（微生物学专业论文）巴斯德梭菌和克雷伯氏杆菌产生13丙二醇的研究.pdf

摘要 1 。3 - 丙二醇( 1 ，3 - p d ) 是一种重要的化工原料其生物合成过程已引起人们越来越多的重视 对巴斯德梭菌( c l o s t r i d i u m p a s t e u r i a n w n ) 利用甘油产生l ，3 - p d 的发酵研究表明，采用补料批式 发酵时，其产量为1 3 1g r 1 ，而主要副产物丁醇的合成量为1 7g 1 - l 。分析表明，在该发酵过程中， 丁醇合成是主要代谢通路，1 ，3 - p d 的代谢流量仅占2 0 。为了降低丁醇产量，采用热不对称交 错p c r ( t a i l - p c r ) 。克隆了cp a s t e u r i a n u m 中丁醇合成的关键酶基因b 酮硫解酶基因， 但是由于cp a s t e u r i a n u m 体内的限制性内切酶限制外源d n a ，使得拟用反义r n a 方法干扰丁醇 合成基因表达的实验未能继续。 采用由c l o s t r i d i u mp a s t e u r i a n u m 的d h a b c e 和e s c r c h mc o l iy q h d 基因构建的表达质粒 p u d y p 转化产酸克雷伯氏杆菌( k l e b s i e l l ao x y t o c a ) ，用于生产1 ，3 - p d 。微供氧发酵实验表明， 工程菌株足o 哪 t o c a ( p u d y p ) 的1 ，3 - p d 最高产量为5 2 9 量1 i ，摩尔转化率为5 6 1 7 ，发酵初 期( 0 1 6 h ) 的生产强度比野生型菌株置o x y t o c a 高4 4 7 ，发酵1 6 h 后，由于质粒不稳定，导 致置o x y t o c a ( p u d y p ) 的生产强度迅速降低。 用n t g 对cp a s t e u r i a n u m 进行诱变，然后经高浓度1 ，3 - p d 耐受和产酸少模型两轮筛选，得 到2 3 1 株突变体。发酵结果表明，没有获得1 ，3 - p d 高产突变株。 确定了肺炎克雷伯氏杆菌( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a ) m 5 3 的最优发酵工艺为：采用微供氧发酵 ( o 2v v i t l 的空气，转速为2 8 0r p m ) ，起始甘油和辅助底物蔗糖浓度分别为2 0g 1 - 1 和5g 1 - 1 。待 底物消耗到1g 1 1 时，开始流加补料，补料液中甘油一蔗糖质量比为1 0 1 。在此条件下，1 ，3 - p d 最高产出浓度达5 5 6 6 9 r 生产强度1 1 6 9 1 一h 一，摩尔转化率3 7 - 4 。 利用构建的乳酸缺失突变株m 5 3 ( 1 d h ) 进行发酵实验，结果表明，l ，3 - p d 的转化率并未增 加。 关键词：1 ，3 - 丙二醇；巴斯德梭菌( c f f r f d m mp a s t e u r i a n u m ) ；产酸克雷伯氏杆菌( 目e h f 括踟 o x y t o c a ) ：肺炎克雷伯氏杆菌( k l e b s i e l l a p n e u m o n i a ) ；b 酮硫解酶 a b s t r a c t l ，3 - p r o p a n e d i o l ( 1 ，3 - p d ) i sa l li m p r o t a n tc h e m i c a lm a t e r i a la n di t sb i o s y n t h e t i cm e t h o da r o u s e s o u rm o l ea n dm o r em t e l e s t s t h eo o n o a n l r a f i o n ，m o l a ry i e l da n dp r o d u c t i v i t yo f1 ，3 - p dw e l - o1 3g 1 - ， 2 2 6 a n do 3 6g r k h ，r e s p e c t i v e l y , i nt h ef e d - b a t c hc a p t u r ew i t hf e r m e n t a t i o no fg l y c e r o lb y c l o s t r i d i u mp a s t e u r i a n u m m e t a b o l i ca n a l y s i ss h o w e dt h a tn - b u m o l ( n 8 0 1w a s 出em a i nf e r m e n t a t i o n p r o d u c ta n dt h em e t a b o l i cf l u xo fi ，3 - p df o r m a t i o nw a sn o tp r e d o m i n a n t i no r d e rt od e c r e a s