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包埋脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻 摘要 植物种质资源是人类赖以生存和发展的物质基础，也是农业可持续发展的 物质基础。长期以来，由于对植物种质资源及多样性保持缺乏足够的重视，使 种质资源面临危机【l l 。植物种质资源的保存研究对于生物多样性保护和植物生物 技术均具有十分重要的意义 2 1 。利用微繁及限制生长等组织培养技术保存植物种 质，其最大优点是所需设备与实验室常规组织培养无异，在培养基、培养环境 氧气含量、培养温度或材料含水量上稍作改变，就能明显地延长继代周期；利 用超低温冰冻技术为长期稳定地保存植物种质资源提供了有效的方法，但由于 多种原因目前大多是基于方法的研究，离实际应用还有一段距离 3 1 。目前有多种 保存微藻的方法，每种方法都有各自的优点。继代保存简单易行，在生产和科 研实践中仍受到青睐；固定化保存使藻细胞生长速度缓慢，可用于次生代谢物 质生产和污水处理；超低温保存具有保持种质遗传稳定性，对藻种进行优胜劣 汰，便于长期保存，能最大限度地减少污染等优点【4 】。包埋脱水法常温和低温保 存是将固定化技术与干燥法结合，与常规的继代保存相比，它的保存时间更为 长久；与超低温保存相比，它不需要较为复杂的操作技术和贵重的保存设备， 成本低廉，而且可以保存大量藻种，是一种有发展潜力的中期保存技术。 本文以绿色巴夫藻( p a v l o v av i r i d i s ) 为实验材料，用包埋脱水法进行常温 和低温保存。选择静止初期的藻细胞包埋在含有3 0 氯化钠的3 的褐藻酸钙胶 球中，细胞负载约5 0 0 0 万个细胞胶球，将胶球用硅胶吸湿法脱水至不同含水量 后，在常温和低温处进行保存。本文探讨了保存温度、光( 暗) 和胶球含水量 等因素对保存效果的影响。结果如下： 1 在2 0 暗下，保存1 8 个月后的最高存活率为7 1 ；在2 0 光下，保存 6 个月后的最高存活率为8 8 。 2 在4 1 2 暗下，保存1 8 个月后的最高存活率为5 4 1 ；在4 自然光照下， 保存6 个月后的最高存活率为6 9 0 。 3 在一3 0 下，保存1 2 个月后的最高存活率为6 3 ：经过1 0 甘油处理后 保存在3 0 下，1 2 个月后的最高存活率为5 9 7 。 4 本文分别用保存6 个月和1 8 个月的藻细胞接种，测定其生长曲线和生 长速率。保存6 个月后，在第1 0 天达到最高细胞密度，平均生长速率由保存前 的0 2 2 1 降低到0 1 6 8 ，经过2 个周期的恢复培养平均生长速率达到0 2 1 1 。保存 1 8 个月后，在第1 2 天达到最高细胞密度，平均生长速率为0 1 3 8 ，经过2 个周 包埋脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻 期的恢复培养平均生长速率为0 1 9 3 。说明经过保存后，藻细胞可正常进行生长 繁殖。 与其它方法相比，采用包埋脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻，操作简单， 无需贵重设备，在藻类种质中期保存中有广阔的应用前景。 关键词：绿色巴夫藻：常温保存；低温保存：包埋脱水法 a b s t r a c t p l a n tg e 册p l a s mr e s o u r c e sf o rt h es u r v i v a lo fm a n k i n da n d t h ed e v e l o p m e n to f t h em a t e r i a lb a s i sf o rs u s t a i n a b l ea g r i c u l t u r a ld e v e l o p m e n ta r et h em a t e r i a l b a s i s f o r a1 0 n gt i m e ，b e c a u s eo ft h ed i v e r s i t yo fp l a n tg e r m p l a s mr e s o u r c e sa n dm a i n t a l nt n e l a c ko fs u f f i c i e n ta t t e n t i 咖t o t h ec r i s i sf a c i n gg e r m p l a s m u k p l a n tg e r m p l a s m r e s o u r c e sf o rt h ep r e s e r v a t i o no fb i o d i v e r s i t yc o n s e r v a t i o na n dr a n tb i o t e c h n o l o g y a r c0 fg r e a ts i g n i f i c a n c e 2 1 m i c r o p r o p a g a t i o na n dr e s t r i c t i o n so nt h eu s e 0 ft l s s u e c u l t u r et e c h n i q u e s ，s u c ha