（植物学专业论文）麻疯树的抗冷性和sad基因的克隆及表达研究.pdf

四川大学博士学位论文 麻疯树抗冷性和s a d 基因 的克隆及表达的研究 植物学专业 研究生罗通指导教师陈放教授 摘要 麻疯树( j a t r o p h ac u r e a s l ) 是一种大戟科( e u p h o r b i a c e a e ) 的油 料植物。广泛分布于世界的热带亚热带地区，在我国的云南、四川、 贵州等地也有大量生长，具有较大的开发应用潜力。但是，由于麻疯 树耐热喜光而只在热带亚热带分布，这就限制了麻疯树的开发利用。 植物的硬脂酰酰基载体蛋白( a c p ) 脱饱和酶( s a d ，e c 1 1 4 9 9 6 ) 是脂肪酸合成代谢的关键酶，催化硬脂酰a c p 脱饱和形成油酰a c p 。 控制着植物体内膜脂和贮脂的饱和脂肪酸不饱和脂肪酸的比例，和植 物的抗寒性、抗病性等功能有密切关系。研究表明，膜脂不饱和脂肪 酸含量高的植物抗冷性强。这里我们首先研究了麻疯树的抗冷性，为 培育和筛选出耐冷性的麻疯树品种奠定基础。然后克隆了麻疯树的 s a d 基因，并对其进行了原核表达，以研究其功能。为利用基因工程 技术，调节s a d 基因活性，从而改善和s a d 有关的植物功能( 如抗冷 性等) 打下基础。 1 、低温对麻疯榭生理指标的影响 将麻疯树种子在正常条件下萌发，待长成幼苗后，用不同的低温 ( 2 5 、1 2 、8 、4 ) ，分别在不同时间内( 1d 、2d ，3d 、 i x 四川大学博士学位论文 4d ) 对麻疯树幼苗进行胁迫然后，将处理的幼苗取出，培养于正常 条件下3d 。分别测定和抗冷性有关的各项指标，以研究麻疯树的冷伤 害和抗冷性。叶绿素含量测定用分光光度法，根系活力( 脱氢酶活性) 的测定用t t c 法，外渗电导率的测定用电导仪法，叶片膜脂中脂肪酸 含量测定用气相色谱法。所得数据经差异显著性分析，结果表明，低 温对麻疯树幼苗造成显著伤害，表现为叶绿素含量减少，根系活力降 低，生物膜的通透性( 电导率) 增大，膜脂不饱和脂肪酸含量下降等。 冷伤害程度和胁迫温度，胁迫时阃密切相关，即胁迫温度越低，胁迫 时间越长，麻疯树受害越严重。麻疯树在低温胁迫下生理活动减弱， 以减小冷伤害这是植物低温适应性反应，表明它具有抗冷性，尤其 对1 2 以上低温具有较大的耐受性 。 2 、不同产地的麻疯拇f 抗冷性研究 用8 的低温分别胁迫来自三个不同产地( 红河、攀技花、永胜) 的麻疯树幼苗，胁追时间为3d 。再分别测定麻疯树幼苗的和抗冷性有 关的各项生理指标：叶绿素含量、根系活力、外渗电导率、膜脂不饱 和脂肪酸含量所得数据经差异显著性分析，结果表明，低温对所有 麻疯树幼苗都造成严重伤害，但三个产地麻疯树幼苗的受害程度不同。 其叶绿素、根系脱氢酶活性的受损率以及外渗电导率的上升率都为： 红河 攀枝花 永胜而永胜和攀枝花产麻疯树幼苗的膜脂不饱和 脂肪酸含量略有增加，但增加无显著性。红河产麻疯树幼苗的膜脂不 饱和脂肪酸含量显著性降低三产地的麻疯树抗冷性为：永胜 攀枝 花 红河。不同产地间麻疯树抗冷性的差异是植物适应原产地气温的 遗传选择的结果。 3 、麻疯树s a d 基因的克隆及特征描述 ( 1 ) 基因克隆及生物信息学分析 从麻疯树正在发育的种子中提取总r n a ，用o l i g o ( d t ) 作引物进行 反转录，获得c d n a 第一条链。在n c b i 上，以蓖麻的s a d 氨基酸序 列作参比序列，利用b l a s t p 程序进行搜索，发现植物s a d 的两个保守 x 四川大学博七学位论文 序列：d l l n k y l y 和g r w k v e ( 或d ) ，并由此设计简并引物：p l ( 5 a y c t y c t b a a t a a r t a y c t y t 3 ) p 2 ( 5 一h t c m a c c t t c c a y c t s c c 3 1 。用p l 、p 2 及反转录产物进行的p c r 扩增，得到一4 9 1 b p 的s a d 基因的中游片段e 根据以上所得中游片段设计两个3 - r a c e 正向引物p 3 ( 5 c t t g a t g t a t g a t g g t c g t - 3 ) 、p 4 ( 5 a t g a c a a t c t t t t t g a c c a c 3 ) ；再设计5 个5 r a c e 引物：r t - p ( 5 - p g c c a a c t t t a t g t c 3 1 ，a 1 ( 5 c a t c a t t c c a a g a a a g g g 一3 ) ，s 1 ( 5 - g a t g a a t c c a a g 朋r a g g g 3 ) 和a 2 ( 5 c a g a c t t g c c a a a g a a c a - 3 ) s 2 ( 5 g t c c a g a c a g a t a g a g a t a c - 3 ) 。通过3 - r a c e 和5 一r a c e ， 得到s a d 基因的下游和上游序列，其长度分别为5 6 lb p 、5 7 8b p 。最 后根据所得上、下游序列设计引物p 5 ( 5 一a a c a a t g g c t c t c a a g c t c a a t c 3 ) p 6 ( 5 t t t t g c c a c a a g g a t t g t a t g c 3 ) ，p c r 扩 增到j s a d 基因( e d n a ) 的全长为1 4 9 lb p ，并和所得上、中、下游 片段拼接所得序列一致用d n a t o o l s5 1 软件进行序列分析发现，该 序列包括一个1 1 9 lb p 的完整的开放阅读框( o r f ) ，4b p 的5 - 非翻 译区序列，2 9 6b p 的3 - 非翻译序列( 含4 个属p o l y a 尾结构的a ) 。 