ey i e l d so f n - b u t a n o l ，t h eg e n eo ft h i o l a s e ( t h oe n c o d i n gt h ek e yg f l g y r f l ei nt h ef o r m a t i o no fn - b u t a n o lf i o mc p a t e u r i a n u m w a s c l o n e d b y t h e r m a la s y m m e t r i c i n t e r l a c e d ( t a i l ) p c i l h o w e v e r , t h e e g p c i j n i f n t o f t h i e x p r e s s i o ni n t e r f e r e db ya n t i s e n s er n am e t h o dw a sn o tp e r f o r m e db e c a u s et h ei n t r a n e l l u l a rs p c = c i a l r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ed i g e s t e dt h eh e t e r o g e n e o u sd n a t h ed h a b c ef r o mc l o s t r t d t u mp a s t e u r t a n u ma n dy q h df r o me s c h e r f c h i ac o i lk 1 2w o r ec l o n e d a n dc o - e x p r e s s i o ni nk l e b s i e l l ao x y t o c aw i i he x p r e s s i o np l a s m i d sp u d y p t h eo o n c e n t 蜘t f i o na n d m o l a ry i e l do fl ，3 - p di nf e d - b a t c hw a s5 2 9g 1 - 1a n d5 6 2 ，r e s p e c t i v e l y , d u r i n g 尼o x y t o c a 州m p u q y pf e d - f e r m e n t a t i o n c o m p a r e dw i t h 正o x y t o c aw i l dt y p c ，t h ep r o d u c t i v i t yo f1 ，3 - p dw a s i n c r e a s e d4 4 7 i n0 - 1 6ho f f e r m e n t a t i o n a f t e r1 6 ht h ep r o d u c t i v i t yw a sd e c r e a s e ds o o nd u et ot h e u n s t a b l a t i o no f p u q y p i nt h i s s t u d i e s 。u pt o2 3 0o fcp a s t e u r i a n u mm u t a n t sw e r ei s o l a t e df r o mt h ep a t e n tc p a s t e u r i a n u mw ta f t e rm u t a g e n e s i sw i t hn - m e t h y l - n - n i t r o s o g u a n i d i n e ( n t g la n dt w os e l e c t i v e p r o c e d u r e s ：h i g hc o n c e n t r a t i o n1 ，3 - p da n dt h ep r o t o ns u i c i d e ，a n a l y s e so ft h e i rp r o d u c t si na n a e r o b i c f e r m e n t a t i o nw e r es h o w nt h e r ew e r ef e ws t r a i n sw i t hh i g hy i e l d so f1 ，3 - p d m o r e o v e r , t h ef e r m e n t a t i o no f k l e b s i e l l a p n e u m o n i am 5 3w a ss t u d i e da n dt h ec o n c e n t r a t i o n ，m o l a r y i e l da n dp r o d u c t i v i t yo f1 ，3 - p dw e r eo b t a i n e d5 5 7g 1 - 1 ，3 7 4 a n d1 1 6g 1 - 1 h - 3 。