sp r e s e r v a t i o no fp l 积g e r m p l a s m ，i t sb i g g e s ta d v a n t a g e 塔 t h en e c e s s a r ye q u i p m e n ta n dc o n v e n t i o n a lt i s s u ec u l t u r el a b o r a t o r yi s n od i f f e r e n t f b mt h ec u l t u r em e d i u m ，c u l t u r ee n v i r o n m e n to x y g e nc o n t e n t ，t e m p e r a t u r e ，m o i s t u r e c o n t e n to rm a t e r i a lc h a n g es l i g h t l y ，w ec a ns i g n i f i c a n t l ye x t e n dt h ep e r i o df o l l o w i n g t h eu s eo fc r y o p r e s e r v a t i o nf r e e z i n gt e c h n o l o g y f o r l o n g t e r ms t a b i l i t y 锄d p f e s e r v a t i o no fp l a n tg e r m p l a s mr e s o u r c e st op r o v i d ea l le f f e c t i v ea p p r o a c h ，b u tf o r v a r i o u sr e a s o n sm o s to ft h ec u r r e n tm e t h o di sb a s e d o nt h es t u d y ，f r o mt h ep r a c t i c a l a p p l i 跚i o n ss t i l ls o m ed i s t a n c e 【3 1 a tp r e s e n t ，t h e r e a r eav a r i e t yo fp r c s e r v 枷o n m e t h o d sm i c r o a l g a e ，e a c hm e t h o dh a si t so w na d v a n t a g e s f o l l o w i n g t h ep r e s e r v a t i o n 0 fas i m p l e ，i nt h ep r o d u c t i o na n ds c i e n t i f i cr e s e a r c hi np r a c t i c ei ss t i l lf a v o r e d ；f i x e d s 0t l l a tp r e s e r v a t i o no ft h es l o wr a t eo fg r o w t ho fa l g a e ，c a nb eu s e df o rs e c o n d a r y m e 诅b o l i t e sp r o d u c t i o na n ds e w a g et r e a t m e n t ；c r y o p r e s e r v a t i o n o f g e r m p l a s m m a i n t a i ng e n e r i cs t a b i l i t y ，t h ea l g a es p e c i e st ot h es u r v i v a lo ft h ef i t t e s t , t of a c i l i t a t e l o n g - t e 姗p r e s e r v a t i o n ，t o m i n i m i z ep o l l u t i o n ，a n d o t h e ra d v a n t a g e s 。“ e n c a p s u l a t i o n d e h y d r a t i o na tr o o mt e m p e r a t u r e a n dl o wt e m p e r a t u r ei sk e p tc o n s t 如t a n dd r y i n gt e c h n o l o g yc o m b i n e dw i t hc o n v e n t i o n a lc o m p a r e d t os a v et h es u b c u l t u r e i t t st i m ef o rm o r el o n g - t e r mp r e s e r v a t i o n ；c o m p a r e dw i t hc r y o p r e s e r v a t i o n , i t d o e sn o t n e e dm o r ec o m p l e xt e c h n o l o g y a n do p e r a t i o n st h ep r e s e r v a t i o n