（微生物学专业论文）血红密孔菌漆酶的纯化及其基因在毕赤酵母中的表达.pdf

摘要 漆酶( e c1 1 0 3 2 ) 是一种含铜的多酚氧化酶，广泛分布于植物，真菌和细菌中。 漆酶能催化降解许多有机和无机底物，在工业应用和生物修复等方面具有广泛的用途。 血红密孔菌是担子菌纲、多孔菌科的一种白腐真菌，能组成型地分泌胞外漆酶。本文主 要研究血红密孔菌胞外漆酶的纯化及其漆酶基因在毕赤酵母中的表达。 通过超滤，d e a e s e p h a r o s ef f 离子交换层析和s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤等纯化技 术对血红密孔菌胞外漆酶进行了纯化，最终纯化倍数为3 6 1 ，总活力回收率为 3 6 5 3 。纯酶的分子量为6 1 4k d a ，在6 0 0n l n 处缺少典型的吸收峰，n 端氨基酸序列 与朱红密孔菌漆酶的n 端氨基酸序列完全一致，与其它木腐真菌产生的漆酶也有较高的 相似性。以a b t s 作为底物时血红密孔菌纯化后的漆酶的最适p h 为3 o ，在p h 2 6 4 2 之间维持较高的酶活，超过p h 4 6 漆酶活性急剧下降；纯酶最适反应温度为6 5 ，在 2 5 时在p h 2 o 5 0 的缓冲液中保温1h 较稳定，在最适p h 下纯酶在4 0 以下较稳 定，超过5 0 酶活下降较快。 纯化后的漆酶能氧化不同的漆酶底物，包括a b t s ，s y r i n g a l d a z i n e 和2 , 6 d i m e t h o x y p h e n o l 。a b t s 的米氏常数最小( o 0 7 7m m o i l ) ，纯酶对a b t s 的催化效率 最高，其它依次为s y r i n g a l d a z i n e 和2 , 6 d i m e t h o x y p h e n o l 。几种漆酶的抑制剂中0 1 m m o l l 的n a n 3 和1m m o l l 半胱氨酸和二硫疏糖醇对漆酶活力有强烈的抑制，而金属 离子螯合剂e d t a 对漆酶活力的抑制程度较低。 染料降解实验发现血红密孔菌纯化后的漆酶对r b b r 的降解不需要小分子介体物质 的参与且降解效果要好于其它白腐真菌来源的漆酶，在5u m l 的酶活下只需1 0m i n 就 可降解9 0 左右的蒽醌染料r b b r 。显示了血红密孔菌及其所产的漆酶在染料降解的应 用上具有很强的工业应用潜力。 采用r t - p c r 扩增得到了漆酶的c d n a 序列，胶回收纯化后将其克隆到t 载体上， 测序结果显示克隆到的序列与血红密孔菌漆酶基因的原始序列相比有所不同，导致了产 物中有三个氨基酸序列发生改变。目的基因与表达载体p p i c z b 相连接构建重组质粒 p p i c z b i a c ：后通过l i c i 法转化p i c h i ap a s t o r i ss m d l l 6 8 h ，重组菌利用z e o c i n 抗性平板 筛选，采用菌落p c r 进一步验证重组质粒已经插入到酵母基因组中。 、 重组菌在b m m y 诱导培养基中实现了目的漆酶基因的分泌表达，菌体的密度随着 培养时间的延长逐渐增加，但上清重组漆酶的活性在培养7 2h 后没有太大变化，最高漆 酶活性达到1 0 9u l 。重组漆酶的表达活性较低可能与信号肽的选用，酵母密码子的偏 好性和培养条件等因素有关。 关键词血红密孔菌；漆酶；纯化；毕赤酵母；异源表达 a b s t r a c t l a c c a s e ( e c1 1 0 叫32b e n z e n e d i o l ：o x y g e no x i d o r e d u c t a s e ) i sam u l t i c o p p e ro x i d a s e w i d e l yd i s t r i b u t e da m o n gp l a n t s ，f u n g ia n db a c t e r i a i tc a t a l y z e st h eo x i d a t i o no f ab r o a dr a n g e o fo r g a n i ca n di n o r g a n i cs u b s t r a t e s ，a n dh a sb e e nw i d e l yu s e di ni n d u s t r ya n db i o r e m e d i a t i o n p y c n o p o r u ss a n g u i n e u si sas a p r o p h y t i cf u n g u sb e l o n g i n gt ot h eb a s i d i o m y c e t e so ft h ef a m i l y p o l y p o r a c e a e ，i tc a l ls e c r e tl a c c a s ec o n s t i t u t i v e l y i nt h i sp a p e r , l a c c a s ef r