r e s p e c t i v e l y , u n d e r m i c r o a e r o b i c ，f e d - b a t c ha n da d d i t i o no f s u c r o s ea sc o s u b s t r a t ec o n d i t i o n i no r d e rt of u r t h e ri n c r e a s et h em o l a ry i e l do fl ，3 一p d ，t h em u t a n tm 5 3 ( 1 d h 。) d e f i c i e n ti nl a c t a t e d e h y d r o g e n a s ew a sc o n s t r u c t e d h o w e v e r , t h eg r o w t ho f m 5 3 ( 1 d h ) w a sa f f e c t e da n dt h ef e r m e n t a t i o n w a ss t o p p e d k e y w o r d s ：1 ，3 - p r o p a n e d i o t ；c l o s t r f d i u m p a s t e u r i a n u m ；k l e b s i e l l ao x y t o c a ；k l e b s i e l l a p n e u m o n i a b t h i e l a s e i i 缩略词表 英文缩写英文全称中文全称 1 ，3 - p d p d o1 ，3 - p m p a e d i 0 11 3 - 丙二醇 2 ，3 - b d b d o2 ，3 - b u m n e d l o l2 ，3 - 丁二酵 3 - h p a 3 - h y d r o x y p r o p i o n a l d e h y d e 3 斑基丙醛 a c c o a a c e t y l - c o a乙酰辅酶a a c ea c e t a t e 乙酸 a d o c b l a d e a o s y l c o b a l a m i n5 - 脱氧腺苷钴氰素( 辅酶b 1 2 ) a 矿a m p i c i l l i n r e s i s t a n c e氨苄霉素抗性 b u t b u t y r a t e丁酸 c d wc e l ld r yw e i g l i t 细飕于重 c m r c h l o r a m p h m i c o lr e s i s t a n c e氯霉索抗性 d t t d i t h i o c r y t h r i t u l二硫苏糖醇 e d t ac a l l , h e d i a l n j r , e t c t l r a a c n i c a c i dd i s o d l m乙二胺四己酸二钠 e m r c r y t h r o m y c i ur e s i s t a n c e 红霉索抗性 e t he t h a n o l 乙醇 g 革兰氏阴性菌 g + 革兰氏阳性菌 g d h t g l y c e r o ld c h y d r a t a s e甘油脱水酶 k m t k a n a m y c i ni i s t a n c e 卡那霉素抗性 l a cl a c t a t e 乳酸 l d h l a c t a t ed e h y d r o g e n a s e 乳酸氧化还原酶( 脱氢酶) n a d h z n i c o t i n a m i d ea d e n i n e d i n u c l e o t i d o 还厍型辅酶l n b o n - b u t a n o l 丁醇 o d o p t i c a ld e n s i t y光密度 p d o r i ，3 - p r o p a e d i o l o x i d o r c d u c t a s e ( d c h y d r o g e n a s e )l ，3 - 丙二醇氧化还原酶( 脱氢酶) s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 s d s - p a g es d sp o l y a c y l a m i d cg e ld c c t r o p h o r e s i s s d s 寨丙烯酰胺凝胶电泳 s u c s u c c i n a t e 丁二酸( 琥珀酸) t c t e t r a c y c l i n er e s i s t a n c e 酗环索抗性 t e m e d n ，n ，n 。，n - t e t r a n l e t h y i c 【h y l e n e d i a m i n e n ，n ，n ，n 叫乙基乙二胺 t f i s n - t r i s ( h y d r o x y m c t h y l ) a m i t t o m e t h a n e n = 羟基甲基氯基叩烷 型唑 兰丝 i j i 独创性声明 y9 3 9 9 6 9 本人声明所里交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：多 1 乇 时间：i 。