o fv a l u a b l e e q u i p m e n t ，a n dc a n s a v eal o to fa l g a e p 卧7 l d v av 订t d bw a sp r e s e r v e db ye n c a p s u l a t i o n d e h y d r a t i o n u n d e rn o r m a l t e m p e r a t u r e a n dl o wt e m p e r a t u r e a l g a l c e l l si ne a r l ys t a t i o n a r yp h a s ew e r e e n c a p s u l a t e di n3 c a a l g i n a t eb e a d sw i t h3 0 0n a c l ，5 0m i l l i o nc e l l si no n e b e a d b e a d sw e r ed e s i c c a t e d w i t hs i l i c a g e l ，t h e nw e r ep r e s e r v e d u n d e rn o r m a l t e m p e r a t u r ea n dl o wt e m p e r a t u r e t h em a i nf a c t o r si n f l u e n c i n gt h e c e l lv i a b i l i t y , s u c h 包埋一脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻 a st e m p e r a t u r e 、l i g h t ( d a r k ) a n dw a t e rc o n t e n to fb e a d sw e r es t u d i e d t h er e s u l t sa r ea s f o l l o w s ： 1 2 0 i nt h ed a r k ，a f t e r1 8m o n t h s ，t h eh i i g h e s ts u r v i v a lr a t eo ft h ep r e s e r v a t i o n w a s7 1p e r c e n t ；2 0 i nt h el i g h t ，a f t e rs i xm o n t h s ，t h eh i g h e s ts u r v i v a lr a t eo ft h e p r e s e r v a t i o nw a s8 8p e r c e n t 2 4 ci nt h ed a r k , a f t e r1 8m o n t h s ，t h eh i g h e s ts u r v i v a lr a t eo ft h ep r e s e r v a t i o n w a s5 4 1p e r c e n t ；4 ci nt h el i g h t ，a f t e rs i xm o n t h s ，t h eh i g h e s ts u r v i v a lr a t eo ft h e p r e s e r v a t i o nw a s6 9 0p e r c e n t 3 - 3 0 ，a f t e r1 2m o n t h s ，t h eh i g h e s ts u r v i v a lr a t eo ft h ep r e s e r v a t i o nw a s6 3 p e r c e n t ；a f t e r1 0p e r c e n tg l y c e r o la f t e rk e p ti n 一3 0 ，a f t e r1 2m o n t h s ，t h eh i g h e s t s u r v i v a lr a t ew a s5 9 7p e r c e n t 4 i nt h i sp a p e r , r e s p e c t i v e l yr e t a i n e df o r6m o n t h sa n d1 8m o n t h so fa l g a ec e l l s w e r em e a s u r e dt h eg r o w t hc u r v ea n di t sg r o w t hr a t e s a v es i xm o n t h sl a t e r , i nt h e t e n t hd a yo ft h eh i g h e s tc e l ld e n s i t y , t h ea v e r a g eg r o w t hr a t ef r o m0 2 2 1b e f o r et h e p r e s e r v a t i o nr e d u c e dt o0 1 6 8 ，a f t e rt w oc y c l e so fr e c u l t u r i n g , a l la v e r a g eg r o w t hr a t e o f0 2 1 1 s a v e1 8m o n t h sl a t e r , i nt h et w e l f t hd a yo ft h eh i 【g h e s tc e l ld e n s i t y , t h e a v e r a g eg r o w t hr a t ew a s0 。