o mp y c n o p o r u s s a n g u i n e u sw a sp u r i f i e da n dt h el a c c a s eg e n ew a se x p r e s s e di np i c h i ap a s t o r i s l a c e a s ef r o mp y c n o p o r u ss a n g u i n e u sw a sp u r i f i e du s i n gu l t r a f i l t r a t i o n ，a n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h ya n dg e lf i l t r a t i o n t h ep u r i f i c a t i o nf o l dw a s 3 6 1a n dr e c o v e r yo ft o t a ll a e c a s e a c t i v i t yw a s3 6 5 3 t h em o l e c u l a rm a s s o ft h ee n z y m ew a s6 1 4k d aa sd e t e r m i n e db ys d s p a g e t h ea b s o r p t i o ns p e c t r u mo ft h ep u r i f i e dp r o t e i nd i dn o ts h o wa b s o r b a n c ep e a j ( a t a r o u n d6 0 0i n n ，t y p i c a lf o rat y p e 1c o p p e rs i g n a lo fb l u ei a c c a s e s t h en - t e r m i n a ls e q u e n c eo f t h ep s a n g u i n e u sl a c c a s ew a si d e n t i c a lw i t hl a c c a s ef r o m 只c i n n a b a r i n u sa n dah i g hs i m i l a r i t y t oo t h e rl a c c a s e sf r o mw o o d d e g r a d i n gf u n g i t h ep h p r o f i l ef o rl a c c a s ea c t i v i t ya g a i n s ta b t s s h o w e dad e a l 【o fm a x i m u ma c t i v i t ya tp h3 0 t h ee n z y m ew a ss t a b l ea t2 5 0 cf o r1hi nt h e p hr a n g ef r o m2 0t o5 0 t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r eo ft h ep u r i f i e de n z y m ew a so b s e r v e da t 6 5 。( 、t h e r ew a sl i t t l el o s so fa c t i v i t y d u r i n gp r e i n c u b a t i o no ft h ee n z y m ef o r1 ha t t e m p e r a t u r eu pt o4 0 c ，b u tt h ea c t i v i t yd e c r e a s e dr a p i d l yb e y o n d5 0 。c t h ep u r i f i e dl a e c a s es h o w e da c t i v i t ya g a i n s tv a r i o u ss u b s t r a t e s ，i n c l u d i n g2 ，2 - a z i n o b i s 0 一e t h y l b e n z o t h i a z o l i n e - 6 一s u l f o n a t e ) ，2 ，6 - d i m e t h o x y p h e n o la n ds y r i n g a l d a z i n e t h el o w e s tk i n v a l u em 0 7 7m m o l l ) w a sf o u n df u ra b t s t h eh i g h e s tc a t a l y t i ce f f i c i e n c yw a sa l s oo b t a i n e d o na b t s ，f o l l o w e db ys y r i n g a l d a z i n ea n d2 ，6 - d i m e t h o x y p h e n 0 1 t h ep u r i f i e de n z y m ew a s s t r o n g l yi