f 年月尹日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议1 研究生签名 导师签名： 孟划 蜘 时间：扫。年，月，尸日 时间：弘彤年月矿日 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 11 ，3 - 丙二醇( 1 ，3 - p d ) 的概况 1 , 1 11 ，3 - p d 的理化性质 1 ) 主要物理性质： 1 ，3 - 丙二醇是无色、无味、无臭的透明粘稠液体。具有吸湿性，可与水、醇和醚等互溶；难 溶于苯、四氯化碳、石油醚t 是一种可燃、低毒性的物质。其具体的物理性质如表1 1 。 表1 11 ，3 丙二醇的主要物理性质 分子式 c 3 h 8 0 2相对分子量 7 6 ，0 9 结构式hoch2ch2ch20h 沸点( 1 0 1 3 l 中a ) 2 1 4 。c 介电常数( 2 0 0 c ) 3 5 x l 矿 表面张力( o ) 4 7 4 3 10 - 3 n m 相对密度( 2 0 6 c 2 0 。c ) 1 0 5 5 4 蒸发热( b p ) 1 8 4 6 8k j m o l 折射率( 2 0 0 c ) 1 4 3 8 9 体积膨胀系数( 2 0 。c - 4 0 0 c ) o 6 1 1 0 3 熔点3 2 。c 2 )主要化学性质：既具有单醇的性质，又具有二醇的化学性质。 1 - 1 21 ，3 - p d 的用途 1 ，3 - p d 的应用领域与其它二元醇类似，主要用作合成聚酯和聚氮酯的单体以及溶剂、抗冻 剂或保护剂，也用做医药合成和有机合成的中间体等。 1 )聚酯纤维领域 1 ，3 - 丙二醇和对苯二甲酸或对苯二甲酸二甲酯反应生成对苯二甲酸丙二醇酯，再经缩聚生成 聚对苯二甲酸丙二醇酯( p t t ) ，最后经熔融纺丝而成聚酯纤维。p t t 纤维具有优异的弹性复性 和低温染色性能，目前p t t 产生技术掌握在壳牌和杜邦两家公司手中，商品名称分别为c o r o e m 与s o r o n a 。 2 )可降解性材料领域 1 ，3 - p d 可与己二酸、癸二酸缩聚，制成相应的聚酯薄膜。这种聚酪薄膜具有生物降解性， 埋在土壤中可在自然界的微生物作用f 逐步分解。 3 ) 涂装领域 以1 ，3 - p d 为原料合成的油漆，具有很好的弹性和硬度，用途广泛，比如可以用作蛇管外层 中田农业大学博士学位论文第一章文献缘述 詈摹皇曼曾暑皇曼詈量一i ll 量皇置皇詈曼曼蔓邕皇! ! ! 皇曼曼舅量皇曼兰量皇曼曼璺! 曼鼍詈皇墨曼皇曼鲁鼍量目曼置量皇目e 皇巴曼囊_ 涂料、罐头油漆和粉末喷涂等。其品质优良，目前只有价格昂贵的二醇类( 主要是1 6 己二醇) 才能与之相媲比。 4 ) 合成药物中间体领域 在药物合成领域， 1 ，3 - p d 己用于维生素h 的合成。近年l ，3 - p d 作为有机合成原料已越来 越受重视，比如1 ，3 - p d 经空气氧化可生成3 _ 羟基丙酸和丙二酸，与尿素反应可合成环状碳酸酯。 1 1 31 3 - p d 的合成工艺 l ，3 - p d 合成路线较多，下面根据其原料进行综述( 李吉春a n d 赵旭涛，2 0 0 4 ；崔小明，2 0 0 6 ) , n 乙烯法 这是以日本t o i j i n 公司为主体探讨乙烯反应合成l 。3 - p d 的技术路线。所用愿车车乙烯价廉易 得，且1 ，3 - p d 的收辜较高，只是此反应的化学过程较为复杂。 丙烯醛合成法 德国d e g u s s a 公司发明了以丙烯醛为原料产生1 。3 - p d 的工业化技术，其产生路线如下； q 如o 蝎 c t c t t c t c h 毛c h c h o h 0 喁c 屿c h 0 h o c n , c n 2 c 地o a 在该产生路线中，产品的收率取决于丙烯醛的水合反应，而最终产品的质量则由3 兹基丙醛 的加氢效果来决定。 3 1 环氧乙烷合成法( e o 法) s h e l l 公司采用环氧乙烷路线大规模产生l ，3 - p d ，其反应路线如下： c o + 喝 埯 岛h 1 0 _ h o c n , c t c h o _ h o c n , c h , c h , o h 此工艺的特点是技术难度大，设备投资高，但产品的质量和成本有竞争力。该方法工程化方 面存在的困难是：( 1 ) 选择和改进高效催化剂；( 2 ) 反应压力较高，氢甲酰化反应压力在1 5 m p a 左右，反应器结构相当复杂。 4 )1 3 二氯丙烯加氢法 1 、3 - 二氯丙烯加氢法台成路线如下： 坞心0 c i c h c h c h a c l c l c 地o h c h 2 c 1 h o c h 2 c h 2 c h 2 0 h 这个合成路线简单，但选样性不高，而且伴随有氢解反应，专一性不强。