1 3 8 ，a f t e rt w oc y c l e so fr e c u l t u r i n g , t h ea v e r a g eg r o w t h r a t ew a s0 1 9 3 a f t e rt h a t s a v e ，t h ea l g a ec e l l sc a nb en o r m a lg r o w t ha n d r e p r o d u c t i o n c o m p a r e dw i t ho t h e rm e t h o d s ，e n c a p s u l a t i o n d e h y d r a t i o nm e t h o di ss i m p l e ，n o e x p e n s i v ee q u i p m e n t ，t h ea l g a eg e r m p l a s mc o n s e r v a t i o ni nt h eb r o a dp r o s p e c t s k e yw o r d s ：p a v l o v av i r i d i s ；n o r m a lt e m p e r a t u r ep r e s e r v a t i o n ；l o wt e m p e r a t u r e p r e s e r v a t i o n ；e n c a p s u l a t i o n - d e h y d r a t i o n 包埋脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论 文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过 的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中 做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 壶姗 日期：j s 口g i 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密 的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：忐i 指导教师签名： 日期： 翁奠，2沙器。苦j 2 包埋脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻 第1 章植物和微藻种质保存技术综述 1 1 植物种质保存技术概述 1 1 1 植物种质保存的重要性 种质( g e r mp l a s e ) 简单地讲就是决定生物的“种性 并将遗传信息从亲代 传递给后代的遗传物质的总体。植物种质保存，实际上指的是保存那些携带它 的物体。它可以是一个群体，一个植株，也可以是一部分器官( 如根茎) 、组织、 花粉、合子和细胞，将来甚至可以是染色体或核酸片段。不同的种质保存方法， 反应着保存种质的不同水平【5 】。随着近代工农业生产的发展和科学技术的进步， 对地球的不合理开发利用，引起生态平衡失调，植物种质资源的流失更加严重 起来，保存植物种质已经成为一个世界性、刻不容缓的问题。人类认识自然、 改造自然能力的增强，人类增长及人类活动加速了种质资源流失，人类对资源 的过度开采、开发，破坏了生态系统，使大量动、植物失去繁殖、栖息场所； 生产上大面积推广的少数品种成为优势种，品种遗传基础狭窄，越来越多的品 种销声匿迹；从某种程度上讲，农业未来的发展取决于对种质资源的保持和迅 速利用，植物种质资源的保存关系到农业的可持续发展；种质资源为人类提供 食物、营养、药品等，同时也为人类构建了一个良好的生态环境，保持人类与 生态环境的和谐发展、稳定和平衡，必须保持种质资沥i i 。 1 1 2 植物种质资源的类别 1 1 2 1 本地品种资源 本地品种资源是育种中最基本的原始材料，它包括古老的地方品种( 或称 农家品种) 和当前推广种植的改良品种。古老的地方品种是长期自然选择和人 工选择的产物，对本地区的自然条件有高度的适应性，对本地流行的某些病害 也具有一定的抗性和免疫力；由于栽培技术的改进和人类对产量与品质的要求 不断提高，古老地方品种对新的栽培条件和生产要求已不能适应，逐渐被新的 优良品种所代替【6 】。 1 1 2 2 外地品种资源 从国外或地区引入的品种或类型，称外地品种资源，与本地品种资源相比 较，它具有遗传上的多样性，具有本地品种所欠缺的种质 6 1 。 1 1 2 3 野生植物种质资源 除栽培种以外的野生植物，称为野生植物种质资源，它包括作物的野生类 型和有一定价值的各种野生植物【6 l 。 包埋脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻 1 1 2 4 人工创造的种质资源 利用杂交、诱变等方法，对已有的种质资源进行有目标的加工，从而创造 出在某种性状上具有某种优点的新类型，即人工创造的种质资源，它们是进行 遗传研究和培育新品种的珍贵材料【酬。 