（微生物学专业论文）降解pla菌株的选育及相关研究.pdf

摘要 聚乳酸( p l a ) 是生物高分子材料中具有广泛用途的代表，由于其具有等同于石油 化工高分子的物性而又能被生物降解，不会引起环境污染，目前引起人们广泛的关注。 在医学、生态学、纺织业和人类的日常生活中，p l a 正发挥着越来越重要的作用。p l a 具有高于1 6 0 的熔点，透明度高，具有高强度和抗拉伸能力，目前正在取代石油化工 塑料而成为新一代的环保生物塑料。 本论文重点在于证明微生物降解p l a 的可行性。筛选出一株具有降解p l a 能力的菌 株，通过紫外诱变获得一抹能高效降解p l a 的突变株，分离、纯化出p l a 解聚酶，并对 其进行了初步的酶学性质的研究。主要结果如下： 1 由抚顺石油三厂排出的污泥中筛选出可降解p l a 的一株细菌，经初步鉴定属固氮 细菌属( a z o t o b a c t e rs p ) ，编号为d s 2 0 0 4 。以d s 2 0 0 4 为出发菌株，通过紫外线诱变， 采用摇瓶培养测定发酵液酶活力的复筛方法，获得具有遗传稳定性的p l a 降解菌株，编 号为d s 2 0 0 4 - - a ，测得该菌株的酶活高于原始出发菌株的1 6 5 1 。 2 对d s 2 0 0 4 - - a 菌株产生的p l a 解聚酶进行了分离、纯化，并对其解聚酶的特性进 行了探讨。纯化倍数约为1 4 6 7 ，酶活力回收率1 0 4 7 ，酶蛋白的相对分子质量约为 4 5 2 k d 。 3 该酶最适反应温度和p h 分别为4 0 c 和8 6 。在温度3 5 以下和p h 8 o 9 2 范围内 稳定。金属离子c a 2 + 对p l a 解聚酶有激活作用，而c u ”、h 矿、z 矿等金属离子对此酶有抑 制作用。质谱仪测得酶降解p l a 的产物中含有乳酸。 4 进行p l a 膜的降解，降解时间为7 d ，得到的p l a 膜表面由透明变成白色，表面 积较未降解时增大，表面未看出形态改变，但强度明显降低。经扫描电镜观察到试样表 面部分地方开始变化，有絮状物富集于试样表面，可能的原因是聚乳酸开始降解，分子 量降低，被溶胀的程度加大，但还没有降解到小分子而脱离样品，当放大倍数增加是表 现得更加明显。 关键词：聚乳酸( p l a ) ，生物降解，p l a 解聚酶 a b s t r a c t p o l y l a c t i d e ( p l a ) w h i c hi su s e dw i d e l yi so n eo f t h eh i g hp o l y m e rm a t e r i a l s a l t h o u g h p l a p l a s t i ch a st h es a r f l ec h a r a c t e rw i t l lp e t r o - c h e m i s t r yp l a s t i c i tc a l lb ed e g r a d e db yl i v i n g o r g a n i s m sa n dw i l ln o t l e a dt oe n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n i ti sk n o w na so n eo ft h e e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i n gm a t e r i a l s n o w a d a y s ，p l ap l a y sa l le s s e n t i a lr o l ei nm e d i c a ls c i e n c e ， t e x t i l ei n d u s t r y , e c o l o g ys c i e n c ea n dd a i l yl i f e p l aw h i c hh a st h ec h a r a c t e r so fr e l a t i v eh i g h m e l t i n gp o i m a n dh i 【g hi n t e n s i t yi sn o wu s e da sas u b s t i t u t eo f p e t r o - c h e m i s t r yp l a s t i c t h ee m p h a s e so ft h e e s s a ya r ep r o v i n gt h ef e a s i b i l i t yo fd e g r a d i n gp l ab y m i c r o o r g a n i s m s ，w h i c hc a l ld e g r a d ep l a i nar e l a t i v es h o r tt i m e s u c hb a c t e r i u mh a sb e e n o b t a i n e d , a n di t sm u t a t i o n