为了最人降低氢解 的影响，可以先刚保护基团取代比较活泼的烯丙基氯( 如先制备醋酸氯丙烯酯) ，然后再加氢， 最j l 舌除去保护基团( 崔宝军a n d 李猛，2 0 0 5 ) 。 2 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 鼍曹皇量薯墨皇皇量墨基鲁詈皇曾| 舅| 罾量量曼蔓量曼曼蔓皇曼皇曼量量皇曼曼皇皇蔓鼍兰蔓皇鼍鼍岂皇舞la l , a i i l 5 )甲醛乙醛缩合法 最近印度申请了以甲醛为原料制各1 ，3 - p d 的专利。该方法是用k o h 作催化剂将甲醛和乙醛 缩合成3 羟基丙醛，再用离子交换树腊脱除k o h 后用异丙醇铝将3 羟基丙醛还原成l ，3 - p d 。 其化学路线如下： 屿 h c h o + c h ；c h o - - h o c h 2 c 玛c h o + h o c h 2 c h 2 c h a o h 该方法具有原料易得、价格低廉的优点，从分子角度来说该方法也是一种非常经济的技术路 线。但此反应的选择性较差，特别是如何将均相碱性催化剂从反应体系中分离而不影响3 羟基丙 醛( 3 - h 队) 的收率还有持进一步解决。 6 )甘油法：分甘油微生物发酵法和甘油化学法。 甘油微生物发酵法 甘油微生物发酵法是一种以补料分批发酵的方式，将工业甘油在微生物作用下转化为l ，3 - p d 的方法。后面将对此做详细的综述。 甘油化学法 即姓甘油为原料通过化学反应制各1 。3 - p d 。c e l a n e s e 公司采用r h - w 催化剂，在2 0 0 由 甘油和合成气反应制备1 ，3 - p d ，其副产物是1 2 - 1 ，3 - p d 和丙醇。d e g u s s a 公司采用以三氧化二 铝为载体的磷酸催化剂，3 0 0 将甘油转化成丙烯醛( 7 0 5 ) 和羟基丙酮( 1 0 ) 。然后丙烯醛 再进行水台制取3 - h p a ，最后3 - h p a 通过加氢制得1 ，3 - 1 ，3 - p d ( 6 0 ) 和l ，2 1 ，3 - p d ( 1 0 ) 。这 种方法以甘油为原料，因此并不是化学产生1 ，3 - 1 ，3 - p d 的好方法。 7 ) 淀粉法 也是一种利用生物技术产生l ，3 - p d 的方法，是杜邦公司与g e f t e r r ：o r 公司合作开发的一种产 生l ，3 - p d 的生物技术。他们利用微生物将葡萄耱( 来自谷物淀粉，如玉米淀粉) 转化为1 3 - p d ， 目前已申请了多项专利，2 0 0 0 年建成了1 8k t a 中试装置，预计2 0 0 8 年实现工业化。化学系统 公司认为，实现生物法产生l ，3 - p d 将是生物技术发展中的一个里程碑。 在上述的各种产生方法中，以生物技术制取l ，3 一丙二醇，不但产生成本低廉，而且还具有化 学合成技术不可比拟的优点，即环境污染小、资源可再生利用，专一性好，产品易分离纯化。因 此，采h 生物技术制取l ，3 - p d 的开发与研究在国际上越来越受到关注。 目前r 我国已有+ 些单位进行了l ，3 - p d 合成的小试研究。比如，黑龙江石化研究院开发出 从丙烯醛开始合成l ，3 - p d 的小试t 艺；上海石油化工研究院研究环氧乙烷路线：浙江大学的阳 永荣教授研究l ，3 氯丙烯法；研究利_ i i 生物技术产生l ，3 一p d 的有大连理工大学生物化工研究 所、华南大学、沈阳农业大学、中国农业大学和清华大学等多家单位。国内并没有实现大规模工 业化产生，工业化的报道仅限于山东邹平铭波化工有限公司于2 0 0 2 年3 月底开发成功工业产生 1 ，3 - 丙- - - 醇的技术。但是其产生成本较高，产量小，产品主要供于药物中间体而无法应用于f 订领 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 域。 因此，虽然我们在l ，3 - p d 的产生开发上傲了一些工作，但是整体研究尚处于起步阶段。特 别是在化工合成方面和国外相比差距明显。要在较短的时间内赶上或超过国外水平，抓住l r i t 行业所带来的锲机，我们必须着眼于l ，3 - p d 产生的新技术生物技术。生物技术产生l 。3 - p d ， 利用可再生资源，环境污染小代表着传统化工工业转变的方向( 即转向“绿色化工”) 。而且我国 微生物资源丰富，研究手段和国外较为接近。只有在这方面加大开发力度，才能形成具有自主知 识产权的产生技术，参与国际竞争，改变现在1 ，3 - p d 供应状况。 1 2 微生物发酵法产生1 ，3 - 丙二醇的研究进展 1 2 1 产生1 。3 - p d 的微生物 1 ，3 - 丙二醇是一种古老的发酵产品a u g u s tf t m d 在1 8 8 1 年首次在舍有c i o s t r 雠u m p a s t e u a n u m 的发酵产物中发现了l ，3 丙= 醇。随后在1 9 1 4 年，v o i s e n e t 报道在能使白酒变坏的 细菌发酵产物中也发现产生了这种物质，但未能分离出相应的微生物。