1 1 3 植物种质离体保存技术 自1 9 7 5 年h e n s h a w 和m o r e l 首次提出离体保存( c o n s e r v s t i o n nv i t r o ) 植物 种质的策略以来，该项技术受到植物界的高度重视。常用的离体保存方法有组 织培养保存法和超低温保存法。前者适合中短期保存，后者用于长期保存 7 1 。 1 1 3 1 组织培养保存法 组织培养技术保存种质有许多优点：很高的增殖率；无菌和无病虫环境， 不受自然灾害的影响；材料体积小，占用空间不大；相对较少的人力花费；不 存在田间活体保存存在的像异花授粉，嫁接繁殖而导致的遗传侵蚀现象；有利 于国际间的种质交流及濒危物种抢救和快繁【8 】。 1 1 3 1 1 常温继代保存法 在常温下，将培养材料进行继代保存，所用的温度可以是培养室的常用温 度，也可以是自然温度。在常温下保存种质，对生长较慢和冷敏感( 如热带和 亚热带植物) 种质有较好的效果。伊华林和邓秀新在2 5 2 c 日光灯照明下保存 了2 4 份柑桔胚性愈伤组织，其中对保存1 3 年的锦橙胚性愈伤组织研究发现， 其9 9 以上的细胞染色体数没有变异，仍保持再生能力t g l 。 1 1 3 1 2 缓慢生长保存法 1 1 3 1 2 1 降低培养温度 利用低温对植物生命活动有抑制作用而进行的保存。王郁民等用小塑料袋 包装果树休眠枝条保存，发现在3 5 下保持自然含水量的枝条具有最好的 保存效果，这是因为这种低温与细胞液冰点相接近，既不会导致细胞结冰伤害 又可有效地抑制生理代谢活动【1 0 】。张俊莲等在3 1 0 的低温条件下对继代9 1 0 代的当归愈伤组织进行了保存试验，发现当归愈伤组织对低温环境具有较好的 内在适应机制，处理后染色体倍性亦较为稳定1 1 1 i 。 1 1 3 1 2 2 调整培养基营养成分水平 植物生长发育状况依赖于外界养分的供给，如果养分供应不足，植物生长 缓慢，植株矮小。通过调整培养基的养分水分，可以有效限制细胞生长，使培 养植物处于最小生长阶段，也称“饥饿法。 2 包埋脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻 1 1 3 1 2 3 添加化学物质 生长抑制物质是一类天然的或人工合成的外源激素，具有很强的抑制细胞 生长的生理活性。试验表明，完善和调整培养基中的生长调节剂配比，特别是 添加生长抑制物质，利用激素调控技术，不仅能延长培养物在试管中的保存时 间，而且能提高试管苗素质和移植成活率。在培养基中添加一些高渗化合物， 如蔗糖、甘露醇、山梨醇等，也是一种常用的缓慢生长保存手段。 1 1 3 1 2 4 降低培养环境中氧含量 生命活动离不开氧气的供给，氧含量的降低，会引起植物细胞代谢的减慢。 因此，减少氧气的供给，如采用矿物油覆盖或减少容器内的氧压等均可达到保 存植物细胞的目的。矿物油不但降低了氧气的供给，而且可减少琼脂表面水分 的蒸发，使得植物组织能以非常缓慢的速度生长。 1 1 3 1 2 5 干燥保存 水是维持生命活动的重要因子，适当降低细胞中的水分，细胞代谢随之降 低。将植物组织放在无菌培养皿内的滤纸上，置于空气流动的无菌箱中风干数 天( 4 0 天) ，然后放在无菌的容器内，室温即可保存，但常在高于o 的低温 保存。另外还有将种质保存于高浓度蔗糖培养基中或利用硅胶进行干燥的。 以上是实验室采用的保存植物细胞组织的一般方法，在实际应用中，根据 保存的目的及材料的状况，常常综合地运用上述几种方法。上述方法的特点是 保存的植物细胞均在生长代谢，只是其中的一些方法使细胞的生长代谢尽可能 地减慢，但细胞并未停止生命活动。这样，细胞发生遗传性的变异是不可能完 全避免的。为了使植物细胞不发生变异，就必须停止其生命代谢活动，植物细 胞的冰冻保存就能实现这一目的。 1 1 3 2 超低温保存 通常将8 0 以下的温度称为超低温。超低温冷冻保存一般以液氮为冷源， 使温度维持在1 9 6 。生物材料在如此低温下，活细胞内的新陈代谢和生长活动 几乎完全停止，处于“生机停顿 状态，因而可使植物材料在该温度下不会发 生遗传性状的改变，但细胞活力和形态发生的潜能可保存，这就有可能极大地 延长储存材料的寿命，避免细胞和组织的染色体数目因长期继代而发生的变化 和离体材料在长期无性繁殖过程中可能造成的退化和病虫侵害，从而有效、安 全地长期保存那些珍贵稀有的种质【1 2 1 。 1 1 3 2 1 快速冷冻法( 一步冷冻法) 3 包埋脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻 快速冷冻法是将保存材料从0 或其他预处理温度( 有的需要加冰冻保护 剂) 直接投入液氮中。快速冷冻法成功的关键在于：利用超速冷冻，使细胞内 的水迅速通过冰晶形成和增长的危险温区( 1 0 1 4 0 ) ，即细胞内的水还未来 得及形成冰晶中心，就降到1 9 6 的安全温度，从而避免胞内冰的危害，这时胞 内水已固化，但不是冰，而是所谓的玻璃化状态，这种玻璃化状态对细胞机构 不会产生破坏作用。 1 1 3 2 2 控速降温冷冻法( 两步冷冻法) 该方法的第一步是在保存材料中加入抗冻保护剂，然后用程序降温仪将材 料按照不同的降温速率降至某一特定温度进行预冻一段时间，然后投入液氮冷 冻保存。