a lt y p eh a sb e e nf o u n dt h r o u g hu l t r a v i o l e t ( u v - ) m u t a g e n e s i s p l a d e p o l y m e r a s oh a sb e e np u r i f i e da n ds o m ep r i m a r ya n a l y s i sh a sb e e nd o n eo ni t t h em a i n r e s u l t so b t a i n e df r o mt h ew o r ka r ea sf o l l o w s ： 1 t h eb a c t e r i u mn u m b e r e dd s 2 0 0 4 ，w h i c hh a st h ea b i l i t yo f d e g r a d a t i n gp l a ，h a sb e e n p u r m e df r o mt h em u dw h i c hw a sd i s c h a r g e db yn o 3p e s o - c o m p a n yo ff u s h u n d s 2 0 0 4 - a , w h i c hh a ss t a b l ec h a r a c t e ro fh e r e d i t y , i so n em u t a t i o n a lt y p eo fd s 2 0 0 4t h r o u g ht h ew a yo f u l t r a v i o l e tm u t a g e n e s i s t h ea c t i v i t yo ft h ee n z y m ew h i c hi sa b s t r a c t e df r o md s 2 0 0 4 - ai s 1 1 6 5 1 t i m e s m o r e t h a n t h a t i s f r o m d $ 2 0 0 4 2 s o m er e s e a r c hh a sb e e nd o n eo nt h ep l ad e p o l y m e r a s ew h i c hi so b t a i n e df r o m d s 2 0 0 4 - a t h e 丘n a lp u r i f i e de n z y m er e p r e s e n t e dt h e1 0 4 7 r e c o v e r ya n dt h e1 4 6 7 - f o l d p u r i f i e dp r o t e i nw i t l laa c t i v i t yo f 4 8 4 4 3 3u m g 3 t h em o s ts u i t a b l er e a c t i o nt e m p e r a t u r eo ft h i sp l a d e p o l y m e r a s ei s4 0 ( 2 a n dp hi s 8 6 b e l o wt e m p e r a t u r e3 5 a n db e t w e e np h8 o 9 2 t h ee n z y m ei ss t a b l e ca _ 舯c 卸a c t i v e t h ee n z y m e ，b u tc u 2 + ，h 矿a n dz n 2 + w i l lm a k ei tl o s ea c t i v a t i o n l a c t i ca c i d ( m w 9 0 ) w h i c h i st h em o n o m e ro f p l ae x i s t si nt h ep l a d e g r a d a t i o np r o d u c t s i tc o m b i n e st o g e t h e rw i t hh + a n d n a + 4 t h eb a c t e r i a0 4 aa l s oh a v et h ea b i l i t yt od e g r a d ep l af i l m s a f t e rs e v e nd a y s d e g r a d a t i o n p l af i l m sp a r t l yl o s tt h e i ri n t e n s i t ya n dt r a n s p a r e n c y , t h e i rs u r f a c ea r e ai sl a r g e r t h a nb e f o r e t h ep h o t o sb ye l e c t r o n i cs c a n n i n gm i c r o s c o p es h o wt h a tt h es u t f a c eo ft h ep l a f i l m sh a sb e e nd e g r a d e dp a r t l y k e y w o r d s ：p o l y l a c t i d c ( p l a ) ，b i o - - d e g r a d a t i o n , p l ad e p o l y m e r a s e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：盘! 