d e l f t 微生物研究学院的 m i c k e l s o n 和w e r k a n m 分别在1 9 2 8 年和1 9 4 0 年对肠道菌产生的l ，3 - 丙二醇进行了定量分析( b i e b l e ta 1 。1 9 9 9 ) 。二十世纪六十年代，研究者的注意力转向甘油代谢的有关酶类，特别是甘油脱水酶 发现此酶为b 1 2 依赖型酶( p o z n a r s k a i ae ta 1 ，1 9 7 2 ；y a k u s h e v ae ta 1 ，1 9 7 4 ) 。1 9 8 3 年第一次报道利用 梭菌发酵生产1 ，3 - 丙二醇( f o r s b e r g ，1 9 8 7 ) 。 到目前为止，发现能将甘油转化为1 。3 - p d 的主要微生物是：k l e b s i e l l ap n e u m o n i a ， e n t e r o b a c t e ra g g l o m e r a n s ，c i t r o b a c t e r f m u n d i i ，l a c t o b a c i l l i 纯b r e v i sa n d l b u n c h n e r d 和c l o s t r i d i a ( cb u t y n c u ma n dcp a s t e u r i a n u m ) ( f o r a g ea n df o s t e r , 1 9 8 2 ；f 0 r s b e r g ，1 9 8 7 ；o p p e n b e r ga n ds e h i n k ， 1 9 9 0 ；t a l a r i c oe c a l ，1 9 9 0 ；d a b r o c k e t a l ，1 9 9 2 ；b a r b i r a t oe ta 1 ，1 9 9 6 b ) 。表1 2 列出了这几种细茁转 化甘油的实验结果，其中肺炎杆菌( k l e b s i e l l a p n e w n o n i a ) 和丁酸梭菌( c l o s t r i d i u nb u t y r c u m ) 具有较高的转化率和l ，3 - p d 产生能力，因此受到更多的地关注。 4 表1 2 产生1 3 - p d 帕种 t a b l e1 2l ，3 - p r o p a n e d l o lf i n a lc o n c e n t r a t i o n s , y l e l d sa n dv o l u m e t r i cp r o d n c t l v i t l e so f d i f f e r e n ts t r a i n sa n d m u t a n t si nb - i c ha n dh 妇妯c u l t u r e c cb u t y r c u m b6 ，2 b f b 3 5 6 5 c 触n 甜 cd i 0 1 fb5 6 f b7 0 3 正o x y t o c a f b 8 2 m 5 a l 尼p n e u m o n i a b 5 7 7 f b7 3 3 0 5 6 0 4 8 2 4 1 5 乙酸和丁醇( b i e b l ，2 0 0 1 ) 乙酸和丁酸 s a i n t - a m a h se la 1 1 9 9 4 乙酸和丁酸 乙酸和丁酸 己酸和丁酸 乙酸和2 ，3 丁二醇 乙酸、乙醇 和乳酸 乙酸和乳酸 ( 璜西la n ds p r o a , 2 0 0 2 ) 抽蛐d - a 删吲畦“， 1 9 9 5 1 李季伦( 未发表) ( o p p e n b e r ga n ds c h i n k ， 1 9 9 0 ) ( b i e b le ta 1 ，1 9 9 8 ) 墨! 竺! 型竺壁! ：! ：! ! ：墼圣塑塑圣壁! ! ! ! ! ! 坚! ! ! ! + b 批式发酵f b 朴料批式发酵c b 连续发酵 1 2 2i ，3 - p d 的生物合成过程 1 ，3 - 丙二醇是甘油发酵的产物，在以其他有机物为底物进行的发酵产物中没有发现。通过分 析表明，甘油发酵的一部分产物和糖发酵的产物相同。这些产物提供菌体生长的能量。在以底物 水平磷酸化生成这些产物的同时产生了许多还原力。还原力能将甘油还原为l ，3 丙二醇，本身被 氧化。但是乳杆菌产生l ，3 - p d 的途径比较特殊，只有一个还原途径，需要另外添加发酵底物以 提供能量和还原力( t a l a r i c oe ta 1 ，1 9 9 0 ；v c i g ad ac u n h aa n df o s t e r , 1 9 9 2 ) 。 图1 ，l 所示的是甘油发酵生化途径。从甘油到丙酮酸的途径在产生l ，3 - p d 的生物体内都是 相同的。甘油脱氢生成二羟基丙酮，二羟基丙酮再经磷酸化，然后转变成为丙酮酸。：羟基丙酮 以厉的糖酵解途径包括一个脱氢反应和两个a t p 形成反应。甘油还原包括甘油脱水成3 一羟基丙 醛的消除反应羊| 【将醛还原为l ，3 - 丙二醇的加氢反应( b i e b le ta l ，1 9 9 9 ) 。 