控速降温法多采用两步冷冻法，即先将材料按照一定的降温速率降到 一个温度预冻一定时间，然后直接投入液氮中。 慢速冷冻：( 细胞脱水) 材料从室温或o c 缓慢下降到零下某一温度，此过程中 可以采用不同的降温速率分段冷冻，通常要使用程序降温仪。 快速冷冻：将经过慢速冷冻的材料迅速移入液氮中。在慢速降温过程中，细胞 外溶液中的水分结冰使溶液浓度升高，但若降温过快，则在细胞内 也形成冰晶，这些胞内冰在复温过程中会产生再结晶而使细胞受损 伤；若降温速度过慢则细胞收缩过度，并且处在高浓度溶液中的时 间过长也会引起损伤，因此应选择一个最佳的冰冻速率。对于不同 的材料，最佳冷冻速率的绝对值具有一定的差异。 1 1 3 2 3 包埋脱水法 包埋脱水法是将植物材料用褐藻酸钙包埋后，先在高浓度蔗糖的培养基中预 培养，再用无菌空气流或硅胶脱水，然后投入液氮中保存。胶囊化可以较大限 度地使待保护材料的结构不致因实验处理或操作中的温度急剧变化而遭至破 坏，脱水就是将胶囊化材料经处理，含水量降到一定程度，再放入液氮中。脱 水方法有直接干燥脱水、高浓度蔗糖预处理和硅胶吸附脱水法等等。蔗糖处理 的目的是为了提高胞质的浓度，增加抗冻力和抗脱水力，促进降温过程中玻璃 化的形成。蔗糖的使用有两种方法：一种是将样品先包埋再进行高浓度的蔗糖 培养处理，大部分研究采用此途径：另一种是将样品先用高浓度的蔗糖预培养 后再进行包埋，包埋后也可以进行更高浓度的蔗糖预培养处理。培养时间与样 品类型和蔗糖浓度有关，基本原则是：既要使样品获得高的抗冻力和抗脱水力， 又不至于引起样品太多的高渗损伤。包埋脱水法的最大优点是使样品获得了较 4 包埋脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻 高的抗冻力，提高了保存效果，使保存后的样品不经愈伤组织直接成苗，降低 了遗传变异的可能性。包埋脱水法最早出现在法国f a b r e 和d e r e u d d r e 保存马铃 薯茎尖的研究中，此法是将植物材料用褐藻酸钙包埋后，先在含高浓度蔗糖的 培养基中预培养，再用无菌空气流脱水，然后投入液氮中保存【1 3 1 。包埋脱水法因 其方法简单，不用有毒害的抗冻保护剂等优点，受到人们的青睐。目前，包埋 脱水法保存植物材料的种类主要有：茎尖和分生组织、体胚或小孢子胚、藻类 等材料【1 4 ，1 5 1 。 包埋脱水法不需要昂贵的降温仪器，降温过程比较随意；避免高浓度保护 剂对材料的毒害作用；各个技术环节的研究相对较为成熟，可以同一时间内处 理大量样品等。迄今已经有5 0 余属1 0 0 种以上的植物种质采用此法保存，所以 包埋脱水法将会在超低温保存中应用的越来越广泛。 1 1 3 2 4 玻璃化法 所谓“玻璃化就是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保 护剂组成的玻璃化溶液中，使细胞及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下过冷 到玻璃化转变温度，而被固化成玻璃态( 或非晶态) ，并以这种玻璃态在低温下 保存【1 6 1 。 1 1 3 2 5 包埋玻璃化法 包埋玻璃化法就是将包埋脱水法和玻璃化法结合起来，其基本程序为预培 养和包埋一玻璃化保护液脱水一液氮保存一化冻一恢复培养。包埋玻璃化法结 合了包埋脱水法和玻璃化法的优点于一身，处理后恢复生长快，对材料的毒害 作用较小及成芽率高等优点。 1 2 微藻保存技术概述 1 2 1 微藻保存的目的和意义 微藻( m i c r o a l g a e ) 因其利用太阳能效率高，营养丰富，生长繁殖旺盛，适 应性强，易培养等，越来越受到广泛的重视，已在水产养殖、污水净化、食品 行业、饲料添加剂、能源开发、药物研制、基础生物研究、色素提取等方面得 到了应用，特别是微藻富含e p a 和d h a ，在降低血压、治疗脑血栓、动脉粥样 硬化、冠心病等心脑血管疾病方面有独特的疗效，开发富含e p a 的海洋微藻的 大规模培养技术，已被公认为代替鱼油生产e p a 的最有效的新途径旧。好的保 种技术既能达到长期贮藏种质的目的，又能复壮，维持藻种的生命活力，保持 微藻的优良遗传性状、不易污染、简便易行。分离培养1 个单种，往往得花费 5 包埋脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻 数月的时间，而筛选出1 个优良的、有应用价值的微藻藻种就更加困难，所以 保存藻种要非常小心。在微藻保种工作中要尽量减少接种次数，避免藻种被杂 藻、细菌或原生动物污染。 1 2 2 微藻保存方法 1 2 2 1 常温和低温保存 1 2 2 1 1 继代保存 继代保存是指把藻种接种在单一固体、液体或固液双相培养基上，在低温 ( 是指温度控制在5 。8 之间) 、弱光( 通常指在冰箱内装1 支8 w 的日光灯照 明) 条件下培养，一代一代传下去的以延续“种族”的1 种方法，接种1 次可 保藏几个月到1 年。液态培养基简便易行，但保存期短；固体培养基保存期较 长但容易干涸；而双相培养基既可避免干涸问题，又能保存更长时间，保存效 果比单一培养基好。由于简便易行，目前在生产和科研实践中，保存藻种最常 用的仍是液体培养基。作为目前一般实验室保存藻种的常规方法，继代保存简 便易行，设备简单，但工作较琐碎，耗费时间和精力。