n h i b i t e db y0 1r o m e i ls o d i u ma z i d e ，1m m o l ll - c y s t e i n ea n dd t r , w h e r e a st h e m e t a li o nc h e l a t o re d t as h o w e do n l yas l i g h ti n h i b i t o r ye f f e c t i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h ep u r i f i e di a c c a s ef r o m 只s a n g u i n e u sw a sa b l et od e c o l o r i z er b b r e f f i c i e n t l yi nt h ea b s e n c eo fa n yr e d o xm e d i a t o r s ，i tw a sa b l et od e c o l o r i z ea b o u t9 0 o f r b b ri no n l y1 0m i nw i t ha ne n z y m ea c t i v i t yo f5u m l t h ed e c o l o r i z a t i o na b i l i t yo f 只 s a n g u i n e u sl a c c a s ed e m o n s t r a t e di t sp o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nd y ed e c o l o r i z a t i o n ae d n a e n c o d i n gf u rl a c o a s eg e n ew a si s o l a t e da n da m p l i f i e df r o m 只s a n g u i n e u sb yr t - p c r t h ee d n aw a sc l o n e di n t op m d l 8 - ts i m p l ev e c t o ra n ds e q u e n c e d ，t h er e s u l ts h o w e d t h a tt h r e en u c l e o t i d e si nt h el a c e a s ee d n aw e r en o tc o n s i s t e n tw i t ht h ef o r m e rl a c c a s eg e n e ， t h i sc h a n g er e s u l t e di nt h r e ed i s c r e p a n c i e si nd e d u c e da m i n oa c i d ss e q u e n c e l a c c a s ee d n a w a sc l o n e di n t ot h ev e c t o rp p i c z bt oc o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp p i c z b i a c p i c h i ap a s t o r i ss m d l l 6 8 hw a st h e nt r a n s f o r m e dw i t hp p i c z b i a cb yl i c i t h es e l e c t i o no f t r a n s f o r m a n t sw a sc a r r i e do u to ny p dp l a t e sc o n t a i n i n gz e o c i n , t r a n s f o r m a n t sw e f gf u r t h e r i d e n t i f i e db yc o l o n yp c r t r a n s f o r m a n t sw e r ec u l t u ，r e di nb m m ym e d i u mu n d e ri n d u c i n gc o n d i t i o n st oe x p r e s s l a c c u s eg e n e t h ec e l l d e n s i t yi n c r e a s e dg r a d u a l l yw h i l el a c e a s ea c t i v i t yf r o mt h ec u l t u r e s u p e m a t a n tc h a n g e dh a l ea f t e r7 2h o u r sc u l t i v a t i o n , a n dt h em a x i m u ml a c c a s ea c t i v i t yw a s 1 0 9u lt h el o wa c t i v i t yo fr e c o m b i n a n