利于机械化批量生产。 真空冷冻干燥简称冻干1 4 “7 1 ，其基本原理是热力学相平衡理论：即将欲保藏的微生物细胞悬 浮液，在共熔点以下预冻，然后在低于三相点压力的高度真空状态下，使物品中的冰晶升华，通 过及时补充升华热能，除去其中多余水分，最后达到干燥的目的。此方法主要是根据微生物生理、 生化特点，干燥后使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受到抑制，达到休眠状态，以保持菌株 原有特性。由此可见，影响冻干发酵剂细胞存活率的因素主要有：冻结温度、冻结时间和冷冻保 护介质。微生物在冷冻过程中，不可避免地会造成部分细胞的死亡或损伤t 4 a - 5 0 l ，尤其是乳酸菌， 6 泡菜中优良乳酸菌的筛选及高效混合菌株发酵剂研制 生理条件要求苛刻，细胞死亡率明显升高【5 。这主要归因于细胞膜成分、物理条件或敏感蛋白结 构在冻干后发生变化1 5 2 钢。目前，微生物一般采用3 5 预冻l h 的工艺。万红兵1 5 6 】等人研究表明 冻结方式和冻结时间对保加利亚乳杆菌冷冻存活率没有影响。 1 3 5 保护剂及抗冻保护机理 真空冷冻干燥过程中，冷冻和干燥两个过程会造成乳酸菌细胞膜的损伤，主要有：机械损伤、 溶质损伤、细胞膜渗透性损伤、d n a 损伤【5 7 】；导致蛋白质变性失活【5 引、p h 值的动态平衡被破坏 侈9 t6 0 及细胞膜脂肪酸组成的变化，这些不同形式的损伤会使乳酸菌在生产过程中的存活率降低。 影响乳酸菌冻干效果的因素有很多，如菌株、细胞大小及形状、增殖培养基、生长阶段及速率、 初始细胞浓度、p h 值、保护剂系统、预冻温度、降温速率、冷冻干燥条件、细胞含水量、细胞 膜成份和复水条件等，其中保护剂系统的影响最为突出【6 1 1 ，它不仅影响发酵剂在冻干过程中的细 胞存活率，也影响保藏期间的细胞稳定性。 冻干保护介质的选择是最为关键的因素，保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学 环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特征和生物活 性1 6 2 - 6 4 1 。保护介质由不同种类的保护剂组成，不同的保护剂对不同菌种的保护效果是不同的，甚 至同种保护剂对同种不同株保护作用也不同1 6 删，单一保护剂并不能满足冷冻干燥的要求，所以 抗冻保护剂一般都是按一定配方混合使用。 冷冻保护剂可分为两种：一是小分子量的化合物如氨基酸、有机酸、低分子的糖类和糖酵类 等；一是大分子的物质如蛋白质、多糖、聚乙烯吡咯烷酮和其他的合成聚合物等。小分子量的保 护剂都有共同的特性，即每个分子都包含不少于3 个可形成氢键的( d h 、- n h 2 、- - n h = o ) 或可 电离的( 酸性的或碱性的) 功能基团。大分子保护荆的物理化学特性目前还不清楚。但它主要是 保护细胞的表面免受伤害，冻干过程中对细胞有一定的保护作用，但大分子保护剂单独使用时， 在保存期间对细胞的保护效果却不明显，如果合适的大分子和小分子保护剂配合使用，将会加速 干燥，且能在干燥和保存期间维持较高的细胞存活率1 6 聊。 保护剂应该满足【6 9 一0 1 ：无免疫原性，无毒性；冷冻升华时不起泡；冻干后易溶解； 在冻干和保存过程中有保护作用；有利于生物活性保持；不影响冻干制品的检测。关于保护 剂对细菌存活率影响的研究国外已有许多报道，脱脂乳【7 5 】是应用比较广泛的保护剂，这是因为 脱脂乳本身具有以下几个特征f 7 6 j ：稳定细胞膜结构，避免细胞受到伤害；增加冻干产品的多 孔结构，利于细胞复水作用；本身包含蛋白为细胞提供一种保护外壳。i c i l a r a 册研究发现，麦 芽提取液、脱脂乳、乳清、胨化乳都有较好的保护作用，田洪涛【7 8 j 等人研究表明海藻糖可显著提 高长双歧杆菌的冻干存活率及冻干茵粉在贮藏期间的细胞稳定性，张英华【7 9 】等人研究保加利亚乳 杆菌时指出海藻糖使菌体的存活率较高，刘丹i s o 等人考察了多种保护剂对瑞士乳杆菌的冻干保护 效果。发现海藻糖、脱脂乳、谷氮酸钠、大豆蛋白胨效果较好。大量国内外研究表明脱脂乳、蔗 糖、甘油、麦芽糊精、海藻糖、谷氨酸钠、酵母膏、蛋白胨等都可用于提高乳酸菌的冻干存活率。 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 4 本课题研究的目的意义、研究内容及技术关键 1 4 1 研究目的 本课题主要从筛选发酵泡菜的优良菌种及高效浓缩型发酵剂制各的关键技术进行深入研究， 包括：从发酵泡菜中分离、纯化并鉴定优势菌种；研究优良菌种的发酵特性；选育优良发酵菌种； 利用正交试验确定泡菜发酵剂混合菌株的最佳配比；优化混合菌株发酵剂发酵泡菜的工艺条件： 研制出泡菜高效混合菌株干制发酵剂。