在多次的移接过程中， 稍有疏忽就会使藻种污染上杂藻、细菌或原生动物，使保种失败。而且还会使 藻种逐渐老化。 1 2 2 1 2 浓缩液保存 微藻的浓缩( a l g a ec o n d e n s a t i o n ) 就是用物理方法( 超滤膜和高速离心机) 或化学方法( 用石灰水、明矾、甲克素、f e c l 3 、多聚a i c l 3 等化学沉淀剂) 将培 养的藻液浓缩成藻泥或藻膏。单胞藻最早和最广泛的应用是作水产经济动物幼 体( 大多数贝类的幼体、虾类的蚤状幼体和糠虾幼体、海参的樽形幼体等) 和 成体( 瓣鳃类软体动物等) 的饵料。目前育苗场培育的单胞藻饵料是以鲜藻液 直接投喂的，因此培养单胞藻的数量和供饵时间都要和育苗时间相吻合，不能 有任何差错。近年来，因供饵不及时给育苗场带来重大损失的例子很多。虽然 将藻液浓缩烘干制成干藻粉也是一条途径，但显然其维生素( v ) 、必需氨基酸 ( e a a ) 、必需脂肪酸( e f a ) 、高不饱和脂肪酸( h u f a ) 、适口性、消化率等与 鲜藻液相比均有损失和下降【1 7 1 。 此方法还存在的问题：( 1 ) 每一种藻类最佳的化学浓缩剂及最适的剂量尚 无统一的结论；( 2 ) 不同的化学浓缩剂和冷冻保护剂的毒性去除方法需进一步 研究；( 3 ) 低温保存过程中最适的保存温度及适宜的降温和解冻速度尚需进一 步研究；( 4 ) 不同藻类预冻时间对冷冻保存存活率的影响；( 5 ) 超滤膜法浓缩 6 包埋脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻 微藻因不毒害藻类、成本低、效率高而显得更有发展前途，但过滤过程中对细 胞结构有无破坏作用、破坏的程度及防止措施尚需进一步研究m 。 表1 采用浓缩液保存微藻的主要结果 t a b l e1p r e s e r v a t i o no fm i c r o a l g a ec o n c e n t r a t e s 1 2 2 1 3 细胞固定化技术一包埋法 1 2 2 1 3 1 细胞固定化技术概述 固定化细胞即将游离细胞包埋在多糖或多聚化合物制成的网状支持物中， 进行无菌培养。固定化细胞培养技术是项最新培养技术，它是一种最接近自然 状态下的培养方法，细胞可处于静止状态或相对静止状态，而其培养液为流动 态。与流体培养细胞相比，固定化细胞具有以下优点：细胞生长缓慢有利于次 生物质积累；易得到高密度的细胞群体并建立细胞间的物理学和化学环境以及 易于收获次生物质等。因此可以说，固定化细胞培养技术是从细胞中获得某种 有用物质的一种最好培养方式 2 6 1 。任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以制 备固定化细胞，一般认为理想的固定化方法应具备以下特点：应用的载体应该 便宜易得以降低固定化成本；固定化过程温和以减少对细胞的损伤，固定化载 体对细胞应是惰性的，即不损伤细胞；载体具有稳定的结构，在所使用的物化 条件下不会被破坏；固定化细胞应使底物、产物和其它代谢物能自由扩散；单 位体积的载体内应该拥有尽可能多的细胞数，当使用固定化活细胞时更应如此。 7 包埋脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻 对固定化方法，国内外不同的学者有不同的分类方法，因此很难对此作出精确 的分类，一般来说大致可以分成：载体法，包括有机载体和无机载体法； 吸附法，分为表面吸附法和细胞凝聚法；包埋法，包括凝胶包埋和微胶囊法； 共价结合法；交联法，即利用多功能试剂产生交联，所有这些方法中，包 埋法和有机载体法运用的较多1 2 7 。 由于微藻细胞受到固定载体的束缚，影响细胞代谢过程，从而抑制细胞的 生长和分裂。固定化后的各种微藻在固定化载体内进行细胞分裂并形成大小不 一的藻落。当藻落达到一定密度后，细胞的生长就逐渐停止。有些种类固定化 细胞会逐渐死亡解体，而另一些种类，若定期更换培养液和保持合适的培养条 件，细胞仍可保持旺盛活力不会死亡。藻类固定化目前有主动包埋和侵入吸附 两种不同的方法。侵入吸附主要取决于藻类的特性，特别是纤丝状藻类在固定 化基质上具有侵入和集落的能力，利用藻类的这一特性可以将其固定在基质上。 主动包埋是适用于大多数藻类的固定化方法，包埋基质可以是天然或人工合成 的高分子物质1 2 7 1 。根据形成胶体的方式，可将固定化基质分为三类：由带电多 聚物的离子交联法形成的胶体，如褐藻酸盐、角叉藻聚糖；由热多聚物冷却 形成的胶体，如琼脂、琼脂糖、角叉藻聚糖等；由化学反应法形成的胶体， 如聚丙烯酰胺【2 6 1 。固定化对微藻的生长有明显的影响。李英敏等对叉鞭金藻游 离生长与固定化细胞生长比较发现，细胞固定化后，生长较缓慢，可能是营养 物质和光线进入胶球受到一定程度阻碍的缘故，但在实验周期内，一直处于不 断的生长阶段，表明固定化叉鞭金藻具有较长的生长周期。胶球直径越小，微 藻的细胞分裂越快，单位体积的藻密度越大，显然，在同样的褐藻酸钠和固定 化条件下形成的褐藻酸钙，其对物质的通透性和透光率是相近的，但胶球直径 越小，物质的扩散距离越短，透过胶球内部的光越强，因此胶球中固定化藻的 营养和光照条件明显优于直径较大的胶球中的藻，有利于它们的细胞分裂和生 长【2 9 1 。 