丑亟日期：兰：己! ：! ： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学 位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：堡垒 日期：出： 学位论文作 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：二f 釜进 日期：竺z ：羔 电话： 邮编： 一、文献综述 1 1 引言 2 1 世纪，塑料制品被广泛地应用，人们日常生活的方方面面都离不开塑料制品。而 传统的塑料制品给人类提供方便的同时，也造成了“白色污染”，使人类生存的环境遭 到破坏。据当前统计，以日本“1 为例，废弃塑料每年达5 0 0 万吨，而且有逐年增加的倾 向。这些塑料一般极其稳定，在自然环境下几乎不降解，因此不断堆积，导致掩埋地不 足、白色垃圾四处遍布甚至海洋污染等弊端，成为全球日益严重的问题。解决“白色污 染州2 埘和减轻环境负担的有效途径之一，就是开发能利用土壤或水中的微生物使之完全 降解的生物可降解性聚合物，于是，可降解塑料应运而生。 生物降解高分子材料是指在生物体内能被降解或酶解，生成的小分子物质被机体吸 收并排出体外的一类功能高分子材料。目前人们己研究开发的生物降解高分子主要有天 然高分子、微生物合成高分子和化学合成高分子三大类。其中天然可降解高分子包括淀 粉、纤维素、聚糖、甲壳素、壳聚糖及其衍生物等；微生物合成的可降解聚合物包括聚 乳酸( p l a ) 、聚羟基烷酸酯、聚b 一苹果酸酯等，人工合成的可降解聚合物包括聚乙烯 醇( p v a ) 、聚乳酸( p l a ) 、聚b 一羟基酸酯类( p h a ) 、聚己内酯( p c l ) 等。以上高分 子材料经过改造后，都可以成为生物可降解材料的原料来源。可降解塑料具有在较短的 时间内、在自然界的条件下能够自行降解的特性。可降解塑料一般分为四大类： 光降解塑料在塑料中掺入光敏剂，在日照下使塑料逐渐分解掉。它属于较早的 一代降解塑料，其缺点是降解时间因日照和气候变化难以预测，因而无法控制降解时间： 生物降解塑料指在自然界微生物( 如细菌、霉菌和藻类) 的作用下，可完全分解为 低分子化合物的塑料。其特点是贮存运输方便，只要保持干燥，不需避光，应用范围广， 不但可以用于农用地膜、包装袋，而且广泛用于医药领域； 光一生物降解塑料“1 光降解和微生物降解相结合的一类塑料，它同时具有光和微 生物降解塑料的特点； 水降解塑料在塑料中添加吸水性物质，用完后弃于水中即能溶解掉，主要用于医 药卫生用具方面( 如医用手套等) ，便于销毁和消毒处理。 在四种降解塑料中，生物降解塑料随着现代生物技术的发展越来越受到重视，成为 研究开发的新一代热点。 目前商品化的生物降解聚合物有生物合成的聚酯、化学合成的脂肪族聚酯和聚己内 酯、以乳酸为基础的聚乳酸，以及以天然物质如淀粉为基础的聚合物合金等。特别是经 过研究发现，聚乳酸及其共聚物的降解过程和降解产物( 乳酸) 对生物体无害”，并可 在自然状态下被生物体吸收并转化为c 0 ：和h 2 0 ；因此，关于其合成方法、物性、降解性 等，正在被人们广泛关注和研究。作为缝合线”1 、创伤包扎材料嘲、接骨材料、牙科材 1 料、医疗器具( 手术刀、锯) 雠”等医疗材料，p l a 已获得广泛的实际应用；而且由于这 种聚合体存在透明性和成型加工性等优点，正在被人们日益重视。基于以上优点，聚乳 酸是取代石油化工塑料的热门生物可降解材料。 1 2 聚乳酸( p l a ) 简介 合成p l a 的单体是乳酸，在乳酸分子中含有一个羟基和一个羧基两个官能团，具有 相当的反应活性，在适当的条件下容易脱水缩和成聚乳酸。由于乳酸具有旋光性，生成 的聚乳酸也具有旋光性，聚乳酸包括聚一d - - 孚l 酸( p - d l a ) ，聚一l 一乳酸( p - l l a ) 和聚 一( d 、l ) 一乳酸，它们的基本性质见表1 “。 表1 不同旋光性p l a 的性质比较 内容 p d l ap l l a p 一( d 、l ) 一l a 溶解性均可溶于二3 9 烷、乙腈、氯仿、二氯甲烷等，但p - ( d 、 l ) 一l a 溶解性更好，不溶于脂肪烃、乙醇、甲醇等。 固体结构结晶性结晶性结晶性 熔点( ) 1 8 01 8 0 一 玻璃化温度( ) 一5 6 5 0 6 0 分解温度( ) 2 0 02 0 01 8 5 2 0 0 拉伸率 2 0 3 0 2 0 3 0 一 断裂强度g d 4 0 5 05 o 6 0 一 水解性 ( 3 7 生理盐4 6 个月4 6 个月2 3 个月 承中的强度减 半时间) 上述性质表明，p l a 易溶解于多种有机溶剂，具有高度结晶的特性，熔点高，抗拉 伸能力强，在生理盐水中可水解等特性；这些特性使其具备了取代p v 塑料的优良性质， 具有取代p v 等石油化工塑料的能力。