将此片段提交g e n b a n k ，登录号为d q 0 8 4 4 9 1 。同源性分析表明，该基 因和其他s a d 基因间有较高的核甘酸序列同源性，其中和蓖麻s a d 基 因的同源性最高( 8 7 ) ，而和其他1 0 种所比较的s a d 基因问的同源 性也都在8 0 以上。 j s a d 基因编码一个3 9 6 氨基酸残基的前体蛋白。其n 末端的3 3 个氨基酸残基是信号肽，含较多的疏水氪基酸，在转运初生的j s a d 越过质体膜进入质体中起重要作用。进入质体的前体蛋白信号肽被剪 切，因此，成熟的j s a d 含3 6 3 个氨基酸残基，分子量为4 1 7k d a ， 等电点为5 1 4 。j s a d 和其它s a d 间有很高的氨基酸序列同源性。j s a d 和所比较的1 0 种s a d 的同源性都在7 0 以上，而和蓖麻s a d 的同源 性高达9 6 2 。在n c b i 上用r p s b l a s t 程序搜索发现植物s a d 有两个 氨基酸序列保守区，一个属酰基a c p 脱饱和酶家族，另一个属类铁蛋 自家族。j s a d 的相应区段和保守区具有较多的相同氨基酸。保守区的 x i 四川大学博士学位论文 许多基团是酶活性位点及底物结合位点的组成。 用s w i s s m o d e l 程序和s w i s s p d bv i e w e r 进一步分析j s a d 成熟 肽的空间构象。结果表明，j s a d 的三维模型和蓖麻s a d 的晶体结构 非常相似。其二级结构主要由a 螺旋组成，从n 末端到c 末端，可 以看到1 1 个相继排列的a 一螺旋和2 个b 折叠。1 1 个q 螺旋组成一个 较大的螺旋结构区，其中的9 个a 螺旋( q3 ，d1 1 ) 形成一个反向平 行的d 螺旋束，而d3 、d4 、n6 和q7 形成一个四螺旋束结构。在 这个四螺旋束结构中埋藏着一个由两个铁原子组成的二铁中心。并主 要由二铁中心及部分四螺旋束的氨基酸形成酶活性中心。两个相同的 贬基对称地结合在起形成有活性的同源二聚体酶分子。 根据2 4 种植物s a d 同源性，用v e c t o r n t i9 0 软件作出系统进化 树。在进化上这些s a d 聚成三支，第一支有1 0 种s a d ( 包括j s a d ) ， 属于7 个科的植物；第二支有1 3 种s a d ，属于1 1 个科的植物；第三 支只有一种s a d 。用d n a t o o l s5 1 估测j s a d 肽链的极性。结果表明， 成熟肽两端3 4 1 2 5 及2 4 3 3 9 6 肽段的亲水性较强，7 应主要定位于分子 的外部，而1 2 6 2 4 2 疏水性相对较强，其中许多氨基酸可能位于分子 内部。用o m i g a2 0p r o t e i nm o t i f s 程序进行蛋白质修饰位点的预测， 共搜索到1 7 个修饰位点：4 个可能的c k 2 磷酸化位点、5 个可能的p k c 磷酸化位点、1 个c a m p 磷酸化位点、1 个t y r 磷酸化位点、4 个豆 蔻酰化位点、1 个脂肪酸脱饱和位点。 ( 2 ) s o u t h e r n 及n o r t h e r n 杂交 用限制性内切酶e c o gi 、砌0i 、 s a li 、e c d r v 将麻疯树基因 组d n a 酶切消化，在o 7 琼脂糖凝胶电泳上用2 5v 电压电泳过夜。 将酶切消化完全的基因组d n a 转移到尼龙膜上，以地高辛标记的 j s a d 成熟肽编码区p c r 产物作为探针，在4 1 杂交过夜。经沈膜、 免疫学检测，并暴x 光从x 光片上可以看到，每种酶切产物至少可 有2 条杂交条带：e c o ri2 4k b 和6 5k b 、砌0i5 4k b 和7 2k b 、 s a li4 1k b 和6 2k b 、e c d r v 3 1k b 和6 2k b 。说明，鲥d 基因在基因 组中至少有2 个拷贝，属于低拷贝数的基因。或者j s a d 是由至少两 个密切相关的同功酶基因组成的基因家族编码的，具至少两种同功酶 x i i 四川大学博士学位论文 形式。 分别从麻疯树幼嫩的根、嫩茎、花、幼嫩果皮、幼嫩种子、成熟 叶以及幼嫩叶中提取总r n a 。n o r t h e r n 杂交结果表明，在所研究的器 官中都有杂交信号，说明j s a d 基因在这些器官中都有表达。但表达的 程度不同，正在发育的果实中表达最旺盛，其次是幼叶，而幼根、幼 茎、花以及成熟叶的j s a d 基因表达相对较弱。 4 、删d 基因的原核表达 以克隆的麻疯树s a d 的c d n a 为基础设计基因特异性引物 p 7 1 5 - g c g q g 冬至q ( s p hi ) g c t t c t a c c c t c a a g t c c g g - 3 】 p 8 1 5 gc q 至鱼( s a li ) t t a c a g c t t c a c t t c t c t a t c 一3 】，通过 p c r 扩增到黝d 基因的成熟肽编码区，并连接到原核表达载体p q e 3 0 的s p hi 、s a li 位点，成功构建了麻疯树s a d 的原核表达载体p s ，将 之转入大肠杆菌e c o l im 1 5 获得重组菌p s m 。并诱导表达，经 s d s p a g e 检测表明，p s m 表达出约4 3k d a 的重组蛋白h i s s a d ，表 达量和诱导时间、诱导温度及i p t g 的浓度有密切关系，在本实验设计 的诱导条件范围内，p s m 表达重组蛋白韵优化诱导条件为：3 0 ，4 6h ，0 4m m 0 1 l o 的i p t g 。通过n i t n a 分离柱分离纯化了表达蛋白 h i s s a d ，用h i s s a d 的提取液作酶源，构建s a d 的离体反应体系。 