为泡菜这传统的大众健康食品从落后的自然发酵转变为 现代的人工控制发酵，并为工业化生产泡菜高效混合菌株干制发酵剂，进一步缩短酸泡菜的发酵 周期、提高产品质量，提供科学依据。 1 4 2 研究意义 近年来，泡菜生产发展迅速，品种日益繁多，人均消费量大，并远销国外，受到世界各界的 青睐。我国蔬菜资源丰富，是世界第一蔬菜生产大国这便为泡菜的生产提供了丰富的原料。从 食品营养和蔬菜保鲜角度来讲，纯种乳酸发酵能解决传统泡菜所存在的不足，具有重要的社会和 经济意义。为泡菜的工业化生产，寻求纯种乳酸发酵的生产模式无疑是一种较佳的选择，国内已 有乳酸菌发酵剂技术的一些报道，但尚未商品化生产。通过筛选发酵泡菜的优良菌种、菌体的高 密度细胞培养、细胞离心浓缩分离等关键技术进行深入研究，研制出泡菜高效混合菌株干制发酵 剂，为建立我国的泡菜发酵剂生产厂家，早日实现发酵剂商品化奠定基础。 1 4 3 研究内容 1 乳酸菌优良菌株的筛选、鉴定及发酵特性的研究 从不同来源的泡菜中分离筛选出乳酸菌，以产酸速度及亚硝酸盐降解率及为指标对分离得合 乎要求的乳酸菌进行筛选，从而选育优良菌株。根据伯杰细菌鉴定手册，对性能优良的菌株 进行形态鉴定、生理生化鉴定，确定其在分类学上的位置。对选育的优良菌株分别进行最适生长 温度、最适起始p n 值及耐盐性的测定，以确定菌株发酵特性。 2 优良发酵剂的筛选 对选育的乳酸菌优良菌株进行优化搭配，通过其p h 值和总酸，并评价产品的感官评价，确 定用于制备高效混合菌株发酵剂的菌种搭配。并以不同温度下优良发酵荆发酵泡菜进行产酸试 验，以确定发酵泡菜的最适温度。 3 乳酸菌廉价增殖培养基的优化筛选 获得乳酸菌大量生长的培养基是制备高效浓缩型冻干发酵剂的前提，选择经济易得、价格低 廉、易于菌体分离的白菜、番茄、胡萝卜等为主要原料，对乳酸菌在白菜汁、番茄汁、胡萝卜汁 等基础培养基中进行细胞生长试验，研究在白菜汁、番茄汁、胡萝卜汁等基础培养基中添加单一 营养因子对菌体生长量的影响，在此基础上采用细胞生长实验，优化筛选出适合工业化生产高效 浓缩型冻干发酵剂的乳酸菌增殖培养基。 8 泡菜中优良乳酸菌的筛选及高效混合菌株发酵剂研制 4 菌体细胞离心分离技术研究 通过离心试验，建立离心浓缩分离菌体细胞过程中活菌收得率与离心损失率、离心存活率相 关性试验方法，寻求最高活菌收得率的适宜离心条件。 5 高效冻干保护剂的优化筛选 泡菜优良发酵菌株经液体m r s 培养基活化、增殖培养基培养、离心收获菌体，以1 0 脱脂 乳作为大分子保护介质的基础上，分别添加糖类、蛋白质类、醇类等多种物质对其进行抗冷冻干 燥性的强化，筛选出以1 0 0 , 6 脱脂乳为基础保护剂的复合保护剂，并将筛选得到的复合保护剂用于 筛选其它泡菜优良发酵菌株作验证性试验。为高效浓缩型千酪冻干发酵剂的工业化生产提供优良 的保护剂。 6 冻干发酵剂的发酵活力研究 利用最佳保护剂配方，制备混菌的冻干发酵剂，制作泡菜，验证直投式发酵剂的性能。 1 4 4 技术关键 分离出发酵产酸速率快、亚硝酸盐降解能力强的乳酸菌菌种，并对其进行初步鉴定及发酵性 能的研究，寻求并筛选适合工业化生产高效浓缩型直投式泡菜发酵剂的廉价增殖培养基配方，优 化筛选菌体浓缩分离条件，优化筛选抗冻干、耐贮的高效冻干保护剂，是本课题拟解决的关键性 问题。 9 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 2 培养基 ( 1 ) m r s 液体、固体培养基隋1 1 ，分别用于乳酸菌菌种活化、筛选与活菌计数。 ( 2 ) m r s 培养基中加入2 ( w v ) c a c 0 3 【8 2 】，用于乳酸菌的分离与鉴定。 ( 3 ) p y 基础培养基【s 3 j ，用于生化特性的测定。 ( 4 ) 白菜汁培养基 白菜汁制备工艺：选取无破损、无霉烂、无虫蛀的新鲜白菜_ 清水洗净、沥干_ 捣碎、打浆 _ 过滤( 1 0 0 目滤布) _ 调p h 值至7 2 - ，1 2 1 c1 5 r a i n 灭菌备用。用于乳酸菌增殖培养基的优化 筛选。 ( 5 ) 番茄汁培养基 番茄汁制备工艺 1 3 1 ：新鲜番茄- 清洗一热烫( 9 0 9 5 ，3 - - 一5 m i n ) 叶榨汁_ 过滤( 1 0 0 目 滤布) _ 调p h 值至7 2 _ 1 2 l 1 5 r a i n 灭菌备用。用于乳酸菌增殖培养基的优化筛选。 ( 6 ) 胡萝卜汁培养基 胡萝卜汁制备工艺：胡萝卜一洗净呻去皮及根梢+ 称重一切片_ 煮沸( 料：水= 1 ：4 ) ，l o o