然i 面，聚乳酸由于也具有玻璃态化温度低，单独 使用硬而脆，吸水性强等特点，因此暂时不能在包装材料、农用材料等广阔领域中使用。 但是，通过化学改造研制的乳酸聚合物在不损害聚乳酸所具有的优良成型加工性和高熔 点等特性的情况下，使其具备p v 塑料的柔软性，使之成为具有硬性的聚乳酸和具有柔 软性的脂肪族聚酯两部分所组成的优良透明性的热塑性塑料。其方法就是在p l a 内部 添加具有柔软性的脂肪族二羧酸、乙二醇、羟基脂肪族羧酸等。这种乳酸类塑料的合成 方法是以乳酸为主原料，在催化剂存在的条件下，与柔软的脂肪族聚酯进行共聚。所得 聚合物的分子量为i 0 2 5 万，具有分散比约为2 的高分子量。而且还可以通过在合成 阶段改变柔软的脂肪族聚酯组成比，制得各种不同特性的共聚物：既可以制得像聚苯乙 2 烯一样的物性，也可以制得与聚乙烯和聚丙烯一样的物性，图1 表示的就是共聚组成与 机械特性的关系。表2 则列出硬质和软质型乳酸类聚合物的代表性品级的一般特性。硬 质型是含一定百分比的柔软性脂肪族聚酯共聚制得的，是改善聚乳酸脆性缺点的品级， 既保持了聚乳酸同样的刚性，又提高了耐冲击性；而软质型则是与更高百分比的柔软脂 肪族聚酯共聚制得的，兼备透明性及聚烯烃一样的韧性及柔软性。两者均具有1 6 0 左 右的熔点。 表2 硬质型与软质型p l a 的比较 薹 ， 舞 i 霎 静 图1 共聚组成与机械特性的关系 磊 喜 靼一 蠢 寒童 鐾 哟 ! 3 聚乳酸的制备 聚乳酸的合成具有长期的历史嘲，早在4 0 多年前，就f 1 3 l a ( 丙交酯) 和g a ( 乙交酯) 开 环聚合分别制得了高分子量的p l a ( 聚乳酸) 和f g a ( 聚乙醇酸) ，这类脂肪族聚酯由于对热 和水的敏感性，长期以来未被引起足够的重视。6 0 年代，在对p g a 对水敏感这一特性重 新审视后，凭借其优点而被开发为可降解的手术缝线材料取代胶原。随后的报道证明： 3 高分子量的p l a 也可在人体内被降解，引发了这类材料作为生物医用材料的开端。此后， 这类脂肪族聚酯，特别是p l a 和p l g a ( l a 和g a 的共聚物) ，作为外科的i 临时敷料及药用辅 料得到了广泛且深入的研究和开发，其中作为骨折内固件( 芬兰b i o f i x 、法国 p h u s i l i n e s ) ，作为抗癌药物投放体系基材制得的新剂型药物( 英国z o l a d e x 、法国 d e c a p e p t y l 、日本e n a n t h o n e ) 已有商品供应。总之，p l a 类材料具有良好的生物相容性 和生物降解性，且降解产物一一乳酸能参与人体的新陈代谢，以及其性能可在大范围内 通过与其他单体共聚得到调节，当前已成为生物降解材料领域中最受重视的材料之一。 乳酸分子中含有一个手性碳原子，其二聚体丙交酯中含有两个手性碳原子，因此， 前者有两个光学异构体，后者具有4 个。其中左旋乳酸由生物工程制备，外消旋乳酸可 由左旋乳酸外消旋化或通过石油化工合成制得。l l a ( l - - 丙交酯) 、d l l a ( d l 一丙交酯) 分 别由相应的乳酸通过两步反应制得。最近，l l a 、d l l a 已能从任何单糖、多糖或寡糖通 过生物工程的技术来制得，产量可高达每年1 0 5 吨。因此，丙交酯已有了新的来源，而 且其成本也有了一定的降低。 聚乳酸的合成“1 大体上有以下几种方法： 直接聚合法 直接聚合法是在脱水剂的存在下，乳酸分子间受热脱水，直接缩聚成低聚物。早在2 0 世纪3 0 4 0 年代就已经开始研究，但是由于涉及反应中产生的水的脱除等关键技术还未 能完全解决，聚合产物的分子量较低( 均低于4 0 0 0 ) ，强度极低，易分解，无实用性。 开环聚合法 开环聚合法是目前全球使用较多的生产方法。早在2 0 世纪中叶，杜邦公司的科研人 员就用开环聚合法获得了高分子量的聚乳酸。近年来，国外对聚乳酸合成的研究主要集 中在丙交酯的开环聚合上。开环聚合多采用辛酸亚锡作引发剂，分子量可达上百万，机 械强度高，聚合分两步进行：第一步是乳酸经脱水环化制得丙交酯； f h 3 貌水珏3 1 m _ c 咖h 丽 o 0 0 c 砖 + o 第二步是丙交酯经开环聚合制得聚丙交酯：此法可通过改变引发剂的种类和浓度，将分 子量控制在数十万至百万，机械强度高。 o 0 c h 3 等等十f h 3 c h o 健化剂。”。 4 共聚法 p l a 为疏水性物质，且降解周期难于控制，通过与其他单体共聚可改变材料的亲水疏 水性、结晶性等。聚合物的降解速度可根据共聚物的分子量、共聚单体种类和配比等加 以控制。具有特定结构( 如二嵌段、多嵌段、星形结构等) 的共聚物可把不同材料的结构 特点结合起来，赋予特殊的性质，因此具有不同组成和特征结构的p l a 共聚物的合成成 为近年来的研究热点。