当酶反应体系中加入菠菜铁氧环蛋白时，重组蛋白在体外表现出明显 的硬脂酰a c p 脱饱和活性。同时也进一步证明了植物s a d 的活性需 要铁氧环蛋白。 关键词：麻疯树；抗冷性；冷害；胁迫；硬脂酰酰基载体蛋白脱饱和 酶；克隆：生物信息学分析；原核表达 x i l l 璺型查兰堡主兰垡堡苎 一 s t u d i e so nt h ec o l d r e s i s t a n c e a b i l i t ya n dc l o n i n ga n de x p r e s s i o n o fs a dg e n eo fj a t r o p h ac u r c a s m a j o r ：b o t a n y p h d c a n d i d a t e ：l u ot o n gs u p e r v i s o r ：p r o f c h e nf a n g a b s t r a c t j a t r o p h ac u r c a sl ，b e l o n g i n gt oe u p h o r b i a c e a e a n dt h r i v i n gi nm a n y a r e a so ft h et r o p i c sa n ds u b t r o p i c sa r o u n dt h ew o r l d ，i sam u l t i p u r p o s e p l a n t w i t hm a n ya t t r i b u t e sa n d c o n s i d e r a b l ep o t e n t i a l s h o w e v e r ，i t s u t i l i z a t i o ni sl i m i t e db yt h eo n l yt r o p i c sa n ds u b - t r o p i c sd i s t r i b u t i o n s t e a r o y l a e y l c a r r i e rp r o t e i n ( a c p ) d e s a t u r a s e ( s a d ，e c 1 14 9 9 6 ) c a t a l y z i n gd e s a t u r a t i o no fs t e a r o y l a c pt o f o r mo l e o y l a c pi sak e y e n z y m eo ff a t t ya c i d ss y n t h e t i cm e t a b o l i s mi nh i g h e rp l a n t sa n dp l a y s a k e yr o l ei nd e t e r m i n i n gt h er a t i oo fs a t u r a t e dt ou n s a t u r a t e df a t t ya c i d si n p l a n t s i tw a sr e p o r t e dt h a tt h i s r a t i oi nm e m b r a n el i p i d sw a sc l o s e l y r e l a t e dt om a n yf u n c t i o n s ，e s p e c i a l l yt h es t r e s sr e s i s t a n c eo fp l a n t s t h e a v a i l a b l ei n f o r m a t i o ni n d i c a t e st h a tt h ec h i l l i n gr e s i s t a n c eo fp l a n t sr i s e s w i t ht h ei n c r e a s ei nt h ec o n t e n t so ft h eu n s a t u r a t e df a t t y a c i d si n m e m b r a n el i p i d s h e r et h ec o l d r e s i s t a n c ea b i l i t yo f ，c u r c a sw a sf i r s t s t u d i e d ，w h i c hm a yl a yt h eb a s i sf o rs e l e c t i n gc o l d r e s i s t a n c ev a r i e t i e so f 3c u r e a s 。t h e n t h eg e n eo f3 c u r c a ss a d ( j s a d 、i sc l o n e da n d x i v 四川大学博士学位论文 e x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o l im 1 5 t h es t u d ym a yl a yt h eb a s i sf o rt h e g e n eo p e r a t i o no fj s a dt oi m p r o v et h ec o n t e n to fu n s a t u r a t e df a t t ya c i d s a n dt oe n h a n c et h ec h i l l i n gr e s i s t a n c ea b i l i t yo fzc u r c a s 1 e f f e c t so fl o wt e m p e r a t u r eo np h y s i o l o g i c a li n d e x e so fj a t r o p h a c 1 1 t e a s t os t u d yt h ec o l di n j u r ya n dc o l d - r e s i s t a n c ea b i l i t yo fj ，c m r c o $ 。