5 嘧 嘶 ” ! 耋 呦 嗽呲 中田农业大学博士学位论文 第一章文献综述 i 3 一丙二薛 黑广 三l 。乙稳珀馥 i a d t , u a x 嚆卜a t p 乳j 辫障n：汇常r 吣占尸 。燮。= 嘲，- 箱羟t - 1 l t q 羟t - 2 l t q ：萋飞带酸p 乙3 磐 毫。罄ff 丁醇丁酸乙馥乙薛2 ，3 - t - - w 圉i i 甘油厌氧代谢途径 f i g 1 。lt h e a n a e r o b i cm e t a b o l i cw a yo f g l y c e r o l 在不同生物体内，丙酮酸去路是不一样的。在肠细菌中。丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶裂解为 乙酰辅酶a 和甲酸。从乙酰辅酶a 开始，经磷酸乙酰辅酶a ，形成乙酸，产生 砰。同时也可 形成乙醇，乙醇是经消耗两个n a d h z ，将中间产物乙醛还原而成。甲酸通常由甲酸裂解酶裂解 生成氢气和二氧化碳。在糖发酵中，丙酮酸可以形成乙酰乳酸，进一步经3 掘基丁酮，形成2 ， 3 丁二醇。另外，乳酸( 丙酮酸的一个还原产物) 和琥珀酸( 由磷酸烯醇式丙酮酸形成) 也可出 现在肠细菌的发酵产物中。 cb u t y r i c u m 和与之相关的细菌，形成1 ，3 - 丙二醇时还形成丁酸。丁酸由两分子的乙酰辅酶 a 缩合而成，包括氧化两个n a d h 2 和形成个a t p 的步骤。而且c t m o * d c u m 也产生少量的乙 醇。cp a s t e u r i a n u m 还另外形成丁酵，在某些情况r 丁醇可成为主要发酵产物( d a b r o c ke ta 1 ， 1 9 9 2 ) 。 1 2 3 合成1 ，3 - p d 的关键酶 合成1 ，3 - p d 的关键酶有两个，分别是甘油脱水酶( g d h t ) 和1 ，3 一丙二醇脱氢酶( 也称作 1 ，3 一丙二醇氧化还原酶，p d o r ) a 另外，甘油氧化途径中的甘油脱氢酶( g d h ) 与1 ，3 - p d 形成 也有很大关系，它影响着甘油转化为i ，3 - p d 的转化率。 6 嘉 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 甘油脱水酶( g d h t ) ，1 3 - p d 脱氢酶( p d o r ) 和甘油脱氢酶( g d h ) 活性在产生1 ，3 - p d 的不同生物体内差别很大。如表1 3 所总结，c p a s t e u r i a n u m 中g d h t 和p d o r 的比活最高，而 产生中用到两个菌c 3 u t y r 缸u m 和置p n e u m o n i a 中两个酶的比活较低。 袭1 3 不同生钧体内甘油脱水酶( g d h t ) ，1 。3 - p d 脱氢酶( p d o r ) 和甘油脱氢酶( g d h ) 比活性 t a b l e1 3c o m p a r i s o nw i t ha c t i v i t i e so f g l y c e r o ld e h y d r a t a s e , 1 ，3 - p r o p a n e d | o ld e h y d r e g e n a s ea n dg l y c e r o l d e h y d r e g e n a s ei nd i f f e r e n to r g a n i s m 。 塑登堕塑l 坐竺! 要! 竺蔓! 巴塑虫 甘油脱氢酶 2 羟基丙酮激酶甘油脱水酶1 ，3 - 丙二醇脱氯酶参考文献 c p a s t e u r i a n u m 4 5 c f r e n 出4 3 c 矗i 毋积“0 2 6 0 ，1 0 0 0 9 o 0 9 2 2 2 1 1 0 4 2 1 7 0 9 o 5 6 5 ( l e n s 味a 1 1 9 9 7 ) ( s a i n t - a m e m e t a l ，2 0 0 i ) 置p n e u m o n i a 约5 61 5 4约0 6约2 2( 1 9 9 5 ) 分离纯化三个关键酶的研究也有很多报道。特别是g d h t ( 甘油脱水酶) ，t t o r a y a ( 2 0 0 0 ， 2 0 0 3 ，2 0 0 4 ) 对它的晶体结构进行了x 衍射分析，并结合化学计量和密度泛焓理论，提出了g d h t 可能的催化机制。 l 、甘油脱氢酶( g d h ) 甘油脱氢酶( e c1 1 1 6 ) 已经从a e r o b a c t e ra e r o g e n e ，ka e r o g e n e s ( r u e he ta 1 ，1 9 8 0 ) ，c f r e u n d i i ( d a n ne ta 1 ，t 9 9 5 ) ，b a c i l l u sm e g a t e r i u m ( m 嘶a n dt o r a y a ，1 9 9 9 ) b t e a r o t h e r m o p h i l u s ， s c h i z o a c c h a r o m y c e sp o m b e ，c e l l u t o m o n a ss p n t 3 0 6 0 和ec o l i ( o s h i oe ta 1 ，1 9 8 2 ) 中得到纯化。 