如已有报道的聚d 、l - 乳酸与聚己内酯( p l a p c l ) 共聚，聚d 、l - 乳酸与聚乙二醇( p l a p e g ) 共聚，乙交酯与丙交酯共聚形成聚乙丙交酯( p g l a ) 等。 e l i s s e e f f 、k i m u r a 、b a r r e r a 等通过设计新环制备出与甘氨酸、赖氨酸的交替共聚物， 这些材料是细胞培养及组织工程的良好载体。 1 。4 聚乳酸酯的降解特性 1 4 1 水解机制的研究 自然界天然的纤维素或木质素等在微生物的存在下将经历新陈代谢过程。典型的情 况是真菌分泌出氧化酶将木质素的芳香族部分分解，而细菌分泌出水解酶使脂肪酸和多 糖降解。常用的有机塑料和石油化工塑料在其大分子链骨架上或其表面不存在利于细菌 和酶的接触和作用的条件。比如，聚丙烯对水解不敏感，不会出现自然条件下的生化降 解；聚酯虽然对水解敏感，但分子结构与那些天然高分子物质极不相同，也不产生酶解 作用。聚乳酸酯以可生物降解和可为人体吸收而广为人知，但它的降解并不同于纤维素 等天然聚合物由直接酶反应而造成降解的作用模式。 研究表明，聚乳酸酯不接受直接的酶攻击，它在自然降解环境下首先水解“2 ”1 ，使 相对分子质量有所降低，分子骨架有所破裂，形成较低相对分子质量的组分。这种水解 过程首先发生在聚合物非晶区和晶区表面。这些最先形成的较低相对分子质量的组分水 解到一定程度，方可以进一步在酶的作用下新陈代谢，使降解过程得以完成。在这里， 第一步的水解作用几乎不可避免。因此，聚乳酸酯的降解过程是间接的。 脂肪族聚酯的水解起始于水的吸收，小分子的水移至样品的表面，扩散进入酯键或 亲水基团的周围，在介质中酸、碱的作用下，酯键发生自由水解断裂，样品的平均分子 量缓慢降低，当分子量降低到一定程度，样品开始溶解，生成可溶的降解产物“”。有些 研究认为降解时不仅发生酯键的自由水解断裂，末端基也起着重要的作用，降解生成的 羧基末端基对水解的自催化现象就是证明“”。s h i h “”对聚d ，l 乳酸的水解研究发现末端 基( 羟基或羧基) 的水解断裂速度比自由链断裂速度快十倍。b r a n d “”等用毛细管电泳研 究了水溶性乳酸低聚物( 聚合度小于l o ) 的降解行为，发现聚合物首先降解生成乳酰乳酸 盐，然后才慢慢降解为乳酸。 1 4 2 降解性能及降解过程 实验室研究表明，唯一能使聚乳酸酯不经水解而直接发生作用的只有蛋白酶k 【1 7 州。 这一点与棉纤维的情况相类似。人们往往因为聚乳酸酯的降解性能而担心其使用性能和 寿命。而有关聚乳酸酯的使用寿命的表述应该是：由于聚乳酸酯在降解机理上存在的特 5 殊性，它的降解总是必须先行水解，并在水解至一定程度后方可以进行酶解。因此，控 制好水解和降解的环境条件，可以明显地控制它的使用寿命。总体而言，它的降解速率 与其它生物降解材料相比要更加缓和一些。聚乳酸酯的水解速度与环境温湿度条件有很 大关系。图2 ”引自国外资料，它显示了环境湿度越大，温度越高，水解就越快，降解 时间便越短。聚乳酸酯在土壤中的水解条件比空气中更加有利。而土壤中大量存在的微 生物，使其在二者中的酶解条件相差更大。因此，聚乳酸酯在埋入土壤中的降解情况与 其在日常空气环境中的降解表现存在极大的差别。 睦 瓣 蠹 蕾 憩 磐i饕挪 郴 舶鄹 蛾。 图2 聚乳酸在不同温湿度下的降解性能 ”臻 甜，o 【i ( ，。 ； 蟊 哦l lc 蝌，一 。嚣i 舛廿r 撬壤尹 棚0 ； ， 钔f l * l 嘲l 搬i 、 0 l l ，i t o - 簪! 0j柚培：0：5 疆i3 j| 04 5 悻l i 图3 聚乳酸酯的降解过程 扩 黪 彘 8 从图3 m ：可以看出，聚乳酸酯在降解的最初阶段主要是通过水解，导致大分子链的 破裂。这一阶段的主要微观表现为相对分子质量的下降，而生化降解产生的c 0 2 微不足道。 从宏观的机械性能来说，这一阶段中的聚乳酸酯仍具备使用价值，但其物理指标随水解 过程的发生而开始缓慢下降。当聚乳酸酯的平均相对分子质量因水解而大大下降之后， 酶解过程明显加快，并逐渐成为聚乳酸酯降解过程的主导方式。由此可见，聚乳酸酯在 一般使用条件下不易因水解而分解；水解到达一定程度以后，方可具备条件接受酶的攻 击发生降解。其综合结果使它的降解速率与其它生物可降解有机高分子材料相比要温和 6 一些。将它埋入土壤中则将比较侠就失去强度；在。堆肥”条件下，由于微生物的存在， 一个月内就会分解成h 2 0 和c 0 2 。事实上，聚乳酸酯的降解效果或者说是使用寿命与棉花 有些相似。这里也要说明，聚乳酸酯的降解最终产物( h 2 0 和c 0 0 是完全无毒的低分子 物。对比有些聚合物虽然也可降解，但产生的低分子物却有毒、有腐蚀性等，这也是聚 乳酸酯的突出优点。聚乳酸酯的降解产物通过植物的光合作用，又能形成淀粉，这是一 个循环的过程。人们由此把聚巍酸酯称为“2 1 世纪的环境循环材料”，具备可持续发展 的优良特性。 1 5 可降解聚乳酸的应用前景 合成聚乳酸纤维随埘 p l a 纤维具有很多优异的特性，如亲水性较p e t 纤维好，悬垂性、回弹性好，以及 较好的卷曲持久性，u v 稳定性好，密度小，结晶熔点可以控制在1 2 0 1 7 0 范围内变 化等等。