tl a c c a s em i g h th a v es o m e t h i n gt od ow i t ht h e s e l e c t i o no f s i g n a ls e q u e n c e ，c o d o nb i a si np i c h i ap a s t o r i sa n dt h ec h o i c eo fc u l t u r ec o n d i t i o n s k e y w o r d sl , c n o p o r u ss a n g u i n e u s ；l a c e a s e ；p u r i f i c a t i o n ；p i c h i ap a s t o r i s ；h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n n i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得壅i 垦盐些盘鲎或其他教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：卢磊签字日期：动町年d z 月2 , o 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘i 垦盎些盘堂有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权壅i 垦盎些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：卢磊导师签名： 签字日期：加年p 6 y t 如日签字日期：伽7 年衫月z , u f t 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 1 绪论 1 绪论 1 1 引言 漆酶( 苯二醇：氧氧化还原酶，e c1 1 0 3 2 ) 是一种含铜的多酚氧化酶，和植物中的 抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白属铜蓝氧化酶家族中的同一小族，在结构和 功能上存在着许多相似之处l i j 。漆酶最早发现于存在日本漆树( r h u sv e r n i c i f e r a ) 中， 它可氧化漆酚形成高聚物使汁液固化，保护伤口免受真菌和昆虫的侵染【”。漆酶主要分 布在植物和真菌中，在昆虫和细菌中也发现有漆酶的存在【2 1 。 漆酶自被发现以来一直是生物学，化学和环境科学等领域十分活跃的研究热点。漆 酶催化氧化的底物十分广泛，包括双酚，多酚，二胺，芳香胺和抗坏血酸等，在一些小 分子氧化还原介质的协同作用下，漆酶作用的底物范围可进一步扩大【。因此漆酶在纸 浆漂白，废水处理，生物修复等方面显示出较大的研究价值和应用潜力。目前，很多不 同来源的漆酶得到了分离纯化并进行了相关的生化性质研究，加深了人们对漆酶结构， 催化特性等方面的认识。随着分子生物学等技术的发展，漆酶基因已经从不同菌种中克 隆出来，通过研究漆酶编码基因即漆酶基因的表达调控机制有助于人们分离新的漆酶基 因及实现漆酶基因的异源高效表达和大规模工业化生产1 3 l 。本文主要研究血红密孔菌漆 酶的纯化及其基因在毕赤酵母中的异源表达。 1 2 漆酶的理化性质 漆酶是一种铜蛋白，一般以单蛋白体的形式存在。不同来源的漆酶蛋白质表观分子 量有很大差异，从5 9 3 9 0k d a 不等，不同的漆酶具有不同程度的糖基化，糖基化程度 在1 0 8 0 之间例。一部分菌株产生的漆酶有数种同工酶组成，都是单体酶，漆酶的适 宜反应温度较低，一般在酸性p h 下具有较高的催化效率，具有广泛的底物专一性n 典型的漆酶分子中一般含有4 个铜离子，这4 个铜离子位于漆酶的活性部位，在氧 化反应中起决定作用l l 】。这4 个铜离子根据光谱和磁性特征可分为三种类型：一个i 型 c u 2 + 和氨基酸残基结合成单核中心，它使漆酶表现为明显的蓝色且在6 0 0n m 处有吸收 峰。一个型c u “和两个型q ，构成三核中心，两个m 型c u 4 + 偶连于一个羟基桥 形成双核，这种结构引起了电子顺磁共振效应的消失。型c u 2 + 在可见光区只有微弱的 吸收，具有电子顺磁共振效应1 4 j 。 根据对漆酶光谱学，动力学和晶体衍射的研究，漆酶催化不同类型底物氧化反应机 理主要表现在底物自由基的生成和漆酶分子中4 个铜离子的协同作用。底物结合于酶活 性中心的i 型c u 2 + 位点，通过h i s c y s h i s 途径将电子传递给三核位点，该位点进一步 把电子传递给结合到活性中心的第二底物氧分子，使之还原成水1 4 】。整个反应需要连续 的单电子氧化作用来满足漆酶的充分还原，还原态的酶分子再通过四电子转移传递给分 东北林业大学硬士学位论文 子氧。在此过程中，氧还原很可能分两步进行，两个电子转移产生过氧化氢中间体，该 中间体在另两个单电子作用下被还原为水【3 。 1 3 漆酶的应用 1 3 1 造纸工业中的应用 漆酶在应用研究中的一个潜在的方面是纸浆的生物漂白。