t h e s e e d l i n g sw e r es t r e s s e dw i t hd i f f e r e n tl o wt e m p e r a t u r e sf o rd i f f e r e n tt i m e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，w h e nt h es e e d l i n g sw e r es t r e s s e du n d e rd i f f e r e n t l o wt e m p e r a t u r e s ( 2 5 ，1 2 ，8 a n d4 1 2 ，r e s p e c t i v e l y ) f o r d i f f e r e n tt i m e ( 1d ，2d ，3da n d4d ，r e s p e c t i v e l y ) ，t h es t r e s s e ds e e d l i n g s s u f f e r e ds e v e r ei n j u r y ，w h i c hw a sr e f l e c t e db yt h ed e c r e a s e dc o n t e n t so f c h l o r o p h y l la n du n s a t u r a t e df a t t ya c i d si nm e m b r a n e ，r e d u c e da c t i v i t yo f t h er o o t sa n di n c r e a s e dp e r m e a b i l i t yo fb i o m e m b r a n e t h ed e g r e eo f i n j u r yc a u s e db yl o wt e m p e r a t u r ew a sc l o s e l yr e l a t e dt ot e m p e r a t u r ea n d d u r a t i o no fs t r e s s t h el o w e rt h et e m p e r a t u r ea n dt h el o n g e rt h ed u r a t i o n o fs t r e s s ，t h es e v e r e ri n j u r yc a u s e d ，o nt h eo t h e rh a n d ，c o l d - s t r e s s e d s e e d l i n g so f 3 c u r c a se x h i b i t e dr e d u c e d p h y s i o l o g i c a la c t i v i t y s u g g e s t i n ga d a p t a t i o na n dr e s i s t a n c eo ft h ep l a n tt oc o l ds t r e s s ，e s p e c i a l l y t h el o w e rt e m p e r a t u r ea b o v el2 2 c o l d r e s i s t a n c ea b i l i t yo fj a t r o p h ae u r c a sg r o w i n gi nd i f f e r e n t e c o l o g i c a le n v i r o n m e n t t h ec o l d - r e s i s t a n c ea b i l i t yo f3 c u r c a sw a ss t u d i e db ym e a n so f l o w - t e m p e r a t u r e ( 8 ) s t r e s st os e e d l i n g sf r o md i f f e r e n te c o l o g i c a ls i t e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc o l ds t r e s sl e dt od i f f e r e n ti n j u r yt ot h ej c h r c a $ e c o t y p e s t h ed e c r e a s e de x t e n to fc h l o r o p h y l lc o n t e n t s ，r o o tv i a b i l i t ya n d i n c r e a s e de x t e n to fm e m b r a n e sp e r m e a b i l i t ys h o w e dap a t t e r no fj c u r c a s f r o m y o n g s h e n g ，p a n z h i h u a a n dh o n g h e ，s u g g e s t i n g ，c u e c a sf r o m y o n g s h e n gh a dt h e t h es t r o n g e s tc o l dt o l e r a n c e ，f o l l o w e db yt h a tf r o m x v 四川大学博士学位论文 p a n z h i h u a ，a n dt h a tf r o mh o n g h ew a st h ec o l d s u s c e p t i b l eo ft h et h r e e t h ed i f f e r e