这些特性都适应将p l a 纤维应用于纤维和非织造布领域，在服装市场、家用及 装饰市场、非织造布市场、双组分纤维领域等也有潜在的应用前景。目前，p l a 纤维已 制成复丝、单丝、短纤维等，主要用于服装和产业领域。以p l a 纤维制得的布料具有真 丝的光泽，优良的手感、亮度、吸水性、形状保持性及抗皱性，因此是理想的面料。 产业领域的用途 p l a 在产业领域的用途，主要是在土木工程中做网、垫子、沙袋和制土壤流失材料 等，在农业、林业中做播种织物、薄膜、防虫防兽害盖布、防草袋和养护薄膜等，在渔 业中做鱼网、鱼线等，在家用器具中做垃圾网、手巾、滤器、擦布等，在户外器具中做 蓬布、覆盖布和帐篷等。 在医学领域的应用0 1 删 p l a 纤维在卫生医疗领域主要作尿布、一次性失禁用品、妇女保健用品、抗紫外线 织物、手术缝合线、骨内固定装置、组织工程支架、绷带、一次性工作服、载药材料、 人工管道、人工韧带和人工肌腱等。 生态学的应用 由于聚乳酸可以发生生物降解最终生成二氧化碳和水，不会对环境形成污染，因此 在生态学具有重要的意义。聚乳酸塑料在工农业生产领域应用广泛，由于聚乳酸塑料韧 性好，故而适合加工成高附加值的薄膜。在使用几年后可自动降解，不会污染土壤和水 源。因此越来越受到人们重视。聚乳酸还可用作纸代用品、纸张塑膜、包装薄膜、食品 容器、生活垃圾袋、农药化肥缓释材料、化妆品的添加成分等。聚乳酸塑料还可用作林 业、水产用材和土壤、沙漠绿化的保水材料。 用于生物可降解塑料 p l a 具备石油化工塑料所具有的透明度高、柔韧性好、稳定性强等有点，也因为来 源广泛，在自然条件下可降解，降解中间及降解最终产物不会污染环境，而受到人们广 泛的关注，正在组织大规模的研究，以便早日取代石油化工塑料，为解决白色污染提供 7 有效的途径。 1 6 本论文工作目的 聚乳酸( p l a ) 是由工业生产发酵获得一种可生物降解的高分子聚酯，它除了具有 高聚物的基本性质外，其可生物降解性和生物相容性倍受人们的关注。这种新型的生物 塑料有着巨大的市场潜力，发展它不仅可以为工业、农业、医药以及人们的日常生活等 方面提供新的材料来源，而且将会对消除“白色污染”改善人类自身的生存环境及环保 事业的健康发展做出重要贡献。 国外对于聚乳酸的研究已经展开，并且已经筛选出降解p l a 塑料的菌株，该菌株 为放线菌类“1 ；从阅读文献可知，现阶段我国对于p l a 生物降解的研究还主要依靠国 外的文献参考。还没有实验室正式将p l a 的生物降解作为研究的方向，本研究的目的 之一就是展开对p l a 生物降解，特别是实验室条件下微生物降解的研究，以期筛选出 可快速降解p l a 塑料制品的菌株，并对其相关的降解酶性质和降解产物进行进一步探 索，进一步验证p l a 的可降解性，为其在工业、农业和医学领域以及日常生活的应用 提供可靠的理论依据。 二、实验材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌株来源 从由抚顺石油三厂活性污泥中筛选而来，经初步鉴定乜5 1 ，属于固氮细菌属 ( a z o t o b a c t e rs p ) ，编号为d s 2 0 0 4 ，该菌株经紫外诱变后，获得其突变株d s 2 0 0 4 - - a ， 实验使用其突变株。 2 1 2 聚乳酸( p l a ) 由中科院长春应用化学研究所提供，白色粉末，熔点1 6 4 6 ，相对分子质量为 2 0 7 4 x 1 0 5 ，多分散系数为1 7 1 。 2 2 培养基。锄( w v ) 2 2 1 分离菌种用培养基 p l a0 1 ，m g s o t 7 h 2 00 0 5 ， n h 4 c 10 1 ，e a c h 2 h 2 00 0 0 0 5 ，f e s 0 4 0 0 0 1 ，k c l0 0 5 ，n a n 0 30 2 ， k h 2 p 0 40 0 4 3 9 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 02 2 6 9 4 ， p h 8 0 4 。 固体培养基为上述配方加入1 5 之的琼脂。 2 2 2 鉴定菌种用培养基 糖发酵培养基( h u g h l e i f s o n 培养基) ：每1 0 0 0 m l 蒸馏水中含有n a c l5 9 ，蛋 白胨2 9 ，k h 2 p 0 4 0 2 9 ，1 溴酚蓝3 m l ，糖( 葡萄塘、乳糖或淀粉) 含量l 。 无氮培养基( a s h b y 无氦培养基) ：每1 0 0 0 m l 蒸馏水中含有甘露醇 1 0 9 ，m g s o 7 h 2 0 、k h 2 p 0 4 、n a c l 和c a s o t 2 h 2 0 各o 2 9 ，c a c o s o 5 9 。 2 3 可降解p l a 菌株的筛选 将取自抚顺石油三厂的活性污泥接入上述液体培养基中，其中加入p l a 粉末作为 唯一碳源，置室温下振荡培养2 0 2 5 d ，取一定量的发酵液稀释涂布平板，平板中的培 养基为以p l a 为唯一碳源的选择性培养基。