在降解纸浆中木素的真菌 酶系中，漆酶、木素过氧化物酶和锰过氧化物酶是起主要作用的三种酶，漆酶能够脱甲 基和部分溶解纸浆中的木素【卯。从脱木素效果来看，虽然木素过氧化物酶稍好一些，但 是漆酶有其自身的优点：漆酶更稳定，固定化后能更有效的发挥作用；不需要过氧化 氢的参与；有些漆酶可以组成型产生，且表达量较高。 1 3 2 生物合成方面的应用 研究表明，漆酶在真菌色素合成中扮演重要的角色，并且可能参与菌索的形成，它 也能在细胞间催化酚类化合物的聚合粘连来固定菌丝。人们已经利用漆酶的这种粘合功 能进行化工行业的开发研究1 6 l 。在酶的催化作用下，用漆酶和木素过氧化物酶氧化木素 可以提高纤维板原料中木素与纤维之间的连接能力，用制浆废水中的木素为原料可以生 产木屑板等产品1 7 。虽然尚未达到大规模生产，但是能有效除去制浆废水中的木素，对 水净化的好处是显而易见的。 1 3 3 食品工业中的应用 1 3 3 1 在饮料中的应用 果汁、果酒和啤酒的色泽和透明度是它们成品质量的重要指标。这些饮料在贮存期 间由于一些酚类化合物的存在会发生氧化反应，引起混浊或色泽的变化，从而影响它们 的品质。漆酶可氧化多酚类物质生成多酚类氧化物，多酚类氧化物可自身聚合形成可被 滤膜截流的大颗粒，用于提高这些饮料的稳定性1 8 】。 1 3 3 2 生产食用菌 漆酶是参与木质素降解的主要酶之一，对多种食用菌生长过程中的胞外酶活性迸行 研究表明，漆酶转录水平和活性在菌丝生长阶段是最高的。因此在食用菌制种过程中加 入漆酶制剂能加速木质素的分解，为菌丝提供更丰富的养料，加快菌丝吃料，缩短培养 时间【训。同时漆酶作为食用菌呼吸链重要的末端氧化酶之一，通过铜离子还原进行电子 传递参与菌体的呼吸作用，加大呼吸强度，为菌体的生命活动提供更多能量，从而加速 菌丝生长发育。由于漆酶对木质素的特殊降解作用，漆酶木质素液体培养菇类已成为 可能，利用这种方法培养木耳、香菇、灵芝等将有益于节约木材和扩大生产规模。 1 3 3 3 其它用途 漆酶可以改善面团的品质。漆酶氧化面筋蛋白中的巯基为二硫键使面筋蛋白发生交 联，从而改善面团的功能性质，结果形成更耐搅拌、干而不黏的面团。漆酶还可缩短生 面团的制作时间，加快生面团崩解。在生面团和烘焙食品的生产中已有一些漆酶制剂 l 绪论 的专利。 1 3 4 环境保护中的应用 1 3 4 1 去除氯酚类有机化合物 不少研究表明，漆酶具有转化酚型底物的能力，其中包括氯酚、甲基酚、甲氧基酚 等。在底物聚合过程中，有氯离子从溶液中被释放出来，这表明漆酶具有去除氯酚化合 物毒性的作用1 1 1 】。 一般认为，漆酶处理有机氯化物的机理是：在有氧条件下，氯酚底物先通过与漆酶 反应被氧化形成游离基或反应活性的醌类物质，然后这些物质互相偶合或发生化学聚合 反应生成高分子化合物，降低这些有毒物质的溶解度，从而除去含氯物质，减少其毒 性。 1 3 4 2 染料降解 在印染和造纸等工业过程中，有大量含有染料的废水释放，成为当今主要的环境问 题之一。合成染料广泛地用于印染工业，目前已超过1 00 0 0 种。合成染料被人们设计成 防水、抗光照、抗氧化的生物难降解化合物，以通常的活性污泥方法处理纺织废水很难 达到预期目的，同时存在着花费高和污泥再处理的问题。而筛选的染料降解细菌，对降 解的染料结构有高度的专一性，不适用于化学结构多样性的纺织废水处理。白腐菌漆酶 具有广泛的底物专一性，可以氧化芳香环化合物，对纺织染料的脱色及降解效果明显。 白腐菌可用于降解某些染料。鉴于漆酶是一种多酚氧化酶，己证明许多纺织染料的降解 与其胞外漆酶有直接关系【1 2 l 。 1 3 5 生物监测中的应用 漆酶在催化过程中消耗氧气，使得这一过程很容易地被转化为电信号而高灵敏地得 到检测。 1 3 5 1 免疫检测 在免疫检测中，漆酶有望替代辣根过氧化物酶成为新的标记酶，因为它有如下几个 优点：氧气作为第二底物，不形成非产物型的酶底复合物；相比于过氧化物酶，漆酶 对介质中不同价态的金属离予浓度的敏感性较低；无需特殊的仪器和试剂l 劓。 1 3 。5 2 生物传癌器 酶电极通常以离子选择电极为传感器，通过在其生物膜上固相化一层酶，溶液中待 测物( 酶的底物) 与酶层接触后发生化学反应，结果生成能使生物膜响应的离子( 酶的 产物) ，再通过传感器将与样品中待测物浓度成正比的电极电位的变化量转化为电化学 信号输出，从而达到检测目的i 埘。由于漆酶能够催化多种酚类物质生成醌类化合物，固 定化漆酶电极在酚类物质的检测中应用广泛。 1 4 漆酶基因的异源表达 漆酶虽然具有良好的应用前景，但目前还很难在工业上实现大规模应用，原因在于 东北林业大学硕士学位论文 = ! ! = = = ! ! ! = = = ! = ：= = ii = ：= = 皇 产生漆酶的真菌不仅生长速度缓慢而且产量较低，难以实现大规模发酵培养。解决的方 法只有通过克隆出漆酶基因然后进行异源表达以提高产量。此外，通过异源表达还可以 利用定点突变来提高漆酶的理化性质如较高的氧化还原电位，更接近于中性的最适反应 p h 值及较高的热稳定性等。 国内有关漆酶的异源表达研究开展较晚，进行异源表达的漆酶产生菌种也比较少。 