n c ei nc o l d r e s i s t a n c ea b i l i t yo f ，e u r c a $ r e s u l t sf r o mg e n e t i c s e l e c t i o nt h a t ，c u r c a sa d a p t e dt ot h et e m p e r a t u r e so fo r i g i n a lh a b i t a t s 3 c l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z i n go fj s a dg e n e ( 1 ) c l o n i n ga n db i o i n f o r m a t i c a la n a l y s i so fj s a dg e n e t h et o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o mt h ed e v e l o p i n gs e e d so f ，c u r c q s r n aw a s r e v e r s e l y t r a n s c r i b e dw i t ht h e p r i m e ro l i g o ( d t ) t w o d e g e n e r a t ep r i m e r s ，p l ( 5 - a y c t y c t b a a t a a r t a y ct y t - 3 ) p 2 ( 5 - h t c m a c c t t c c a y c t s c c 一3 ) ，w e r ed e s i g n e da c c o r d i n g t ot h e c o n s e r v e da m i n oa c i ds e q u e n c ed l l n k y l ya n dg r w k v e ( o rd ) o f p l a n t ss a ds e a r c h e db yb l a s t po nn c b i p c rw a sp e r f o r m e dw i t hp 1a n d p 2a n da4 91 b pf r a g m e n tw a so b t a i n e d b a s e do nt h ef r a g m e n to b t a i n e da b o v e ，t w o3 - r a c ep r i m e r sp 3 ( 5 c t t g a t g t a t g a t g g t c g t - 3 ) ，p 4( 5 - a t g a c a a t c t t t t t g a c c a c - 3 ) a n df i v e5 - r a c ep r i m e r sr t - p ( 5 一p g c c a a c t t t a t g t c - 3 ) ，a i ( 5 - c a t c a t t c c a a g a a a g g g 一3 ) s1 ( 5 - g a t g a a t c c a a g a t a g g g - 3 ) ，a 2 ( 5 一c a g a c t t g c c a a a g a a c a 一3 ) s 2 ( 5 - g t c c a g a c a g a t a g a g a t a c 一3 ) w e r ed e s i g n e d t h r o u g h3 - r a c ea n d 5 - r a c e ，a5 8 0b pa n da5 7 8b pf r a g m e n t sw e r eo b t a i n e dr e s p e c t i v e l y f i n a l l y ，t h ef u l l - l e n g t he d n ao fj s a dw a so b t a i n e dt h r o u g hr t - p c r r e a c t i o n u s i n g t h e g e n e - s p e c i f i cp r i m e r sp 5 ( 5 一a a c a a t g g c t c t c a a g c t c a a t c 一3 ) p 6 ( 5 t t t t g c c a c a a g g a t t g t a t g c 3 ) s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ef u l l - l e n g t he d n ao fj s a do b t a i n e d w a s1 4 9 1b pc o n t a i n i n ga n11 9 1b po fc o m p l e t eo r f ，a4b po f5 一a n da 2 9 6b po f3 - u n t r a n s l a t e ds e q u e n c e t h eg e n es e q u e n c ew a ss u b m i t t e dt o o e n b a n k ( a c c e s s i o nn o d q 0 8 4 4 9 1 ) ，i d e n t i t ya n a l y s i ss h o w st h a tj s a d g e n es h a r e sh i g h e rn u c l e o t i d es e q u e n c ei d e n t i t yw i t ho t h e rs a d t h e n u c l e o t i d ei d e n t i t yb e t w e e nj s a da n dr i