经3 7 d 培养，对平板上生长状况良好的 菌株逐一挑取，经分离纯化后，得到四株降解状况相对良好的菌株，分别命名为d s 2 0 0 l 、 d s 2 0 0 2 、d s 2 0 0 3 、d s 2 0 0 4 。 2 4p l a 降解菌株降解速率的测定 2 4 1p l a 悬浮液的制备2 力 将p l a 颗粒溶于氯仿，制得2 ( w v ) p l a 一氯仿溶液，与十二烷基磺酸钠溶 9 液混合，混合液经超声波处理5 m i n ，制得p l a 乳化液，7 0 。c 磁力搅拌9 0 m i n 除去氯仿， 得到p l a 悬浮液。 2 4 2 酶活测定及酶活单位定义嚣侧 以p l a 为底物用分光光度计测定p l a 降解酶活力。取3 m l 悬浮液置于4 0 恒温 水浴，待温度平衡后加入l m l 酶液，反应1 0 m i n 后，于5 8 0 n m 波长下测其光吸收( 升高) 。 一个酶活单位定义为：每分钟引起光吸收升高或降低0 0 0 1 ( a 5 8 0 n m ) 单位所需的 酶量。 2 5 菌株d s 2 0 0 4 的初步鉴定” 2 5 1 显微镜观察 将d s 2 0 0 4 接种于牛肉膏蛋白胨培养基，3 7 培养4 8 h ，挑取少量活化后的菌体，制 成涂片，番红染色，光学显微镜下观察，并测定细胞大小。 2 5 2 革兰氏染色 通过革兰氏染色确定菌株d s 2 0 0 4 的革兰氏性质。 2 5 3 糖发酵实验 使用葡萄糖、乳糖和支链淀粉为不同糖源，检测菌株d s 2 0 0 4 利用糖的能力，并检 测d s 2 0 0 4 菌株发酵糖后是否产酸产气。 2 5 4 固氮能力的检测 将d s 2 0 0 4 菌株接种于无氮培养基中，检测该菌株是否能利用大气中的氮。 2 6 细胞悬液的制备 2 6 1 菌种活化 将d s 2 0 0 4 菌株转接到以p l a 为唯一碳源的斜面培养基上，3 7 培养4 8 h 。 2 6 2 细胞悬液的制备 菌种活化后，以无菌水冲洗，将d s 2 0 0 4 菌株的细胞洗入装有玻璃珠的三角瓶中， 3 7 震荡1 0 1 5 m i n ，显微镜镜检，调整细胞浓度至1 0 ”个m 1 ，使之适于诱变。 2 7 紫外线( u v ) 诱变处理及突变株的筛选。“矧 2 7 1 紫外线诱变 灭菌平皿中装入5 m l d s 2 0 0 4 细胞悬液，在磁力搅拌器下用紫外灯( 3 0 w ，照射距 离1 5 - 2 0 c m ) 照射，照射时间为0 8 0 s ，处理后的悬液在无菌室红灯下适当稀释。 2 7 2 初筛 取上述菌悬液o 2 m l 涂布于培养基上，避光培养2 3 d ，计数存活菌落，计算致死 率。 2 7 3 复筛 根据初筛结果，从固体平皿中挑取经紫外诱变后仍然能在p l a 唯一碳源上生长的 1 0 菌落，接入液体培养基中，3 7 5 1 2 摇瓶培养5 d ，每天取发酵液，4 1 2 离心3 0 m i n ( 1 2 0 0 0 x g ) ，倾出上清液，检测p l a 降解酶的活力及蛋白含量。 2 8 蛋白质的测定方法 按f o l i n 一酚( l o w r y ) 方法测定，以酪蛋白为标准蛋白。 2 9 酶的分离纯化方法“栅 2 9 1 酶液的制备 经1 2 0 h 发酵后的5 0 0 0 m l 发酵液于4 c 、1 2 0 0 0 g 离心3 0 m i n ，弃取沉淀，上清 液经滤纸过滤后即为粗酶液。 2 9 2 超滤浓缩 根据分子量大小，使用超滤膜( 截留分子量5 0 0 0 ) 超滤浓缩。 2 9 3 盐析 在搅拌条件下，缓慢向浓缩粗酶液中加入( n h 4 ) 2 5 0 4 粉末至4 5 - , 5 0 饱和度， 静置过夜，4 ，1 2 0 0 0 x g 离心3 0 m i n ，弃去沉淀。 2 9 4 透析脱盐 将浓缩液装入透析袋中，4 c 下对蒸馏水透析4 8 h ，中间换水数次，用b a t l ：检查 5 0 4 2 。，直至透析液中无沉淀为止。 2 9 5 冷冻干燥 将透析脱盐后的酶液经冷冻干燥，储存于一2 0 的冰箱。 2 9 6s e p h a d e xg - 1 0 0 凝胶色谱 使用5 m m n a a e - h a e ( p h = 5 o ) 缓冲液平衡s e p h a d e x g - 1 0 0 层析柱，然后将冷冻 干燥后的酶溶于同样的缓冲液中上柱分离，洗脱液与平衡用缓冲液相同，流速9 m l h ， 每管3 m l ，于2 8 0 r i m 自动监测，记录洗脱液的吸收值变化。 2 1o 酶的最适反应温度的测定。” 将p l a 悬浮液分别置于2 0 c 、3 0 ( 2 、3 5 ( 2 、4 0 、4 5 c 、5 0 、5 5 1 2 、6 0 c 、6 5 1 2 、7 0 ( 2 的水浴中预热1 0 r a i n ，然后加入一定量的酶液，保温3 0 m i n ，以蒸馏水做空白 对照。测定酶液在不同反应温度下的酶活力单位。 