固定化细胞的活力测定有以下方法：染色技术( 二乙酸荧光素法) ，二乙 酸荧光素法( f d a ) 染色法可用来测定细胞的存活率，被活细胞吸收的f d a 被 细胞酯酶分解脱去乙酰基，而使这种染料产生荧光，而死细胞却不能，这便可 在荧光显微镜下进行检查，其它染色法如伊文思兰法和品红法也可测定细胞活 力；呼吸强度的测定，测定细胞的呼吸作用可以用来表示细胞的存活率，呼 吸作用的测定法是用c l a r k 型氧电极作检测器，将湿度为1 0 0 2 0 0 m g 的游离细 8 包埋脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻 胞或相当重量的固定化细胞制品放入适当的培养基中( 总体积5 m 1 ) 在2 5 下测定 氧的消耗速率，测出细胞干重后便可计算出比呼吸强度；细胞生长和分解速 率的测定，细胞的重量和数量的增加是微量细胞活性的很好指标【2 6 。 1 2 2 1 3 2 褐藻胶包埋法 褐藻酸钠( s o d i u ma l g i n a t e ，n a a l g ，简称a g s ) ，别名海藻酸盐、海带胶、 海藻胶，是一种从天然褐藻中提取的聚阴离子多糖( 海藻酸) 的钠盐，由1 ，4 - 聚b d 甘露糖醛酸( m 糖) 和a i 广古洛糖醛酸( g 糖) 连结而成，其分子式为 ( c 6 h 7 0 6 n a ) n 。不同来源的褐藻胶是由不同比例的m 、g 嵌段组成的共聚物。 古洛糖醛酸一般为总糖量的2 0 - 4 0 ，x 射线图谱的分析表明，古洛糖醛酸是褐 藻胶中能与金属离子结合的活性部分，二价钙离子与不同链上的古洛糖醛酸螯 合，使其发生交联，形成不溶性的凝胶。因此，古洛糖醛酸含量高的褐藻胶对 钙离子的结合能力强，加入钙离子后立即形成凝胶，凝胶的机械强度大，孔径 小。甘露糖醛酸含量高的褐藻酸加入钙离子后，凝胶是逐渐形成的。海藻酸钠 粉末一般为白色或黄色，溶解后形成透明粘稠液，当p h 1 2 时成胶体状态，p h 3 时形成不融性凝胶。 褐藻酸钠的结构式如下： n 0 n 0 h h h 0 一 在c a 2 + 离子等多价阳离子的存在下，糖中的羧酸和多价阳离子之间形成离 子键，从而形成褐藻酸盐胶。反应式如下： 2 n a a l g + c a c l 2 - * c a ( a l g ) 2 + 2 n a c l 海藻酸钙在与磷酸盐、柠檬酸、e d t a 、乳酸及m 9 2 + 、k + 、n a + 等阳离子存 在下，凝胶颗粒容易解体破碎。 制作方法：将褐藻酸钠溶解于蒸馏水中，加入n a c l ，配成一定浓度的褐藻酸 钠溶液( 多为1 5 - 3 ) ，经消毒后，在室温下与细胞混合，充分搅匀后制成胶 9 包埋脱水法常温和低温保存绿色巴夫藻 藻混悬液，用注射器或滴管慢慢将上述细胞液滴入c a c l 2 溶液中，形成小球，停 留1 5 3 0 r a i n ，经培养液洗涤后，可再进行培养。 1 2 2 1 3 3 保存条件 表2 采用包埋法常温和低温保存微藻的主要结果 t a b l e2s t o r a g eo fm i c r o a l g ab ye n c a p s u l a t i o nu n d e rn o r m a lt e m p e r a t u r ea n d l o wt e m p e r a t u r e 牟氏角刺藻 微型小球藻 绿色杜氏藻 等鞭金藻 双点舟形藻 旋鞭巴夫藻 三角褐指藻 浅色紫球藻 盐泽螺旋藻 聚球藻 朱氏四片藻 贺氏钙板金藻 三角褐指藻 中肋骨条藻 蓝螺藻 矮小海链藻 c h a e t o c e r o sm u e l e r i c h l o r e l l a 加加 d u 舶l i e l l av i r i d i s i s o c h r y s i sg a l b a n a n a v i c u l ad 缸s i p a m p a v l o v ag y r a n s p h a e o d a c t y l u m t r i c o r n u t u m p o r p h y r i d i u m p u r p u r e u m s p i r u l i n as u b s a l s a s y n e c h o c o c c u ss p t e t r a s e l m i sc h u i e m i l i a n ah u x l e y i p h a e o d a c t y l u m t r i c o r n u t u m s k e l e t o n e m ac o s t a t u m s c r i p p s i e l l at r o c h o i d e a t h a l a s s i o s i r a p s e u d o n a n a 室温、自然光照，液体培养基； 5 4 0 天；6 3 0 天 3 1 】 4 c ，暗，液体培养基 6 3 0 天；2 年 4 5 0 天；5 4 0 天 4 5 0 天；5 4 0 天 5 4 0 天；2 年 4 5 0 天：5 4 0 天 6 3 0 天；2 年 5 4 0 天；2 年 5 4 0 天；6 3 0 天 如天：1 天 5 4 0 天：2 年 4 c ，弱光，液体培养基3 个月