c i n u sc o m m u n i ss a d ( r s a d ) i s u pt o8 7 a n dt h ei d e n t i t i e sb e t w e e nj s a da n d10s a dc o m p a r e da r ea l l x v i 四川大学博士学位论文 h i g h e rt h a n8 0 j s a dg e n ee n c o d e sap r e c u r s o rw i t h3 9 6 一a m i n oa c i d s ：t h ep u t a t i v e p r o t e i nc o n t a i n sn3 3 - a m i n oa c i d ss i g n a lp e p t i d ea n da3 6 3 a m i n oa c i d s m a t u r ep e p t i d ew i t hm w4 1 7k d aa n di s o e l e c t r i cp o i n t5 7 4 t h es i g n a l p e p t i d ew a sas e c r e t a r ys e q u e n c ec o n t a i n i n gh i g hc o n t e n to fh y d r o p h o b i c a m i n oa c i d s ( 6 3 6 ) ，w h i c hw a se x p e c t e dt ot r a n s p o r tt h en a s c e n t p o l y p e p t i d ec h a i na c r o s sp l a s t i dm e m b r a n ei n t op l a s t i ds t r o m a w h e n t h e p u t a t i v ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fj s a dw a sc o m p a r e dw i t ht h ea m i n oa c i d s e q u e n c e so fo t h e rs a di nt h en c b id a t a b a s eu s i n gb l a s tp r o g r a m ，a h i g hd e g r e eo fi d e n t i t yw a sf o u n d a m o n gt h es a di ng e n b a n k ，r s a d h a st h eh i g h e s ti d e n t i t yw i t hj s a d ( 9 6 2 ) a n dv a s tm a j o r i t yo fo t h e r s a dh a v em o r et h a n6 0 i d e n t i t yw i t hj s a d 、 t h ep o l y p e p t i d eh a st w oc o n s e r v e dd o m a i n s ，o n eb e l o n g i n gt o a c y l a c pd e s a t u r a s ef a m i l yw i t hc o n s i d e r a b l eh o m o l o g yi nnn u m b e ro f h i g h l yc o n s e r v e db l o c k sa n da n o t h e rb e l o n 舀n gt o f e r r i t i n l i k e f a m i l y m o s tr e s i d u e si nc o n s e r v e dr e g i o na r ec a n d i d a t e sf o rt h ec a t a l y t i ca n d s u b s t r a t e b i n d i n gs i t e so ft h ee n z y m e 7 p r o g r a ms w i s s m o d e la n ds w i s s p d bv i e w e rw e r eu s e dt oa n a l y z e j s a ds p a c ee o n f i g u r a t i o n t h ea n a l y s i sr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e d u c e d t h r e e - d i m e n s i o n a lm o d e lo fj s a dw a sv e r ys i m i l a rt oc r y s t a ls t r u c t u r eo f r s a d 1 1 n h e l i c e s ( a l n 1 1 1a n d21 3 - h a i r p i n s ( 8 1 1 3 2 ) a r ec o n t a i n e di n t h et h r e e d i m e n s i o n a lm o d e lo fj s a d a 3 ，n 4 ，u 6a n dn 7h e l i c e so fs a d f o r maf o u r h e l i c e s b u n d l es t r u c t u r e ad i i r o nc e n t r ei sb u r i e di r i t et h e f o u r h e l i c e s b u n d l es t r u c t u r e t h ea c t i v ec e n t r eo fs a di si o c a t e di