2 11 酶的热稳定性的测定嘲 将酶液分别于2 0 c 、3 0 ( 2 、3 5 ( 2 、4 0 c 、4 5 c 、5 0 c 、5 5 c 的水浴中保温，间隔一 定时间取样测酶活，绘制酶活性一保温时间曲线。 2 1 2 酶的最适反应p h 的测定嘲 配制1 0 种从p h 3 6 - 1 0 0 的不同p h 的p l a 悬浮缓冲液( p n 3 6 - 5 0 乙酸乙酸钠缓 冲液，p h 5 8 8 0 磷酸盐缓冲液，p h 8 6 1 0 0 甘氨酸- 氢氧化钠缓冲液) ，再用p h 计校正， 以保证溶液的p h 值。将一定量的酶液加入不同p h 值的p l a 悬浮缓冲液中，构成一系 列酶反应体系，于4 0 c 测酶活性，绘制酶活性p h 曲线，找出所对应的p h 值，即为 该酶的最适反应p h 值。 2 1 3 酶的p h 稳定性的测定1 。 将酶液与不同的缓冲液在4 0 。c 保温l h 后，再按标准酶活测定法测其酶活力，以在 最适反应p h 下保温所测得的酶活力为1 0 0 ，其余折合成剩余的百分数，以此对保温 p h 作图，便可得到该酶在上述条件下的p h 稳定曲线。 2 1 4 分子量的测定嘲 2 1 4 1 制胶及电泳 采用s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 法。采用不连续垂直板电泳系统， 分离胶浓度1 2 ，浓缩胶浓度5 ，采用t r i s h c l 缓冲体系。 2 1 4 2 染色及显色 考马斯亮蓝r 2 5 0 染色。 2 1 5p l a 膜的降解 2 1 5 1p l a 膜的制各 将混合后的p l a 样品切成小块，置于平扳硫化机上，1 8 0 、5 m p a 的压力下压成 0 1 m m 厚的薄片，然后放置到冷压机下保压冷却至室温。实验用p l a 膜为中科院长春应 用化学研究所提供。 2 1 5 2p l a 膜的降解。1 将已称重的p l a 膜( 长1 2 c m ，宽o 8 c m ，质量介于1 3 m g - 1 9 m g 之间) 放入2 5 0 m l 三角瓶中，加液体培养基1 0 0 m l ，接入菌种后置于2 8 摇床培养( 1 0 0 r m i n ) ，定时取样。 样品取出后，用蒸馏水冲洗干净，干燥后用分析天平称重量变化。 2 1 6 降解产物的测定。” 用l d i 1 7 0 0 激光解吸电离飞行时间质谱仪测定降解产物。仪器工作参数为：质量 范围：m z 0 8 0 0 0 0 ，排斥电压：3 0 k v ，吸引电压：9 3 k v ，检测器电压：- 4 7 5 k v ，真 空度：1 1 0 4 p a 。 2 1 7 主要仪器 b e c k m a n 离心机( 美国b e c k m a n 公司) j y - 9 2 型超声波细胞粉碎机( 宁波新芝科器研究所) 超滤器( p a l lf i l t r o n 公司生产) 1 2 a l p h a l - 2 型冷冻干燥机( c h r i s t 公司生产) 低温层析柜 激光光密度扫描仪( p h a r m a c i a l k b 公司生产) 7 2 3 分光光度计 l d i 1 7 0 0 激光解吸电离飞行时间质谱仪 扫描电子显微镜 7 5 4 分光光度计 三、实验结果 3 1 可降解p l a 菌株的筛选和纯化 采用以p l a 为唯一碳源的液体培养基，接种采自抚顺石油三厂的活性污泥，经3 7 摇瓶培养2 0 2 5 d ，初步筛选出可利用p l a 作为碳源的菌株数株，经平板画线将上述 筛选出的菌株纯化，最后接种于斜面培养基，选取其中长势良好的4 株分别编号为 d s 2 0 0 1 、d s 2 0 0 2 、d s 2 0 0 3 、d s 2 0 0 4 ，接种于以p l a 为唯一碳源的斜面培养基，达到纯化 和扩增的目的。 3 2 不同菌株降解酶活性的比较 将d s 2 0 0 1 d s 2 0 0 4 菌株活化3 5 d 后，接种于以p l a 为唯一碳源的液体培养基， 每天同一时间取样，连续取得l o d 发酵液，分别测定发酵液中降解酶活性和蛋白含量， 绘制酶活性和蛋白含量曲线，结果如图4 所示。 通过对比可以发现，菌株d s 2 0 0 4 的蛋白含量和酶活力相对较高，且蛋白含量和酶 活性峰值都出现在发酵的第五天左右，证明菌株d s 2 0 0 4 在筛选出的菌株当中降解能力 较强，故选择d s 2 0 0 4 菌株进行进一步的实验。 1 6 0 1 4 0 1 2 0 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 o 123 4 567891 0 t d 1 4 1 8 1 6 1 4 1 2 童 1 0 毫 8 毒 6 毫 4 2 0 1 6 0 1 4 0 1 2 0 1 0 0 8 0 6 0 4 0 l234567891 0 t d r 一蛋白含量曲线一酶话力曲线 图4 菌株d s 2 0 0 i d s 2 0 0 4 酶活和蛋白含量测定 1 5 博m m 挖m 8 6 4 2 oo m9876 d 5432l 堪：2 m 屹m 8 6 4 2 o 一日ja州o-oh山 加o