到目前为止，仅有木质层孔菌( f o m el i g n o s u s ) 1 1 4 l ，野生革耳菌( p a n u sr u d i s ) 陋埘， 杂色云芝( c o r i o l u sv e r s i c o l o r ) 旧，金针菇( f l a m m u l i n av e l u t i p e s ) | 1 8 j ，平菇( 糙皮侧 耳，p l e u r o t u so s t r e a t u s ) 1 9 l 和粗糙脉胞菌【2 0 j 等少数几种真菌的漆酶基因被异源表达。这 几种真菌漆酶基因的异源表达系统均为毕赤酵母表达系统，所表达的重组蛋白的活性从 0 0 5 3u m l 1 7 】到9 0 3u m o “j 相差较大。可见产漆酶真菌的选择对表达高活性的重组漆 酶是至关重要的。另外，即使是同一种漆酶基因在毕赤酵母中表达，培养条件如温度、 p h 值等都会影响漆酶的活性。me ta l ，用毕赤酵母表达木质层孔菌漆酶基因，在培养 条件未优化前所得的重组漆酶活力约3 2u m l ，经优化培养后最高活力可达9 0 3u m l 【1 4 j 。张银波等最近用三种不同的毕赤酵母菌株( g s l l 5 ，k m 7 1 ，s m d l l 6 8 ) 均成功表达 了平菇漆酶基因，比较全面地研究了漆酶基因在毕赤酵母中实现高效表达的条件及所产 漆酶的酶学性质【1 9 l ，为今后实现重组漆酶的工业化生产及实际应用奠定了基础。除了在 毕赤酵母中表达真菌天然的漆酶基因外，杨建强等利用设计扩增引物在野生革耳菌漆酶 基因的e d n a 序列3 端添加1 5 个核苷酸后得到漆酶的突变基因，获得了比原来重组漆 酶活性有所提高的突变体【1 6 1 。 国外从1 9 9 0 年左右就开始了漆酶基因异源表达的研究，目前已将约二十种来源的 真菌漆酶基因进行了异源表达，所涉及的表达系统包括s a c c h a r o m y c e s n 删括缸【2 l r2 2 1 ， h c h i ap a s t o r i s z 3 ，2 4 l ，曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 1 2 5 御和木霉属( t r i c h o d e r m a ) f 勰2 9 1 的一些丝 状真菌。一般来说，酵母表达系统表达的重组漆酶产量较低，约5 m g m l ，而丝状真菌 表达的重组漆酶产量一般为1 0 2 0m g m l 2 5 1 。k i i s l d n o nl le ta 1 用里氏木霉 ( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 作为漆酶基因的异源表达宿主，其产量高达2 3 0m g m l1 2 9 1 。不 过酵母作为表达系统具有丝状真菌所不具备的一些优点：如生长迅速，可有效分泌重组 蛋白并提供有效的翻译后加工，另外酵母遗传操作简单，有利于对酵母宿主和重组蛋白 进行突变改型等【“3 0 i 。最近，枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 的漆酶基因c o t a 也成功 在大肠杆菌中实现了表达，所表达的重组蛋白即使在8 0 也具有很高的稳定性【3 l l 。 s o n o k it e ta 1 将杂色云芝( c o r i o l u sv e r s i c o l o r ) 的漆酶基因转入烟草( n i c o t i a n a t a b a c u m ) ，获得的转基因烟草可在根系分泌出有活性的漆酶，并显示出对有机污染物具 有良好的降解效果【3 2 】，因此转基因植物有望在污染土壤的生物修复中发挥巨大作用。 h o o de e e ta 1 将云芝漆酶基因转入玉米中，得到的重组漆酶的产量为0 5e k g 干重， 显示出用植物生产工业蛋白具有一定的市场竞争力，为提高漆酶产量提供了一条全新的 思路【3 3 , 3 4 l 。 1 绪论 1 5 毕赤酵母表达系统 原核生物表达系统如大肠杆菌通常可用来表达来源于真核生物c d n a 的异源蛋白， 但是在多数情况下，细菌合成的真核生物蛋白不仅稳定性差且缺乏生物活性，大部分原 因是由于蛋白质翻译后不恰当的折叠与缺乏化学修饰等相应机制。翻译后修饰有很多类 型：通过蛋白酶解从一些蛋白质前体中切去一段氨基酸序列，从而获得功能分子；或在 蛋白质的某些氨基酸上加入特定的糖基，可赋予蛋白质稳定性及独特的结合性，这是主 要的翻译后修饰。其它的修饰方式包括磷酸化、乙酰化、硫酸化等。许多翻译后修饰是 在高尔基体和线粒体中完成的，而原核生物一般缺少这些细胞器所以不能表达出有活性 的蛋白。董佳里将粗毛栓菌漆酶基因在大肠杆菌中进行了融合表达，得到的是丧失了漆 酶活性的重组蛋白1 3 5 1 。真菌漆酶一般为糖蛋白，所以不适合用原核生物来表达，提高其 产量的方法目前只能通过真核表达系统来实现。 酵母表达系统是现在用的较多的一种真核表达系统，大量用于生产工业化用途的蛋 白。常见的酵母表达系统包括酿酒酵母表达系统和毕赤酵母表达系统。