n t ot h e f o u r h e l i c e s b u n d l es t r u c t u r e i ti sm o s tp r o b a b l et h a tt h ed e d u c e dj s a d p o l y p e p t i d ec h a i no f3 6 3a m i n oa c i d si sas u b u n i t ，w h i c hs h o u l di nv i v o p o l y m e r i z ei n t oh o m o l o g i c a ld i m e r sw i t hm o l e c u l a rw e i g h ta b o u t7 0k d a t op e r l e r mt h ef u n e t i o n s x v i i 四川大学博士学位论文 ap h y l o g e n e t i et r e eo f2 4p l a n t ss a dw a sb u i l tb a s e do nt h e i r i d e n t i t i e sw i t hs o f t w a r ev e c t o rn t i9 0 t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts a da r e g r o u p e di n t o t h r e eb r a n c h e st h r o u g h o u te v o l u t i o n t h ef i r s tb r a n c h ， i n c l u d i n gj s a d ，c o n t a i n s 10s a do fp l a n t s b e l o n g i n gt o 7d i f f e r e n t f a m i l i e s t h es e c o n do n ec o n t a i n s13s a do fp l a n t sb e l o n g i n gt o11 f a m i l i e sa n dt h et h i r dc o n t a i n s1 s a do n l y t h eh y d r o p a t h yp l o to fj s a dp e p t i d ec h a i nw a sa n a l y z e dw i t hd n a t o o l s5 1 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et w oe n d so fj s a d ，a b o u ta m i n o a c i d s1 2 6 “1 2 5a n d2 4 3 3 9 6 ，w e r eh i g h l yh y d r o p h i l i c a n dt h em i d d l e r e g i o n ，a b o u t 12 6 “2 4 2a m i n o a c i d s ，w a sr e l a t i v e l yh y d r o p h o b i c t h e r e f o r e ，t h et w oe n d sm u s tm a i n l yl o c a t eo nt h e s u r f a c eo fj s a d m o l e c u l ea n dt h em i d d l er e g i o ni nt h ei n t e r i o r s e v e n t e e nc h e m i c a lm o d i f i c a t i o ns i t e sw e r ef o u n di na i lb yo m i g a 2 0p r o t e i n m o t i f s 。 w h i c h w e r e 4 c k 2 - p h o s p h o s i t e ， 5 p k c p h o s p h o s i t e ， 1c a m p - p h o s p h o - s i t e ，1t y r - p h o s p h o s i t e 4m y r i s t y la n d1f a t t y - a c i d d e s a t u r 一2 ( 2 ) s o u t h e r na n dn o r t h e r n b l o t g e n o m i cd n aw a sp r e p a r e df r o my o u n gl e a v e su s i n gt h em e t h o do f c t a ba n dc o m p l e t e l yd i g e s t e db yr e s t r i c t i o ne n z y m e se c o ri ，x h oi ， s a lia n de c o rvs e p a r a t e l y d i g e s t e dp r o d u c t sw e r el o a d e do no 7 a g a r o s eg e la n dt r a n s f e r r e dt on y l o nm e m b r a n e t h ep r o b ew a st h em a t u r e p e p t i d eg e n ef r a g m e n tr e c o v e r e df r o mp c rp r o d u c t sa n dl a b e l e du s i n g d i g h y b r i d i z a t i o nw a sc o n d u c t e da t41 o v e rn i g h t t h eb l