现在己经分离纯化的甘油脱氢酶有两种，一种是依赖于辅酶n a d p * ，另一种是依赖于n a d + 。除 此之外另一种不依赖辅酶的膜结合蛋白也已经被发现( j o h n s o ne ta 1 ，1 9 8 5 ) 。还有一些微生物产生 甘油脱氢酶的同功酶，如在足p n e u m o n i a e 中发现了两种甘油脱氢酶定名为g d h t 的是甘油代 谢关键酶，而对定名为g d h h 的认识尚不充分。 2 )1 ，3 - 丙二醇氧化酶( p d o r ) l ，3 丙二醇氧化酶( e c1 1 1 2 0 2 ) 催化3 羟基丙醛还原形成1 ，3 - p d ，正p n e u m o n i a e ( j o h n s o n a n du n ，1 9 8 7 ) ，l a c tb u c h n e r i 和l a c t b r e v i s ( v e i g a - d a - c u n t t aa n df o s t e r , 1 9 9 2 ) 、l a c t r e u t e r i ( t o d d l ，1 9 9 0 ) 和c f r e u n d i i ( d a n i e la n dg o t t s c h a l k ，1 9 9 2 ) 中的p d o r 已经得到纯化。lr e u t e r i 中此酶 的分f 餐约为3 5 0 ，0 0 0d a ，基分子餐从4 1 0 0 0d a 到4 6 ，0 0 0d a 不等。c # e u n d i i 中此酶的 性质与世p n e u m o n i a e ，lb r e v i s 羊l 咀b u c h n e r i 的相似。编码该酶的基因测序已经完成，并在eo “ 中得以诱导表达。cb u t y r i c u m 中全酶分子量为3 8 4 ，0 0 0 d a ，含有8 个分子量为4 8 ，7 5 0d a 的 砸基。五p n e u m o n i a 中该酶n 端氮基酸残基序列和cf r e u n d i i 有8 3 的相似性，而与c p a s t e u t i a n u m 的有7 8 的相似性。 7 中国农业大学博士学位论文第一章文献塔述 3 ) 甘油脱水酶 甘油脱水酶( g d h t ) 的生理作用是将甘油转化为电子受体3 堀基丙醛，使茁体能够在厌氧 条件下不需要外源电子受体就艟够生长。根据甘油脱水酶和维生素b 1 2 的关系将其分为两类，即 b 1 2 依戟型和非b i 2 依籁型。依赖维生素如的甘油脱水醇( e c 4 2 1 3 0 ) 存在于c i t r a o b a c t e r s p ， p r o p i o n i b a c t e r i u m f r e u n d e n r p i c h i i ( d a n i da n dg o t t s c h a l k ，1 9 9 2 ) ，k l e b s i e l l as p ( p o z n a n s k a i ae ta 1 ， 1 9 7 2 ) ，l a c t o b a c i l l u s2 0 8 - a ( s a u v a g e o te ta 1 ，2 0 0 2 ) ，s a l m o n e l l a ( b o b i ke ta 1 ，1 9 9 7 ) 和e n t e r o b a c t e r ( t o r a y ae t8 1 ，1 9 7 6 ) 中。其性质研究的较为详细。cb u t y r i c u m 的g d h t 直到2 0 0 4 年才被表达纯 化，发现这个甘油脱水酶不依赖于b 1 2 同年对此非b 1 2 依赖型甘油脱水酶做了x - r a y 分析 ( r a y n a u de ta l 。2 0 0 3 ) 。 a 依籁维生素b 1 2 ( a d o c b l ) 的二醇脱水酶 纯化的j i = o x y t o e a = 醇脱水酶分子量约1 9 0 ，0 0 0 d a ，利用2 2 - ar e s o l u t i o n 的x 衙射对 g d h t - c n - c b l - l ，3 - p d 晶体分析表明，二醇脱水酶是一个异质的二聚体，三个单体为勘p 和t ( t o r a y a ，2 0 0 3 ) 。 a 亚基中间区域形成空穴，催化活性位点位于其中。k + 结合于空穴内部的负电荷上，而 e o b a l a m i n 覆盖于空穴口上，隔开了活性位点。k + 背后的空穴被长链和氨基酸残基填充( t o r a y a , 2 0 0 0 ) 。 e 亚基的p - 8 b a r r e l 有两个狭缝，由p - 3 和1