在酿酒酵母中成 功表达了许多重组蛋白，但是存在以下几方面的问题：( 1 ) 有时表达水平很低；( 2 ) 有 时外源蛋白过度糖基化，在每一个n 连接寡糖链中含多于1 0 0 个甘露糖基，额外的甘露 糖单元可能改变产物的生物活性或改变其免疫原性；( 3 ) 有时设计的是分泌蛋白质，而 实际上滞留在细胞质问，增加纯化的时间和成本：( 4 ) 酿酒酵母的乙醇产量过高，对细 胞毒性大，因而减少蛋白质产量1 3 6 j 。 近些年来，科学家证明甲基营养酵母，例如毕赤酵母，最适合作为过量表达异源蛋 白的宿主。首先，乙醇氧化酶( a o x i ，a l c o h o lo x i d a s e1 ) 启动子是已知最强、最易受 调控的启动子之一。第二，它可以以一个或多个拷贝在基因组的特定位点上形成稳定的 整合表达质粒。第三，这些菌株可以高密度培养。到目前为止，已有超过3 0 0 个异源蛋 白在毕赤酵母中表达i 刈。毕赤酵母与酿酒酵母相比，具有许多优点：( 1 ) 毕赤酵母具有 高效的启动子，紧密调控编码乙醇氧化酶的甲醇诱导型基因，该酶是甲醇利用途径中的 第一种酶。在有甲醇的情况下，细胞内乙醇氧化酶能达到总蛋白的3 0 ；缺乏的情况 下，a o x l 基因完全关闭。而且，a 0 x 1 基因启动子能快速对培养基中加入的甲醇做出 反应。在大规模培养中可以通过诱导监控使重组蛋白产量最大化。( 2 ) 毕赤酵母不合成 乙醇，可以高密度培养产生大量蛋白。( 3 ) 毕赤酵母可实现异源蛋白的分泌表达，并且 酵母自身只分泌表达少量蛋白，简化分泌型蛋白的纯化1 3 0 j 。 1 6 本课题来源及研究目的和意义 1 6 1 课题来源 国家自然科学基金资助项目( n o 3 0 6 7 1 7 0 2 ) 东北林业大学硕士学位论文 1 6 2 研究目的和意义 本研究的目的和意义包括通过对血红密孔菌胞外漆酶的纯化，进一步了解其理化性 质和有关酶学特性，用纯酶进行染料降解实验可初步评估血红密孔菌漆酶的工业应用前 景。通过克隆出漆酶基因然后进行异源表达以提高产量，为实现其在工业上的大规模应 用奠定基础。 2 血红密孔苗漆酶的纯化 2 血红密孔菌漆酶的纯化 血红密孔菌是属于担子菌纲，多孔菌科，密孔菌属的一种大型真菌，它可导致木材 白色腐朽。漆酶是血红密孔菌分泌的许多胞外酶中的一种，具有重要的工业应用价值。 通过对血红密孔菌胞外漆酶的纯化，可进一步了解其理化性质和有关酶学特性，用纯酶 进行染料降解实验可初步评估血红密孔菌漆酶的工业应用前景。 2 1 材料 2 1 1 菌种 血红密孔菌( p y c n o p o r u ss a n g u i n e u s ) 采自东北林业大学凉水国家自然保护区，采 用4 cp d a ( p o t a t od e x t r o s ea g a r ) 斜面保存于东北林业大学微生物及免疫学实验室。 2 1 2 药品 2 2 - a z i n o - b i s o - e t h y l b e n z o t h i a z o l i n e 6 s u l f o n a t e ) ( a b t s ) ， s y r i n g a l d a z i n e ， 2 ，6 - d i m e t h o x y p h c n o l ，r e m a z o ib r i l l i a n tb l u er ( r b b r ) 为s i g m a 公司生产；丙烯酰胺，n ，n 一 甲叉双丙烯酰胺。过硫酸铵，甘氨酸，b 一巯基乙醇为a m r c s c o 公司产品；s e p h a d e xg 7 5 ( a m e r s h a mp h a r m a c i a ) ：d e a e - s e p h a r o s ef f ( 北京鼎国生物技术有限公司) ；标准蛋 白( 大连宝生物公司) ；二硫疏糖醇( d 1 厂r ) ( m e r c k ) ；其他试剂均为国产分析纯或国产 生化试剂。 2 1 3 培养基 ( 1 ) 平板活化培养基( g l ) 葡萄糖2 0 ，k h 2 p 0 43 ，m g s 0 4 7 h 2 01 5 ，马铃薯 2 0 0 ，琼脂1 5 ，v b l 微量，p h 自然。 ( 2 ) 液体产酶培养基( g l ) ：葡萄糖2 0 ；l 广天冬素2 5 ；d l - b 一苯丙氨酸o 1 5 ；腺嘌 呤0 0 2 7 5 ；k 2 l p 0 41 ；m g s 0 4 7 h 2 00 5 ；c a c h0 0 hf e s 0 4 7 h 2 00 0 1 ；m n s 0 4 4 h 2 0 0 ：0 0 1 ；z n s o | 7 h 2 00 0 0 1 ；c u s 0 4 5 h 2 00 0 0 2 ( 调节p h 至5 0 ) 。 2 1 4 仪器 高速冷冻离心机 分光光度计 超滤装置 聚丙烯酰胺凝胶电泳仪 凝胶成像装置 h z q f 1 6 0 a 高低温恒温振荡培养箱 高压灭菌锅 t i - 1 3 0 0 梯度混合器 h i m a cc f1 6 r x ( h i t a c h i ) u 2 8 0 0 ( h i t a c h i ) l a b s c a l et f fs y s t e m ( m i l l i p o r e ) h o e f o rm i n iv e s y s t e m fa m e r s h a mb i o s c i e n c e s ) g e n eg e n i u sb i o l m a g i n gs y s t e m 上海一恒科技有限公司 m l s 3 0 2 0 ( s a n y 0 ) 上海青浦沪西仪器厂 东北林业大学硕士学位论文 h l - 2 恒流泵 h d 2 1 - 2 紫外检测器 x w t - 2 台式记录仪 b s 1 0 0 a 自动部分收集器 2 2 方法 上海青浦沪西仪器厂 上海青浦沪西仪器厂 上海自动化仪表三厂 上海青浦沪西仪器厂 2 2 1 培养方法 将p d a 斜面保存的血红密孔菌菌种接种到p d a 平板活化培养7d ，用打孔器在长 满血红密孔菌的p d a 平板上取5 个菌饼( 直径5r a m ) 接种到装有5 0m l 液体培养基的 2 5 0 m l 三角瓶中，2 8 1 5 0r p m ，培养7d 作为发酵液。 2 2 2 样品制备 收集发酵液，80 0 0r p m ，4 c 离心2 0m i n 去除菌丝，上清放置4 c 冰箱保存用作后 续实验。 2 2 3 漆酶活性及蛋白含量的测定 用分光光度计在4 2 01 1 1 1 1 下检测漆酶与底物在2 5 反应3r a i n 的吸光度，计算漆酶 活性。酶的活性定义为每分钟氧化1 # m o l 底物为产物所需的酶量为一个酶活力单位。 测定吸光度体系为：空白对照管中加2 9 5m l 柠檬酸，磷酸盐缓冲液( p h3 4 ) 和5 0 l 稀释后的酶液；检测管中加1 9 5m l 柠檬酸一磷酸盐缓冲液( p h 3 4 ) ，5 0 l 稀释后的酶 液，1m l 1m m o l l a b t s 。蛋白质含量的测定用考马斯亮蓝法。以标准牛血清蛋白作标 准曲线。所有测量均重复三次取平均值。 2 2 4 纯化步骤 ( 1 ) 发酵液上清用超滤装置进行超滤浓缩。 ( 2 ) d e a e s e p h a r o s ef f ( 1 6 x 5 0c m ) 离子交换层析：2 0m m o l l 磷酸盐缓冲液 ( p h6 5 ) 平衡，将浓缩样品上柱后，用o 1m o f ln a c l 和2 0m m o | l 磷酸盐缓冲液 ( p h6 5 ) 梯度洗脱，流速1m _ m i n ，自动部分收集器收集1 0 0 管，每管3m l 。收集 有漆酶活性的组分并浓缩。 ( 3 ) s e p h a d e xg 7 5 ( 1 6 5 0c m ) 凝胶过滤；2 0m m o l l 磷酸盐缓冲液( p h6 5 ) 平 衡，用相同的缓冲液洗脱，流速0 5m 1 m i n ，自动部分收集器收集1 0 0 管，每管3 m l 。收集有漆酶活性的组分。 2 2 5 凝胶电泳及光谱扫描 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 和常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( n a t i v ep a g e ) 采用5 堆积胶和1 5 分离胶进行【埘，s d s p a g e 用考马斯亮蓝r 2 5 0 染色，n a t i v ep a g e 用1m m o l l a r s 染色。 纯化漆酶的光谱扫描使用紫外可见分光光度计在2 0 0 8 0 0i l r n 之间进行扫描。 2 血红蟹孔酉浮酶的纯化 _ _ _ _ _ - _ - - - _ _ - _ - _ - _ - _ - _ _ _ = 日| j _ e - _ j e _ e = j _ 口日_ _ _ _ _ _ _ - _ - - _ | 目_ 目一i m _ _ _ _ - _ 一 2 2 6n 端氨基酸测序 纯化漆酶的n 端氨基酸序列由上海基康公司采用4 9 2 c l c 蛋白测序仪测定。 2 2 7 温度及p h 值对漆酶活性和稳定性的影响 p h 对漆酶活性的影响用柠檬酸磷酸盐缓冲液在p h 2 6 6 2 范围内测定，温度对漆 酶活性的影响在最适p h 下在2 0 7 5 范围内测定。 p h 对漆酶稳定性的影响通过在2 5 c 时将漆酶与p h 2 o 7 0 的柠檬酸磷酸盐缓冲 液混合放置1h 后测定剩余活性。漆酶的热稳定性测定在最适p h 的柠檬酸磷酸盐缓冲 液中在2 0 7 0 c 放置1h 后测定剩余活性。所有测量均重复三次取平均值。 2 2 8 动力学参数和抑制剂对漆酶活性的影晌 纯化漆酶的底物特异性用a b t s ，s 灿g a l d a z i 琳，2 , 6 - d i m e t h o x y p h e n o l 作为底物在 p h 2 o 7 0 的柠檬酸磷酸盐缓冲液中测定。底物的浓度范围在0 1 tm m o l l 之间。每 种底物的米氏常数在其最适p h 下用l i n e w e a v e r - b u r k 双倒数作图求出 几种漆酶可能的抑制剂对酶潘的影响用a b t s 作为底物在其最适p h 下测定。将抑 制剂与纯化的漆酶在2 5 下保温3m i n 后测定漆酶剩余的活性。所有测量均重复三次取 平均值。 2 2 9 漆酶对染料的脱色实验